DK145234B - Fremgangsmaade og reagens til kvantitativ bestemmelse af cholesterol - Google Patents

Description

Am os) DANMARK V-S/

|j| (12) FREMLÆGGELSESSKRIFT on 145234 B

DIREKTORATET FOR PATENT- OG VAREMÆRKEVÆSENET

(21) Ansøgning nr. 2556/73 (51) lnt.CI.3 C 12 Q 1/60 (22) Indleveringsdag 9 · maj 1973 (24) Løbedag 9 · maj 1973 (41) Aim. tilgængelig 18. nov. 1973 (44) Fremlagt 1 1 · Okt. 1 982 (86) International ansøgning nr.

(86) International indleveringsdag (85) Videreførelsesdag - (62) Stamansøgning nr. -

(30) Prioritet 17. maj 1972, 2224132, DE

(71) Ansøger BOEHRINGER MANNHEIM GMBH., 6800 Mannheim-Waldhof, DE.

(72) Opfinder Wolfgang Gruber, DE: Hans Ulrich Bergmeyer, DE: Erich

Bernt, DE: Alexander Hagen, DE: Peter Roeschlau, DE: m. fl.

(74) Fuldmægtig Firmaet Chas. Hude.

(54) Fremgangsmåde og reagens til kvantitativ bestemmelse af cholesterol.

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til kvantitativ enzymatisk bestemmelse af fri og forestret cholesterol og et reagens til gennemførelse af fremgangsmåden.

Bestemmelsen af cholesterol har en væsentlig betydning for den me-φ dicinske diagnostik. En forhøjet cholesterolkoncentration i blodet -3- er en væsentlig risikofaktor for arteriosclerose. Ved høje chole- ^ sterolmængder, altså ved hypercholesterolaani, forekommer coronarin-

Lf) sufficiens og hjerteinfarkt hyppigere end ved lavere cholesterol-

Si mængder. Hypercholesterolaani begunstiger forekomsten af arterio- *

Q

2 U5234 sclerose og coronarsygdoimne og må derfor erkendes tidligt, således at behandlingen kan begynde rettidigt. Forhøjede cholesterolmængder findes også hyppigt ved diabetes mellitus, nephrotisk syndrom, hypo= thyreose og leversygdomme, såsom galdecirrose. En hurtig og pålideligt gennemførlig fremgangsmåde til bestemmelse af cholesterol har derfor stor betydning.

De kendte og anvendelige fremgangsmåder til kvantitativ cholesterol-bestemmelse er baseret på reaktionen ifølge Liebermann og Burchard.

Fri og forestret cholesterol danner derefter med eddikesyreanhydrid og koncentreret svolvsyre blågrønt farvede forbindelser, hvis farve-intensitet er proportional med cholesterolkoncentrationen og kan måles spektrofotometrisk.

Denne kendte fremgangsmåde er imidlertid behæftet med væsentlige ulemper. Hovedulempen ved denne fremgangsmåde består i dens manglende specificitet. Liebermann-Burchard-reaktionen er en forholdsvis uspecifik steroidreaktion, hvori der foruden cholesterol også kan indgå andre steroider. Da der f.eks. i plasma endnu findes 1-3% dihydrocholesterol 7 og 0,5-1,4% Δ -cholestenol foruden andre steroider, forekommer der en uønsket stor fejl. Endvidere forstyrres denne reaktion af bilirubin og hæmoglobin, hvilket fører til forøgede og dermed forkerte positive cholesterolmængder. En yderligere ulempe består i, at der må arbejdes med aggressive og ætsende reagenser.

Opfindelsen tager derfor sigte på at angive en hidtil ukendt fremgangsmåde og et middel til bestemmelse af cholesterol, som ikke er behæftet med de ovenfor anførte ulemper, og som især er absolut specifik for cholesterol og ikke kræver aggressive reagenser.

Dette opnås ved en fremgangsmåde af den indledningsvis anførte art, som er ejendommelig ved, at cholesterol i vandigt medium inkuberes med cholesteroloxidase, indtil fuldstændig oxidation har fundet sted, og at enten oxygenforbruget, dannet H202 eller dannet cholestenon bestemtes.

Cholesteroloxidase er et hidtil ukendt enzym, som katalyserer nedenstående reaktion: „ cholesteroloxidase v . . __, „ „

Cholesterol + 02 -f cholestenon + H202

Ovennævnte reaktion forløber kvantitativt og muliggør derigennem 3 1Λ523Λ en absolut specifik og nøjagtig kvantitativ bestemmelse af chole= sterol.

Cholesteroloxidase, udgangsmaterialet til udvinding deraf, dens rensning og dens egenskaber er beskrevet i dansk patentskrift nr.

131.784. Cholesteroloxidase er et enzym, som er bundet til chole= sterolomsættende mikroorganismers cellemembran, og som kan omsætte den meget hydrofobe forbindelse cholesterol. Cholesteroloxidasen kan udvindes ved, at en cholesterolomsættende mikroorganisme oplukkes og ekstraheres ved nedbrydning af cellevæggen ved en pufferopløsning med pH 5-9, som indeholder et ikke-ionogent overfladeaktivt middel, hvorefter cholesteroloxidase isoleres fra ekstrakten, og enzymet elueres med en pufferopløsning indeholdende det overfladeaktive middel. Til anvendelse ved udvindingen egner sig i princippet enhver cholesterolomsættende mikroorganisme, men særlig gode resultater er blevet opnået med bakterier hørende til slægten Proactino= myces, fortrinsvis bakterierne Proactinomyces eurythrupolis NBC 9158, ATCC 17.895, ATCC 4277 og Norcardia formica ATCC 14.811.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen egner sig til bestemmelse af cholesterol i vandige medier af enhver art, såsom levnedsmiddelekstrakter, legemsvæsker og især serum. På grund af den store specificitet ved fremgangsmåden bestemmes kun fri cholesterol. Bundet cholesterol, der som bekendt foreligger i forestret form, kan dog ligeledes bestemmes ved hjælp af forudgående kemisk eller enzymatisk forsæbning. Kemisk forsæbning sker f.eks. med alkoholisk ka= lilud, enzymatisk forsæbning med esterase, fortrinsvis med chole= sterolesterase fra lever eller pankreas, idet man ved tilstedeværelse af både cholesterolesterase og cholesteroloxidase overraskende opnår en fuldstændig frigørelse af den bundne cholesterol.

Målingen af oxygenforbruget, ^Omdannelsen eller cholestenondannel-sen ifølge det ovenfor angivne almene reaktionsskema kan ske ifølge de hertil kendte og sædvanlige metoder.

Egnede metoder til bestemmelse af oxygenforbruget er f.eks. gaskromatografi og depolarisationsmetoder. Den polarometriske bestemmelse ved hjælp af oxygenelektrode foretrækkes, da denne fremgangsmåde især egner sig til automatiseret gennemførelse af cholesterol-bestemmelsen. Sådanne bestemmelsesmetoder kendes. Den i de tyske offentliggørelsesskrifter nr. 21 30 340 og nr. 21 30 308 beskrevne fremgangsmåde til polarometrisk måling af oxygenforbruget i vandige 4 145234 medier har vist sig særligt velegnet.

Dannet hydrogenperoxid kan bestemmes såvel titrimetrisk som poten-tiometrisk, polarografisk og kolorimetrisk samt enzymatisk. De enzymatiske fremgangsmåder under anvendelse af katalase eller peroxi= dase foretrækkes, da disse ikke blot er yderst specifikke og pålidelige, men også kan kombineres med hovedreaktionen under dannelse af hydrogenperoxid på meget enkel måde. Bestemmelsen ved hjælp af katalase i nærværelse af (3-diketoner, som f.eks. acetylacetone og en lavere alifatisk mono- eller polyvalent alkohol, såsom methanol, ethanol eller methylenglycol, samt bestemmelsen ved hjælp af peroxi= dase i nærværelse af et kromogen har vist sig særlig velegnet. Ved bestemmelsen ved hjælp af katalase, acetylacetone og methanol oxideres sidstnævnte til formaldehyd, som sammen med acetylacetone indgår i en farvereaktion, der kan måles. Ved bestemmelsen ved hjælp af peroxidase tilsættes som kromofor forbindelser, der efter reaktionen kan bestemmes fotometrisk. Et eksempel på en egnet kromofor er 2,2'-aminobenzthiazolinsulfonsyre.

Bestemmelsen af cholestenon sker ved hjælp af ketoreagenser, fortrinsvis et hydrazinderivat, som omsættes med ketogrupper under hydrazondannelse, såsom f.eks. 2,4-dinitrophenylhydrazin. Choleste= non kan dog også bestemmes direkte ved måling af absorptionen ved 240 nm.

Opfindelsen angår endvidere et reagens til bestemmelse af choleste= rol, hvilket reagens består af cholesteroloxidase og et system til bestemmelse af H202 eller et system til bestemmelse af cholestenon og eventuelt et middel til forsæbning af forestret cholesterol samt fortrinsvis et overfladeaktivt middel. I en første fortrukket udførelsesfonti består dette reagens af cholesteroloxidase, katalase, acetylacetone, methanol og aitnoniumholdig puffer, enten enkeltvis eller i blanding. I en yderligere foretrukket udførelsesform består reagenset af cholesterol= oxidase, peroxidase, kromogen og puffer, enten enkeltvis eller i blanding. Som kromogen foretrækkes 2,2'-aminobenzthiazolinsulfonsyre.

I en yderligere foretrukket udførelsesform består reagenset ifølge opfindelsen af cholesteroloxidase og et med ketogrupper under hydra= zondannelse reagerende hydrazinderivat samt eventuelt en puffer. Som hydrazinderivat foretrækkes 2,4-dinitrophenylhydrazin.

145234 5

De ovenfor nævnte foretrukne reagenskombinafioner indeholder fortrinsvis, foruden de ovenfor anførte obligatoriske bestanddele, endvidere gængse opløsningsmidler, katalysatorer og overfladeaktive stoffer. Alle disse tilsætningsstoffer er kendte for fagmanden og almindelige i påvisningssystemer for hydrogenperoxid eller cholestenon.

De ovenfor nævnte reagenskombinationer indeholder fortrinsvis de essentielle bestanddele i følgende mængdeforhold: 4 5 1. 13-150 U cholesteroloxidase samt 2*10 - 5*10 sædvanlig kata- lase, 0,05-0,2 ml acetylacetone og 2-10 ml methanol i 100 ml ammoniumholdig puffer, pH 5-7, samt 0,02-0,3 ml af et overfladeaktivt middel (fortrinsvis hydroxypolyethoxydodecan).

2 4 2. 3-40 U cholesteroloxidase samt 2*10 - 1*10 U peroxidase, 50-200 mg 2,2'-aminobenzthiazolinsulfonsyre samt 0,05-0,5 ml overfladeaktivt middel (fortrinsvis hydroxypolyethoxydodecan) i 100 ml puffer, pH 6-8.

3. 0,1-1 U cholesteroloxidase, 1-5 ml af en 1 mM opløsning af 2,4-dinitrophenylhydrazin og eventuelt 0,005-0,1 ml overfladeaktivt middel.

4. 2-100 U cholesteroloxidase samt 0,1-2,0 ml overfladeaktivt middel (fortrinsvis hydroxypolyethoxydodecan) i 50 ml puffer, pH 5-9, fortrinsvis 0,5 M natriumphosphatpuffer, pH 7,5.

De følgende eksempler belyser opfindelsen nærmere:

Eksempel 1

Polarometrisk bestemmelse af oxygenforbruget.

Der anvendes fortrinsvis det i fig. 1 viste apparat. Apparatet består af en reaktionsbeholder 1 i form af et cylindrisk kammer af gennemsigtigt formstof med en indvendig diameter på 143 mm og en indvendig højde på 220 mm. Kammeret indeholder 1,8 ml af en opløsning af 18 mM kaliumiodid, 7,5 mM ammoniumheptamolybdat, 80Q mM natriumchlorid og 2 U cholesteroloxidase i 0,2 M kaliumphosphatpuffer pH 6,0. Ind i reaktionsbeholderen rager en detektor 3, som består af en oxygenføl- 6 U5234 som elektrode. Detektoren er tilsluttet en analysator 4. På bunden af reaktionsbeholderen 1 findes en magnetomrører 5. Gennem en påfyldningsåbning 6 fyldes 20 yl af en vandig cholesterolholdig opløsning som prøve. Under kraftig omrøring med magnetomrøreren måles formindskelsen i oxygenkoncentrationen i opløsningen. Det efter 2 1/2 minuts reaktion iagttagne oxygenforbrug registreres som funktion af cholesterolkoncentrationen. Måleresultatet for forskellige koncentrationer af den cholesterinholdige opløsning er vist i fig. 2. Der viser sig at være en lineær afhængighed mellem målesignalet og cholesterolkoncentrationen .

Fremgangsmåden blev gentaget under anvendelse af en ved hjælp af alkoholisk KOH forsæbet serumprøve. Bestemmelsen gav en koncentration på 193 mg cholesterol/100 ml. Sammenligningsbestemmelsen ifølge Liebermann og Burchard viste 182 mg/100 ml.

Eksempel 2

Bestemmelse af 10 g ammoniumhydrogenphosphat opløses i 100 ml vand og indstilles 5 til pH 7/0 med 85% phosphorsyre. Derefter tilsættes 10 U katalase.

En blanding af 0,2 ml acetylacetone og 10 ml methanol fyldes op til 100 ml med den således opnåede opløsning.

7,5 ml af den således opnåede opløsning blandes med 0,5 ml serum eller med 0,5 ml af en cholesterolstandardopløsning med et indhold på 200 mg% cholesterol. Lige store mængder af den serumholdige prøve og den cholesterolstandardholdige prøve tilsættes hver især 5 U cholesteroloxidase og 0,02 ml af en 10% hydroxypolyethoxydodecanop-løsning og inkuberes i 70 minutter ved 37°C. Derefter måles det dannede farvestof fotometrisk ved 405 nm under hensyntagen til reagens-blindværdierne. Der tegnes en kalibreringskurve for cholesterolstan-dardopløsningerne, som er vist i fig. 3 på tegningen. På kalibreringskurven er cholesterolkoncentrationen anført i forhold til ekstinktionen ved 405 nm.

Cholesterolindholdet i den serumholdige prøve bestemmes under benyttelse af en standard som referencestørrelse. Kontrolbestemmelser ifølge Liebermann-Burchard viste en afvigelse på ca. 5%.

7 1452 3 Λ

Eksempel 3

Bestemmelse af Η202·

Til 3 ml kaliumphosphatpuffer pH 7 (O2 mættet), som indeholder 100 mg% 2,2'-aminobenzthiazolinsulfonsyre, sættes 0,05 ml af en 20% opløsning af hydroxypolyethoxydodecan og 0,02 ml (= 36 U) i handelen gående peroxydaseopløsning samt 0,02 ml H202 (0,02 ml 30% v:v H202 til 100 ml vand) til fjernelse af reducerende stoffer. Blandingen blev fulgt i fotometeret ved henholdsvis 405 nm og 436 nm. Såsnart reaktionen er standset, tilsættes 0,01 ml serum (fortyndet 1:15 med vand). Efter 10 minutter tilsættes 0,15 U cholesteroloxidase. Efter yderligere 10 minutter aflæses ekstinktionsforskellen.

På samme måde, men under anvendelse af en cholesterolstandardopløs-ning med et indhold på 200 mg%, blev den i fig. 4 viste kalibreringskurve tegnet. Ved hjælp af denne kalibreringskurve bestemmes cholesterolindholdet i serumprøven. Målingen viste et indhold på 180 mg% cholesterol. En kontrolmåling ifølge Liebermann og Burchard viste 185 mg%.

Eksempel 4

Bestemmelse af cholestenon.

0,2 ml serum (fortyndet 1:10 med vand) tilsættes 0,05 ml 20% hydro^ xypolyethoxydodecanopløsning og 0,15 U cholesteroloxidase. Efter 15 minutter tilsættes 2,0 ml af en opløsning indeholdende 1 mM 2,4-dinitrophenylhydrazin i 1 N saltsyre. Efter yderligere 30 minutter tilsættes 4,0 ml vand, og den dannede hydrazon måles i fotometeret ved 405 nm. Bestemmelsen sker ved hjælp af en standardkurve under hensyntagen til reagensblindværdien. Målingen kan også ske ved 546 nm under tilsætning af alkali.

Målingen i en typisk prøve viste 60 mg% fri cholesterol og et samlet cholesterolindhold på 154 mg% (forsæbning med alkoholisk KOH).

Sammenligningsbestemmelsen ifølge Liebermann-Burchard viste et samlet cholesterolindhold på 170 mg%.

Til forsæbning af forestret cholesterol (måling af samlet cholesterolindhold i serum) blandes 1 ml serum, 1 ml 20% hydroxypolyethoxydodecan-

Claims (13)

1. Fremgangsmåde til kvantitativ bestemmelse af cholesterol, kendetegnet ved, at cholesterol i vandigt medium inkuberes med cholesteroloxidase, indtil fuldstændig oxidation har fundet sted, og at enten oxygenforbruget, dannet eller dannet cholestenon bestemmes.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at oxygenforbruget måles polarometrisk.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det dannede ^2°2 bestemmes enzymatisk med katalase eller peroxidase. 9 145234

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, k en d e t e. g n e t ved, at dannet· · cholestenon måles efter omsætning med et ketoréagens, især 2,4-dini^ trophenylhydrazin.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at dannet cholestenon bestemmes direkte ved måling af absorptionen -ved 240 nm. __ t > ·

6. Fremgangsmåde ifølge krav 1-5, kendetegnet ved, at man j ' i særskilte portioner fra hver prøve bestemmer frit og totalt chole= sterol henholdsvis uden og med forsæbning ved hjælp af ethanolisk kalilud.

7. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1-5, kendetegnet ved, at man i en portion først bestemmer fri cholesterol, -derefttet·--· tilsætter esterase, fortrinsvis cholesterolésterase, under samtidig * tilstedeværelse af cholesteroloxidasen, og til slut bestemmer den bundne cholesterol.

8. Reagens til anvendelse ved fremgangsmåden ifølge krav 1, ken detegnet ved, at det består af cholesteroloxidase og et system .til bestemmelse af e-^er et system til bestemmelse af cholestenon og eventuelt et middel til forsæbning af forestret cholesterol samt fortrinsvis et overfladeaktivt middel.

8 145234 opløsning og 5 ml 0,5 N KOH i 90% ethanol, og der opvarmes i 30 minutter til 70°C. Derefter får opløsningen lov til at køle af, blandes med 10 ml 0,1 M magnesiumsulfatopløsning og centrifugeres fra. Den ovenpå svømmende væske (13 ml) indeholder den samlede choleste= rolmængde i fri form. Forsæbningen af forestret cholesterol med leveresterase eller chole= sterolesterase sker ved 30 minutters inkubation af det pågældende serum ved 37°C og pH 6-8. Eksempel 5 0. 2.ml serum sættes til 2,5 ml 0,5 M natriumphosphatpuffer, pH 7,5, med 0,4% hydroxypolyethoxydodecan. Ekstinktionen (E^) aflæses ved 240 nm i et egnet spektralfotometer, og reaktionen sættes i gang med 0,02 ml (= 1,5 U) cholesteroloxidase. Efter 2 minutter aflæses ekstinktionen (E^) påny. Koncentrationen af den dannede cholestenon og dermed af cholesterol fremgår af forskellen mellem den første og anden aflæsning under hensyntagen til den molære ekstinktionskoefficient for cholestenon ved 240 nm. Målingen for typisk prøve viste 58 mg% frit cholesterol og et samlet cholesterolindhold på 163 mg% (efter forsæbning). Sammenligningsbestemmelsen ifølge Liebermann-Burchard viste et samlet cholesterolindhold på 173 mg%. Patentkrav .

9. Reagens ifølge krav 8, kendetegnet ved, at systemet til bestemmelse af består Catalase, en β-diketon, en lavere ali- fatisk alkohol, især methanol, og puffer.

10. Reagens ifølge krav 8, kendetetegnet ved, at systemet til bestemmelse af H2®2 består peroxidase, kromogen og puffer.

11. Reagens ifølge krav 8, kendetegnet ved, at systemet til bestemmelse af cholestenon består af et med ketogrupper reagerende derivat, især 2,4-dinitrophenylhydrazin.

12. Reagens ifølge krav 9, kendetegnet ved, at det inde- 4 “5 holder 13-150 U cholesteroloxidase samt 2*10 - 5*10 U katalase, 0,05-0,2 ml acetylacetone, 2-10 ml methanol i 100 ml ammoniumion-holdig puffer, pH 5-7, samt 0,02-0,3 ml af et overfladeaktivt middel.

13. Reagens ifølge krav 10, kendetegnet ved, at det inde-