DE2917891C2

DE2917891C2 - Verfahren zur Herstellung von Acyl-CoA-Synthetase

Info

Publication number: DE2917891C2
Application number: DE2917891A
Authority: DE
Inventors: Sakayu Shimizu; Yoshiki Kyoto Tani; Hideaki Yamada
Original assignee: Amano Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Amano Enzyme Inc
Priority date: 1978-05-15
Filing date: 1979-05-03
Publication date: 1985-11-07
Also published as: GB2022593B; US4269942A; US4229538A; DE2917891A1; FR2434200B1; GB2022593A; FR2434200A1

Description

züchtet, die Zellen durch Ultraschall aufbricht, die sich ergebende überstehende Flüssigkeit mit Animo· niumsulfat fraktioniert, dann auf eine Sephadex G-200-Säule aufbringt, die aktiven Fraktionen bei 30 bis 50% Sättigung mit Ammoniumsulfat fraktioniert und dann mit DEAE-Cellulose und Sephadex G-200 behandelt, wobei diese Synthetase die physikalischen und chemischen Eigenschaften wie folgt aufweist:

1. Substratspezifität:

Wirkt auf Fettsäuren mit Q-CirKohlenstoßkette, insbesondere m:f Fettsäuren mit langer Ci₆-Ci₈-

Kette unter jeweiliger Bildung des Acyl-CoA je nach der verwendeten Fettsäure 2. Optimaler pH-Wert:

Der optimale pH-Wert liegt nahe 7 bis 8. 3. Optimale Temperatur:

Die optimale Temperatur liegt bei 35 bis 45°C.

4. Stabilität:

Ist in der Lösung (pH 7,4) eines 0,02 m Tris-HCl-Puffers mit 10 mMol 2-Mercaptoäthanol bei 5°C und darunter 7 Tage stabil,. eiterhin 1 Monat darüber in Gegenwart von Glycerin bei einer Endkonzentration von 50% stabil.

5. Einfluß eines Inhibitors:

Hohe Konzentration Laurinsäure, Oleinsäure, Palmitoleinsäure hemmt die Reaktion extrem stark; diese Hemmwirkung wird aber im Fall der gleichzeitigen Anwesenheit von Serumajbumin stark reduziert.

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Acyl-CoA-synthetase gemäß dem Patentanspruch.

Bekanntlich wird Acyl-CoA-synthetase mit starker Aktivität gegenüber langkettigen Ci₆-C|g-Fettsäuren im allgemeinen aus Rattenleber erhalten; es wurde nun jedoch gefunden, daß Acyl-CoA-synthetase aus bestimmten Mikroorganismen erhalten werden kann, und dieses Enzym wird als Acyi-CoA-synthetase LCF-18 bezeichnet. Durch die Verwendung der erfindungsgemäßen Aiyl-CoA-synthetase LCF-18, die eine hohe Aktivität gegenüber langkettigen Ci₆-C_l8-Fettsäuren aufweist, können nicht-veresterte Fettsäuren des Menschen genau bestimmt werden, und dies ist sehr nützlich für die Diagnose von Diabetes usw.

Im allgemeinen ist Acyl-CoA-synthetase ein Enzym, das nicht-veresterte Fettsäure in Gegenwart von CoA, ATP und Mg-Ionen zu Acyl-CoA thioverestert und auch als Thiokinase bezeichnet wird. Diese enzymatische Reaktion verläuft wie folgt:

R—COOH + ATP -JUiL-, _R_co_AMP+PPi

R—CO —AMP+ CoASH ► R —CO—SCoA + AMP

R—COOH + ATP + CoASH > R—CO—SCoA + PPi + AMP

In den letzten Jahren ist mit der Aufklärung der physiologischen Bedeutung nicht-veresterter Fettsäure in vivo eine Zunahme und Abnahme der Menge nicht-veresterter Serumfettsäure zunehmend medizinisch als bedeutend angesehen worden. Beispielsweise wurde gefunden, daß eine extreme Zunahme nicht-veresterter Serum-Fettsäure im Falle von Diabetes zu erkennen ist.

5ί Als Folge hiervon ist eine Zunahme nicht-veresterter Serum-Fettsäure, durch ihre Bestimmung erfaßt, fur die

&: Diagnose des Zustands einer solchen Krankheit wie Diabetes herangezogen worden, aber die nicht-veresterte

I Serum-Fettsäure ist im allgemeinen durch chemisch-colorimetnsche Methoden bestimmt worden. Die che-

■v misch-colorimetrische Methode jedoch erfordert eine große Menge Blut, komplizierte analytische Arbeitsweisen und eine längere Zeit für die Durchführung, was diese Methode unerwünscht macht Dann ist mit der

: jüngsten Entwicklung der Methode für klinische Laborverwendung die quantitative Bestimmung nicht-veresterter Fettsäure nach der sogenannten enzymatischen Methode in jüngster Zeit der Anwendung zugeführt

-.- worden.

ί; Zur quantitativen Bestimmung nicht-veresterter Fettsäure nach der enzymatischen Methode wird nicht-ver-

: esterte Fettsäure und Acyl-CoA-synthetase zu Acyl-CoA umgesetzt und das durch diese Reaktion gebildete Pro-

£. dukt enzymatisch bestimmt, wodurch die Konzentration an nicht-veresterter Fettsäure erhalten wird. Aber hin-

i¹ sichtlich nicht-veresterter Serum-Fettsäure ist, da langkettige Cj₆-Cij-Fettsäuren in großen Mengen in Serum

'[:_. enthalten sind, eine solche Acyl-CoA-synthetase, die in der Lage ist, langkettige C₁₆-Cijj-Fettsäuren zu Acyl-

;,: CoA wirksam thiozuverestern, natürlich erforderlich; jedoch als für diesen Zweck geeignete Acyl-CoA-synthe-

'$■ tase war nur eine solche aus Lebermikrosomen von Ratten bekannt is

■7; Da sich diese Acyl-CoA-synthetase aus Tieren ableitet, ist sie jedoch sehr teuer; daher ist es aus wirtschaft-

:^:, liehen Gründen wünschenswert, eine aus Mikroorganismen stammende Acyl-CoA-synthetase zu erhalten, die

h eine billige Quelle darstellt.

i.:'; Bislang sind als zur Produktion von Acyl-CoA-synthetase befähigte Mikroorganismen die folgenden bekannt:

V-- Eschericbia coli (European Journal of Biochemistry, Bd. 12,576-b"82 [1970]); Bacillus megatsrium, Stamm M 2u

fe (Biochemistry, Bd. 4,85-95 [1965]): Torulopsis Y. (Journal of Bacteriology, Bd, 104,1397-VC*98 [1970]); Pseudomonas22 (Journal ofBacteriology, Bd. 105,1216-1218 [1971]) und Nocardiaasteroides (Journal of Bacterio-

f logy, Bd. 114,249-256 [1973]).

; Da aber alle diese bekannten Stämme als Substratspezifität eine solche Acyl-CoA-synthetase produzieren, die

' optimale Aktivität gegenüber Fettsäuren mit 14 und weniger Kohlenstoffatomen in der Kohlenstoßkette auf-

\ weist, kann ein aus diesen Stämmen stammendes Enzym nicat im klinischen Laboratorium für langkettige

ν C_]6-CirFettsäuren verwendet werden.

y Im Hinblick auf die Acyl-CoA-synthetase, die auf langkettige Ci₆-Ci₈-Fettsäuren ebenso stark einwirkt wie

K eine solche aus Rattenlebermikrosomen. würde, wenn ein solcher Stamm, der die Acyl-CoA-synthetase in

i?i großen Mengen produziert, unter enzymproduzierenden Mikroorganismen gefunden werden könnte, dieser

L eine große gewerbliche Bedeutung aufweisen; unter diesem Gesichtspunkt wurden die vorliegenden Unter-

V suchungen durchgeführt und dabei wurde gefunden, daß solche Stämme, die diese enzymatische Aktivität be-

;: sitzen, unter der Vielzahl von Mikroorganismen existieren,

i Die Figuren veranschaulichen die Erfindung weiter; von diesen zeigt

F i g. 1 ein Schema zur teilweisen Reinigung des erfindungsgemäßen Enzyms durch Behandeln mit Sephadex

L G-200,

'■;■; F i g. 2 ein Schema zur Substratspezifität des erfindungsgemäßen Enzyms gegenüber Fettsäuren mit verschleiß denen Kohlenstoff-Kettenlängen,

! J Fig.3 und Fig. 4 Diagramme zum optimalen pH-Wert und zur optimalen Temperatur des erfindungsge-

fy mäßen Enzyms.

i", Bei Fig. 3 wurde im Fall der pH-Werte von 6,0 bis 8,0 und von 74 bis 9,0 Kaliumphosphat-Puffer bzw. Tris-

i HCl-Puffer verwendet.

^: Im Rahmen der Erfindung wurden zahlreiche Stämme untersucht, die in der Lage sind, Natriumpalmitat als

;;■: Kohlenstoffquelle zu assimilieren, und dann wurde jeder Stamm gezüchtet, den man im Natriuir.palmitat-

Medium wachsen lassen kann, einem Medium (pH 7,0) mit 1% Natriumpalmitat, 0,2% Pepton, 0,1% K₁HPO₄,

1' 0,1% KH₂PO₄,0,05% MgSO₄ · 7 JI₂0,0,03% Hefeextrakt und 0 bis 1,0% Triton X-IOO; solche gezüchteten Zellen

ύ wurden in 0,02 m Kaliumphosphat-Puffer (pH 8) mit 10 mMol 2-Mercaptoäthanol suspendiert und die Zellen wurden durch einen Ultraschalloszillator aufgebrechen, um Acyl-CoA-synthetase zu extrahieren, so daß sich

\;... eine enzymatische Aktivität von Palmitoyl-CoA-synthetase ergab. Tabelle I zeigt eine Reihe der diese enzyma-

ψ tische Aktivität start aufweisenden Stämme.

: Ina übrigen war die Aktivität von Stearyl-CoA-synthetase und die von Palmitoyl-CoA-synthetase dieser

|; Stämme nahezu gleich.

y^:- Tabelle I

ΪΛ ,—

i': Stamm Aktivität der Paltnitoyl-CoA-synthetase

Pseudomonas aeruginosa IFO 3919 0,149 Pseudomonas schuylkilliensis IFO12055 0,055 Pseudomonas synxantha IFO 3906 0,077 Aeromonas hydrophila IFO 3820 0,057 Fusarium oxysporum IFO 5942 0,058 Gibberella fujikuroi IFO 6604 0,080

IU 15

Femer wurde im Rahmen der Erfindung unter den Stämmen von Basidiomyceten eine Auswahl an Stämmen getroffen, die Glucose und/oder Natriumpalmitat als Kohlenstoffquelle zu assimilieren vermögen, und dann wurde jeder Stamm gezüchtet, in dem obigen Medium bzw. in den folgenden Medien wachsen gelassen:

Das eine war ein Medium (pH 4,5) (Glucosemedium: nachfolgend als G-Medium bezeichnet) mit 0,5% Hefeextrakt, 2,0% Glucose und Leitungswasser;

das andere war ein Medium (pH 4,5) (Glucose-Natriumpalmitat-Medium, nachfolgend als G+P-Medium bezeichnet) bestehend aus einem solchen, hergestellt durch Zusatz von 0,5% Natriumpalmitat zum G- Medium;

und die so gezüchteten Zellen wurden jeweils in 0,02 m Kaliumphosphatpuffer (pH 6,5) mit 10 mMol 2-

Mercaptoäthanol suspendiert und mit einem Ultraschall-Oszillator aufgebrochen, um Acyl-CoA-synthe-

tase zu extrahieren.

Tabelle II zeigt mehrere dieser Stämme, die diese enzymatische Aktivität stark aufweisen. Die Aktivität der StearylCoA-synthetase dieser Acyl-CoA-synthetase und der der Palmitoyl-CoA-synthetase war nahezu gleich.

20 25 30 35 40 45 50 55

Stamm

Aktivität von Paimitoyl-CoA-syrühetase

(μΜοΙ/mg/h)

(G) (G+ P)

0,318	0,358
0,397	<0,200
0,262	0,482
0,236	-
<0,200	0,224
0,333	0,421

Gloeophyllum sepiarium IFO 6267 Gloeophyllum trabeum IFO 6430 Gloeophyllum ungulatum IFO 6431 Gloeophyllum trabeum IFO 6509 Pycnoporus coccineus IFO 9768 Trametes sanguinea IFO 6489

Als verwendbares Medium kommen sowohl natürliche als auch synthetische Medien mit Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze in Frage, und Quellen für andere Nährstoffe können außerdem breite Anwendung finden. Als Quellen für Kohlenstoff können folgende verwendet werden: Q-Cis-Fettsäuren, z. B. Oleinsäure, Palmitinsäure, Linolsäure usw. und deren Salze, z. B. das Natrium-, Kaliumsalz usw., sowie Glucose, Fructose, Galactose, Glycerin, Succinat, Citrat, Sorbit oder jede andere gewöhnlich verwendete Verbindung.

Als Quellen für Stickstoff können folgende verwendet werden: anorganische Stickstoffverbindungen, wie Natriumnitrat, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid usw., oder organische Stickstoffverbindungen, wie Pepton, Fleischextrakt, Maisquellwasser, Hefeextrakt usw. Als anorganische Salze können KH₂PO₄, MgSO₄ usw. verwendet werden; außerdem wird Triton X-100 als grenzflächenaktives Mittel verwendet.

Eine bevorzugte Zusammensetzung des Mediums zur Durchführung der Erfindung ist beispielsweise wie folgt: 1,0% Natriumpalmitat oder 0,5% Succinat, 0,3% Pepton, 0,1% K₂HPO₄, 0,03% Hefeextrakt und 0,05% MgSO₄ ■ 7H₂O. Vorteilhafte Kulturbedingungen für das Züchten des Stammes sind 22-37°C für 2 bis 7 Tage unter aeroben Bedingungen.

Die so erhaltene Fermentationsbrühe wird bei vermindertem Druck zentrifugiert oder filtriert, um Zellen zu erhalten, diese werden durch einen Ultraschalloszillator (6 min bei 15°C und darunter) aufgebrochen und der Zentrifugalabscheidung unterworfen, um überstehende Flüssigkeit zu erhalten. Dann wird aus der überstehenden Flüssigkeit Acyl-CoA-synthetase nach folgender Arbeitsweise gereinigt: Zuerst wird die überstehende Flüssigkeit, nämlich die rohe Enzymlösung, mit Ammoniumsulfat (30 bis 45% Sättigung) fraktioniert; dann wird auf eine Sephadex G-200-SäuIe aufgebracht und die aktiven Fraktionen werden bei 30 bis 50% Sättigung mit Ammoniumsulfat fraktioniert, mit DEAE-Celiulose und Sephadex G-200 behandelt, so daß Acyl-CoA-synthetase erhalten wird. Die physikalischen und chemischen Eigenschaften der so erhaltenen Acyl-CoA-synthetase sind wie folgt:

1. Substratspezifität:

Dieses Enzym wirkt auf Fettsäuren mit Q-C^-KohlenstoSkette, insbesondere auf Fettsäuren mit langer Ci6-C_lrKette unter jeweiliger Bildung des Acyl-CoA je nach der verwendeten Fettsäure. 2. Optimaler pH-Wert:

Der optimale pH-Wert des erfindungsgemäßen Enzyms liegt nahe 7 bis 8.

3. Optimale Temperatur:

Die optimale Temperatur des erfindungsgemäßen Enzyms liegt bei 35 bis 45°C.

4. Stabilität:

Das erfindungsgemäße Enzym ist in der Lösung (pH 7,4) eines 0,02 m Tris-HCl-PufFers mit 10 mMol 2-Mer-

captoäthanol bei 5°C und darunter 7 Tage stabil, weiterhin 1 Monat darüber in Gegenwart von Glycerin bei einer Endkonzentration von 50% stabil.

5. Einfluß eines Inhibitors usw.

Hohe Konzentration wasserlöslicher, langkettiger Fettsäure wie Laurinsäure, Oleinsäure, Palmitoleinsäure usw. hemmt die Reaktion extrem stark. Diese Hemmwirkung wird aber im Falle der gleichzeitigen Anwesenheit von Serumalbumin stark reduziert.

Die Aktivität des erfmdungsgemäß erhältlichen Enzyms wurde nach der Methode von Kornberg-Pricer (Journal of Biological Chemistry, Bd. 204,329-343 [1953]) unter Verwendung langkettiger Fettsäuren wie Palmitat {/.,«) oder Stearat (C₁₈) als Substrat bestimmt.

Eine Aktivität (spezifische Aktivität) wird durch die Menge an Hydroxamat (μΜοΙ) repräsentiert, die durch 1 mg Enzymprotein pro h gebildet wird.

Acyl-CoA-synthetase, erfindungsgemäß erhalten, besitzt die Eigenschaft, auf langkettige C^-C^-Fettsäuren genauso wie die aus Rattenlebermikrosomen stammende Acyl-CoA-synthetase einzuwirken. Dies ist das erste Mal, daß eine solche Acyl-CoA-synthetase aus bestimmten Mikroorganismen jemals aufgefunden worden ist; daher wird die erfindungsgemäße Acyl-CoA-synthetase als Acyl-CoA-synthetase LCF-18 bezeichnet.

Acyl-CoA-synthetase LCF-18 wird aus bestimmten Mikroorganismen erhalten; daher kann sie in großem industriellem Maßstab produziert werden, und da sie eine starke Aktivität gegenüber langkettigen Ci₆-Ci₈-FeU-säuren besitzt, ist sie äußerst brauchbar zur Bestimmung von nicht-veresterter Fettsäure im Humanserum.

Die quantitative Bestimmungsmethode für nicht-veresterte Serum-Fettsäure unter Verwendung von Acyl-CüA-Syfiiuciäsc LCF-IS ist wie fuigi:

Umsetzen von Acyl-CoA-synthetase LCF-18 mit nicht-veresterter Serum-Fettsäure in Gegenwart von ATP und CoA, Umsetzen von Myokinase mit so gebildetem AMP in Gegenwart von ATP, Umsetzen von Pyruvatkinase mit so gebildetem ADP in Gegenwart von Phosphoenolpyruvat und dann Umsetzen von Lactatdehydrogenase mit so gebildetem Pyruvat in Gegenwart von NADH und damit Umwandlung von NADH in NAD; dann wird die Konzentration der erhaltenen reduzierten NADH bei 340 nm gemessen. Diese Reaktion kann durch die folgenden Gleichungen (1) bis (4) veranschaulicht werden:

NEFA + CoA + ATP
Acyl-CoA-synthetase LCF-18

Acyl-CoA + AMP + PPi (1)

Myokinase

AMP+ ATP ► 2ADP (2)

2 ADP + 2 Phosphoenolpyruvat
Pyruvatkinase

2 ATP + 2 Pyruvat (3)

2 Pyruvat + 2 NADH

45

Lactat-dehydrogenase

2Lactat + 2NAD (4)

50

Nach der erfindungsgemäßen Methode kann nicht-veresterte Serum-Fettsäure quantitativ genau bestimmt werden, und die Diagnose von Diabetes usw. ist leicht durchzuführen.
Die Erfindung wird nun im folgenden Beispiel beschrieben:

Beispiel 1

500-ml-Sakaguchi-Kolben mit jeweils 200 ml eines Hauptmediums werden vorbereitet. Das Hauptmedium (10 1, pH 6,4) setzt sich aus 0,5% Succinat, 0,3% Pepton, 0,1% K₂HPO₄,0,03% Hefeextrakt und 0,05% MgSO₄ · 7 H₂O zusammen und wird vor der Verwendung 20 min bei 12O⁰C sterilisiert. Jeder Kolben wird mit 2 ml einer Impfkulturflüssigkeit von Pseudomonas aeruginosa IFO 3919 inokuliert, die zuvor durch Einimpfen des Stammes in ein Impfmedium (pH 6,4) aus 1% Glucose, 1,5% Pepton, 0,3% K₂HPO₄ und 0,02% MgSO₄ · 7H₂O und anschließendes Inkubieren erhalten worden ist Der Kolben wird 24 h bei 28°C aerob inkubiert, danach wird die so erhaltene Kulturbrühe zentrifugiert, um 45 g nasser Zellen zu erhalten. Diese nassen Zellen werden mit 100 ml 0,02 m Kaliumphosphatpuffer (pH 8,0) mit 10 mMol 2-Mercaptoäthanol versetzt, durch Ultraschall aufgebrochen und dann zentrifugiert (mit 25 000 g), und so werden96 ml einer überstehenden Flüssigkeit erhalten. Diese überstehende Flüssigkeit zeigt eine spezifische Aktivität der Acyl-CoA-synthetase von 0,230 μΜοΙ/mg/h als Palmitoyl-CoA-synthetase- Aktivität

Beispiel 2

500-ml-Sakaguchi-Kolben mit jeweils 200 ml eines Hauptmediums werden vorbereitet. Das Hauptmedium (101, pH 7,0) setzt sich aus 0,5% Glucose, 0,5% Natriumpalmitat, 0,3% Pepton, 0,1% K₂HPO₄,0,03% Hefeextrakt und 0,05% MgSO₄ · 7 H₂O zusammen und wird vor Gebrauch 20 min bei 12O⁰C sterilisiert. Jeder Kolben wird mit 2 ml einer Impfkulturflüssigkeit von Gibberella fujikuroi IFO 6604 beimpft, die zuvor durch Einimpfen des Stammes ^!n ein Impfmedium (pH 7,0) aus 1% Glucose, 1,5% Pepton,0,3% K₂HPO₄ und 0,02%MgSO₄ · 7 H₂O und anschließs-ades Inkubieren erhalten worden ist. Der Kolben wird 24 h bei 3O⁰C aerob inkubiert; darauf wird die so erhaltene Kulturbrühe zentrifugiert und liefert 45 g nasse Zellen. Die so erhaltenen nassen Zellen werden mit

ίο 100 ml eines 0,02 m Kaliumphosphat-Puffers (pH 8,0) mit 10 mMol 2-Mercaptoäthanol versetzt, durch Ultraschall aufgebrochen (6 min bei 15°C und darunter) und dann (bei 25 000 g) zentrifugiert, um 95 ml überstehende Flüssigkeit zu ergeben. Die so erhaltene überstehende Flüssigkeit zeigt eine spezifische Aktivität von Acyl-CoA-synthetase von 0,142 μΜοΙ/mg/h als Palmitoyl-CoA-synthetase-Aktivität.

is Beispiel 3

Ähnlich wie in Beispiel 1 wird Pseudomonas synxantha IFO 3906 kultiviert, um 40 g nasser Zellen zu erhalten. Die so erhaltenen nassen Zellen werden mit 100 ml 0,02 m Kaliumphosphatpuffer (pH 8,0) mit 10 mMol 2-Mercaptoäthanol versetzt, durch Ultraschall aufgebrochen (6 min bei 15⁰C und darunter), gefolgt von der Zentrifugalabscheidung (bei 25 000 g), um 90 ml überstehende Flüssigkeit zu ergeben. Die so erhaltene überstehende Flüssigkeit zeigt eine spezifische Aktivität von Acyl-CoA-synthetase von 0,180 μΜοΙ/mg/h als Palmitoyl-CoA-synthetase-Aktivität.

Beispiel 4

Fusarium oxysporuro IFO 5942 wird gezüchtet, um 40 g nasse Zellen zu erhalten. Die so erhaltenen nassen Zellen werden mit 100 ml 0,02 m Kaliumphosphatpuffer (pH 8,0) mit 10 mMol 2-Mercaptoäthanol, 1% Triton X-100, 1 mMol MgCl₂ und 1 mMol ÄDTA versetzt, durch Ultraschall (6 min bei 15⁰C und darunter) aufgebrachen und dann (bei 12 000 g) zentrifugiert, um 95 ml überstehende Flüssigkeit zu liefern. Die so erhaltene überstehende Flüssigkeit hat eine spezifische Aktivität von Acyl-CoA-synthetase von 0,15 μΜοΙ/mg/h als PaI-mitoyl-CoA-synthetase-Aktivität.

Beispiel 5

Ahnlich wie in Beispiel 1 wird Aeromonas hydrophila IFO 3820 kultiviert, um 42 g nasser Zellen zu erhalten. So erhaltene nasse Zellen werden mit 100 ml 0,02 m Kaliumphosphatpuffer (pH 8,0) mit 10 mMol 2-Mercaptoäthano! versetzt, durch uiiraschaii (6 min bei 15°C und darunter) aufgebrochen, dann (bei 25 ööö g) der Zentrifugalabscheidung unterworfen, um 98 ml überstehende Flüssigkeit zu liefern. Die so erhaltene überstehende Flüssigkeit hat eine spezifische Aktivität von Acyl-CoA-synthetase von 0,057 μΜοΙ/mg/h als Palmitoyl-CoA-synthetase-Aktivität.

Beispiel 6

Ähnlich wie in Beispiel 1 wird Pseudomonas schuylkilliensis IFO 12055 gezüchtet, um 40 g nasser Zellen zu erhalten. So erhaltene nasse Zellen werden mit 100 ml 0,02 m Kaliumphosphatpuffer (pH 8,0) mit 10 mMol 2-Mercaptoäthanol versetzt, durch Ultraschall (6 min bei 15°C und darunter) aufgebrochen, dann (bei 25 000 g) der Zentrifugalabscheidung unterworfen, um 95 ml überstehende Flüssigkeit zu liefern. So erhaltene überstehende Flüssigkeit hat die spezifische Aktivität von Acyl-CoA-synthetase von 0,055 μΜοΙ/mg/h als Palmitoyl-CoA-synthetase-Aktivität.

Beispiel 7

500-ml-Sakaguchi-Kolben mit jeweils 200 ml eines Hauptmediums werden vorbereitet. Das Hauptmedium (101, pH 4,5) setzt sich aus 2,0% Glucose, 0,5% Natriumpalmitat, 0,3% Pepton, 0,1% K₂HPO₄,0,5% Hefeextrakt

und 0,05% MgSO₄ · 7 H₂O zusammen und wird vor Gebrauch 20 min bei 120⁰C sterilisiert. Jeder Kolben wird mit 2 ml einer Impfkulturflüssigkeit von Gloeophyllum sepiarium IFO 6267 beimpft, die zuvor durch Einimpfen des Stammes in ein Impfmedium (pH 4,5) mit 1 % Glucose, 1,5% Pepton, 0,3 % K₃HPO₄ und 0,02% MgSO₄ · 7 H₂O und anschließendes Inkubieren erhalten worden ist Der Kolben wird 5 Tage bei 28°C aerob inkubiert; dann wird die so erhaltene Kulturbrühe bei vermindertem Druck filtriert, um 45 g nasser Zellen zu liefern. So erhaltene nasse Zellen werden mit 100 ml 0,02 m Kaliumphosphatpuffer (pH 6,5) mit 10 mMol 2-Mercaptoäthanol versetzt, durch Ultraschall (6 min bei 15°C und darunter) aufgebrochen und dann (bei 25 000 g) zentrifugiert, um 96 ml überstehende Flüssigkeit zu liefern. So erhaltene überstehende Flüssigkeit hat eine spezifische Aktivität von Acyl-CoA-synthetase von 0,358 μΜοΙ/mg/h als Palmitoyl-CoA-synthetase-Aktivität

Beispiel δ

500-ml-Sakaguchi-Kolben mit jeweils 200 ml eines Hauptmediums werden vorbereitet Das Hauptmedium (10 Ϊ, pH 4,5) setzt sich aus 2,0% Glucose, 0,3 % Pepton, 0,1% K₂HPO₄,04% Hefeextrakt und 0,05% MgSO₄ · 7 H₂O

Ι zusammen und wird vor Gebrauch 20 min bei 120⁰C sierilisiert. Jeder Kolben wird mit 2 ml einer Impfkultur-

'■ flüssigkeit von Gloeophyllum trabeum IFO 6430 beimpft, die zuvor durch Einimpfen des Stammes in ein Impf-

..;■ medium (pH 4,5) aus 1% Glucose, 1,5% Pepton, 0,3% K₂HPO₄ und 0,02% MgSO₄ · 7 H₂O mit anschließender

: Inkubation erhalten worden war. Der Kolben wird 5 Tage bei 28°C aerob inkubiert; darauf wird die so erhaltene

' Kulturbrühe bei vermindertem Druck filtrier!, um 48 g nasser Zellen zu liefern. So erhaltene nasse ZeHen wer-

: den mit 100 ml 0,02 m Kaliumphosphatpuffer (pH 6,5) mit 10 mMol 2-Mercaptoäthanol, 1% Triton X-100,

j 1 mMol MgCl₂ und 1 mMol ÄDTA versetzt, durch Ultraschall (6 min bei 15°C oder darunter) aufgebrochen un<s

M dann (bei 12 000 g) zentrifugiert, um 98 mi überstehende Flüssigkeit zu ergeben. Die so erhaltene überstehende

'} Flüssigkeit zeigt spezifische Acyl-CoA-synthetase-Aktivität von 0,397 μΜοΙ/mg/h als Palmitoyl-CoA-synthe-

■] tase-Aktivität.

Beispiel 9

Ähnlich wie in Beispiel 7 wird Gloeophyllum ungulatuip. IFO 6431 kultiviert, um 40 g nasser Zellen zu erhalten. So erhaltene nasse Zellen werden mit 100 ml 0,02 m Kaliumphosphatpuffer (pH 6,5) mit 10 mMol 2-Mercaptoäthanol versetzt, durch Ultraschall (6 min bei 15⁰C und darunter) aufgebrochen und dann (bei 25 000 g) der Zentrifugalabscheidung unterworfen, um 90 ml überstehende Flüssigkeit zu liefern. Die so erhaltene Flüssigkeit zeigt spezifische Acyl-CoA-synthetase-Aktivität von 0,482 μΜοΙ/mg/h als Palmitoyl-CoA-synthetase-Aktivität.

!

ι Beispiel 10

; Ähnlich wie in Beispiel 8 wird Gloeophyllum trabeum IFO 6509 kultiviert, um 40 g nasser Zellen zu erhalten.

So erhaltene nasse Zellen werden mit 0,02 m Kaliumphosphatpuffer (pH 6,5) mit 10 mMol 2-Mercaptoäthanol, 1% Triton X-100,1 mMol MgCl₂ und 1 mMol ÄDTA versetzt, durch Ultraschall (6 min bei 15⁰C und darunter) aufgebrochen und dann (bei 12 000 g) zentrifugiert, um 95 ml überstehender Flüssigkeit zu liefern. So erhaltene überstehende Flüssigkeit hat eine spezifische Aktivität von Acyl-CoA-synthetase von 0,236 μΜοΙ/mg/h als Palmitoyl-CoA-synthetase-Aktivität.

^: Beispiel 11

Ähnlich wie in Beispiel 7 wird Pycnoporus coccineus IFO 9768 kultiviert, um 42 g nasser Zellen zu erhalten. So erhaltene nasse Zellen werden mit 100 ml 0,02 m Kaliumphosphatpuffer (pH 6,5) mit 10 mMol 2-Mercapto-

ι äthanol versetzt, durch Ultraschall (6 min bei 15°C oder darunter) aufgebrochen, darauf der Zentrifugalabscheidung (bei 25 000 g) unterworfen, um 98 ml überstehende Flüssigkeit zu liefern. So erhaltene überstehende Flüssigkeit zeigt eine spezifische Aktivität von Acyl-CoA-synthetase von 0,224 μΜοΙ/mg/h als Palmitoyl-CoA-

L! synthetase-Aktivität

·,■; Beispiel 12

Ahnlich wie in Beispiel 7 wird Trametes linea IFO 6489 kultiviert, um 40 g nasser Zellen zu erhalten. So erhaltene nasse Zellen werden mit 100 ml υ,02 in Kaliumphosphatpuffer (pH 6,5) mit 10 mMol 2-Mercaptoäthanol versetzt, durch Ultraschall (6 min bei 15°C und darunter) aufgebrochen, darauf der Zentrifugalabsrheidung (bei 25 000 g) unterworfen, um 95 ml überstehende Flüssigkeit zu liefern. So erhaltene überstehende V₁Ussigkeit zeigt eine spezifische Aktivität von Acyl-CoA-synthetase von 0,421 μΜοΙ/mg/h als Palmitoyl-CoA-synthetase.

'{■'. Beispiel 13

> 500 ml Acyl-CoA-synthetase-enthaltende Flüssigkeit (Palmitoyl-CoA-synthetase-Aktivität 0,230

|h μΜοΙ/mg/h), nach Beispiel 1 erhalten, wurden mit Ammoniumsulfat (25 bis 45% Sättigung) fraktioniert, darauf k gegen 0,02 m Kaliumphosphatpuffer dialysiert. Die dialysierte Lösung wurde auf eine DEAE-Cellulose-Säule H (11 X 25 cm) aufgebracht, die mit dem gleichen Puffer ins Gleichgewicht gebracht worden war. Nach dem fs Waschen der Säule mit 0,02 m Kaliumphosphatpuffer, pH 8,0, mit 0,075 m KCl (61) wurde das Enzym mit 0,02 m Il Kaliumphosphatpuffer, pH 8,0, mit 0,3 m KCl eluiert. Aktive Fraktionen wurde mit Ammoniumsulfat (30 bis 50% Sättigung) fraktioniert, durch eine Sephadex G-200-Säule (3 ^ x 105 cm) geführt, mit 0,02 m Kaliumphosphatpuffer, pH 8,0, ins Gleichgewicht gebracht. Das Enzym wurde durch Ultrafiltration konzentriert, gegen 0,005 m Kaliumphosphatpuffer, pH 7,0, dialysiert und auf eine Hydroxylapatit-Säule (3,5 x 10 cm), mit dem gleichen Puffer ins Gleichgewicht gebracht, gebracht Elution erfolgte unter linearem Gradienten des Kaliumphosphatpuffers (0,02 bis 0,4 m, 500 ml). Aktive Fraktionen wurden wie oben konzentriert, gegen 0,02 m Kalium- phosphatpuffer, pH 8,0, dialysiert und mit 4/10 Volumen Glycerin gemischt. Das endgültige Präparat hatte 60fache spezifische Aktivität gegenüber zellfreiem Extrakt mit 26% Ausbeute. Das Enzym war wenigstens 4 Monate bei Lagerung bei -20⁰C stabil.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung von Acyl-CoA-Synthetase LCF-18 durch Züchtung von Mikroorganismen und Isolierung der Acyl-CoA-Synthetase aus den gezüchteten Zellen, d a d u r c h g e k e η η ζ c i c h η e t, daß man S einen Stamm aus der Gruppe

(1) Pseudomonas aeruginosa IFO 3919,

(2) Gibberella fujikuroi IFO 6604,

(3) Pseudomonas synxantha IFO 3906, (4) Fusarium oxysporum IFO 5942,

(5) Aeromonas hydrophila IFO 3820,

(6) Pseudomonas schuylkilliensis IFO 12055,

(7) Gloeophyllum sepiarium IFO 6267,

(8) Gloeophyllum trabeum IFO 6430, (9) Gloeophyllum ungulatum IFO 6431,

(10) Gloeophyllum trabeum IFO 6509,

(11) Pycnoporus coccineus IFO 9768 und

(12) Trametes sanguinea IFO 6489