DE2559875B1 - Verfahren zur Bestimmung von Cholesterin - Google Patents

Verfahren zur Bestimmung von Cholesterin

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Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren
zur Bestimmung von Cholesterin, und zwar von Gesamtcholesterin oder von gebundenem Cholesterin.
Cholesterin liegt in biologischem Material, wie z. B.
r> Serum u. dgl., teils in freier Form, teils in gebundener Form als Ester vor. Zur Bestimmung von gebundenem Cholesterin oder des gesamten Cholesterins ist es erforderlich, das in gebundener Form vorliegende Cholesterin zuerst freizusetzen. Dies erfolgte bisher durch
-ίο Verseifung unter alkalischen Bedingungen, beispielsweise mit alkoholischer Kalilauge. Nach der Verseifung wird das freigesetzte Cholesterin dann nach einer der bekannten Methoden bestimmt.
Die alkalische Verseifung des gebundenen Cholesterins ist ein störender und zeitraubender Verfahrensschritt. Hinzu kommt, daß die verwendeten relativ aggressiven Reagentien zu einem Abbau des Cholesterins führen können. Um einen solchen Abbau und damit eine Verfälschung der Analysenergebnisse zu
-,n verhindern, muß unter relativ milden Bedindungen hydrolysiert werden, welche wiederum die erforderliche Zeitdauer für die Bestimmung unerwünscht ver-
ern.
Besonders nachteilig ist die alkalische Freisetzung
>5 des Cholesterins dann, wenn anschließend die Bestimmung des Cholesterins nach der bevorzugten enzymatischen Methode mittels Cholesterinoxidase erfolgen soll. Da im stark alkalischen Medium bekanntlich die Enzyme inaktiviert werden, muß das
bo Hydrolysat durch Zusatz von Säure auf pH 5 bis 8 gebracht werden, ehe mit der enzymatischen Bestimmungbegonnen werden kann. All dies führt dazu, daß die Bestimmung des gesamten Cholesterins oder des gebundenen Cholesterins immer noch unerwünscht
b5 lange dauert und zu arbeitsaufwendig ist.
Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein Verfahren zur Bestimmung von Gesamtcholesterin oder gebundenem Cholesterin zu schaffen, welches die obener-
wähnten Nachteile beseitigt.
Erfindungsgemäß gelingt dies durch das im Patentanspruch 1 definierte Verfahren.
Die gemäß Anspruch 1 ausgenommene Verwendung von Cholesterinesterase aus Candida rugosa (bzw. cylindracea) ist bereits Gegenstand der älteren Anmeldung DE-AS 2315501.
Es wurde gefunden, daß mit Cholesterinesterase aus Mikroorganismen eine rasche und quantitative Verseifung von gebundenem Cholesterin durchgeführt werden kann. Da die anschließende Bestimmung des freigesetzten Cholesterins mit Cholesterinoxidase erfolgt, ermöglicht das Verfahren der Erfindung die vollenzymatische Bestimmung des Cholesterins und damit eine entscheidende Verbesserung der medizinischen Routinediagnostik sowie eine leichte Adaption des Verfahrens auf die Durchführung in Analysenautomaten.
Es war zwar bereits bekannt, daß in Pankreas und Leber Cholesterinesterasewirksamkeit vorhanden ist und für die Verseifung von Cholesterinestern in Kombination mit einem Cholesterin oxidierenden System auf Basis von Cholesterinoxidase verwendet werden kann (DE-AS 2224132). Jedoch liegt gebundes Cholesterin in biologischem Material in Form von Estern sehr unterschiedlicher Säuren vor. Im Rahmen eines Analysenverfahrens ist es erwünscht, wenn alle vorkommenden Ester in etwa gleicher Geschwindigkeit und mit gleicher Zuverlässigkeit quantitativ gespalten werden. Bei den bekannten Cholesterinesterasen bestehen jedoch erhebliche Unterschiede hinsichtlich der Wirksamkeit gegenüber verschiedenen Cholesterinestern. Aufgrund der bekannten Eigenschaften dieser Enzyme ist es überraschend, daß die Cholesterinesterasen aus Mikroorganismen in der Lage sind, sämtliche vorkommenden Cholesterinester innerhalb sehr kurzer Zeit quantitativ zu spalten.
Cholesterinesterasen aus Mikroorganismen erwiesen sich hinsichtlich Spaltungsgeschwindigkeit und Wirksamkeit gegenüber unterschiedlichen Cholesterinestern und Cholesterinesterasen anderen Ursprungs als überlegen.
Weiter wurden gefunden, daß verschiedene Mikroorganismen besonders aktive Cholesterinesterasen enthalten und daher im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens ohne Abtrennung und Reinigung der Cholesterinesterasen direkt eingesetzt werden können. Dies hat neben der besonders einfachen Zugänglichkeit auch den Vorteil, daß bei Unterlassung jeder Trennung und Anreicherung der Cholesterinesterase die Gefahr vermieden wird, daß aus der in der Praxis meist vorliegenden Mischung mehrerer, für verschiedene Cholesterinester spezifischer Cholesterinesterasen eine Trennung derselben, die eine quantitative Erfassung alles gebundenen Cholesterins sehr erschweren würde, vermieden wird.
Hinzu kommt noch, daß die Reinigung der meist in Lipoidmembranen gebundenen Cholesterinesterasen umständlich ist und daher zu einem Präparat führt, das aufgrund seines Preises für eine Routinediagnostik weniger gut geeignet ist als ein ohne jegliche Enzymreinigung brauchbares Mikroorganismenpräparat.
Besonders vorteilhafte Ergebnisse wurden beim erfindungsgemäßen Verfahren erhalten unter Verwendung einer Cholesterinesterase aus Aspergillus spec. WS 90030. Dieser Mikroorganismus kann direkt als solcher oder in aufgeschlossener Form, beispielsweise als Acetontrockenpulver, im Rahmen der Erfindung
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eingesetzt werden. Ebenso ist aber natürlich auch die Verwendung eines angereicherten Cholesterinesterasepräparates aus diesem Mikroorganismus möglich, wobei ein besonderer Vorteil darin besteht, daß eine gewisse Anreicherung hier sehr einfach erzielt werden kann. Ähnlich günstige Eigenschaften wurden gefunden bei
Actinomyces aureoverticillium WS 90002
Actinomyces cyaneofuscatus WS 90003
Actinomyces griseomycini WS 90004
Actinomyces longisporus-fl. WS 90005
Actinomyces malachiticus WS 90006
Actinomyces roseolus WS 90007
Actinomyces toxytricini WS 90008
Actinomyces variabilis WS 90009
Streptomyces spec. WS 90010
Streptomyces autotrophicus WS 90011
Streptomyces canescens WS 90012
Streptomyces chartreusis WS 90013
Streptomyces michiganensis WS 90014
Streptomyces murinus WS 90015
Streptomyces hachijoensis WS 90016
Streptomyces caelestes WS 90017
Streptomyces tendae WS 90018
Nocardia rubra WS 90019
Candida mycoderma WS 90020
Candida albicans WS 90021
Candida albicans WS 90022
Candida albicans WS 90023
Candida spec. WS 90024
Cunninghamella elegans WS 90025
Mucor mucedo WS 90026
Rhizopus spec. WS 90027
Penicillium spec. WS 90028
Aspergillus spec. WS 90029
Mit den oben erwähnten bevorzugten Mikroorganismen ist es möglich, durch direkten Zusatz derselben in einer sehr geringen Menge und unter Beibehaltung der pH-Wert- und Temperaturbedingungen, wie sie bei der nachfolgenden enzymatischen Cholesterinbestimmung erwünscht sind, innerhalb weniger Minuten eine quantitative Freisetzung des Cholesterins zu erzielen. Dabei wurde gefunden, daß die üblichen Stabilisierungsmittel auf Kohlehydratbasis, welche für solehe Mikroorganismen verwendet werden, im Rahmen des vollenzymatischen Verfahrens der Cholesterinbestimmung nicht stören.
Wie erwähnt, kann für das erfindungsgemäße Verfahren auch eine abgetrennte und angereicherte Cholesterinesterase aus Mikroorganismen, verwendet werden. Eine geeignete Anreicherung läßt sich erzielen, indem von einem Acetontrockenpulver des Mikroorganismus oder sonstigen biologischen Materials ausgegangen wird und dieses einer Dialyse, einer Behandlung mit schwach-basischem Anionenaustauscher und einer Ammonsulfatfraktionierung unterzogen wird. Auf diese Weise gelingt leicht eine 20- bis 30fache Anreicherung der Cholesterinesterase. Als schwach-basischer Anionenaustauscher erwies sich ein mit Diäthylaminoäthanolgruppen modifiziertes Präparat auf Kohlenhydratbasis als besonders geeignet. Bei der Ammonsulfatfraktionierung wird vorzugsweise die Fraktion zwischen 1,8 und 2,4 Mol Ammonsulfat gewonnen. Die so erhaltene Enzymfraktion wird anschließend vorzugsweise auf dem genannten Austauschermaterial chromatographiert.
Besonders günstige Ergebnisse wurden im Rahmen der Erfindung mit Mikroorganismen erhalten, weiche
auf einem Cholesterinesterhaltigen Nährmedium gezüchtet wurden. Hierbei kann der Cholesterinester oder eine Cholesterinestermischung als einzige Kohlenstoffquelle während der Züchtung zugesetzt werden oder zusammen mit einer anderen Kohlenstoffquelle verwendet werden. Besonders bevorzugt wird die Verwendung von Mikroorganismen, die in einem mehrstufigen Züchtungsverfahren erhalten wurden, wobei sie in der ersten Stufe auf einem geeigneten Kohlenstoff lieferanten, wie Glycerin, und in der zweiten Stufe auf einem Cholesterinester gezüchtet werden. Ein geeignetes Züchtungsverfahren ist beispielsweise in den deutschen Offenlegungsschriften 2224133 und 2307518 beschrieben.
Die Wirksamkeit der Cholesterinesterase wird vorzugsweise durch Zusatz oberflächenaktiver Substanzen gesteigert. Besonders bevorzugt wird ein Zusatz von Hydroxypolyäthoxydodekan.
Die Bestimmung mit Cholesterinoxydase ist beispielsweise beschrieben in der deutschen Offenlegungsschrift 2224132. Das dort beschriebene Verfahren kann vorteilhaft mit dem erfindungsgemäßen Verfahren kombiniert werden. Prinzipiell kann hierbei der Sauerstoffverbrauch, die H2O2-Bildung oder die Cholestenonbildung gemessen werden.
Die Bestimmung des Sauerstoffverbrauchs kann beispielsweise gaschromatographisch, polarometrisch oder nach dem Polarisationsverfahren erfolgen. Diese Bestimmungsmethoden sind an sich bekannt. Gebildetes Wasserstoffperoxyd kann titrimetrisch, potentiometrisch, polarographisch und kolorimetrisch sowie enzymatisch bestimmt werden. Bevorzugt ist die enzymatische Bestimmung unter Verwendung von Katalase oder Peroxydase, insbesondere die Bestimmung mittels Katalase in Gegenwart von ß-Diketonen wie Acetylaceton, niedrigen Alkoholen und Ammoniumionen-haltigem Puffer oder die Bestimmung mittels Peroxydase in Gegenwart eines Chromogens wie 2,2'-Aminobenzthiazolinsulfonsäure. Cholestenon wird mit Hilfe von Ketoreagentien, z. B. 2,4-Dinitrophenylhydrazin oder photometrisch bei 240 nm bestimmt.
Für die vollenzymatische Bestimmung des gesamten oder gebundenen Cholesterins mit Cholesterinoxidase wird vorzugsweise eine solche aus Nocardia erythropolis ATCC 17895, Nocardia erythropolis ATCC 4277, Nocardia formica ATCC 14811 oder Proactinomyces erythropolis NCIB 9158 verwendet.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Reagens zur Bestimmung von Cholesterin, bestehend aus Cholesterinesterase aus Mikroorganismen, ausgenommen Candida rugosa (bzw. cylindracea) und einem System zur Bestimmung von freiem Cholesterin mittels Cholesterinoxidase. Vorzugsweise besteht das Reagens aus Cholesterinesterase mikrobiologischen Ursprungs, Cholesterinoxidase, einem System zur Bestimmung von H2O2 oder einem System zur Bestimmung von Cholestenon. Ganz besonders bevorzugt wird hierbei ein Reagens, bei welchem als Cholesterinesterase einer der weiter oben erwähnten Mikroorganismen, insbesondere in Form eines Acetontrokkenpulvers, oder eine daraus erhaltene Proteinfraktion mit Cholesterinesteraseaktivität verwendet wird.
In einer speziellen und bevorzugten Ausführungsform besteht ein solches Reagens aus Cholesterinoxidase, einem Cholesterinesterasepräparat aus einem der oben erwähnten Mikroorganismen, Katalase, Actylaceton, Methanol und Ammoniumionen-haltigen Puffer, einzeln oder gemischt. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform besteht das Reagens aus Cholesterinoxidase, einem Präparat aus einem der erwähnten Mikroorganismen mit Cholesterinesteraseaktivität, Peroxydase, Chromogen und Puffer, einzeln oder gemischt. Als Chromogen wird 2,2'-Aminobenzthiazolinsulfonsäure bevorzugt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform besteht das erfindungsgemäße Reagens aus Cholesterinoxidase, einem Cholesterinesterasepräparat aus einem der genannten Mikroorganismen und einem mit Ketogruppen unter Hydrazonbildung reagierenden Hydrazinderivat sowie gegebenenfalls einem Puffer. Als Hydrazinderivat wird 2,4-Dinitrophenylhydrazin bevorzugt.
Die oben erwähnten bevorzugten Reagenskombinationen können außer den angeführten obligaten Bestandteilen zusätzlich übliche Lösungsmittel, Stabilisatoren oder/und oberflächenaktive Substanzen enthalten. Alle diese Zusatzstoffe sind dem Fachmann bekannt und in Nachweissystemen für Wasserstoffperoxyd bzw. Cholesteron üblich.
Vorzugsweise enthalten die oben erwähnten Reagenskombinationen die essentiellen Bestandteile in folgenden Mengenverhältnissen:
1. 13 bis 150 U Cholesterinoxidase, 0,05 bis 0,5 mg Mikroorganismen-Cholesterinesterase, 2XlO4 bis 5 X 105 U Katalase, 0,05 bis 0,2 ml Acetylaceton und 2 bis 10 ml Methanol in 100 ml Ammoniumionen-haltigem Puffer pH 5 bis 7 sowie gegebenenfalls 0,02 bis 0,3 ml eines oberflächenaktiven Mittels, vorzugsweise Hydroxypolyäthoxydodecan.
2. 3 bis 40 U Cholesterinoxidase, 0,05 bis 0,5 mg Mikroorganismen-Cholesterinesterase sowie 2 X 102 bis 1 X 104 U Peroxydase, 50 bis 200 mg 2,2'-AminobenzthiazoIinsulfonsäure sowie gegebenenfalls 0,05 bis 0,5 ml oberflächenaktives Mittel, vorzugsweise Hydroxypolyäthoxydodecan in 100 ml Puffer pH 6 bis 8.
3. 0,1 bis 1 U Cholesterinoxidase, 0,05 bis 0,5 mg Mikroorganismen-Cholesterinesterase, 1 bis
5 ml einer 1 mM Lösung von 2,4-Dinitrophenylhydrazin sowie gegebenenfalls 0,005 bis 0,1 ml oberflächenaktives Mittel in 10 ml Puffer in pH
6 bis 8.
4. 2 bis 100 U Cholesterinoxidase, 0,05 bis 0,5 mg Mikroorganismen-Cholesterinesterase sowie gegebenenfalls 0,1 bis 2,0 ml oberflächenaktives Mittel (vorzugsweise Hydroxypolyäthoxydodecan), in 50 ml Puffer pH 5 bis 9, vorzugsweise in 0,5 ml Natriumphosphatpuffer pH 7,5.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren und Reagens läßt sich eine außerordentlich rasche und vollständige Verseifung von gebundenem Cholesterin durchführen. Beispielsweise wird unter den Bedingungen der Cholesterinbestimmung mit Cholesterinoxidase erfindungsgemäß eine quantitative Spaltung von gebundenem Cholesterin innerhalb von 1 bis 3 Minuten bei einem Zusatz von Aspergillus sp. WS 90030 Acetontrockenpulver in einer Menge zwischen 0,1 bis 0,3 mg erzielt.
Das folgende Beispiel erläutert die Erfindung weiter.
Beispiel
10 g Diammoniumhydrogenphosphat werden in
7 8
100 ml Wasser gelöst und mit 85-proz. Phosphorsäure der cholesterinstandardhaltigen Probe werden mit je auf pH 7,0 eingestellt. Dann werden 105 U Katalase 0,1 U Cholesterinoxidase versetzt und 60 Minuten bei zugesetzt. Mit der so erhaltenen Lösung wird eine 37° C inkubiert. Dann wird der gebildete Farbstoff Mischung von 0,2 ml Acetylaceton, 10 nil Methanol bei 405 nm photometrisch gemessen unter Berück- und 0,1 g Hydroxypolyäthoxydodecan auf 100 ml "> sichtigung des Proben-Leerwertes,
aufgefüllt. Zu dieser Lösung werden 2,5 U Chole- DerCholesteringehaltder serumhaltigen Probe besterinesterase aus Rhizopus spec. (WS 90027) gege- trug - unter Benutzung eines Standards als Bezugsben, größe - 154 mg% Gesamtcholesterin. Die Kontroll-5,0 ml der so erhaltenen Lösung werden mit bestimmung mit Cholesterinesterase aus Candida 0,02 ml Serum bzw. 0,02 ml einer Cholesterin-Stan- κι rugosa ATCC 14830 anstelle von Cholesterinesterase dard-Lösung mit einem Gehalt von 200 mg% Chole- aus Rhizopus spec. (WS 90027) ergab den gleichen sterin gemischt. Aliquotes der serumhaltigen sowie Wert.

Claims (13)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Bestimmung von Gesamtcholesterinoder gebundenem Cholesterin durch Freisetzung des gebundenen Cholesterin mit Cholesterinesterase und anschließende enzymatische Bestimmung des freigesetzten Cholesterins mittels Cholesterinoxidase, dadurch gekennzeichnet, daß gebundenes Cholesterin mit Cholesterinesterase aus Mikroorganismen, ausgenommen Candida rugosa (bzw. cylindracea) freigesetzt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine Cholesterinesterase aus Rhizopus spec. WS 90027 oder Aspercjllus spec. WS 90030 verwendet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine Cholesterinesterase aus Actinomyces aureoverticillium WS 90002 Actinomyces cyaneofuscatus WS 90003 Actinomyces griseomycini WS 90004 Actinomyces longisporus-fl. WS 90005 Actinomyces malachiticus WS 90006 Actinomyces roseolus WS 90007 Actinomyces toxytricini WS 90008 Actinomyces variabilis WS 90009 Streptomyces spec. WS 90010 Streptomyces autotrophicus WS 90011 Streptocymes canescens WS 90012 Streptomyces chartreusis WS 90013 Streptomyces michiganensis WS 90014 Streptomyces murinus WS 90015 Streptomyces hachijoensis WS 90016 Streptomyces caelestes WS 90017 Streptomyces tendae WS 90018 Nocardia rubra WS 90019 Candida mycoderma WS 90020 Candida albicans WS 90021 Candida albicans WS 90022 Candida albicans WS 90023 Candida spec. WS 90024 Cunninghamella elegans WS 90025 Mucor mucedo WS 90026 Penicillium spec. WS 90028 Aspergillus spec. WS 90029 verwendet wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Cholesterinesterase und Cholesterinoxidase gleichzeitig zugesetzt werden.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine Cholesterinoxidase aus Nocardia erythropolis ATCC 17895, Nocardia erythropolis ATCC 4277, Nocardia formica ATCC 14811 oder Proactinomyces erythropolis NCIB 9158 verwendet wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß eine Cholesterinesterase aus einem Mikroorganismus verwendet wird, der auf einem Cholesterinesterhaltigen Nährmedium gezüchtet wurde.
7. Reagens zur Bestimmung von Cholesterin, bestehend aus Cholesterinesterase aus Mikroorganismen, ausgenommen Candida rugosa (bzw. cylindracea) und einem System zur Bestimmung von freiem Cholesterin mittels Cholesterinoxidase.
8. Reagens nach Anspruch 7, dadurch gekenn-
zeichnet, daß das System zur Bestimmung von freiem Cholesterin aus Cholesterinoxidase, einem System zur Bestimmung von H2O2 oder einem System zur Bestimmung von Cholestenon besteht.
9. Reagens nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Cholesterinesterase aus einem Mikroorganismus gemäß Anspruch 2 oder 3 enthält.
10. Reagens nach Anspruch 9, bestehend aus Cholesterinoxidase, einer Cholesterinesterase aus einem Mikroorganismus gemäß Anspruch 2 oder 3, Katalase, Acetylaceton, Methanol und Ammoniumionen-haltigem Puffer.
11. Reagens nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es Peroxidase, Chromogen und Puffer als System zur Bestimmung von H2O2 enthält.
12. Reagens nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es als System zur Bestimmung von Cholestenon ein mit Ketogruppen unter Hydrazonbildung reagierendes Hydrazinderivat enthält.
13. Reagens nach einem der Ansprüche 7 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß es ein oberflächenaktives Mittel enthält.
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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991018987A1 (de) * 1990-06-06 1991-12-12 Boehringer Mannheim Gmbh Cholesterinesterasen mit variabler substrat-spezifität

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