ф
00 Изобретение относитс к области медицины, -1 именно к способу опреде лени общего холестерина или св занного холестерина в сыворотке - i крови. Известен способ определени обще го холестерина в сыворотке крови пу тем воздействи на пробу холестерин эстеразой с последующим измерением холестерина после обработки холестеринэстеразой lj . Цель изобретени - повьшение точ ности определени . Поставленна цель достигаетс тем, что согласно способу определени общего холестерина в сыворотке крови путем воздействи на пробу холестеринзстеразой с последующим 1змерением холестерина после обработки холестеринзстеразой, в качестве холестеринэстеразы использую ацетоновый сухой порошок или обогащенную холестеринэстеразную фракцию микробной массы Candida rugosa АТС С 14830 или Rhisopus spec. (WC 90027), которую берут в соотношении 1 - 10 ч. на 1 мл сыворотки. Способ осуществл ют следующим образом. Используют холестеринэстеразу из Candida rugosa (называемой также .Cylindracea) АТСС 14830 или WC 9003 и Aspergillus spec. WS 90030. Оба эти микроорганизма могут примен тьс непосредственно или в растворенной форме, например, какацетоновый сухой порошок. Возможно применение препарата, насьщенного холестеринэстеразой , из этих микроорганизмов причем преимущественно состоит в том, что простым путем можно достич определенного насыщени . Обычна форма представл ет собой стабилизированный лактозой ацетоновый сухой порошок. Подобные благопри тные свойства найдены у следующих препаратов: Actinomyces aureoverticilium WS 90002 Actinomyces cyaneofuscatus WS9U003 Actinomyces griseomycini WS90004 Actinomyces LongisWS90005 porus-fl Actinomyces malachiWS90006 Actinomyces roseolus WS900U7 Actinomyces toxytricini WS 90008 Actinomyces variabilis WS 90009 WS 90010 Streptomyces spec. Streptomyces autotrophicus WS 90011 Streptomyces canesWS 90012 cens Streptomyces chartreusis WS 90013 Streptomyces michiganensis WS 90014 Streptomyces murinus WS 90015 Streptomyces hachijoensis WS 90016 Streptomyces caelesWS 90017 tes Streptomyces tendae WS 90018 Nocardia rubra WS 90019 Candida mycoderena WS 90020 Candida albicans WS 90021 Candida albicans 90022 Candida albicans 90023 Candida spec. WS 90024 Cunninghamella eleWS 90025 gans Mucor mucedo WS 90026 Rhizopus spec. WS 90027 Penicillium spec. WS 90028 Aspergillus spec. WS 90029 Нар ду с предпочтительными холесинэстеразами микробиологического исхождени могут примен тьс же холестеринэстеразы другого исхождени . Преимущество способа сосотоит в , что возможно полное ферментативопределение общего холестерина. этом имеет значение то, что при ощи препаратов холестеринэстераиз микроорганизмов возможно бысти количественное освобождение хотерина из его сложных эфиров. астности, при помощи указанных роорганизмов можно добавлением ледних достигнуть в течение неських минут количественного высождени холестерина. Установлено, обычные стабилизаторы на основе евода, которые примен ют дл их микроорганизмов, в рамках ментативного способа определени : естерина не вли ют на результат еделени . Дл осуществлени способа можно мен ть обогащенную холестеринеразу , преимущественно из микроорганизмов . Соответствующее обогащение можно достигнуть исход из ацетонового сухого порошка микроорганизма или другого биологического материала, подверга его диализу, обработке слабоосновной.анионообмен ной смолой и фракционированию с сульфатом аммони . Таким путем легк достигают 20-30-кратное обогащение холестеринэстеразы. Особенно благопри тные результаты получены с микроорганизмами, которые выращивались на содержащей холестериновый эфир питательной сре де . При этом холестериновый эфир или смесь холестериновых эфиров может добавл тьс во врем выращива ни как единственный источник углерода или примен тьс вместе с други источником углерода. Особенно предпочтительны микроорганизмы, которые получены многостадийным способом . культивировани , причем они культивируютс в первой стадии на соответствующем поставщике углерода, как глицерин, и во второй стадии на холестериновом эфире. Хрлестеринэстераза из Candida rugosa АТСС-14830 имеет в слабокислой области между рН 5 и 6,5 . очень хорошую стойкость. Оптимум рН фермента 7,5. Характерна особеннос фермента заключаетс в том, что осо бенно каталитическа реакци происх дит при сравнительно высоком содержании соли в реакционной среде. Поэтому преимущественно работают с буферным раствором 0,2-0,8 М, особенно 0,4-0,6 М. Величина рН может быть 4,5-7,5, преимущественно 5-6,5 Активность холестеринэстеразы повьшаетс при добавлении поверхностно-активных веществ, особенно гидро ксиполиэтоксидодекана. Последующее определение холестерина производ т ферментативно, .преимущественно с применением холесте- риноксидазы. Можно примен ть также холестериндегидразу или холестери дегидрогеназу . Определение посредством холестериноксидазы по известному способу можно комбинировать с данным способом . При этом можно измер ть расход кислорода, образование H.jOj или образование холестенона. Расход кислорода можно определ т напримеру методом газовой хроматогр фии, пол рометрическим или пол ризационным методами. Образованную перекись водорода,можно определ ть титрометрическим, потенциометрическим , пол рографическим и колориметрическим методами, а также ферментативным . Предпочтительно ферментативное определение с применением каталазы или пероксидазы, особенно определение посредством каталазы в присутствии/3-дикетонов, как ацетилацетон , низших спиртов и содержащего ионы аммони буферного раствора или определение посредством пероксидазы в присутствии хромогена, как 2,2-аминобензтиазолинсульфокислота. Колестенон определ етс при помощи кетореактивов, например 2,4-динитрофенилгидразина , или фотометрическим методом при 240 нм. Пример 1. В сыворотке с применением известного способа определ ют содержание свободного- холестерина 63 мг % (63 мг в 100 мл). Дл определени св занного холестерина сравнительную пробу сыворотки обрабатывают при 70 С раствором едкого кали в спирте. После нейтрализации и повторного измерени имеющегос холестерина получают общее содержание холестерина 181 мг %. Отсюда следует, что 118 мг холестерина 100 мл бьши в св занной форме. Способ повтор лс с необработанной сывороткой, однако к началу определени добавл ли 0,3 мг (в пересчете на протеин) Candida rugosa АТСС 14830 - сухого .ацетонового порошка в торговой форме. Через 3 мин пол рографическое определение показало содержание общего холестерина 183 мг%. Пример 2. Дл увеличени активности холестеринэстеразы аце-тоновый сухой порошок Candida rugosa АТСС-14830 раствор ют в буферном растворе с фосфатом кали при рН 6,0 и подвергают диализу-относительно того же буферного раствора. После удалени содержшцейс в качестве стабилизатора лактозы в подвергнутом диализу растворе получают специфическую активность холестеринэстеразы 0,3 ед/мг протеина. ПолученньЕй таким путем раствор смешивают с модифицированными rjpynпами диэтнла шноэтанола ионообменником на основе декстрана, ионит отдел ют и элюируют при помощи 0,2 М буферного фосфатного раствора при рН 6,0. В элюате получают специфическую активность холестерин эстеразы 1,2 ед/мг. Полученный таким путем рартвор подвергают фракционированию с сульфатом аммони . Осаждающую протеиновую фракцию между 1,8 и 2,4 М сульфатом аммони отдел ют. Она имеет специфическую активность холестерин эстеразы 2,5 ед/мг. Полученный таким образом продукт снова раствор ют в фосфатном буферном растворе с рН 6,0, подвергаю диализу относительно того же буферного раствора до удалени соли и затем хроматографируют на колонне, заполненной такой же анионообменной смолой, как указано. Снова производ т элюирование посредством 0,2 М фосфатного буферного раствора с рН 6,0. Во-фракции с активностью холестеринэстеразы получают специфиче кую активность 7 ед/мг протеина. Полученный таким путем обогащенный препарат холестеринэстеразы при мен ют дл определени холестерина. Однако введенное количество только 0,001 мг в пересчете на протеин. Результат соответствовал примеру 1. П .р и М е р 3. К 0,5 мл сыворотки или холестеринового эталона добавл ют 1,0 мл 0,5 М буферного раствора с фосфатом кали при рН 7,5, который содержит О,,4% гидрокси полиэтоксидодекана, и 2,5 ед холестеринэстеразы по примеру 2. Эта реакщюнна смесь инкубируетс в течение 40 мин при . После этого 0,25 мл этого раствора добавл ют к 3 мл холестеринового реактива, который содержит 2 ч. уксусной кислоты , 3ч. уксусного ангидрида и 1 ч. кислоты (реактив Либермана-Вурхардта ). Использу эталон как сравнительную величину, дл типичной пробы на ход т 170 мг% общего холестерина. Сравнительное определение при омылении холестериновых зфиров посредством раствора едкого кали в спирте дает величину 165 мг%. Пример 4. 0,02 MJ| сыворотки смешивают с 10 мл 0,5 М буферного раствора с фосфатом кальци , который содержит 0,4% гидрокси полиэтоксидодекана, и 0,2 ед холес3 теринэстеразы по примеру 2. Реакционный раствор инкубируют 60 мин при . После этого определ ют экстинкцию (Е) при 240 нм по показани м соответствующего спектрофотометра , реакци начиналась с 0,1 ед стериндегидразы из Brevibacterium sterolicum. Через 15 мин снова считывают по прибору экстинкцию ( Ej). Концентраци образованного Д -холестенона и холестерина получаетс из разности между первым и вторым отсчетом, учитьша мол рный коэффициент экстинкции дл Д -холестенона при 240 нм. Измерение. типичной пробы показало 183 мг% общего холестерина. Сравнительное определение с холестериноксидазой (из Nocardia erythropolis ) вместо стериндегидразы давало 181 мг% общего холестерина. Пример 5. Юг диаммонийгидрофо .сфата раствор ют в 100 мл воды и при помощи 85%-ной фосфорной кислоты устанавливают величину рН 7,0. Затем добавл ют 10 ед каталаэы . Полученным таким путем раствором доливают до 100 мл смесь 0,2 мл ацетилацетона, 10 мл метанола и 0,1 г гидроксиполиэтоксидодекана . В этот раствор добавл етс 2,5 ед холестеринэстеразы из Rhizopus spec. (WS 90027). 5,0 мл полученного таким путем раствора смешивают с 0,02 мл сьюоротки или 0,02 мл холестеринового эталонного раствора с содержанием 200 мг% холестерина. Дел щиес без остатка количества содержащей сыворотку и содержащей холестериновый эталонный раствор пробы смешивают каждое с О,1 ед холестериноксидазы и инкубируют 60 мин при . Затем крас щее вещество измер ют при 405 нм фотометром, учитыва холостую величину пробы. Содержание холестерина в содержащей сыворотку пробе, учитыва эталон как сравнительную величину, 154 мг% всего холестерина. Контрольное определение посредством холестеринэстеразы из Candida rugosa АТСС 14830 вместо холестеринэстеразы из Rhizopus spec. (WS 90027) давгшо такую же величину. 7 Способ позвол ет быстро и точно определить содержащее св занного холестерина в биологической жид- 11681038 . кости, при этом возможно определение холестерина, св занного в сложные эфиры.