JPS6225040B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は総コレステロール測定用安定化酵素溶
液及びその製法に関する。

コレステロールは一部は遊離した形で、一部は
コレステロールエステルのような結合状態で血清
などのような生物学的物質中に存在する。総コレ
ステロールを測定するにはコレステロールエステ
ルの形で結合しているコレステロールを遊離させ
ねばならない。従来は例えばアルコールカリ溶液
を利用してコレステロールエステルをアルカリ条
件下で鹸化することにより結合コレステロールの
遊離が行われた。この場合、鹸化後、遊離したコ
レステロールを公知の方法で化学的または酵素的
に測定することができる。化学的測定は例えばリ
ーベルマンーブルヒアルト法によつて行うことが
でき、酵素的測定はコレステロールオキシダー
ゼ、コレステロールエステラーゼまたはコレステ
ロールデヒドラーゼを利用することによつて行う
ことができる。

結合コレステロールのアルカリ鹸化は総コレス
テロール測定のプロセス中では煩雑な且つ時間の
かかる段階である。しかも、比較的作用の強い試
薬が使用されるから、コレステロールの分解を招
くおそれがある。このような分解を阻止すると共
に誤つた及び／または不正確な分析結果が得られ
るのを防止するため、比較的おだやかな条件下で
加水分解を行わねばならない。従つて、コレステ
ロール測定に要する時間がそれだけ長くなり、不
都合である。コレステロール測定を好ましい酵素
法によつて行うとすれば、アルカリによる結合コ
レステロールの遊離処理は特に不利である。酵素
は強アルカリ媒質中で不活性であるから、酵素法
測定を開始する前に、水解物に酸を添加して約５
乃至８のPHに中和しなければならない。このよう
な余分な段階が必要であるから、総コレステロー
ル測定全体に要する時間が更に長くなる。

コレステロールエステル中のエステル結合を破
壊する酵素であるコレステロールエステラーゼの
作用で結合コレステロールを遊離させ得ることも
公知である。このコレステロールエステラーゼは
初期に於いては豚のすい臓やラツトのすい液のよ
うな動物性供給源から分離された。コレステロー
ルエステラーゼがすい臓中に見出されるだけでは
なく、肝臓中に見出すことができることも公知で
ある。

アラン等は豚のすい臓及びラツトのすい液から
分泌されたコレステロールエステラーゼを利用し
て血清中の総コレステロールを測定するための酵
素法を記述している〔“クリニカル・ケミストリ
ー”20（1974），470−475〕。アラン等の方法では
コレステロールエステラーゼ（コレステロールエ
ステルヒドラーゼ）によりエステル化コレステロ
ールを遊離処理した。処理の結果得られた遊離コ
レステロールをコレステロールオキシダーゼで処
理することによりコレステノン及び過酸化水素を
形成した、この過酸化水素を分光測光法を利用し
て定量測定した。過酸化水素がペルオキシダーゼ
の存在に於いて４−アミノアンチピリン及びフエ
ノールと反応してキノンイミン染料を形成する。
アラン等は緩衝水溶液を利用してコレステロール
測定を実施した、コレステロールエステラーゼは
一般に水溶液中で不安定な公知の不安定化合物で
ある。アラン等は彼らの方法に使用された酵素溶
液が不安定であり、室温（25℃）では８時間、低
温（４℃）では24時間が安定維持限界であると述
べている。

ボーシヤン等の米国特許第3925164号も血清中
の総コレステロールを測定する酵素測定法を開示
している。この方法は血清サンプルをコレステロ
ールエステラーゼで処理することにより結合コレ
ステロールを遊離させる。次いで公知の方法で総
コレステロールを測定する。この方法では動物性
供給源から調製したコレステロールエステラーゼ
を使用せず、微生物から調製したコレステロール
エステラーゼを使用する。この特許は動物性供給
源から得られたコレステロールエステラーゼの場
合分解速度が定量的でないから、定量分析プロセ
スに於いてコレステロールエステルを完全に鹸化
するという点で微生物から得られるコレステロー
ルエステラーゼの方が動物性供給源から得られる
コレステロールエステラーゼよりも好ましいと述
べている。また、生物学的物質中では結合コレス
テロールが多様な種類の酸の形で存在する。定量
分析プロセスに於いて酵素法が有用であるために
は、含有されるあらゆるタイプのエステルがほぼ
同じ速度で且つ同じ確実性で定量的に分解するこ
とが必要である。公知の動物性コレステロールエ
ステラーゼの多くは夫々特定のコレステロールエ
ステルに固有の効果を示す傾向がある。このよう
な動物性コレステロールエステラーゼの作用がコ
レステロールエステルの種類に応じて異なること
は公知である。

微生物から調製されたコレステロールエステラ
ーゼは動物性供給源から調製されたものよりも好
ましいが、この微生物から得られるコレステロー
ルエステラーゼも溶液、特に水溶液中で化学変化
し易い不安定な化合物であり、この化学変化が酵
素作用を低下させる。経時的に行われる個々の測
定にむらのない正確な分析方法を提供するには診
断測定に使用される酵素溶液が安定でなければな
らない。酵素溶液が不安定であれば、測定の再現
性が得られないだけでなく、不安定な酵素溶液は
廃棄して新鮮な溶液を調製しなければならないか
ら医療コストを増大させることになる。

最近の報告によれば、米国で１年間に行われる
診断のための試験管テストの約25％は不確なもの
であるといわれる。テストが不確実であれば、不
必要な医療を実施して必要な医療を差し控える結
果となり、収入の損失にもつながる。極立つた特
殊性のため、酵素測定の利用は近年著しく増大
し、この傾向は今後も続くと考えられる。しか
し、正確な、一貫性のある測定結果を得るには厳
しい品質管理が要求される。このような条件が課
せられるのも酵素の正確な性質、酵素反応のメカ
ニズムの大部分が解明されていないからである。

現在のところ、診断用試薬の製造に於ける最大
の制約は酵素溶液の不安定な特性にある。現在の
コレステロール診断方法では微生物から得たもの
を利用するにしても動物性供給源から得たものを
利用するにしても不安定な酵素成分を使用せざる
を得ない。酵素が不安定であるから、この種の酵
素溶液の製造、調合用乾燥媒質の調製、この種の
酵素溶液の処分には厳しい品質管理が要求され
る。このような品質管理は多大のコストを伴な
う。また、プロセス中のいずれかの段階に於ける
品質管理を高度の管理基準以内に維持しないと、
最終製品の品質が著しく低下し、測定結果の精度
低下につながるおそれがある。

酵素または補酵素の反応能力を安定化する公知
の商業的技術では酵素または補酵素を固形マトリ
ツクス中に固定するか、主として製薬業界で乾燥
粉末の錠剤化に際して行うように凍結乾燥、乾式
混合してから酵素の化学構造を固形マトリツクス
中に固定する。この公知技術はいかにも手の込ん
だ技術であるかのようであるが実用的でなく、好
ましくもなく、経済性にも問題がある。メーカー
は脱水を義務づけられ、半完成製品を供給するこ
とになるから、希釈段階及び最終製品使用段階に
於ける品質管理を放棄せざるを得ない。一方、測
定を行う側はパツケージング、試薬空費、凍結乾
燥及び乾式混合に要する少なからぬコストを負担
させられる。製品の有用性はパツケージの態様及
びサイズによつても制限される。

特に製品を診断のための測定に利用する試験施
設では製品の一様性を得るのが困難である。この
ことは市販されている凍結乾燥対照血清（基準血
清）の多くが各容器の酵素成分許容誤差を平均±
10％であると表示していることからも明らかであ
る。

本発明は液状試薬中に不安定成分を含有するに
も拘らず、酵素溶液を有効に“安定化する”こと
により、溶液中の不安定成分の作用を制御するも
のである。安定化手段により液状媒質中での長期
間の安定性を確保できる。また、高品質製品の製
造過程で厳密な耐性制御が可能であるから、かさ
張るパツケージを避けることができ、パツケー
ジ、凍結乾燥及び試薬空費の大きいコストを節減
することができる。

血清中の総コレステロール測定に有用な不安定
酵素に本発明の処理を施すことにより、酵素の作
用または測光時の吸収能に悪影響を及ぼすことな
く長期間に亘る安定性が得られる。本発明は製
造、パツケージング、貯蔵及び使用時を通じて品
質管理を維持できる試薬を提供する。かさ張るパ
ツケージの不便さがパツケージング、凍結乾燥及
び試薬空費に伴なう高いコストと共に解消され
る。ここに述べる総コレステロール測定用の液状
酵素系は総コレステロール測定に必要な融通性を
提供する。本発明の安定化された酵素を、この安
定酵素の溶液を新鮮な試薬と比較することで評価
した結果、時間を経た液も新鮮な試薬も同様な感
度及び精度を具えることが判明した。このような
試薬を安定な液体の形で提供することで、分光測
光式測定法に於ける呈色を強めるだけでなく、非
呈色式測定法の能率をも高めることができる。総
コレステロール測定用の安定液状酵素は酸素消費
及び／または過酸化水素生成及び消費に基づいて
測定が行われる場合特に有利である。本発明の液
体系は従来の凍結乾燥または乾式媒質タイプのも
のに比較して試薬均質性、パツケージング、融通
性及び使用法の点でも有利である。

診断のためのコレステロール測定に於いて、調
合済液状媒質中の不安定な成分、特にコレステロ
ールエステラーゼを安定化するのは臨床検査施設
の需要及び信頼性に関する規制当局の要望を満た
すための新規のアプローチである。本発明の液体
系は融通性に優れ、手動検査だけでなく自動測定
にも応用できる。

血清中の総コレステロール測定用酵素の安定化
を、本発明ではPHを約４乃至約９の範囲内に維持
できる緩衝液にコール酸金属塩と、コレステロー
ルエステラーゼと、コレステロールオキシダーゼ
と共に、安定化酵素溶液の2.5容積％までの界面
活性剤及び同溶液の少なくとも7.5容積％のポリ
ヒドロキシ有機化合物を含有させることによつて
達成する。緩衝液に溶解したコール酸ナトリウム
にコレステロールエステラーゼを添加する。この
混合物を充分に混ぜ合わす。次いでトライトン−
Ｘ−100（TRITON−Ｘ−100）及びグリセリン
を添加する。緩衝液の別の部分にコレステロール
オキシダーゼを溶解し、前記混合物に添加する。
緩衝液の更に別の部分にペルオキシダーゼを溶解
して前記混合物に添加する。次いで４−アミノア
ンチピリンを前記混合物に導入し、溶解する。得
られた酵素溶液は貯蔵及び以後の使用に備えて適
当な瓶に配分すればよい。このように瓶詰めした
溶液の予想される貯蔵寿命は約２年乃至約３年で
ある。

上記酵素溶液は呈色希釈分と組合わせて総コレ
ステロール測定に使用される。この希釈溶液は総
コレステロール測定に有用な適当な呈色剤を含有
している。トライトン−Ｘ−100をフエノール及
び水と組合わせることで適当な呈色希釈溶液を調
製することができる。水は呈色希釈分のPHを上記
酵素溶液と同じ範囲、例えば約６乃至約８の範囲
に維持する緩衝液の形で提供すればよい。上記酵
素溶液を呈色希釈分と組合わせて得た溶液はその
まま総コレステロール測定に使用することができ
る。この組合わせ溶液の貯蔵寿命は冷却条件下で
約１年である。当然のことながら、総コレステロ
ール測定を比色計以外の手段で行う場合、呈色希
釈液を使用する必要はない。酸素消費量分析に基
づく測定法では上記酵素溶液を水で薄めるだけで
よく、ペルオキシダーゼを添加する必要もない。

本発明のその他の構成要件及び派生的利点は以
下の詳細な説明から明らかになるであろう。

本発明の方法及び安定溶液は臨床検査の分野で
血清中の総コレステロール測定に利用できる。下
記の一連の化学反応は本発明の安定溶液を利用す
る総コレステロール測定方法の原理を裏づけるも
のである。

（） コレステロールエステル コレステロールエステラーゼ H₂O コレステロール＋脂肪酸 （） コレステロール＋O₂ コレステロールオキシダーゼ コレスト−４−エン−３−オン＋H₂O₂ 上記反応式で表わされるコレステロール測定方
法ではコレステロールエステル結合がコレステロ
ールエステラーゼにより分解されて遊離コレステ
ロール及び適当な脂肪酸を形成する。次いでコレ
ステロールオキシダーゼの存在に於いてコレステ
ロールが酸素と反応してケトンのコレスト−４−
エン−３−オン及び過酸化水素を形成する。血清
サンプル中に存在するコレステロールを定量する
ために開発されたのが上記反応式（）である。
一般に、コレステロールの定量は過酸化水素生成
または酸素消費を測定することによつて行うこと
ができる。

過酸化水素生成を利用する場合、過酸化水素と
反応して呈色体を形成する呈色剤を使用するのが
普通であり、この呈色は分光測定分析によつて定
量的に測定することができる。本発明の安定酵素
溶液を利用する特に好ましい過酸化水素生成測定
方法はペルオキシダーゼの存在に於いて過酸化水
素と反応することにより下記の反応式に従つて呈
色体を形成するフエノール及び４−アミノアンチ
ピリンを使用する。

生成する呈色体は500nmに最大吸収帯を持つ。
こ の波長に於ける吸光度が過酸化水素生成量を表わ
し、この生成量を化学量論的計算により初期コレ
ステロール存在量に相関させることができる。

酸素消費の測定に基づいてコレステロール分析
を行う場合には酸素消費量を総コレステロール濃
度に関連させる計器によつて酸素消費量を測定す
ればよい。酸度消費量は比色計で測定することも
できるが、酸素電極を利用して測定することもで
きる。酸素電極を利用する酸素消費量測定器はベ
ツクマン・インスツルメンツ・インコーポレイテ
ツドからコレステロールアナライザー２の商品名
で市販されている。酸素電極はサンプル／試薬溶
液中に浸漬され、この溶液中の酸素濃度に応答す
る。酸素電極は隔膜を通して陰極へ向かう酸素拡
散によつて制限される電流を測定するという点で
は一種のポーラログラフ電極である。隔膜と陰極
の間に、安定した一定厚さの電解質ゲルが維持さ
れている。隔膜を通して拡散する酸素の量は溶液
中の酸素濃度に比例する。連携の電子回路が電極
出力信号を微分して、酸素消費量に比例する従つ
て、コレステロール濃度に比例する信号を提供す
る。酸素消費量分析はコレステロール濃度を測定
し且つ直接その数値を表示することのできる計器
が市販されているという点で有利である。この方
法はまた、呈色反応を必要とせず、血清サンプル
中の他の着色物質の存在または過酸化水素と反応
する還元物質の存在から発生するおそれがある呈
色剤との干渉を未然に避けられることができる。

本発明の安定酵素溶液は呈色反応（分光測定）
に基づく総コレステロール測定にも酸素消費量に
基づく総コレステロール測定にも応用できる。本
発明の安定溶液を分光測定方式による分析に使用
する場合、酵素溶液は２つの別々の試薬として、
または１つの濃縮液として調製することができ
る。２試薬系として調製するなら、第１試薬、即
ち、酵素濃縮液はカツプリングして呈色体を形成
する１つの化合物に酵素、即ち、コレステロール
エステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ及び
ペルオキシダーゼを組合わせて成る安定溶液であ
る。第２試薬、即ち、呈色体は第１試薬の希釈剤
でもあり、過酸化水素及びペルオキシダーゼの存
在に於いて第１試薬とカツプリングして呈色する
第２化合物から成る。これら２つの別々の試薬を
組合わせることで血清中のコレステロール濃度を
測定する。両試薬を組合わせない状態で、第１試
薬（濃縮液）は室温で約６箇月乃至１年間、冷却
下で（〜４℃）２乃至３年間の安定性を有し、本
質的に非劣化性の第２試薬（呈色体）は第１試薬
よりもはるかに長い安定性を具える。両者を組合
わせても、この組合わせで得られる混合物の安定
性は公知溶液よりはるかに優れ、冷却下で約６乃
至約12箇月、室温で約２乃至３箇月、約37℃で約
１週間、約41℃で約24時間以内である。コレステ
ロール測定を酸素消費量に基づいて行う場合、測
定が呈色反応に基づいて行われるのではないから
酵素溶液は１種類だけでよい。即ち、酸素消費量
に基づく測定方法に使用される酵素溶液は分光測
定による測定方法に関連して述べた第１試薬（濃
縮液）に似た溶液であり、酵素としてコレステロ
ールエステラーゼ及びコレステロールオキシダー
ゼを含有する安定溶液である。この安定溶液は使
用に先立つて水で薄めてもよいが、そのまま使用
できるように希釈された状態で市販することも可
能である。

経験に照らして、下記の方法に従つて調製すれ
ば本発明の酵素溶液は高い精度のコレステロール
分析を可能にするに充分な作用を発揮する。

尚、説明の便宜上、夫々の測定方法と関連させ
ながらこれに使用する安定溶液を説明する。

本発明の試薬を調製するのに使用される緩衝液
は試薬のPHを約４乃至約９の範囲に維持すること
のできる緩衝液である。好ましい緩衝液は第一燐
酸カリウムを水に溶解し、上記範囲内の所望のPH
を得るため水酸化ナトリウムを添加することによ
つて調製する。このように調製される緩衝液にと
つて特に好ましいPHは約6.60である。適当なPH値
を提供するだけでなく、酵素作用またはコレステ
ロール測定中に発生する反応を妨げるおそれが殆
どない緩衝液を選択する。上記第一燐酸カリウム
を含有する緩衝液は望ましいPH値を提供すると共
に、コレステロール測定中に発生する酵素反応を
妨げないから特に好ましい。

血清サンプルを分光測定に基づいて分析する際
にはPHが約４乃至約９の緩衝液にコレステロール
エステラーゼを溶解することによつて酵素含有試
薬を調製する。コレステロールエステラーゼの緩
衝液への溶解を助けると共に、コレステロールエ
ステルを含有するサンプル中のリポ蛋白質の分解
を助けるため、コール酸ナトリウムを添加する。
コール酸の例えばアルカリ金属塩のどのような金
属塩を使用することもできるが、入手し易く、し
かも溶液中にナトリウムイオンが存在しても溶液
自体やコレステロール分析に悪影響を及ぼさない
から、ナトリウム塩が好ましい、コレステロール
エステラーゼと緩衝液との混合物にコール酸ナト
リウムを添加することでコレステロールエステラ
ーゼ及び更に添加される他の酵素を活性化し、得
られる酵素溶液の安定化を助け、血清サンプル中
に存在するリポ蛋白質を分解することができる。
コール酸ナトリウムは市販されており、市販のコ
ール酸ナトリウムは本発明の溶液に使用しても差
支えないが、市販のコール酸ナトリウムは酵素の
作用を妨げ、形成される呈色体の吸光度を低下さ
せるおそれもある不純物を含有している。従つ
て、酵素溶液の調製に際しては少量のコール酸ナ
トリウムを使用することが望ましい。例えば、酵
素溶液の最終容積150mlにつき約2.25ｇ以下、好
ましくは0.750ｇのコール酸ナトリウムを使用す
る。この程度の量ならばコール酸ナトリウムが酵
素の作用を著しく阻害することはない。

コレステロールエステラーゼはいかなるタイプ
のものでもよいが、微生物から製造されたものが
好ましい。微生物を原料とするコレステロールエ
ステラーゼが好ましいのは測定媒質中での安定性
と活性が動物性供給源から調製されたものよりも
優れているからである。また、動物性供給源から
得られるコレステロールエステラーゼは一般にプ
ロテアーゼが混ざつており、このプロテアーゼは
コレステロール測定に使用されるコレステロール
オキシダーゼと反応してこれを破壊し、コレステ
ロールオキシダーゼがコレステロールと反応して
コレステノンを形成するという反応を不可能にす
ることからも微生物を原料とするコレステロール
エステラーゼの方が好ましい。好ましいコレステ
ロールエステラーゼはシユードモナス属フルオレ
ツセンス（pseudomonas fluorescens）から製造
されたコレステロールエステラーゼであり、具体
的には協和醗酵工業株式会社から市販されている
シユードモナス属フルオレツセンスATCC21156
から得られる。

酵素溶液に所望の活性を与える量である限りコ
レステロールエステラーゼの使用量は任意であ
る。ここにいうコレステロールエステラーゼの必
要量とは、約37℃の温度で約10分でコレステロー
ルエステルの逆エステル化を完了させるに充分な
作用を最終酵素溶液に与えるような量であり、具
体的には酵素濃縮液150mlにつき約150IUまたは
分光測定方式分析に使用する希釈溶液１につき
約1000IUであればよい。尚、コレステロールエ
ステラーゼはシユードモナス属フルオレツセンス
以外の微生物からも得られ、例えばボーシヤン等
の米国特許第3925614号に記載されているような
微生物からも得られる。

コレステロールエステラーゼ、コール酸ナトリ
ウム及び緩衝液を混合した後、この混合物を約24
時間に亘つて冷却条件下に置く。混合物を充分混
ぜ合わせて均質な不透明溶液を得る。この溶液に
エチレングリコール、プロピレングリコール、グ
リセリンのようなポリヒドロキシ化合物を添加す
る。酵素活性を妨げず、コレステロール分析に悪
影響を及ぼすこともない点でグリセリンが特に好
ましい。ポリヒドロキシ化合物の添加量は酵素溶
液容積の少なくとも7.5％であり、好ましくは7.5
乃至50容積％とする。これより少ないと安定化作
用が十分でない。これにより多くてもよいが、そ
の場合、酵素の活性を低下させてコレステロール
分析に要する時間を長くするおそれがある。ポリ
ヒドロキシ化合物の添加量が多過ぎると酵素溶液
の粘性を増大させて計器による分析を困難にする
おそれもある。

ポリヒドロキシ化合物のほかに、アルキルアリ
ールポリエーテルアルコールから成るトライトン
−Ｘ−100（ローム・アンド・ハース・カンパニ
ーの登録商標である製品名）を添加する。トライ
トン−Ｘ−100はイーストマン・コダツク・カン
パニー及びジエイ．テイー．ベーカー・ケミカ
ル・カンパニーから販売されている。トライトン
−Ｘ−100はCAS登録第9002−93−１号のポリエ
チレングリコール−Ｐ−イソオクチルフエニルエ
ーテルである。本発明の安定溶液用として市販の
トライトン−Ｘ−100を使用しても差支えない。
ジエイ．テイー．ベーカー・ケミカル・カンパニ
ーからLSCノン・イオニツク・サーフアクタン
ト・シントレツクス（LSC Non−Ionic
Surfactant Scintrex）の商品名で市販されてい
るシンチレーシヨン・グレードのトライトン−Ｘ
−100が特に好ましい。トライトン−Ｘ−100の適
正添加量は最終酵素溶液に対する容積比で2.5％
以下であるが、約0.5％以下が好ましい。トライ
トン−Ｘ−100の添加量が上記約0.5容積％を上回
つても構わないが、トライトン−Ｘ−100は界面
活性剤であるから、0.5％以上になると起泡が過
剰になるから好ましくない。一般にトライトン−
Ｘ−100を0.3容積％以上添加してもその活性が著
しく増大したり、コレステロール分析の進行速度
を著しく早めることにはならない。トライトン−
Ｘ−100は少なくとも約0.1容積％添加すればコレ
ステロールエステラーゼを活性化する。即ち、コ
レステロールエステラーゼの活性を増大させるこ
とができ、経験に照らしてシユードモナス属フル
オレツセンスを原料とするコレステロールエステ
ラーゼの活性はトライトン−Ｘ−100の添加量が
0.1容積％以下になると低下することが明らかに
なつた。ここで理論を主張する意図はないが、ト
ライトン−Ｘ−100の添加量が0.1容積％以上なら
ば生コレステロールエステラーゼの脂質が破壊さ
れることによりコレステロールエステラーゼが活
性化されるというのが出願人の想定するメカニズ
ムである。

ポリヒドロキシ化合物及びトライトン−Ｘ−
100を添加した後、コレステロールオキシダーゼ
をこの溶液に添加する。コレステロールオキシダ
ーゼはまず初めに緩衝液で溶解し、次にこの溶解
したコレステロールオキシダーゼを酵素溶液に添
加する。コレステロールオキシダーゼは微生物を
供給源とするものが好ましく、例えば動物を供給
源とする非微生物系のコレステロールオキシダー
ゼは上記コレステロール分析媒質中に於いてその
活性が著しく劣る。使用に適したコレステロール
オキシダーゼの供給源となり得る微生物はシユー
ドモナス属スプーリ（pseudomonas sp）、ノカ
ルジア属エリスロポリス（nocardia
erythropolis）及びブレビバクテリウム属ステロ
リクム（brevibacterium sterolicum）である。
これらの微生物を供給源とするコレステロールオ
キシダーゼは市販されており、本発明の溶液用と
してこれら市販のコレステロールオキシダーゼを
使用することができる。使用に適した酵素は上記
微生物から得られるが、酵素溶液中に於けるコレ
ステロールオキシダーゼの活性はコレステロール
オキシダーゼの供給源及び分析媒質のPHに依存す
る。本発明の酵素溶液に好ましいコレステロール
オキシダーゼの供給源はノカルジア属エリスロポ
リスである。このコレステロールオキシダーゼは
ホワツトマン・ケミカル・カンパニーから市販さ
れている。ノカルジア属エリスロポリスを供給源
とするコレステロールオキシダーゼが好ましいの
は５乃至約９のPH、好ましくは約６乃至約８のPH
に於いて最大活性を呈するからである。ノカルジ
ア属エリスロポリスから得られるコレステロール
オキシダーゼは本発明の酵素溶液中で特に安定で
あり、その活性を維持する。シユードモナス属ス
プーリから得られるコレステロールオキシダーゼ
は約５のPHに於いて最大活性を持つ。ブレビバク
テリウム属ステロリクムから得られるコレステロ
ールオキシダーゼは約６のPHに於いて最大活性を
持つ。コレステロールエステラーゼの場合と同様
に、コレステロールオキシダーゼも使用量は任意
であるが、経済的な理由から最少量のコレステロ
ールオキシダーゼを使用することが好ましい。コ
レステロールオキシダーゼの添加量が多くなると
反応速度が増大するから総コレステロール測定を
完了するのに必要な時間が短縮される。本発明溶
液の安定性という点で、酵素濃縮液に対して約
300乃至約1000IU／、好ましくは約500乃至約
750IU／のコレステロールオキシダーゼを添加
できることが実証されている。上記量のコレステ
ロールオキシダーゼは約37℃の温度でコレステロ
ール測定を約10分間で完結するのに充分である。

ペルオキシダーゼも緩衝溶液の一部に溶解し、
緩衝されている酵素溶液に添加する。西洋わさび
から得られるペルオキシダーゼは市販されてお
り、この市販のペルオキシダーゼを本発明溶液の
調製に使用することができる。この西洋わさびを
供給源とするペルオキシダーゼはベツクマン・イ
ンスツルメンツ・インコーポレイテツドから市販
されている。ペルオキシダーゼは比較的安価であ
るから、呈色体が瞬時に形成されるように充分な
量を使用することができる。形成される過酸化水
素が反応と殆ど同時にペルオキシダーゼによつて
消費され、過酸化水素の副反応が起こる余地が与
えられないように充分な量のペルオキシダーゼを
添加することが好ましい。このようにすれば全体
の反応式がコレステロール測定のために充分定量
的となる。一般に、酵素溶液150ml（最終試薬750
ml）につき約2.25乃至約45KUのペルオキシダー
ゼを添加すれば過酸化水素と瞬時反応させるに充
分である。

以上のように調製したコレステロールエステラ
ーゼ、コレステロールオキシダーゼ及びペルオキ
シダーゼを含有する酵素溶液に、ペルオキシダー
ゼ及び過酸化水素との反応を介して他方の化合物
とカツプリングして呈色体を形成し得る化合物を
添加する。酵素溶液にはカツプリング可能な一方
の化合物だけを添加する。酵素溶液に添加する好
ましい化合物は４−アミノアンチピリンである。
４−アミノアンチピリンは過酸化水素及びペルオ
キシダーゼの存在に於いてフエノールと結合して
キノンイミン染料を生成させることができる。４
−アミノアンチピリン添加量は全酵素溶液150ml
につき約22.5乃至約67.5mgである。経験に照らし
て、４−アミノアンチピリンはコレステロール分
析中酵素反応全体を抑制する一方、形成される呈
色体の色を不安定にする傾向を持つ。即ち、４−
アミノアンチピリンの使用量が多ければ多いほど
呈色体の色があせ、吸光度は500nmに於けるキノ
ンイミン染料のピーク吸光度に於いて増大する。
４−アミノアンチピリンの使用量を少なくすれば
最終色に対する悪影響は少なくなるが、好ましい
レベル以下になると、４−アミノアンチピリン量
が過酸化水素と化学量論的に反応するには不充分
となるから分析プロセスが適正に進行しない。

以上のように調製された酵素含有溶液は血清サ
ンプル中の総コレステロールを化学量論的に分析
するのに使用することができる。この溶液はコレ
ステロール測定に至る反応式を進行させる酵素を
含有するから酵素濃縮液と呼称する。経験に照ら
して、含有される酵素が冷却温度（約４℃）下で
約２年間、約室温に於いて約４箇月間その活性の
約90％を維持して安定である。

酵素濃縮液を総コレステロールの化学量論的分
析に使用する場合、４−アミノアンチピリン及び
過酸化水素と結合して定量可能な色を形成するこ
とのできる他方の化合物を含有する第２試薬と組
合わせる必要がある。この第２試薬はフエノール
及びトライトン−Ｘ−100を水に溶解することに
よつて形成する。上記反応式に従つてフエノール
が４−アミノアンチピリン及び過酸化水素と反応
することによりキノンイミン染料を生成させる。
第２試薬中のフエノール量は形成される過酸化水
素の瞬時反応を得るのに充分な量である。しか
し、フエノールは水性媒中の蛋白質を変化させる
傾向があるから、その濃度が高過ぎるのは望まし
くない。また、フエノールはコレステロールが存
在しなくても色を発生させる副反応を起こすこと
があり得るから、フエノール濃度が高いと（酵素
濃縮液及び第２試薬の）複合試薬の安定性に悪影
響を及ぼし易い。形成される第２試薬1.5に約
0.75乃至約2.25ｇのフエノール濃度が好ましい。
このフエノール濃度は経験上、比色分析を著しく
妨げたり、被処理血清中に存在する蛋白質を劣化
変性させたり、コレステロール分析用安定溶液に
その他の悪影響を与えたりすることなく、コレス
テロール分析中に形成される過酸化水素を瞬時反
応させるのに有効であることが判明している。

本発明の溶液に使用する水は脱イオン水及び／
または蒸溜水であることが好ましい。即ち、この
ような脱イオン水及び／または蒸溜水の使用は水
道水中に存在する可能性がある不純物による溶液
汚染を避ける上で好ましい。但し、発明者は水道
水を使用した場合にも正確な測定結果を得た。

比色分析及び分光測定分析を利用する総コレス
テロール分析測定では、血清サンプル分析を開始
する前に酵素濃縮液を第２試薬（呈色体形成試
薬）と組合わせる。即ち、分析測定に先立つて２
つの溶液を組合わせ、互いに充分に混ぜ合わせ
る。この複合溶液も公知コレステロール分析溶液
よりも優れた安定性を呈する。混合されたこの複
合溶液は冷却温度（２℃乃至８℃）下で約６乃至
約12箇月、室温で約２乃至３箇月、37℃で約１箇
月、41℃で約24時間の安定性を有する。混合され
た複合溶液の初期吸光度は通常約0.200以下であ
り、固形物を含有しない、やや赤味を帯びた透明
液である。複合溶液のPHは約４乃至約９、好まし
くは約6.6±0.2に維持される。

血清サンプルの総コレステロール分析に於い
て、酵素濃縮液が第２試薬と複合されて複合基質
溶液を形成する。この複合基質の“約数”部を血
清サンプルの“約数”部と複合させる。２つの
“約数”部を互いに充分混ぜ合わせ、キノンイミ
ン染料特有の色が現われる呈色反応を進行させる
のに充分な時間に亘つて約37℃で保温する。一般
的にはこの時間は約５分間乃至15分間である。反
応時間は上述のように媒質のPHと、酵素、コール
酸塩、トライトン−Ｘ−100、４−アミノアンチ
ピリン及びフエノールの濃度に依存する。別の実
施態様として、酵素濃縮液と第２試薬とを組合わ
せて複合基質溶液を形成するのではなく、各酵素
濃縮液、第２試薬及び血清サンプルの“約数”を
組合わせて充分に混合し、約37℃で必要時間に亘
つて保温してもよい。保温時間が経過するとキノ
ンイミン染料に特有の色が現われる。この色は約
30分間乃至１時間に亘り安定である。

分光測定分析は当業者に公知の分光測定分析技
術を利用して行われる。当業者には明らかなよう
に、複合基質溶液から成るブランク液を形成す
る。このブランク液を使用して分光測定器をセツ
トし、次いで複合基質を分光測定器に配置してサ
ンプルごとに吸光度を測定する。各サンプルの吸
光度を相関させることにより各サンプル中のコレ
ステロール濃度を得ることができる。上述のよう
に、分析媒質中に現われる色は室温に於いて約30
分間乃至１時間に亘つて安定であるから分析が容
易である。

分光測定分析はコレステロール濃度が既知であ
る溶液の吸光度を測定することによつて目盛り調
整をする。複合基質をコレステロール濃度が既知
のサンプルと混合し、これらサンプルの吸光度を
測定することで目盛り調整を完全なものにする。
次いで濃度対吸光度の相関曲線を作成する。ここ
で分析すべき血清サンプルを分析し、その吸光度
を前記相関曲線に対応させることにより血清サン
プル中の総コレステロール濃度を確定する。

血清中の総コレステロールを分光測定分析する
には２つの溶液を利用する方式のほかに、必要成
分を含有する濃縮液または最終的な希釈液の形で
単一の試薬を調製する方式も可能である。単一溶
液を使用する場合、ブランク液の吸光度が増大す
るのを防止するため、遮光性の容器または貯蔵場
所に保管しなければならない。本発明では酵素濃
縮液から成るこの単一試薬を公知のこの種の溶液
よりも高い安定性を有するように形成できること
が立証された。長期間に亘つて安定なこの酵素濃
縮液は使用に際して水で薄めるだけでよいが、そ
のまま使用できる希釈液の形で供給しても、１年
間近くは安定性を失わず、血清サンプル中のコレ
ステロールを分光測定分析するのに好適である。

単一試薬を使用する場合、例えばコール酸ナト
リウムのようなコール酸塩をPHが約４乃至約９の
適当な緩衝液に溶かすことで調製することができ
る。適当な緩衝液は約6.60のPHを提供する第１燐
酸カリウム及び水酸化ナトリウムから成る緩衝液
である。この緩衝液にはコレステロールエステラ
ーゼをも添加する。適当なコレステロールエステ
ラーゼならいかなる種類のものでも利用できる
が、微生物から得られたコレステロールエステラ
ーゼ、特に第２試薬方式による総コレステロール
分析に関連して上述したようにシユードモナス属
フルオレツセンスから得られたコレステロールエ
ステラーゼを使用することが好ましい。成分を充
分に混合し、確実な混合を達成するため約24時間
冷却状態下に放置する。

この溶液に、最終濃縮液容積の7.5容積％以
上、好ましくは7.5乃至50容積％のポリヒドロキ
シ化合物、例えばグリセリン、エチレングリコー
ル、プロピレングリコールを添加する。好ましい
ポリヒドロキシ化合物はグリセリンである。

充分な量の緩衝液にコレステロールオキシダー
ゼを溶解し、これを上記混合液に導入する。コレ
ステロールオキシダーゼは適当なものであればど
のようなものでもよいが、好ましくは微生物を供
給源とするコレステロールオキシダーゼがよい。
動物性供給源から調製されたコレステロールオキ
シダーゼは微生物系のコレステロールオキシダー
ゼほどの安定性を呈しない。コレステロールオキ
シダーゼの好ましい微生物供給源はノカルジア属
エリスロポリス、シユードモナス属スプーリ及び
ブレビバクテリウム属ステロリクムである。コレ
ステロールオキシダーゼの添加量はコレステロー
ルオキシダーゼの種類及びその供給源に依存す
る。ノカルジア属エリスロポリスから得られたコ
レステロールオキシダーゼは約５乃至約９のPHに
於いて最大活性を呈し、約６乃至約８のPHに於い
て更に高い活性を呈するという点で好ましい。コ
レステロールオキシダーゼの使用量は経済的考慮
に基づいて選択する。即ち、コレステロールオキ
シダーゼ使用量が多ければコレステロール分析の
反応時間がそれだけ短縮されるからである。コレ
ステロールオキシダーゼもコレステロールエステ
ラーゼも約37℃で約２乃至10分間で反応が完結す
るような量を添加するのが好ましい。

ペルオキシダーゼも充分量の緩衝液に溶解して
酵素濃縮液に導入する。ペルオキシダーゼは適当
なものならどんな種類のものでも使用できるが西
洋わさびから調製したものが好ましい。ペルオキ
シダーゼ使用量は反応中に発生する過酸化水素と
の瞬時反応を提供するに充分な量である。発生す
る過酸化水素と瞬時反応させることで分析の正確
さに悪影響を及ぼすおそれのある過酸化水素の副
反応を防止することができる。

ポリヒドロキシ化合物を添加しながら約0.1乃
至約0.5容積％のトライトン−Ｘ−100も添加す
る。トライトン−Ｘ−100を上記量だけ添加すれ
ば、調製される溶液に望ましくない界面特性を与
えることなく溶液中の酵素に充分な安定性を与え
ることができる。

コレステロールオキシダーゼ及びペルオキシダ
ーゼを添加した後、酵素濃縮液に４−アミノアン
チピリンを添加する。４−アミノアンチピリンは
ペルオキシダーゼの存在に於いて形成される過酸
化水素及びフエノールと反応して呈色体（キノン
イミン染料）を生成させる呈色体形成化合物の１
種である。４−アミノアンチピリンは形成される
過酸化水素と化学量論的に反応するのに充分な量
だけ添加する。化学量論的に過剰な４−アミノア
ンチピリンを使用することが好ましい。４−アミ
ノアンチピリン添加量の上限は呈色に対する４−
アミノアンチピリンの不安定化作用に依存する。
即ち、化学量論的濃度よりも高い濃度の４−アミ
ノアンチピリンは呈色体の約500nmのピーク吸光
度に於いて呈色を弱める傾向がある。

４−アミノアンチピリンの添加後、４−アミノ
アンチピリン及び過酸化水素と反応して呈色体を
形成する第２化合物として酵素濃縮液にフエノー
ルを添加する。フエノールは形成される過酸化水
素及び４−アミノアンチピリンと反応するに充分
な量を添加する。

こうして得られた酵素濃縮液は総コレステロー
ル分析に使用する際に水で薄める。濃縮液は遮光
状態に維持する限り室温で約６箇月間に亘つて安
定である。濃縮物は使用の際に濃縮液約１部に対
して水４部の割合で蒸溜水で希釈すればよい。こ
うして得られた溶液は４℃に於いて約６乃至12箇
月間、室温で２乃至３箇月間に亘つて安定であ
る。

酸素消費量測定方式の総コレステロール分析で
は酵素濃縮液から成る単一酵素試薬だけでよく、
最終希釈酵素試薬の形のものでも４℃で１年間の
安定性を維持できる。血清サンプル中に存在する
総コレステロールを定量するために酸素消費量を
測定するのであるから、溶液中に呈色体形成剤を
添加する必要も、２つの別々の溶液を使用する必
要もない。酸素消費量に基づく総コレステロール
分析に使用する本発明の安定溶液はPHが約４乃至
約９の緩衝液に例えばコール酸ナトリウムのよう
なコール酸のナトリウム塩を溶解することによつ
て調製する。緩衝液は分光測定方式による総コレ
ステロール分析に関連して上述したような緩衝液
でよい。即ち、緩衝液にコール酸ナトリウムを溶
解した後、コレステロールエステラーゼを添加
し、溶解する。こうして得た混合液を約24時間に
亘つて冷却条件（２℃乃至８℃）下に放置して成
分溶解を確実にする。混合物を充分に混ぜ合わせ
て一様に不透明な溶液を得る。

使用するコレステロールエステラーゼはその種
類を問わないが、動物系のコレステロールエステ
ラーゼは微生物系のコレステロールエステラーゼ
ほどの安定性を持たないから、微生物から得られ
たコレステロールエステラーゼが好ましい。分光
測定方式の総コレステロール分析に使用するコレ
ステロールエステラーゼに関連して上述したよう
に、協和醗酵工業株式会社から市販されている微
生物シユードモナス属フルオレツセンス
ATCC21156からコレステロールエステラーゼを
調製するのが好ましい。

このコレステロールエステラーゼ緩衝液にポリ
ヒドロキシ化合物及びトライトン−Ｘ−100を添
加する。ポリヒドロキシ化合物としては例えばグ
リセリン、エチレングリコール、プロピレングリ
コールのようなポリヒドロキシアルコールを使用
すればよく、中でもグリセリンが好ましい。グリ
セリンは最終酵素濃縮液容積の少なくとも7.5容
積％、好ましくは7.5乃至50％の量を添加する。
トライトン−Ｘ−100は最終酵素濃縮液に対して
2.5容積％以下、好ましくは約0.1乃至約0.5容積％
に相当する量を添加する。

ポリヒドロキシ化合物及びトライトン−Ｘ−
100を添加した後、コレステロールオキシダーゼ
を溶液に添加する。コレステロールオキシダーゼ
を先ず適量の緩衝液に溶解してから、コレステロ
ールエステラーゼ、ポリヒドロキシ化合物及びト
ライトン−Ｘ−100を含有している混合物に導入
する。コレステロールオキシダーゼは適当なコレ
ステロールオキシダーゼならその種類を問わない
が、微生物から得られたコレステロールオキシダ
ーゼが特に好ましい。コレステロールオキシダー
ゼの供給源としてはシユードモナス属スプーリ、
ノカルジア属エリスロポリス及びブレビバクテリ
ウム属ステロリクムが挙げられる。ノカルジア属
エリスロポリス微生物がコレステロールオキシダ
ーゼの供給源として好ましい。コレステロールオ
キシダーゼの添加量は任意の適量でよいが、経済
的理由から制限される。また、このコレステロー
ルオキシダーゼの添加量はその供給源の種類及び
調製される溶液のPHに依存する。ノカルジア属エ
リスロポリスから得られたコレステロールオキシ
ダーゼは５乃至９のPHに於いて最大活性を呈し、
６乃至約８のPHでは更に優れた活性を呈するか
ら、この点でノカルジア属エリスロポリスから得
られるものが好ましい。コレステロールオキシダ
ーゼの増量に伴ない、コレステロール分析を行う
ための必要時間が短縮される。酸素消費に至る一
連の反応が37℃に於いて約２乃至５分間で完了す
るようにコレステロールオキシダーゼ添加量を設
定するのが好ましい。

以上のようにして得られた溶液は血清サンプル
中の総コレステロールを酸素消費量に基づいて分
析するのに利用できる安定溶液を提供する。酵素
濃縮液は冷却条件（２℃乃至８℃）下で約２乃至
３年間、室温で約６箇月の安定を保つ。希釈を終
えた作用溶液は室温で２乃至３箇月間、冷却条件
下で６乃至12箇月間の安定を維持する。この溶液
はベツクマン・コレステロール・アナライザー２
に組込んだ場合特に有用である。ベツクマン・コ
レステロール・アナライザー２は毎時約50件まで
の血清サンプルを分析できる。計器は既知量のコ
レステロールを含有する標準血清を利用して目盛
り調整をすればよい。血清及び使用される安定溶
液の容積は、約１mlの安定溶液＋約５乃至10μｌ
の血清サンプルである。計器に導入されるサンプ
ルは約５μｌが普通である。

以下実施例に従つて本発明を詳述するが、本発
明はこれらの実施例に制限されるものでない。

実施例 分光測定に基づく２試薬方式総コレステロール
分析のための安定溶液 水酸化ナトリウム及び第１燐酸カリウムで緩衝
液を形成することにより第１試薬及び安定溶液を
調製した。即ち、136ｇの第１燐酸カリウムを980
mlの蒸溜水に溶解することによつて緩衝液を調製
した。こうして得た溶液に33ｇの水酸化ナトリウ
ムを添加し、充分に混合し、溶液中に溶解した。
こうして得た緩衝液のPHは約6.60であつた。

73mlの緩衝液に0.75ｇのコール酸ナトリウムを
添加した。この緩衝液に協和醗酵工業株式会社か
ら市販されているシユードモナス属フルオレツセ
ンス系コレステロールエステラーゼ（ATCC
21156）150国際単位（IU）を添加して充分に緩
衝液及びコール酸ナトリウムと混合し、得られた
混合物を約24時間に亘つて冷却条件（２℃乃至８
℃）下に放置し、一様に不透明な溶液を得た。

この混合物にグリセリン75ml及びジエイ．テイ
ー．ベーカー・ケミカル・カンパニーから市販さ
れているトライトン−Ｘ−100（シンチレーシヨ
ン・グレード）2.25mlを添加した。緩衝されたコ
レステロールエステラーゼ混合溶液と充分に混ざ
り合うようにグリセリン及びトライトン−Ｘ−
100を撹拌しながら同時に添加した。

ホワツトマン・ケミカル・カンパニーから市販
されているノカルジア属エリスロポリス系コレス
テロールオキシダーゼを１mlの緩衝液に溶解し
た。この場合、75IUの活性を提供するに充分な
量のコレステロールオキシダーゼを緩衝液に溶解
した。こうして得たコレステロールオキシダーゼ
溶液をコレステロールエステラーゼ緩衝溶液中に
導入した。

22.5KUを提供するに充分な量のペルオキシダ
ーゼ（西洋わさびから調製したもの）を１mlの緩
衝液に溶解した。こうして得た溶液もコレステロ
ールエステラーゼ緩衝液中に導入した。

酵素を含有する緩衝液に45mgの４−アミノアン
チピリンを添加し、よく混ぜ合わせて４−アミノ
アンチピリンを溶解させた。得られた溶液の総容
積は約150mlであつた。酵素濃縮試薬の調合濃度
は１中に下記の通りであつた。

コール酸ナトリウム 10mM±２％ ４−アミノアンチピリン 1.5mM±２％ ペルオキシダーゼ 150000IU／±５％ コレステロールオキシダーゼ 500IU／±５％ コレステロールエステラーゼ
1000IU／±５％ トライトン−Ｘ−100 1.5％±２％（容積比） グリセリン 約50容積％ 1.5の蒸溜水に1.5ｇのフエノールを溶解する
ことにより第２試薬を調製した。このフエノール
水溶液に1.5mlのトライトン−Ｘ−100（シンチレ
ーシヨン・グレード）を添加した。得られた溶液
の容積は約1.5、調合濃度は下記の通りであつ
た。

トライトン−Ｘ−100 0.1％±２％（容積比） フエノール 10mM±２％ 血清サンプル中のコレステロール分析を行う前
に２つの試薬を下記量の割合で複合した。即ち、
酵素濃縮試薬0.20mlに第２試薬0.80mlを添加し
た。この複合試薬を少なくとも30回反転させるこ
とで充分に混合した。こうして複合された試薬の
調合濃度は下記の通りであつた。

トライトン−Ｘ−100 0.4％（容積比） フエノール 8mM コール酸ナトリウム 2mM ４−アミノアンチピリン 0.3mM ペルオキシダーゼ 30000IU／ コレステロールオキシダーゼ 100IU／ コレステロールエステラーゼ 200IU／ グリセリン 10.0容積％ 複合試薬は透明な外観を呈し、25℃に於けるPH
6.7±0.2であつた。500nmに於いて測定された初
期吸光度は≦0.100であつた。複合試薬は500nm
に於いて1000mg／dlまでの±５％線形度を呈し
た。２℃乃至８℃で２年間貯蔵した後の複合試薬
の測定範囲を高温に於ける促進安定度試験に基づ
いて評価したところ、約500mg／dlであつた。市
販の脂質対照血清PRECILIPと比較した結果、複
合試薬の理論値の95乃至105％の活性が得られ
た。

複合試薬は各血清サンプル中の総コレステロー
ルを分析するのに37℃に於いて約５乃至６分間の
反応時間を必要とした。総コレステロール分析は
血清サンプル１件につき、サンプル10μ及び複
合試薬1.0mlを使用して実施した。

複合試薬の室温に於ける安定性は約３箇月であ
つた。41℃に於ける安定性は約24時間、２℃乃至
８℃では６乃至12箇月であつた。この安定性は脂
質対照血清PRECILIPのコレステロール値の95乃
至105％の活性が得られる期間として測定した。
この場合サンプル容積は５倍使用した（即ち、試
薬１mlにつきサンプル50μｌ）。未複合試薬、即
ち、酵素濃縮試薬を促進条件下で試験した結果、
41℃で72時間、37℃で10日間の安定度を示した。

実施例 分光測定に基づく単一試薬方式総コレステロー
ル分析用安定酵素溶液 実施例に述べたように第１燐酸カリウム及び
水酸化ナトリウムを使用して緩衝液を調製した。
この緩衝液73mlにコール酸ナトリウム0.75ｇを添
加し、更にシユードモナス属フルオレツセンス
（ATCC 21156）を原料とするコレステロールエ
ステラーゼ150IUを添加し、この混合物を充分に
混ぜ合わせ、冷却条件（２℃乃至８℃）下で約24
時間放置し、一様に不透明な溶液を得た。

この不透明溶液にグリセリン75ml及びジエイ．
テイー．ベーカー・ケミカル・カンパニーから市
販されているトライトン−Ｘ−100（シンチレー
シヨン・グレード）を2.25ml添加した。

ホワツトマン・ケミカル・カンパニーから市販
されているノカルジア属エリスロポリス系コレス
テロールオキシダーゼを緩衝液１mlに溶解したも
のを上記緩衝されたコレステロールエステラーゼ
溶液に導入した。コレステロールオキシダーゼの
添加量は75IUであつた。更に、緩衝液１mlにペ
ルオキシダーゼ22.5KUを溶解したものを上記緩
衝されたコレステロールエステラーゼ溶液に導入
した。ペルオキシダーゼは西洋わさびを原料とす
る市販のペルオキシダーゼであつた。コレステロ
ールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ
及びペルオキシダーゼを含有するこの溶液を充分
に混ぜ合わせた。

得られた酵素溶液に４−アミノアンチピリン45
mgを添加し、混ぜ合わせて４−アミノアンチピリ
ンの溶解を助けた。

４−アミノアンチピリン添加に続いて450mgの
フエノールを添加し、得られた溶液を充分に混ぜ
合わせて乳白色溶液を得た。

以上のようにして調製した安定酵素溶液の調合
濃度は下記の通りでつた。

コール酸ナトリウム 10mM±２％ ４−アミノアンチピリン 1.5mM±２％ ペルオキシダーゼ 150000IU／±５％ コレステロールオキシダーゼ 600IU／±５％ コレステロールエステラーゼ
1000IU／±５％ トライトン−Ｘ−100 1.5％±２％（容積比） フエノール 30mM±２％ グリセリン 約50容積％ 総コレステロール分析を行う際に試薬0.20mlを
蒸溜水0.80に溶解し、少なくとも30回反転させ
て充分に混合することで上記濃縮酵素試薬溶液を
希釈した。希釈溶液の安定度は２℃乃至８℃で約
６乃至12簡月であつた。尚、希釈した試薬の成分
濃度は下記の通りであつた。

トライトン−Ｘ−100 0.3％（容積比） フエノール 6mM コール酸ナトリウム 2mM ４−アミノアンチピリン 0.3mM ペルオキシダーゼ 30000IU／ コレステロールオキシダーゼ 100IU／ コレステロールエステラーゼ 200IU／ グリセリン 約10容積％ この希釈試薬は透明な外観を呈し、PHは25℃で
約6.7±0.2であつた。希釈試薬の初期吸光度は
500nmに於いて≦0.100であつた。500nmに於け
る±５％線形度は1000mg／dlまで得られた。測定
範囲は２℃乃至８℃で１年間貯蔵後500mg／dlで
あつた。また、希釈試薬の反応度は５倍濃度の市
販脂質対照血清PRECILIPの分析に使用した場合
（即ち、希釈試薬１mlに対して対照血清50μｌ）、
37℃で10分間の反応時間で対照血清中コレステロ
ール理論値の95乃至105％であつた。

促進安定度試験で希釈試薬は37℃で24時間貯蔵
後、５倍濃度PRECILIP理論値の95乃至105％を
得るだけの安定度を示した。濃縮液のみの場合
（非希釈）、その安定度は41℃で約72時間、約37℃
で約10日間であつた。

希釈試薬による総コレステロール分析に要する
反応時間は37℃で約５乃至６分間であつた。総コ
レステロール分析は希釈試薬1.0ml、血清サンプ
ル10μｌを使用して実施し、５倍濃度PRECILIP
の場合には希釈試薬１mlに対してPRECILIP50μ
ｌを使用して実施した。

実施例 実施例に記載の調合をそのまま繰返した。但
し成分濃度を変えることで下記の調合濃度を有す
る複合試薬を得た。

コール酸ナトリウム 1.45mM ４−アミノアンチピリン 0.63mM フエノール 3.98mM トライトン−Ｘ−100 0.038％（容積比） ペルオキシダーゼ 10000IU／ コレステロールオキシダーゼ 150IU／ コレステロールエステラーゼ 200IU／ グリセリン 約10容積％ この複合試薬の安定度は２℃乃至８℃で２箇月
であつた。

実施例 酸素消費量測定に基づく総コレステロール分析
用安定溶液 実施例に記載のように第１燐酸カリウム及び
水酸化ナトリウムを使用して緩衝液を調製した。
緩衝液のPHは約6.60であつた。

925mlの緩衝液に0.75ｇのコール酸ナトリウム
及び1000IUのコレステロールエステラーゼを添
加した。コレステロールエステラーゼはシユード
モナス属フルオレツセンス（ATCC 21156）系の
ものである。得られた混合物を冷却条件（２℃乃
至８℃）下に24時間放置してコール酸ナトリウム
及びコレステロールエステラーゼの混合及び溶解
を助けた。こうして得た混合液は可視粒子を含ま
ない一様に不透明な溶液であつた。

この緩衝コレステロールエステラーゼ溶液に75
mlのグリセリン及び2.25mlのトライトン−Ｘ−
100（シンチレーシヨン・グレード）を添加し
た。

約1000IUのコレステロールオキシダーゼを１
mlの緩衝液に溶解したものを上記緩衝コレステロ
ールエステラーゼ溶液に導入して充分に混ぜ合わ
せた。

得られた溶液が酸素消費量に基づく血清サンプ
ル中総コレステロールの分析に使用できる安定酵
素溶液であつた。この溶液の成分濃度は下記の通
りであつた。

コール酸ナトリウム 10mM±２％ コレステロールオキシダーゼ
〜1000IU／±５％ コレステロールエステラーゼ
〜1000IU／±５％ トライトン−Ｘ−100
0.225％±0.2％（容積比） グリセリン 7.5容積％ 緩衝液 0.6−0.8モル 安定溶液は５倍濃度PRECILIPのコレステロー
ル値の95乃至105％を得られる期間として促進温
度試験により測定した結果、冷却条件下で約２乃
至３年間、室温で約３箇月、37℃で３日間、41℃
で約24時間であつた。

この溶液はベツクマン・コレステロール・アナ
ライザー２と併用すれば酸素消費量に基づく血清
サンプル中総コレステロール分析に用いるのに好
適な溶液である。総コレステロール測定器に約１
mlの溶液を使用し、この１mlの安定酵素溶液中に
被検血清サンプル約５μｌを導入した。

実施例 酸素消費量に基づく総コレステロール分析用安
定酵素濃縮液 実施例に記載したように第１燐酸カリウム及
び水酸化ナトリウムを使用して緩衝液を調製し
た。緩衝液のPHは約6.60であつた。

73mlの緩衝液に0.75ｇのコール酸ナトリウム及
び150IUのシユードモナス属フルオレツセンス
（ATCC 21156）系コレステロールエステラーゼ
を添加し、この混合物を冷却条件（２℃乃至８
℃）下に24時間放置してコール酸ナトリウム及び
コレステロールエステラーゼの混合及び溶解を助
けた。可視粒子を含有しない一様に不透明な溶液
を得た。

この緩衝コレステロールエステラーゼ溶液に75
mlのグリセリン及び2.25mlのトライトン−Ｘ−
100（シンチレーシヨン・グレード）を添加し
た。

コレステロールオキシダーゼ約150IUを１mlの
緩衝液に溶解したものを上記緩衝コレステロール
エステラーゼ溶液に添加し、充分に混合した。こ
うして得た溶液が緩衝液及び／または水で希釈す
れば酸素消費量に基づく血清サンプル中総コレス
テロール分析に使用できる安定酵素濃縮液であ
る。この濃縮液の希釈後の成分濃度は下記の通り
であつた。

コール酸ナトリウム 10mM±２％ コレステロールオキシダーゼ
1000IU／±５％ コレステロールエステラーゼ
1000IU／±５％ トライトン−Ｘ−100
0.225％±0.2％（容積比） グリセリン 約50容積％ 緩衝液（PH6.6） 約50容積％ この安定酵素濃縮液はベツクマン・コレステロ
ール・アナライザー２を使用する場合のように緩
衝液及び／または水で希釈すれば酸素消費量に基
づく血清サンプル中総コレステロール測定分析に
用いるのに好適である。酵素濃縮液約１部に対し
て希釈分約５乃至６部の比率で希釈した。総コレ
ステロール測定器中に約１mlの希釈溶液を導入
し、これに被検血清サンプル約５μｌを導入して
から、このサンプルに対する分析を実施した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ コール酸金属塩と、コレステロールエステラ
   ーゼと、コレステロールオキシダーゼと、約４乃
   至約９のPHを提供する緩衝液と共に、安定化酵素
   溶液の2.5容積％までの界面活性剤及び同溶液の
   少なくとも7.5容積％のポリヒドロキシ有機化合
   物を含有させたことを特徴とする総コレステロー
   ル測定用安定化酵素溶液。 ２ 前記コール酸金属塩が、安定化酵素溶液150
   mlに対して約2.25ｇ以下である特許請求の範囲第
   １項に記載の総コレステロール測定用安定化酵素
   溶液。 ３ 前記ポリヒドロキシ有機化合物が、安定化酵
   素溶液容積の7.5乃至約50％である特許請求の範
   囲第１項に記載の総コレステロール測定用安定化
   酵素溶液。 ４ 前記界面活性剤が、安定化酵素溶液容積の約
   0.5乃至2.5％である特許請求の範囲第１項に記載
   の総コレステロール測定用安定化酵素溶液。 ５ 前記コール酸金属塩が、コール酸ナトリウム
   である特許請求の範囲第１項または第２項に記載
   の総コレステロール測定用安定化酵素溶液。 ６ 前記ポリヒドロキシ有機化合物が、グリセリ
   ン、エチレングリコール、ソルビトール、プロピ
   レングリコールから成る群から選択したものであ
   る特許請求の範囲第１項または第３項に記載の総
   コレステロール測定用安定化酵素溶液。 ７ 前記界面活性剤が、ポリエチレングリコール
   −ｐ−イソオクチルフエニルエーテルである特許
   請求の範囲第１項または第４項に記載の総コレス
   テロール測定用安定化酵素溶液。 ８ 前記コレステロールオキシダーゼが、シユー
   ドモナス属スプーリ、ノカルジア属エリスロポリ
   ス、ブレビバクテリウム属ステロリクムから成る
   群から選択した微生物から得たものである特許請
   求の範囲第１項に記載の総コレステロール測定用
   安定化酵素溶液。 ９ 前記緩衝液が、約６乃至約８のPHを提供する
   ものである特許請求の範囲第１項に記載の総コレ
   ステロール測定用安定化酵素溶液。 １０ 前記緩衝液が、第一燐酸カリウム及び水酸
   化ナトリウムである特許請求の範囲第１項または
   第９項に記載の総コレステロール測定用安定化酵
   素溶液。 １１ 前記安定化酵素溶液が、酸素消費量に基づ
   くコレステロール測定用酵素溶液である特許請求
   の範囲第１項乃至第１０項のいずれかに記載の総
   コレステロール測定用安定化酵素溶液。 １２ 0.75ｇのコール酸ナトリウムと、1000IUの
   コレステロールエステラーゼと、75mlのグリセリ
   ンと、2.25mlの界面活性剤と、1000IUのコレステ
   ロールオキシダーゼと、約6.6のPHを提供する925
   mlの緩衝液の含有比率を有する特許請求の範囲第
   １１項に記載の総コレステロール測定用安定化酵
   素溶液。 １３ 0.75ｇのコール酸ナトリウムと、800IUの
   コレステロールエステラーゼと、75mlのグリセリ
   ンと、2.25mlの界面活性剤と、1000IUのコレステ
   ロールオキシダーゼと、約6.6のPHを提供する75
   mlの緩衝液の含有比率を有する酸素濃縮溶液であ
   つて、該酵素濃縮溶液１部に対して水４倍の割合
   で希釈して用いるための酵素濃縮溶液である特許
   請求の範囲第１１項に記載の総コレステロール測
   定用安定化酵素溶液。 １４ コール酸金属塩と、コレステロールエステ
   ラーゼと、コレステロールオキシダーゼと、約４
   乃至約９のPHを提供する緩衝液と、ペルオキシダ
   ーゼと、４−アミノアンチピリンと共に、安定化
   酵素溶液の2.5容積％までの界面活性剤及び同溶
   液の少なくとも7.5容積％のポリヒドロキシ有機
   化合物を含有させたことを特徴とする総コレステ
   ロール測定用安定化酵素溶液。 １５ 前記コール酸金属塩が、安定化酵素溶液
   150mlに対して約2.25ｇ以下である特許請求の範
   囲第１４項に記載の総コレステロール測定用安定
   化酵素溶液。 １６ 前記ポリヒドロキシ有機化合物が、安定化
   酵素溶液容積の7.5乃至約50％である特許請求の
   範囲第１４項に記載の総コレステロール測定用安
   定化酵素溶液。 １７ 前記界面活性剤が、安定化酵素溶液容積の
   約0.5乃至2.5％である特許請求の範囲第１５項に
   記載の総コレステロール測定用安定化酵素溶液。 １８ 前記コール酸金属塩が、コール酸ナトリウ
   ムである特許請求の範囲第１４項または第１５項
   に記載の総コレステロール測定用安定化酵素溶
   液。 １９ 前記ポリヒドロキシ有機化合物が、グリセ
   リン、エチレングリコール、ソルビトール、プロ
   ピレングリコールから成る群から選択したもので
   ある特許請求の範囲第１４項または第１６項に記
   載の総コレステロール測定用安定化酵素溶液。 ２０ 前記界面活性剤が、ポリエチレングリコー
   ル−ｐ−イソオクチルフエニルエーテルである特
   許請求の範囲第１４項または第１７項に記載の総
   コレステロール測定用安定化酵素溶液。 ２１ 前記コレステロールオキシダーゼが、シユ
   ードモナス属スプーリ、ノカルジア属エリスロポ
   リス、ブレビバクテリウム属ステロリクムから成
   る群から選択した微生物から得たものである特許
   請求の範囲第１４項に記載の総コレステロール測
   定用安定化酵素溶液。 ２２ 前記緩衝液が、約６乃至約８のPHを提供す
   るものである特許請求の範囲第１４項に記載の総
   コレステロール測定用安定化酵素溶液。 ２３ 前記緩衝液が、第一燐酸カリウム及び水酸
   化ナトリウムである特許請求の範囲第１４項また
   は第２２項に記載の総コレステロール測定用安定
   化酵素溶液。 ２４ 前記ペルオキシダーゼが、西洋わさびから
   得たものである特許請求の範囲第１４項に記載の
   総コレステロール測定用安定化酵素溶液。 ２５ 前記４−アミノアンチピリンが、安定化酵
   素溶液150mlに対して約22.5乃至約67.5mgである
   特許請求の範囲第１４項に記載の総コレステロー
   ル測定用安定化酵素溶液。 ２６ コール酸金属塩と、コレステロールエステ
   ラーゼと、コレステロールオキシダーゼと、約４
   乃至約９のPHを提供する緩衝液と、ペルオキシダ
   ーゼと、４−アミノアンチピリンと、フエノール
   と共に、安定化酵素溶液の2.5容積％までの界面
   活性剤及び同溶液の少なくとも7.5容積％のポリ
   ヒドロキシ有機化合物を含有させたことを特徴と
   する総コレステロール測定用安定化酵素溶液。 ２７ 前記コール酸金属塩が、安定化酵素溶液
   150mlに対して約2.25ｇ以下である特許請求の範
   囲第２６項に記載の総コレステロール測定用安定
   化酵素溶液。 ２８ 前記ポリヒドロキシ有機化合物が、安定化
   酵素溶液容積の7.5乃至約50％である特許請求の
   範囲第２６項に記載の総コレステロール測定用安
   定化酵素溶液。 ２９ 前記界面活性剤が、安定化酵素溶液容積の
   約0.5乃至2.5％である特許請求の範囲第２６項に
   記載の総コレステロール測定用安定化酵素溶液。 ３０ 前記コール酸金属塩が、コール酸ナトリウ
   ムである特許請求の範囲第２６項または第２７項
   に記載の総コレステロール測定用安定化酵素溶
   液。 ３１ 前記ポリヒドロキシ有機化合物が、グリセ
   リン、エチレングリコール、ソルビトール、プロ
   ピレングリコールから成る群から選択したもので
   ある特許請求の範囲第２６項または第２８項に記
   載の総コレステロール測定用安定化酵素溶液。 ３２ 前記界面活性剤が、ポリエチレングリコー
   ル−ｐ−イソオクチルフエニルエーテルである特
   許請求の範囲第２６項または第２９項に記載の総
   コレステロール測定用安定化酵素溶液。 ３３ 前記コレステロールオキシダーゼが、シユ
   ードモナス属スプーリ、ノカルジア属エリスロポ
   リス、ブレビバクテリウム属ステロリクムから成
   る群から選択した微生物から得たものである特許
   請求の範囲第２６項に記載の総コレステロール測
   定用安定化酵素溶液。 ３４ 前記緩衝液が、約６乃至約８のPHを提供す
   るものである特許請求の範囲第２６項に記載の総
   コレステロール測定用安定化酵素溶液。 ３５ 前記緩衝液が、第一燐酸カリウム及び水酸
   化ナトリウムである特許請求の範囲第２６項また
   は第３４項に記載の総コレステロール測定用安定
   化酵素溶液。 ３６ 前記ペルオキシダーゼが西洋わさびから得
   たものである特許請求の範囲第２６項に記載の総
   コレステロール測定用安定化酵素溶液。 ３７ 前記４−アミノアンチピリンが、安定化酵
   素溶液150mlに対して約22.5乃至約67.5mgである
   特許請求の範囲第２６項に記載の総コレステロー
   ル測定用安定化酵素溶液。 ３８ 前記フエノールが、安定化酵素溶液150ml
   に対して約0.75乃至約2.25ｇである特許請求の範
   囲第２６項に記載の総コレステロール測定用安定
   化酵素溶液。 ３９ 0.75ｇのコール酸ナトリウムと、150IUの
   コレステロールエステラーゼと、75mlのグリセリ
   ンと、2.25mlの界面活性剤と、75IUのコレステロ
   ールオキシダーゼと、約6.60のPHを提供する75ml
   の緩衝液と、22.5KUのペルオキシダーゼと、45
   mgの４−アミノアンチピリンと、450mgのフエノ
   ールの含有比率を有する酵素濃縮溶液であつて、
   該酵素濃縮溶液１部に対して水４部の割合で希釈
   して用いるための酵素濃縮溶液である特許請求の
   範囲第２６項に記載の総コレステロール測定用安
   定化酵素溶液。 ４０ (a) コール酸金属塩と、コレステロールエ
   ステラーゼと、コレステロールオキシダーゼ
   と、約４乃至約９のPHを提供する緩衝液と、ペ
   ルオキシダーゼと、４−アミノアンチピリンと
   共に、安定化酵素溶液の2.5容積％までの界面
   活性剤及び同溶液の少なくとも7.5容積％のポ
   リヒドロキシ有機化合物を含有させた酵素濃縮
   溶液と、 (b) フエノール及び界面活性剤を含有する水溶液
   から成る呈色希釈溶液と の組合せから成ることを特徴とする総コレステロ
   ール測定用安定化酵素溶液。 ４１ 前記コール酸金属塩が、安定化酵素溶液
   150mlに対して約2.25ｇ以下である特許請求の範
   囲第４０項に記載の総コレステロール測定用安定
   化酵素溶液。 ４２ 前記ポリヒドロキシ有機化合物が、安定化
   酵素溶液容積の7.5乃至約50％である特許請求の
   範囲第４０項に記載の総コレステロール測定用安
   定化酵素溶液。 ４３ 前記界面活性剤が、安定化酵素溶液容積の
   約0.5乃至2.5％である特許請求の範囲第４０項に
   記載の総コレステロール測定用安定化酵素溶液。 ４４ 前記コール酸金属塩が、コール酸ナトリウ
   ムである特許請求の範囲第４０項または第４１項
   に記載の総コレステロール測定用安定化酵素溶
   液。 ４５ 前記ポリヒドロキシ有機化合物が、グリセ
   リン、エチレングリコール、ソルビトール、プロ
   ピレングリコールから成る群から選択したもので
   ある特許請求の範囲第４０項または第４２項に記
   載の総コレステロール測定用安定化酵素溶液。 ４６ 前記界面活性剤が、ポリエチレングリコー
   ル−ｐ−イソオクチルフエニルエーテルである特
   許請求の範囲第４０項または第４３項に記載の総
   コレステロール測定用安定化酵素溶液。 ４７ 前記コレステロールオキシダーゼが、シユ
   ードモナス属スプーリ、ノカルジア属エリスロポ
   リス、ブレビバクテリウム属ステロリクムから成
   る群から選択した微生物から得たものである特許
   請求の範囲第４０項に記載の総コレステロール測
   定用安定化酵素溶液。 ４８ 前記緩衝液が、約６乃至約８のPHを提供す
   るものである特許請求の範囲第４０項に記載の総
   コレステロール測定用安定化酵素溶液。 ４９ 前記緩衝液が、第一燐酸カリウム及び水酸
   化ナトリウムである特許請求の範囲第４０項また
   は第４８項に記載の総コレステロール測定用安定
   化酵素溶液。 ５０ 前記ペルオキシダーゼが西洋わさびから得
   たものである特許請求の範囲第４０項に記載の総
   コレステロール測定用安定化酵素溶液。 ５１ 前記４−アミノアンチピリンが、安定化酵
   素溶液150mlに対して約22.5乃至約67.5mgである
   特許請求の範囲第４０項に記載の総コレステロー
   ル測定用安定化酵素溶液。 ５２ 前記フエノールが、安定化酵素溶液150ml
   に対して約0.75乃至約2.25ｇである特許請求の範
   囲第４０項に記載の総コレステロール測定用安定
   化酵素溶液。 ５３ 前記酵素濃縮溶液が、0.75ｇのコール酸ナ
   トリウムと、150IUのコレステロールエステラー
   ゼと、75mlのグリセリンと、2.25mlの界面活性剤
   と、75IUのコレステロールオキシダーゼと、約
   6.60のPHを提供する75mlの緩衝液と、22.5KUの
   ペルオキシダーゼと、45mgの４−アミノアンチピ
   リンの含有比率を有し、前記呈色希釈溶液が、
   1.5ｇのフエノールと、1.5mlの界面活性剤と、1.5
   の水の含有比率を有する特許請求の範囲第４０
   項に記載の総コレステロール測定用安定化酵素溶
   液。 ５４ コール酸金属塩と、コレステロールエステ
   ラーゼと、ポリヒドロキシ有機化合物と、界面活
   性剤と、コレステロールオキシダーゼと、約４乃
   至約９のPHを提供する緩衝液とを含有する総コレ
   ステロール測定用安定化酵素溶液の製法であつ
   て、 (a) PHが約４乃至約９の緩衝液を調製する段階
   と、 (b) 前記緩衝液にコール酸金属塩を溶解する段階
   と、 (c) 前記緩衝液の第１部分にコレステロールエス
   テラーゼを溶解する段階と、 (d) 前記緩衝液の第１部分にポリヒドロキシ有機
   化合物を添加する段階と、 (e) 前記緩衝液の第１部分に界面活性剤を添加す
   る段階と、 (f) 前記緩衝液の第２部分にコレステロールオキ
   シダーゼを溶解し、溶解したコレステロールオ
   キシダーゼを前記緩衝液の第１部分に添加する
   段階と を有することを特徴とする総コレステロール測定
   用安定化酵素溶液の製法。 ５５ 前記コール酸金属塩が、安定化酵素溶液
   150mlに対して約2.25ｇ以下である特許請求の範
   囲第５４項に記載の総コレステロール測定用安定
   化酵素溶液の製法。 ５６ 前記ポリヒドロキシ有機化合物が、安定化
   酵素溶液容積の約50％以下である特許請求の範囲
   第５４項に記載の総コレステロール測定用安定化
   酵素溶液の製法。 ５７ 前記界面活性剤が、安定化酵素溶液容積の
   約0.5乃至約2.5％である特許請求の範囲第５４項
   に記載の総コレステロール測定用安定化酵素溶液
   の製法。 ５８ 前記コール酸金属塩が、コール酸ナトリウ
   ムである特許請求の範囲第５４項または第５５項
   に記載の総コレステロール測定用安定化酵素溶液
   の製法。 ５９ 前記ポリヒドロキシ有機化合物が、グリセ
   リン、エチレングリコール、ソルビトール、プロ
   ピレングリコールから成る群から選択したもので
   ある特許請求の範囲第５４項または第５６項に記
   載の総コレステロール測定用安定化酵素溶液の製
   法。 ６０ 前記界面活性剤が、ポリエチレングリコー
   ル−ｐ−イソオクチルフエニルエーテルである特
   許請求の範囲第５４項または第５７項に記載の総
   コレステロール測定用安定化酵素溶液の製法。 ６１ 前記コレステロールオキシダーゼが、シユ
   ードモナス属スプーリ、ノカルジア属エリスロポ
   リス、ブレビバクテリウム属ステロリクムから成
   る群から選択した微生物から得たものである特許
   請求の範囲第５４項に記載の総コレステロール測
   定用安定化酵素溶液の製法。 ６２ 前記緩衝液が、約６乃至約８のPHを提供す
   るものである特許請求の範囲第５４項に記載の総
   コレステロール測定用安定化酵素溶液の製法。 ６３ 前記緩衝液が、第一燐酸カリウム及び水酸
   化ナトリウムである特許請求の範囲第５４項また
   は第６２項に記載の総コレステロール測定用安定
   化酵素溶液の製法。 ６４ 前記安定化酵素溶液が、酸素消費量に基づ
   くコレステロール測定用酵素溶液である特許請求
   の範囲第５４項乃至第６３項のいずれかに記載の
   総コレステロール測定用安定化酵素溶液の製法。 ６５ コール酸金属塩と、コレステロールエステ
   ラーゼと、ポリヒドロキシ有機化合物と、界面活
   性剤と、コレステロールオキシダーゼと、約４乃
   至約９のPHを提供する緩衝液とを含有し、更にペ
   ルオキシダーゼと、４−アミノアンチピリンとを
   含有する総コレステロール測定用安定化酵素溶液
   の製法であつて、 (a) PHが約４乃至約９の緩衝液を調製する段階
   と、 (b) 前記緩衝液にコール酸金属塩を溶解する段階
   と、 (c) 前記緩衝液の第１部分にコレステロールエス
   テラーゼを溶解する段階と、 (d) 前記緩衝液の第１部分にポリヒドロキシ有機
   化合物を添加する段階と、 (e) 前記緩衝液の第１部分に界面活性剤を添加す
   る段階と、 (f) 前記緩衝液の第２部分にコレステロールオキ
   シダーゼを溶解し、溶解したコレステロールオ
   キシダーゼを前記緩衝液の第１部分に添加する
   段階と、 (g) 前記緩衝液の第３部分にペルオキシダーゼを
   溶解し、溶解したペルオキシダーゼを前記緩衝
   液の第１部分に添加する段階と、 (h) 前記緩衝液の第１部分に４−アミノアンチピ
   リンを溶解する段階と を有することを特徴とする総コレステロール測定
   用安定化酵素溶液の製法。 ６６ 前記コール酸金属塩が、安定化酵素溶液
   150mlに対して約2.25ｇ以下である特許請求の範
   囲第６５項に記載の総コレステロール測定用安定
   化酵素溶液の製法。 ６７ 前記ポリヒドロキシ有機化合物が、安定化
   酵素溶液容積の約50％以下である特許請求の範囲
   第６５項に記載の総コレステロール測定用安定化
   酵素溶液の製法。 ６８ 前記界面活性剤が、安定化酵素溶液容積の
   約0.5乃至約2.5％である特許請求の範囲第６５項
   に記載の総コレステロール測定用安定化酵素溶液
   の製法。 ６９ 前記コール酸金属塩が、コール酸ナトリウ
   ムである特許請求の範囲第６５項または第６６項
   に記載の総コレステロール測定用安定化酵素溶
   液。 ７０ 前記ポリヒドロキシ有機化合物が、グリセ
   リン、エチレングリコール、ソルビトール、プロ
   ピレングリコールから成る群から選択したもので
   ある特許請求の範囲第６５または第６７項に記載
   の総コレステロール測定用安定化酵素溶液の製
   法。 ７１ 前記界面活性剤が、ポリエチレングリコー
   ル−ｐ−イソオクチルフエニルエーテルである特
   許請求の範囲第６５項または第６８項に記載の総
   コレステロール測定用安定化酵素溶液の製法。 ７２ 前記コレステロールオキシダーゼが、シユ
   ードモナス属スプーリ、ノカルジア属エリスロポ
   リス、ブレビバクテリウム属ステロリクムから成
   る群から選択した微生物から得たものである特許
   請求の範囲第６５項に記載の総コレステロール測
   定用安定化酵素溶液の製法。 ７３ 前記緩衝液が、約６乃至約８のPHを提供す
   るものである特許請求の範囲第６５項に記載の総
   コレステロール測定用安定化酵素溶液の製法。 ７４ 前記緩衝液が、第一燐酸カリウム及び水酸
   化ナトリウムである特許請求の範囲第６５項また
   は第７３項に記載の総コレステロール測定用安定
   化酵素溶液の製法。 ７５ 前記ペルオキシダーゼが、西洋わさびから
   得たものである特許請求の範囲第６５項に記載の
   総コレステロール測定用安定化酵素溶液の製法。 ７６ 前記４−アミノアンチピリンが、安定化酵
   素溶液150mlに対して約22.5乃至約67.5mgである
   特許請求の範囲第６５項に記載の総コレステロー
   ル測定用安定化酵素溶液の製法。 ７７ コレステロールエステラーゼを含有する前
   記緩衝液の第１部分にフエノールを添加する段階
   をも有する特許請求の範囲第６５項に記載の総コ
   レステロール測定用安定化酵素溶液の製法。 ７８ 前記フエノールが、安定化酵素溶液150ml
   に対して約0.75乃至約2.25ｇである特許請求の範
   囲第７７項に記載の総コレステロール測定用安定
   化酵素溶液の製法。 ７９ (a) PHが約４乃至約９の緩衝液を調製し、 (b) 前記緩衝液の第１部分にコール酸ナトリウ
   ム、コレステロールエステラーゼ、ポリヒドロ
   キシ有機化合物及び界面活性剤を溶解し、前記
   緩衝液の第２部分にコレステロールオキシダー
   ゼを溶解し、溶解したコレステロールオキシダ
   ーゼをコレステロールエステラーゼを含有する
   前記緩衝液の第１部分に添加し、前記緩衝液の
   第３部分にペルオキシダーゼを溶解し、溶解し
   たペルオキシダーゼをコレステロールエステラ
   ーゼを含有する前記緩衝液の第１部分に添加
   し、コレステロールエステラーゼを含有する前
   記緩衝液の第１部分に４−アミノアンチピリン
   を溶解することにより第１溶液である酵素濃縮
   溶液を調製し、 (c) 前記緩衝液の第４部分にフエノール及び界面
   活性剤を溶解することにより第２溶液である呈
   色剤希釈溶液を調製する 段階から成ることを特徴とする総コレステロール
   測定用安定化酵素溶液の製法。 ８０ 前記コール酸金属塩が、安定化酵素溶液
   150mlに対して約2.25ｇ以下である特許請求の範
   囲第７９項に記載の総コレステロール測定用安定
   化酵素溶液の製法。 ８１ 前記ポリヒドロキシ有機化合物が、安定化
   溶液容積の約50％以下である特許請求の範囲第７
   ９項に記載の総コレステロール測定用安定化酵素
   溶液の製法。 ８２ 前記界面活性剤が、安定化酵素溶液容積の
   約0.5乃至約2.5％である特許請求の範囲第７９項
   に記載の総コレステロール測定用安定化酵素溶液
   の製法。 ８３ 前記コール酸金属塩が、コール酸ナトリウ
   ムである特許請求の範囲第７９項または第８０項
   に記載の総コレステロール測定用安定化酵素溶液
   の製法。 ８４ 前記ポリヒドロキシ有機化合物が、グリセ
   リン、エチレングリコール、ソルビトール、プロ
   ピレングリコールから成る群から選択したもので
   ある特許請求の範囲第７９項または第８１項に記
   載の総コレステロール測定用安定化酵素溶液の製
   法。 ８５ 前記界面活性剤が、ポリエチレングリコー
   ル−ｐ−イソオクチルフエニルエーテルである特
   許請求の範囲第７９項または第８２項に記載の総
   コレステロール測定用安定化酵素溶液の製法。 ８６ 前記コレステロールオキシダーゼが、シユ
   ードモナス属スプーリ、ノカルジア属エリスロポ
   リス、ブレビバクテリウム属ステロリクムから成
   る群から選択した微生物から得たものである特許
   請求の範囲第７９項に記載の総コレステロール測
   定用安定化酵素溶液の製法。 ８７ 前記緩衝液が、約６乃至約８のPHを提供す
   るものである特許請求の範囲第７９項に記記の総
   コレステロール測定用安定化酵素溶液の製法。 ８８ 前記緩衝液が、第一燐酸カリウム及び水酸
   化ナトリウムである特許請求の範囲第７９項また
   は第８７項に記載の総コレステロール測定用安定
   化酵素溶液の製法。 ８９ 前記ペルオキシダーゼが西洋わさびから得
   たものである特許請求の範囲第７９項に記載の総
   コレステロール測定用安定化酵素溶液の製法。 ９０ 前記４−アミノアンチピリンが、安定化酵
   素溶液150mlに対して約22.5乃至約67.5mgである
   特許請求の範囲第７９項に記載の総コレステロー
   ル測定用安定化酵素溶液の製法。 ９１ 前記フエノールが、安定化酵素溶液150ml
   に対して約0.75乃至約2.25ｇである特許請求の範
   囲第７９項に記載の総コレステロール測定用安定
   化酵素溶液の製法。