DE2917891C2 - Verfahren zur Herstellung von Acyl-CoA-Synthetase - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von Acyl-CoA-SynthetaseInfo
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Description
züchtet, die Zellen durch Ultraschall aufbricht, die sich ergebende überstehende Flüssigkeit mit Animo·
niumsulfat fraktioniert, dann auf eine Sephadex G-200-Säule aufbringt, die aktiven Fraktionen bei 30 bis 50%
Sättigung mit Ammoniumsulfat fraktioniert und dann mit DEAE-Cellulose und Sephadex G-200 behandelt,
wobei diese Synthetase die physikalischen und chemischen Eigenschaften wie folgt aufweist:
1. Substratspezifität:
Kette unter jeweiliger Bildung des Acyl-CoA je nach der verwendeten Fettsäure
2. Optimaler pH-Wert:
Der optimale pH-Wert liegt nahe 7 bis 8.
3. Optimale Temperatur:
4. Stabilität:
Ist in der Lösung (pH 7,4) eines 0,02 m Tris-HCl-Puffers mit 10 mMol 2-Mercaptoäthanol bei 5°C und
darunter 7 Tage stabil,. eiterhin 1 Monat darüber in Gegenwart von Glycerin bei einer Endkonzentration von 50% stabil.
5. Einfluß eines Inhibitors:
Hohe Konzentration Laurinsäure, Oleinsäure, Palmitoleinsäure hemmt die Reaktion extrem stark;
diese Hemmwirkung wird aber im Fall der gleichzeitigen Anwesenheit von Serumajbumin stark reduziert.
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Acyl-CoA-synthetase gemäß dem Patentanspruch.
Bekanntlich wird Acyl-CoA-synthetase mit starker Aktivität gegenüber langkettigen Ci6-C|g-Fettsäuren im
allgemeinen aus Rattenleber erhalten; es wurde nun jedoch gefunden, daß Acyl-CoA-synthetase aus bestimmten
Mikroorganismen erhalten werden kann, und dieses Enzym wird als Acyi-CoA-synthetase LCF-18 bezeichnet.
Durch die Verwendung der erfindungsgemäßen Aiyl-CoA-synthetase LCF-18, die eine hohe Aktivität gegenüber
langkettigen Ci6-Cl8-Fettsäuren aufweist, können nicht-veresterte Fettsäuren des Menschen genau
bestimmt werden, und dies ist sehr nützlich für die Diagnose von Diabetes usw.
Im allgemeinen ist Acyl-CoA-synthetase ein Enzym, das nicht-veresterte Fettsäure in Gegenwart von CoA,
ATP und Mg-Ionen zu Acyl-CoA thioverestert und auch als Thiokinase bezeichnet wird. Diese enzymatische
Reaktion verläuft wie folgt:
R—COOH + ATP -JUiL-, R_co_AMP+PPi
R—CO —AMP+ CoASH ► R —CO—SCoA + AMP
R—COOH + ATP + CoASH > R—CO—SCoA + PPi + AMP
In den letzten Jahren ist mit der Aufklärung der physiologischen Bedeutung nicht-veresterter Fettsäure in vivo
eine Zunahme und Abnahme der Menge nicht-veresterter Serumfettsäure zunehmend medizinisch als bedeutend
angesehen worden. Beispielsweise wurde gefunden, daß eine extreme Zunahme nicht-veresterter Serum-Fettsäure
im Falle von Diabetes zu erkennen ist.
5ί Als Folge hiervon ist eine Zunahme nicht-veresterter Serum-Fettsäure, durch ihre Bestimmung erfaßt, fur die
&: Diagnose des Zustands einer solchen Krankheit wie Diabetes herangezogen worden, aber die nicht-veresterte
I
Serum-Fettsäure ist im allgemeinen durch chemisch-colorimetnsche Methoden bestimmt worden. Die che-
■v misch-colorimetrische Methode jedoch erfordert eine große Menge Blut, komplizierte analytische Arbeitsweisen und eine längere Zeit für die Durchführung, was diese Methode unerwünscht macht Dann ist mit der
: jüngsten Entwicklung der Methode für klinische Laborverwendung die quantitative Bestimmung nicht-veresterter Fettsäure nach der sogenannten enzymatischen Methode in jüngster Zeit der Anwendung zugeführt
-.-
worden.
ί; Zur quantitativen Bestimmung nicht-veresterter Fettsäure nach der enzymatischen Methode wird nicht-ver-
: esterte Fettsäure und Acyl-CoA-synthetase zu Acyl-CoA umgesetzt und das durch diese Reaktion gebildete Pro-
£. dukt enzymatisch bestimmt, wodurch die Konzentration an nicht-veresterter Fettsäure erhalten wird. Aber hin-
i1 sichtlich nicht-veresterter Serum-Fettsäure ist, da langkettige Cj6-Cij-Fettsäuren in großen Mengen in Serum
'[:_.
enthalten sind, eine solche Acyl-CoA-synthetase, die in der Lage ist, langkettige C16-Cijj-Fettsäuren zu Acyl-
;,: CoA wirksam thiozuverestern, natürlich erforderlich; jedoch als für diesen Zweck geeignete Acyl-CoA-synthe-
'$■
tase war nur eine solche aus Lebermikrosomen von Ratten bekannt is
■7;
Da sich diese Acyl-CoA-synthetase aus Tieren ableitet, ist sie jedoch sehr teuer; daher ist es aus wirtschaft-
::, liehen Gründen wünschenswert, eine aus Mikroorganismen stammende Acyl-CoA-synthetase zu erhalten, die
h eine billige Quelle darstellt.
i.:'; Bislang sind als zur Produktion von Acyl-CoA-synthetase befähigte Mikroorganismen die folgenden bekannt:
fe (Biochemistry, Bd. 4,85-95 [1965]): Torulopsis Y. (Journal of Bacteriology, Bd, 104,1397-VC*98 [1970]); Pseudomonas22 (Journal ofBacteriology, Bd. 105,1216-1218 [1971]) und Nocardiaasteroides (Journal of Bacterio-
f
logy, Bd. 114,249-256 [1973]).
; Da aber alle diese bekannten Stämme als Substratspezifität eine solche Acyl-CoA-synthetase produzieren, die
' optimale Aktivität gegenüber Fettsäuren mit 14 und weniger Kohlenstoffatomen in der Kohlenstoßkette auf-
\
weist, kann ein aus diesen Stämmen stammendes Enzym nicat im klinischen Laboratorium für langkettige
ν C]6-CirFettsäuren verwendet werden.
y
Im Hinblick auf die Acyl-CoA-synthetase, die auf langkettige Ci6-Ci8-Fettsäuren ebenso stark einwirkt wie
i?i großen Mengen produziert, unter enzymproduzierenden Mikroorganismen gefunden werden könnte, dieser
L
eine große gewerbliche Bedeutung aufweisen; unter diesem Gesichtspunkt wurden die vorliegenden Unter-
;: sitzen, unter der Vielzahl von Mikroorganismen existieren,
i Die Figuren veranschaulichen die Erfindung weiter; von diesen zeigt
L
G-200,
'■;■;
F i g. 2 ein Schema zur Substratspezifität des erfindungsgemäßen Enzyms gegenüber Fettsäuren mit verschleiß denen Kohlenstoff-Kettenlängen,
! J Fig.3 und Fig. 4 Diagramme zum optimalen pH-Wert und zur optimalen Temperatur des erfindungsge-
fy
mäßen Enzyms.
i", Bei Fig. 3 wurde im Fall der pH-Werte von 6,0 bis 8,0 und von 74 bis 9,0 Kaliumphosphat-Puffer bzw. Tris-
i HCl-Puffer verwendet.
: Im Rahmen der Erfindung wurden zahlreiche Stämme untersucht, die in der Lage sind, Natriumpalmitat als
;;■: Kohlenstoffquelle zu assimilieren, und dann wurde jeder Stamm gezüchtet, den man im Natriuir.palmitat-
1' 0,1% KH2PO4,0,05% MgSO4 · 7 JI20,0,03% Hefeextrakt und 0 bis 1,0% Triton X-IOO; solche gezüchteten Zellen
ύ
wurden in 0,02 m Kaliumphosphat-Puffer (pH 8) mit 10 mMol 2-Mercaptoäthanol suspendiert und die Zellen
wurden durch einen Ultraschalloszillator aufgebrechen, um Acyl-CoA-synthetase zu extrahieren, so daß sich
\;... eine enzymatische Aktivität von Palmitoyl-CoA-synthetase ergab. Tabelle I zeigt eine Reihe der diese enzyma-
ψ
tische Aktivität start aufweisenden Stämme.
: Ina übrigen war die Aktivität von Stearyl-CoA-synthetase und die von Palmitoyl-CoA-synthetase dieser
|; Stämme nahezu gleich.
y:-
Tabelle I
ΪΛ ,—
i': Stamm Aktivität der Paltnitoyl-CoA-synthetase
IU
15
Femer wurde im Rahmen der Erfindung unter den Stämmen von Basidiomyceten eine Auswahl an Stämmen
getroffen, die Glucose und/oder Natriumpalmitat als Kohlenstoffquelle zu assimilieren vermögen, und dann
wurde jeder Stamm gezüchtet, in dem obigen Medium bzw. in den folgenden Medien wachsen gelassen:
das andere war ein Medium (pH 4,5) (Glucose-Natriumpalmitat-Medium, nachfolgend als G+P-Medium
bezeichnet) bestehend aus einem solchen, hergestellt durch Zusatz von 0,5% Natriumpalmitat zum G-
Medium;
und die so gezüchteten Zellen wurden jeweils in 0,02 m Kaliumphosphatpuffer (pH 6,5) mit 10 mMol 2-
tase zu extrahieren.
Tabelle II zeigt mehrere dieser Stämme, die diese enzymatische Aktivität stark aufweisen.
Die Aktivität der StearylCoA-synthetase dieser Acyl-CoA-synthetase und der der Palmitoyl-CoA-synthetase
war nahezu gleich.
20
25
30
35
40
45
50
55
Stamm
(μΜοΙ/mg/h)
(G) (G+ P)
0,318 | 0,358 |
0,397 | <0,200 |
0,262 | 0,482 |
0,236 | - |
<0,200 | 0,224 |
0,333 | 0,421 |
Gloeophyllum sepiarium IFO 6267
Gloeophyllum trabeum IFO 6430
Gloeophyllum ungulatum IFO 6431
Gloeophyllum trabeum IFO 6509
Pycnoporus coccineus IFO 9768
Trametes sanguinea IFO 6489
Als verwendbares Medium kommen sowohl natürliche als auch synthetische Medien mit Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze in Frage, und Quellen für andere Nährstoffe können außerdem breite
Anwendung finden. Als Quellen für Kohlenstoff können folgende verwendet werden: Q-Cis-Fettsäuren, z. B.
Oleinsäure, Palmitinsäure, Linolsäure usw. und deren Salze, z. B. das Natrium-, Kaliumsalz usw., sowie Glucose,
Fructose, Galactose, Glycerin, Succinat, Citrat, Sorbit oder jede andere gewöhnlich verwendete Verbindung.
Als Quellen für Stickstoff können folgende verwendet werden: anorganische Stickstoffverbindungen, wie
Natriumnitrat, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid usw., oder organische Stickstoffverbindungen, wie Pepton, Fleischextrakt, Maisquellwasser, Hefeextrakt usw. Als anorganische Salze können KH2PO4, MgSO4 usw.
verwendet werden; außerdem wird Triton X-100 als grenzflächenaktives Mittel verwendet.
Eine bevorzugte Zusammensetzung des Mediums zur Durchführung der Erfindung ist beispielsweise wie
folgt: 1,0% Natriumpalmitat oder 0,5% Succinat, 0,3% Pepton, 0,1% K2HPO4, 0,03% Hefeextrakt und 0,05%
MgSO4 ■ 7H2O. Vorteilhafte Kulturbedingungen für das Züchten des Stammes sind 22-37°C für 2 bis 7 Tage
unter aeroben Bedingungen.
Die so erhaltene Fermentationsbrühe wird bei vermindertem Druck zentrifugiert oder filtriert, um Zellen zu
erhalten, diese werden durch einen Ultraschalloszillator (6 min bei 15°C und darunter) aufgebrochen und der
Zentrifugalabscheidung unterworfen, um überstehende Flüssigkeit zu erhalten. Dann wird aus der überstehenden Flüssigkeit Acyl-CoA-synthetase nach folgender Arbeitsweise gereinigt: Zuerst wird die überstehende
Flüssigkeit, nämlich die rohe Enzymlösung, mit Ammoniumsulfat (30 bis 45% Sättigung) fraktioniert; dann wird
auf eine Sephadex G-200-SäuIe aufgebracht und die aktiven Fraktionen werden bei 30 bis 50% Sättigung mit
Ammoniumsulfat fraktioniert, mit DEAE-Celiulose und Sephadex G-200 behandelt, so daß Acyl-CoA-synthetase erhalten wird. Die physikalischen und chemischen Eigenschaften der so erhaltenen Acyl-CoA-synthetase
sind wie folgt:
1. Substratspezifität:
Dieses Enzym wirkt auf Fettsäuren mit Q-C^-KohlenstoSkette, insbesondere auf Fettsäuren mit langer
Ci6-ClrKette unter jeweiliger Bildung des Acyl-CoA je nach der verwendeten Fettsäure.
2. Optimaler pH-Wert:
3. Optimale Temperatur:
4. Stabilität:
captoäthanol bei 5°C und darunter 7 Tage stabil, weiterhin 1 Monat darüber in Gegenwart von Glycerin bei
einer Endkonzentration von 50% stabil.
5. Einfluß eines Inhibitors usw.
Hohe Konzentration wasserlöslicher, langkettiger Fettsäure wie Laurinsäure, Oleinsäure, Palmitoleinsäure
usw. hemmt die Reaktion extrem stark. Diese Hemmwirkung wird aber im Falle der gleichzeitigen Anwesenheit
von Serumalbumin stark reduziert.
Die Aktivität des erfmdungsgemäß erhältlichen Enzyms wurde nach der Methode von Kornberg-Pricer (Journal
of Biological Chemistry, Bd. 204,329-343 [1953]) unter Verwendung langkettiger Fettsäuren wie Palmitat
{/.,«) oder Stearat (C18) als Substrat bestimmt.
Eine Aktivität (spezifische Aktivität) wird durch die Menge an Hydroxamat (μΜοΙ) repräsentiert, die durch 1
mg Enzymprotein pro h gebildet wird.
Acyl-CoA-synthetase, erfindungsgemäß erhalten, besitzt die Eigenschaft, auf langkettige C^-C^-Fettsäuren
genauso wie die aus Rattenlebermikrosomen stammende Acyl-CoA-synthetase einzuwirken. Dies ist das erste
Mal, daß eine solche Acyl-CoA-synthetase aus bestimmten Mikroorganismen jemals aufgefunden worden ist;
daher wird die erfindungsgemäße Acyl-CoA-synthetase als Acyl-CoA-synthetase LCF-18 bezeichnet.
Acyl-CoA-synthetase LCF-18 wird aus bestimmten Mikroorganismen erhalten; daher kann sie in großem
industriellem Maßstab produziert werden, und da sie eine starke Aktivität gegenüber langkettigen Ci6-Ci8-FeU-säuren
besitzt, ist sie äußerst brauchbar zur Bestimmung von nicht-veresterter Fettsäure im Humanserum.
Die quantitative Bestimmungsmethode für nicht-veresterte Serum-Fettsäure unter Verwendung von Acyl-CüA-Syfiiuciäsc
LCF-IS ist wie fuigi:
Umsetzen von Acyl-CoA-synthetase LCF-18 mit nicht-veresterter Serum-Fettsäure in Gegenwart von ATP
und CoA, Umsetzen von Myokinase mit so gebildetem AMP in Gegenwart von ATP, Umsetzen von Pyruvatkinase
mit so gebildetem ADP in Gegenwart von Phosphoenolpyruvat und dann Umsetzen von Lactatdehydrogenase
mit so gebildetem Pyruvat in Gegenwart von NADH und damit Umwandlung von NADH in NAD; dann
wird die Konzentration der erhaltenen reduzierten NADH bei 340 nm gemessen. Diese Reaktion kann durch die
folgenden Gleichungen (1) bis (4) veranschaulicht werden:
NEFA + CoA + ATP
Acyl-CoA-synthetase LCF-18
Acyl-CoA-synthetase LCF-18
Acyl-CoA + AMP + PPi (1)
Myokinase
AMP+ ATP ► 2ADP (2)
2 ADP + 2 Phosphoenolpyruvat
Pyruvatkinase
Pyruvatkinase
2 ATP + 2 Pyruvat (3)
2 Pyruvat + 2 NADH
45
Lactat-dehydrogenase
2Lactat + 2NAD (4)
50
Nach der erfindungsgemäßen Methode kann nicht-veresterte Serum-Fettsäure quantitativ genau bestimmt
werden, und die Diagnose von Diabetes usw. ist leicht durchzuführen.
Die Erfindung wird nun im folgenden Beispiel beschrieben:
Die Erfindung wird nun im folgenden Beispiel beschrieben:
500-ml-Sakaguchi-Kolben mit jeweils 200 ml eines Hauptmediums werden vorbereitet. Das Hauptmedium
(10 1, pH 6,4) setzt sich aus 0,5% Succinat, 0,3% Pepton, 0,1% K2HPO4,0,03% Hefeextrakt und 0,05% MgSO4 ·
7 H2O zusammen und wird vor der Verwendung 20 min bei 12O0C sterilisiert. Jeder Kolben wird mit 2 ml einer
Impfkulturflüssigkeit von Pseudomonas aeruginosa IFO 3919 inokuliert, die zuvor durch Einimpfen des Stammes
in ein Impfmedium (pH 6,4) aus 1% Glucose, 1,5% Pepton, 0,3% K2HPO4 und 0,02% MgSO4 · 7H2O und
anschließendes Inkubieren erhalten worden ist Der Kolben wird 24 h bei 28°C aerob inkubiert, danach wird die
so erhaltene Kulturbrühe zentrifugiert, um 45 g nasser Zellen zu erhalten. Diese nassen Zellen werden mit 100
ml 0,02 m Kaliumphosphatpuffer (pH 8,0) mit 10 mMol 2-Mercaptoäthanol versetzt, durch Ultraschall aufgebrochen
und dann zentrifugiert (mit 25 000 g), und so werden96 ml einer überstehenden Flüssigkeit erhalten. Diese
überstehende Flüssigkeit zeigt eine spezifische Aktivität der Acyl-CoA-synthetase von 0,230 μΜοΙ/mg/h als
Palmitoyl-CoA-synthetase- Aktivität
500-ml-Sakaguchi-Kolben mit jeweils 200 ml eines Hauptmediums werden vorbereitet. Das Hauptmedium
(101, pH 7,0) setzt sich aus 0,5% Glucose, 0,5% Natriumpalmitat, 0,3% Pepton, 0,1% K2HPO4,0,03% Hefeextrakt
und 0,05% MgSO4 · 7 H2O zusammen und wird vor Gebrauch 20 min bei 12O0C sterilisiert. Jeder Kolben wird mit
2 ml einer Impfkulturflüssigkeit von Gibberella fujikuroi IFO 6604 beimpft, die zuvor durch Einimpfen des
Stammes !n ein Impfmedium (pH 7,0) aus 1% Glucose, 1,5% Pepton,0,3% K2HPO4 und 0,02%MgSO4 · 7 H2O und
anschließs-ades Inkubieren erhalten worden ist. Der Kolben wird 24 h bei 3O0C aerob inkubiert; darauf wird die
so erhaltene Kulturbrühe zentrifugiert und liefert 45 g nasse Zellen. Die so erhaltenen nassen Zellen werden mit
ίο 100 ml eines 0,02 m Kaliumphosphat-Puffers (pH 8,0) mit 10 mMol 2-Mercaptoäthanol versetzt, durch Ultraschall
aufgebrochen (6 min bei 15°C und darunter) und dann (bei 25 000 g) zentrifugiert, um 95 ml überstehende
Flüssigkeit zu ergeben. Die so erhaltene überstehende Flüssigkeit zeigt eine spezifische Aktivität von Acyl-CoA-synthetase
von 0,142 μΜοΙ/mg/h als Palmitoyl-CoA-synthetase-Aktivität.
is Beispiel 3
Ähnlich wie in Beispiel 1 wird Pseudomonas synxantha IFO 3906 kultiviert, um 40 g nasser Zellen zu erhalten.
Die so erhaltenen nassen Zellen werden mit 100 ml 0,02 m Kaliumphosphatpuffer (pH 8,0) mit 10 mMol 2-Mercaptoäthanol
versetzt, durch Ultraschall aufgebrochen (6 min bei 150C und darunter), gefolgt von der Zentrifugalabscheidung
(bei 25 000 g), um 90 ml überstehende Flüssigkeit zu ergeben. Die so erhaltene überstehende
Flüssigkeit zeigt eine spezifische Aktivität von Acyl-CoA-synthetase von 0,180 μΜοΙ/mg/h als Palmitoyl-CoA-synthetase-Aktivität.
Fusarium oxysporuro IFO 5942 wird gezüchtet, um 40 g nasse Zellen zu erhalten. Die so erhaltenen nassen
Zellen werden mit 100 ml 0,02 m Kaliumphosphatpuffer (pH 8,0) mit 10 mMol 2-Mercaptoäthanol, 1% Triton
X-100, 1 mMol MgCl2 und 1 mMol ÄDTA versetzt, durch Ultraschall (6 min bei 150C und darunter) aufgebrachen
und dann (bei 12 000 g) zentrifugiert, um 95 ml überstehende Flüssigkeit zu liefern. Die so erhaltene
überstehende Flüssigkeit hat eine spezifische Aktivität von Acyl-CoA-synthetase von 0,15 μΜοΙ/mg/h als PaI-mitoyl-CoA-synthetase-Aktivität.
Ahnlich wie in Beispiel 1 wird Aeromonas hydrophila IFO 3820 kultiviert, um 42 g nasser Zellen zu erhalten.
So erhaltene nasse Zellen werden mit 100 ml 0,02 m Kaliumphosphatpuffer (pH 8,0) mit 10 mMol 2-Mercaptoäthano!
versetzt, durch uiiraschaii (6 min bei 15°C und darunter) aufgebrochen, dann (bei 25 ööö g) der Zentrifugalabscheidung
unterworfen, um 98 ml überstehende Flüssigkeit zu liefern. Die so erhaltene überstehende
Flüssigkeit hat eine spezifische Aktivität von Acyl-CoA-synthetase von 0,057 μΜοΙ/mg/h als Palmitoyl-CoA-synthetase-Aktivität.
Ähnlich wie in Beispiel 1 wird Pseudomonas schuylkilliensis IFO 12055 gezüchtet, um 40 g nasser Zellen zu
erhalten. So erhaltene nasse Zellen werden mit 100 ml 0,02 m Kaliumphosphatpuffer (pH 8,0) mit 10 mMol 2-Mercaptoäthanol
versetzt, durch Ultraschall (6 min bei 15°C und darunter) aufgebrochen, dann (bei 25 000 g)
der Zentrifugalabscheidung unterworfen, um 95 ml überstehende Flüssigkeit zu liefern. So erhaltene überstehende
Flüssigkeit hat die spezifische Aktivität von Acyl-CoA-synthetase von 0,055 μΜοΙ/mg/h als Palmitoyl-CoA-synthetase-Aktivität.
500-ml-Sakaguchi-Kolben mit jeweils 200 ml eines Hauptmediums werden vorbereitet. Das Hauptmedium
(101, pH 4,5) setzt sich aus 2,0% Glucose, 0,5% Natriumpalmitat, 0,3% Pepton, 0,1% K2HPO4,0,5% Hefeextrakt
und 0,05% MgSO4 · 7 H2O zusammen und wird vor Gebrauch 20 min bei 1200C sterilisiert. Jeder Kolben wird mit
2 ml einer Impfkulturflüssigkeit von Gloeophyllum sepiarium IFO 6267 beimpft, die zuvor durch Einimpfen des
Stammes in ein Impfmedium (pH 4,5) mit 1 % Glucose, 1,5% Pepton, 0,3 % K3HPO4 und 0,02% MgSO4 · 7 H2O und
anschließendes Inkubieren erhalten worden ist Der Kolben wird 5 Tage bei 28°C aerob inkubiert; dann wird die
so erhaltene Kulturbrühe bei vermindertem Druck filtriert, um 45 g nasser Zellen zu liefern. So erhaltene nasse
Zellen werden mit 100 ml 0,02 m Kaliumphosphatpuffer (pH 6,5) mit 10 mMol 2-Mercaptoäthanol versetzt,
durch Ultraschall (6 min bei 15°C und darunter) aufgebrochen und dann (bei 25 000 g) zentrifugiert, um 96 ml
überstehende Flüssigkeit zu liefern. So erhaltene überstehende Flüssigkeit hat eine spezifische Aktivität von
Acyl-CoA-synthetase von 0,358 μΜοΙ/mg/h als Palmitoyl-CoA-synthetase-Aktivität
Beispiel δ
500-ml-Sakaguchi-Kolben mit jeweils 200 ml eines Hauptmediums werden vorbereitet Das Hauptmedium
(10 Ϊ, pH 4,5) setzt sich aus 2,0% Glucose, 0,3 % Pepton, 0,1% K2HPO4,04% Hefeextrakt und 0,05% MgSO4 · 7 H2O
Ι zusammen und wird vor Gebrauch 20 min bei 1200C sierilisiert. Jeder Kolben wird mit 2 ml einer Impfkultur-
'■ flüssigkeit von Gloeophyllum trabeum IFO 6430 beimpft, die zuvor durch Einimpfen des Stammes in ein Impf-
..;■ medium (pH 4,5) aus 1% Glucose, 1,5% Pepton, 0,3% K2HPO4 und 0,02% MgSO4 · 7 H2O mit anschließender
: Inkubation erhalten worden war. Der Kolben wird 5 Tage bei 28°C aerob inkubiert; darauf wird die so erhaltene
' Kulturbrühe bei vermindertem Druck filtrier!, um 48 g nasser Zellen zu liefern. So erhaltene nasse ZeHen wer-
: den mit 100 ml 0,02 m Kaliumphosphatpuffer (pH 6,5) mit 10 mMol 2-Mercaptoäthanol, 1% Triton X-100,
j 1 mMol MgCl2 und 1 mMol ÄDTA versetzt, durch Ultraschall (6 min bei 15°C oder darunter) aufgebrochen un<s
M dann (bei 12 000 g) zentrifugiert, um 98 mi überstehende Flüssigkeit zu ergeben. Die so erhaltene überstehende
'} Flüssigkeit zeigt spezifische Acyl-CoA-synthetase-Aktivität von 0,397 μΜοΙ/mg/h als Palmitoyl-CoA-synthe-
■] tase-Aktivität.
Ähnlich wie in Beispiel 7 wird Gloeophyllum ungulatuip. IFO 6431 kultiviert, um 40 g nasser Zellen zu erhalten.
So erhaltene nasse Zellen werden mit 100 ml 0,02 m Kaliumphosphatpuffer (pH 6,5) mit 10 mMol 2-Mercaptoäthanol
versetzt, durch Ultraschall (6 min bei 150C und darunter) aufgebrochen und dann (bei 25 000 g) der
Zentrifugalabscheidung unterworfen, um 90 ml überstehende Flüssigkeit zu liefern. Die so erhaltene Flüssigkeit
zeigt spezifische Acyl-CoA-synthetase-Aktivität von 0,482 μΜοΙ/mg/h als Palmitoyl-CoA-synthetase-Aktivität.
!
ι Beispiel 10
; Ähnlich wie in Beispiel 8 wird Gloeophyllum trabeum IFO 6509 kultiviert, um 40 g nasser Zellen zu erhalten.
So erhaltene nasse Zellen werden mit 0,02 m Kaliumphosphatpuffer (pH 6,5) mit 10 mMol 2-Mercaptoäthanol,
1% Triton X-100,1 mMol MgCl2 und 1 mMol ÄDTA versetzt, durch Ultraschall (6 min bei 150C und darunter)
aufgebrochen und dann (bei 12 000 g) zentrifugiert, um 95 ml überstehender Flüssigkeit zu liefern. So erhaltene
überstehende Flüssigkeit hat eine spezifische Aktivität von Acyl-CoA-synthetase von 0,236 μΜοΙ/mg/h als
Palmitoyl-CoA-synthetase-Aktivität.
: Beispiel 11
Ähnlich wie in Beispiel 7 wird Pycnoporus coccineus IFO 9768 kultiviert, um 42 g nasser Zellen zu erhalten.
So erhaltene nasse Zellen werden mit 100 ml 0,02 m Kaliumphosphatpuffer (pH 6,5) mit 10 mMol 2-Mercapto-
ι äthanol versetzt, durch Ultraschall (6 min bei 15°C oder darunter) aufgebrochen, darauf der Zentrifugalabscheidung
(bei 25 000 g) unterworfen, um 98 ml überstehende Flüssigkeit zu liefern. So erhaltene überstehende
Flüssigkeit zeigt eine spezifische Aktivität von Acyl-CoA-synthetase von 0,224 μΜοΙ/mg/h als Palmitoyl-CoA-
L! synthetase-Aktivität
·,■; Beispiel 12
Ahnlich wie in Beispiel 7 wird Trametes linea IFO 6489 kultiviert, um 40 g nasser Zellen zu erhalten. So
erhaltene nasse Zellen werden mit 100 ml υ,02 in Kaliumphosphatpuffer (pH 6,5) mit 10 mMol 2-Mercaptoäthanol versetzt, durch Ultraschall (6 min bei 15°C und darunter) aufgebrochen, darauf der Zentrifugalabsrheidung
(bei 25 000 g) unterworfen, um 95 ml überstehende Flüssigkeit zu liefern. So erhaltene überstehende V1Ussigkeit
zeigt eine spezifische Aktivität von Acyl-CoA-synthetase von 0,421 μΜοΙ/mg/h als Palmitoyl-CoA-synthetase.
'{■'. Beispiel 13
> 500 ml Acyl-CoA-synthetase-enthaltende Flüssigkeit (Palmitoyl-CoA-synthetase-Aktivität 0,230
|h μΜοΙ/mg/h), nach Beispiel 1 erhalten, wurden mit Ammoniumsulfat (25 bis 45% Sättigung) fraktioniert, darauf
k gegen 0,02 m Kaliumphosphatpuffer dialysiert. Die dialysierte Lösung wurde auf eine DEAE-Cellulose-Säule
H (11 X 25 cm) aufgebracht, die mit dem gleichen Puffer ins Gleichgewicht gebracht worden war. Nach dem
fs Waschen der Säule mit 0,02 m Kaliumphosphatpuffer, pH 8,0, mit 0,075 m KCl (61) wurde das Enzym mit 0,02 m
Il Kaliumphosphatpuffer, pH 8,0, mit 0,3 m KCl eluiert. Aktive Fraktionen wurde mit Ammoniumsulfat (30 bis
50% Sättigung) fraktioniert, durch eine Sephadex G-200-Säule (3 ^ x 105 cm) geführt, mit 0,02 m Kaliumphosphatpuffer,
pH 8,0, ins Gleichgewicht gebracht. Das Enzym wurde durch Ultrafiltration konzentriert, gegen
0,005 m Kaliumphosphatpuffer, pH 7,0, dialysiert und auf eine Hydroxylapatit-Säule (3,5 x 10 cm), mit dem gleichen
Puffer ins Gleichgewicht gebracht, gebracht Elution erfolgte unter linearem Gradienten des Kaliumphosphatpuffers (0,02 bis 0,4 m, 500 ml). Aktive Fraktionen wurden wie oben konzentriert, gegen 0,02 m Kalium-
phosphatpuffer, pH 8,0, dialysiert und mit 4/10 Volumen Glycerin gemischt. Das endgültige Präparat hatte
60fache spezifische Aktivität gegenüber zellfreiem Extrakt mit 26% Ausbeute. Das Enzym war wenigstens
4 Monate bei Lagerung bei -200C stabil.
Hierzu 2 Blatt Zeichnungen
Claims (1)
- Patentanspruch:Verfahren zur Herstellung von Acyl-CoA-Synthetase LCF-18 durch Züchtung von Mikroorganismen und Isolierung der Acyl-CoA-Synthetase aus den gezüchteten Zellen, d a d u r c h g e k e η η ζ c i c h η e t, daß man S einen Stamm aus der Gruppe(1) Pseudomonas aeruginosa IFO 3919,(2) Gibberella fujikuroi IFO 6604,(3) Pseudomonas synxantha IFO 3906, (4) Fusarium oxysporum IFO 5942,(5) Aeromonas hydrophila IFO 3820,(6) Pseudomonas schuylkilliensis IFO 12055,(7) Gloeophyllum sepiarium IFO 6267,(8) Gloeophyllum trabeum IFO 6430, (9) Gloeophyllum ungulatum IFO 6431,(10) Gloeophyllum trabeum IFO 6509,(11) Pycnoporus coccineus IFO 9768 und(12) Trametes sanguinea IFO 6489
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