JPS62275700A - 血清中のコレステリンを測定するための試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はｉｉ離及びエステル化されたコレステリンの酵
素定量に使用する方法に関する。

コレステリンの定量は医学的な診断法にとって非常に重
要である。増加したコレステリン血中膿度は動脈硬化症
の重要な危険因子である。コレステリン値の高い場合、
′すなわち高コレステリン血症の場合には、コレステリ
ン値の低い場合よりも頻繁に冠機能不全及び心臓梗塞が
起きる。高コレステリン血症は動脈硬化症及び冠状動Ｉ
Ｉｉ、疾患を惹起しやすい。従って治療を適正時に開始
するためには、早期に発見しなければならない。高いコ
レステリン値は真性糖尿病、不フローゼ症候群、甲状腺
機能減弱及び肝疾患、例えば胆汁肝硬変の場合にもしば
しば見出される。

４′−知で右１ｈ？「フレステ１１ン宇悟１↓を寸ｒ１
−べＩしマソーゴ＋Ｌヒアルト（Ｌｌｅｂｅｒｍａｎｎ
　ｕｎｄ　Ｂｕｒｃｂａｒｄ　）の反応に基づいている
。この方法によると、Ｆｉｓのフレステリンおよびエス
テル化コレステリンが無水酢酸および濃硫酸と青−緑色
に着色した化合物を形成し、この濃淡が分光光度計で測
定されている。

この公知方法の重大な欠点を有する。その主要な欠点は
その方法が非特異的である点にある。リーベルマン番プ
ルヒアルトの反応は、コレステリン以外のステロイドに
よっても起きる比較的非特異的なステロイド反応である
。例えば血漿中には他のステロイドと共に、なお１〜３
９Ａのジヒドロコレステリン及び０．５〜１．４％のΔ
７−コレスチノールも存在するので、大きな誤差が生じ
る。その上、該反応はビリルビン及びヘモグロビンによ
って障たげられ、結果、不当に高いプラスのコレステリ
ン値が得られる。その他の欠点は、攻撃的で腐蝕性の試
薬を使用して操作しなくてはならないという点に存する
。

前記の欠点を打せず、かつ特にコレステリンに対し絶対
的に特異的であり、腐蝕的な試薬を必要としない新規コ
レステリン定量法は、既にコレステノンを水媒体中でコ
レステリンオキンタ′−ゼと共に恒温に保持し、かつ酸
素消費量又は生成したＨ２０２又はコレステノンを定量
することから成るコレステリン定量法により解決されて
いる。

コレステリンオキノダーゼは次の反応を接触する新規酵
素である： この反応は定量的に進行し、絶対的に特異で、かつ正確
なコレステリンの定量を可能ならしめる。

本発明の方法は、血清中のコレステリンの定量に好適で
ある。周知の如くエステル化された形で存在する結合型
フレステリンも前辺って化学的もしくは酵素的にケン化
することによて定量することができる。例えば化学的ケ
ン化はアルコール性苛性カリ溶液によって、酵素的ケン
化はエステラーゼ、有利には肝臓又は膵臓からのコレス
テリンエステラーゼによって行われる。

前記一般式による、Ｈ２０２生成量又はコレステノン生
成量の測定はその為に公知かつ常用の方法により行うこ
とができる。

即ち、生成した過酸化水素は、滴定並びに電位差滴定、
ポーラログラフイー及び比色並びに酵素法により定量す
ることができる。カタラーゼ又はベルオキンダーゼを使
用する酵素法が何列である。該方法は単に非常に特異的
でかつ確実であるのみならず、極めて而単に過酸化水素
の生成下に主反応上組合わせることができるからである
。特にβ−ソノケトン類例えばアセチルアセト二ノ及び
低級脂肪族の１価又は多価アルコール、例えばメタノー
ル、エタノール又はメチレングリコールの存在下でのカ
タラーゼによる測定並びに発色体の存在下でのベルオキ
ングーゼによる測定が特に適当であると判明した。カタ
ラーゼ、アセチルアセト／及びメタノールを用いる測定
の際に、メタノールはホルムアルデヒドに酸化され、こ
のホルムアルデヒドはアセチルアセトンと共に呈色反応
を生じ、この呈色反応をｆｌｌ＋定することができる。

ベルオキングーゼによる測定の際には、反応後に光度測
定法で測定することのできる化合物を発色体として使用
する。適当な発色体の例は２，２′−アミ／ベンズチア
ゾリンスルホン酸である。

コレステノンの測定はケト試薬、有利にはヒドラゾン生
成下にケト基と反応するヒドラノン誘導体、例えハ２．
４−ジニトロフェニルヒドラジンを用いて実施する。し
がしながら、コレステノンを直接、２４０ｎｍにおける
吸収の測定によって測定することもできる。

本発明のコレステリンオキンターゼ及びＨ２０２ル１定
用の系又はフレステノン測定用の系から成るコレステリ
ン測定試薬の第一の有利な実施例において、該試薬はコ
レステリンオキ／ダーゼ、カタラーゼ、アセチルアセト
ン、メタノール及びアンモニウムイオン含有の緩衝液（
単独又は混合して）から構成されている。もう１つの有
利な実施例においては、試薬はコレステリンオキ／ダー
ゼ、ベルオ千７り−ゼ、発色体及び緩衝液（＋４！独又
は混合して）から構成されている。発色体としては２．
２′−アミノベンズチアゾリンスルホン酸がを利である
。

その他の有利な例によれば、本発明による方法はコレス
テリンオキングーゼ及びヒドラゾン生成下にケト基と反
応するヒドラジン誘導体及び場合により緩衝液から構成
されている試薬を用いて実施される。ヒドラジン誘導体
としては２．４−ジニトロフェニルヒドラジンが有利で
ある。

有利には、前記の試薬組合せは記載した必須成分の他に
付加的に常用の溶剤、安定剤及び表面活性物質を含有す
る前記のを利な試薬組合せは主成分を次の量比で含佇す
る。

１、ｐＨ５〜７のアンモニウムイオン含臀ｍ衝液１００
　ｍｉ中にコレステリンオキシダーゼ１３〜１５０単位
並びに市販のカタラーゼ２．１０４〜５．１０”’　単
位、アセチルアセトン０．０５〜０．２腸１及びメタノ
ール２〜１０ｍｌ、並びに界面活性剤（有利にはヒドロ
キンポリニドキンドデカン）０．０２〜０．３履１０ ２、ｐＨ６〜８の緩衝液１００１中にコレステノンオキ
ン０〜１．１０　単位、２１２′−アミノベンズチアゾ
リンスルホン酸５０〜２００ｍｇｆびに界面活性剤（イ
ｆ利にはヒドロキンポリエトキンドデカン）０．０５〜
０．　５ｍｌ。

３、フレステリンオキ７ダーゼｏ、　　ｉ〜１単位、２
，４−ノニトロフエルヒドラノンの１ｍＭ溶液１〜５ｍ
ｆ及び場合により界面活性剤０．００５〜０．１１゜４
、ｐＨ５〜９の緩衝液、有利にはｐＨ７，５の０．５Ｍ
燐酸ナトリウム緩衝液５０１中にコレステリンオキ／ダ
ーゼ２〜１００単位韮びに界面活性剤（有利にはヒドロ
キノポリエトキンドデカン）ｏ、１〜２０ｍ１゜次に本
発明を実施例につき説明する。

参五斑−１ Ｈ２Ｏ２の定量 燐酸水素アンモニウム１０ｇを水１００曹１に溶解し８
５％燐ＭでｐＨ７，０に調整する。次いでカタラーゼ１
ｏ５！１１位を添加する。こうして得た溶液で、アセチ
ルアセトン０．２ｍＲ：メタ／−ルｌｏｍ＋との混合物
を全ｆｆｉ　１００ｉ＋ｌ１１ｍする。

こうして得た溶液７．５１を血ｉｎ０．５厘ｌ又は２０
０膓ｇ％コレステリン含分を仔するコレステリン標準溶
液０．５１と混合する。血清含有試料及びコレステリフ
標準液含佇試料の少量に各々フレステリンオキ７グーゼ
５単位及びｌＯ％ヒドロキ７ポリエトキンドデヵン溶液
０．０２ｍ１を加え、７０分間３７゛ｃで恒温保持する
。

次いで生成した色素を、試薬盲検値を考慮して４０５ｎ
ｍで光度計により測定する。コレステリン標準溶液を用
いて校正線図を作成、これを図面の第１図に示した。校
正線図ではフレステリン濃度が４０５ｎｍにおける吸光
に対してプロ、トされている。

＋ｆ＋＋清含仔試料のコレステノンｙ５度を、２′準ｍ
として標マ液を使用して測定する。リーベルマン・ブル
ヒアルトによる対照値は約５％の偏差を生じた。

尼し Ｈ２０２の定量 １００ｍｇＶｏの２．２′−アミノベンズチアゾリンス
ルポン酸を含打するｐＨ７の燐酸カリウム緩衝液（０２
ｒ！Ａ和）３１に２０％０％ヒドロキシポリエトキンド
デカン０５＊１及び市販のベルオキンダーゼ溶液０．０
２ｍ１　（＝３６単位）及び還元性物質を除去するため
にＨ２０２０，０２ｍ１　（水１００ｍｌニ対シ３０　
（容ｆｆｌ／容り　％（７）Ｈ２０２０，０２謬１）を
加える。この混合物を光度計で４０３ｎｍ又は４３６ｒ
＋ｍで追跡した。反応が静止したら直ちに血清０．０１
■１（水で１：１５に希釈）を加える。１０分後にコレ
ステリンオキ／ダーゼ０．１５単位を加える。更に１０
分後に吸光度差を読みとる。

同様にして、但し２００■ｇ％の含分を仔するコレステ
リン標準溶液を使用し４３［ｉ　ｎ＋ｍで第２図に示し
た校正線を作成した。この校正線を用いて、血清試料の
フレステリン１０度を一１定する。測定により１８０■
ｇ％のコレステリンフ農度が判明シた。リーベルマンφ
ブルヒアルトによる対照値は１８５＋ｗｇ％であった。

丈施虜−上 コレステリンの定量 血清（水で１：１０に希釈）０．２鵬ｌに２０％ヒドロ
キ／ポリエトキンドデカン溶液０．０５ｍ１及びコレス
テリンオキソダーゼ０，１５単位を加える。１５分後に
、ＩＮＮ塩中中２，４−ノニトロフエルヒドラシン１ミ
リモルを含何する溶液２．０１を添加する。更に３０分
後に水４８０１を加え、生成したヒドラゾンを光度計で
４０５ｎｍで測定する。評価は試薬盲検値を考慮して基
準線について行なう。測定はアルカリの添加後に５４６
ｎｍでも行うことができる。

代表的試料の測定により遊離コレステノン６０■ｇ％及
び全コレステリン（アルコール性ＫＯ，Ｈによってケン
化）１５４ｍｇ％が得られた。

リーベルマン番プルヒアルトの比較定量では全コレステ
リン１７０ｍｇ％が得られた。

エステル化されたコレステリンをケン化するために（血
清中の全コレステリンの測定）、血清１ｍｌ、２０％ヒ
ドロキ／ポリエトキシドデカン溶液１羨ｌ及び９０％エ
タ、ノール中の０．５Ｎ　　ＫＯＨ５層ｌを混合し３０
分間７０’Ｃに加熱する。次いで溶液を冷却し、０．１
Ｍ硫酸マグネシウム溶液１０ｍｌと混合しかつ遠心分離
する。上澄液（１３■ｌ）全コレステリンを遊離型で含
佇する。

肝エステラーゼ又はコレステリンエステラーゼによりエ
ステル化されたコレステリンのケン化は、３７°Ｃでｐ
Ｈ６〜８で血清を３０分間恒温で保持して行なう。

夫胤医−２ ０，４％ヒドロキシポリエトキンドデカンを存するｐＨ
７，５の０．５Ｍ燐酸ナトｊＪウム緩衝液２．５騰Ｉを
加える。

適当な分光光度計で２４０　ｎｍにおける吸光度（Ｅｌ
）を読みとり、コレステリンオキングーゼ０．０２ｍ１
　（＝Ｌ５Ｕ）で反応を開始する。２分後にもう一度吸
光度（Ｅｌ）を読みとる。生成したフレステリンエステ
リンの濃度及び従ってフレステノンの濃度は、２４０　
ｎｍにおけるコレステリンのモル吸光係数を考慮して１
回目の読みとりと２回目の読みとりとの差から得られる
。

代表的試料の測定により遊離フレステリン５８１ｇ％及
び全コレステリン（ケン化により）１６３■ｇ％が得ら
れた。

リーベルマン・ブルヒアルトの比較測定で、全コレステ
リン１７ｆ３ｍｇ％が得られた。

実施例−１ 血清０．０５厘１を、ヒドロキシポリエトキシドデカン
０゜５％を含打する０、５Ｍ燐酸酸カリウムー緩衝液（
ｐＨ７゜５）１０ｍｌ中に加える。適当な分光光度計で
２４０ｎｍでの吸光度（Ｅｌ）を読み、１Ｍ硫酸アンモ
ニウム溶液中の貯蔵安定で、痕跡量の界面活性剤も含ま
ないコレステリンオキンダーゼ０．０２ｍ１．（＝Ｏ，
ＩＵ）で反応を開始させる。３分後に改めて吸光度（Ｅ
ｌ）を読む。最初の読みと２度目の読みとの差から１２
４０　　ｎｍでのコレステノンに関するモル吸光係数を
考慮に入れると、生じたフレステリンの１Ω度が得られ
る。典型的な資料の測定で、遊離のフレステリン６２粍
％及び全コレステリン（鹸化後の）１６７履ｇ％が得ら
れた。

界面活性剤を添加しない比較測定は、１５分の反応時間
を必要とした。

【図面の簡単な説明】

添付図面の第１図および第２図はコレステリン標準溶液
を用いて制作した吸光度とフレステリン濃度との関係を
示す校正線図である。 手続補正書（自発） 昭和６１４ドア月７日

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）血清又は血しょう中のコレステリンエステルを、
   先ず第一工程でコレステリンエステラーゼにより鹸化し
   、次いで得られたコレステリンを第２工程でコレステリ
   ンオキシダーゼと自体公知の方法で反応することにより
   定量すること、その際、テスト溶液に対し０．３％ない
   し４％の界面活性剤の存在下で行うことを特徴とする血
   清又は血しょう中のコレステリン測定方法