JP2837273B2 - 分析法 - Google Patents
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/44—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/92—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving lipids, e.g. cholesterol, lipoproteins, or their receptors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
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- G01N2800/04—Endocrine or metabolic disorders
- G01N2800/044—Hyperlipemia or hypolipemia, e.g. dyslipidaemia, obesity
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の背景 1.発明の分野 本発明は、酵素加水分解を行って長鎖脂肪酸を放つこ
とのできる基質のための臨床試料に用いうる定量分析に
関する。本発明は特にリパーゼ用のトリグリセリド基質
およびホスホリパーゼ用のリン脂質基質のようなエステ
ル基質に関するものであるが、これらに限定されない。
とのできる基質のための臨床試料に用いうる定量分析に
関する。本発明は特にリパーゼ用のトリグリセリド基質
およびホスホリパーゼ用のリン脂質基質のようなエステ
ル基質に関するものであるが、これらに限定されない。
2.従来の技術 トリおよびジグリセリドのようなエステルは細胞膜機
能およびエネルギー伝達のあらゆる状況に対してありふ
れた基本的なものである。従って、これらの成分の分析
は臨床診断の多くの領域において関心がもたれている。
すなわち、たとえば、臨床試料のトリグリセリド含有量
を分析することによって、最近の食事での脂肪摂取量お
よび肝臓の脂肪をエネルギー利用に代謝する能力をある
程度示すことができる。しかしながら、トリグリセリド
の分析に現在利用できる方法、たとえばシグマ・ケミカ
ル社（英国、ドールシット、ポール）のキットのような
市販のものは、酸素加水分解によって放たれるグリセロ
ールの測定によるものである。すなわち、シグマの方法
の第405号では、トリグリセリドをイソプロパノール中
に抽出し、そして水酸化カリウムでケン化する。次に、
遊離グリセロールを過ヨウ素酸塩によってホルムアルデ
ヒドに変える。アセチルアセトンとの反応によって、ホ
ルムアルデヒドは黄色のジアセチルジヒドロルチジンを
形成し、これを比色法により測定する。
能およびエネルギー伝達のあらゆる状況に対してありふ
れた基本的なものである。従って、これらの成分の分析
は臨床診断の多くの領域において関心がもたれている。
すなわち、たとえば、臨床試料のトリグリセリド含有量
を分析することによって、最近の食事での脂肪摂取量お
よび肝臓の脂肪をエネルギー利用に代謝する能力をある
程度示すことができる。しかしながら、トリグリセリド
の分析に現在利用できる方法、たとえばシグマ・ケミカ
ル社（英国、ドールシット、ポール）のキットのような
市販のものは、酸素加水分解によって放たれるグリセロ
ールの測定によるものである。すなわち、シグマの方法
の第405号では、トリグリセリドをイソプロパノール中
に抽出し、そして水酸化カリウムでケン化する。次に、
遊離グリセロールを過ヨウ素酸塩によってホルムアルデ
ヒドに変える。アセチルアセトンとの反応によって、ホ
ルムアルデヒドは黄色のジアセチルジヒドロルチジンを
形成し、これを比色法により測定する。
シグマの方法第336、337、339および334号では、グリ
セロールをリパーゼを用いて酵素によってトリグリセリ
ドから放ち、そしてグリセロールをさらにATPと反応さ
せてグリセロール−１−ホスフェートを形成する。４つ
の方法は、グリセロール−１−ホスフェートをさらに反
応させて分光光度測定することができる吸光度の変化を
もたらす方法が異なるだけである。そのような分析法
は、臨床試料に用いると、グリセロール自体が細胞代謝
の生成物であるので、血液試料のグリセロール含有量の
分析は患者の循環トリグリセリド量の正確な値を示さな
いかもしれないという欠点がある（Cole、Clin.Chem.36
/7、1267−1268（1990）参照）。低濃度または少量の臨
床血液試料で正確な結果を示すトリグリセリドおよび他
の関連基質、たとえばリン脂質およびコレステロールエ
ステルを分析する別の手段の開発が求められていること
は明らかである。
セロールをリパーゼを用いて酵素によってトリグリセリ
ドから放ち、そしてグリセロールをさらにATPと反応さ
せてグリセロール−１−ホスフェートを形成する。４つ
の方法は、グリセロール−１−ホスフェートをさらに反
応させて分光光度測定することができる吸光度の変化を
もたらす方法が異なるだけである。そのような分析法
は、臨床試料に用いると、グリセロール自体が細胞代謝
の生成物であるので、血液試料のグリセロール含有量の
分析は患者の循環トリグリセリド量の正確な値を示さな
いかもしれないという欠点がある（Cole、Clin.Chem.36
/7、1267−1268（1990）参照）。低濃度または少量の臨
床血液試料で正確な結果を示すトリグリセリドおよび他
の関連基質、たとえばリン脂質およびコレステロールエ
ステルを分析する別の手段の開発が求められていること
は明らかである。
発明の概要 このたび、適当な酵素を基質に作用させて脂肪酸を放
ち、次に保たれた脂肪酸の、脂肪酸を高度の親和力（10
5M以下の解離定数を有する）で結合するタンパク質への
結合を検出または測定することによって、そのような基
質を血清のようなアルブミン含有臨床試料中で素早くか
つ敏感に定量分析することができることを見いだした。
そのようなタンパク質は、たとえば動物の肝臓から抽出
することができる天然生成物である脂肪酸結合タンパク
質（FABP）として公知のものが非常に好ましい。以後、
本発明はFABPに関連して説明するが、記載の種類の他の
結合タンパク質をFABPに代えることができることは無論
のことである。さらに、血清を臨床試料として用いて本
発明を説明するが、本発明を全体血液および血漿のよう
な他の臨床試料並びにこれらから得た部分精製フラクシ
ョンに適用しうることも無論のことである。脂肪酸−FA
BP結合相互作用の分析は、標識プローブ、実際には標識
脂肪酸を用いることによって行うのが最も都合がよい。
この標識プローブはリパーゼの作用によって放たれた脂
肪酸と、FABP上の結合部位について競争する。次いで遊
離標識、すなわち、FABPに結合していない遊離標識の量
を測定するのが都合がよい。
ち、次に保たれた脂肪酸の、脂肪酸を高度の親和力（10
5M以下の解離定数を有する）で結合するタンパク質への
結合を検出または測定することによって、そのような基
質を血清のようなアルブミン含有臨床試料中で素早くか
つ敏感に定量分析することができることを見いだした。
そのようなタンパク質は、たとえば動物の肝臓から抽出
することができる天然生成物である脂肪酸結合タンパク
質（FABP）として公知のものが非常に好ましい。以後、
本発明はFABPに関連して説明するが、記載の種類の他の
結合タンパク質をFABPに代えることができることは無論
のことである。さらに、血清を臨床試料として用いて本
発明を説明するが、本発明を全体血液および血漿のよう
な他の臨床試料並びにこれらから得た部分精製フラクシ
ョンに適用しうることも無論のことである。脂肪酸−FA
BP結合相互作用の分析は、標識プローブ、実際には標識
脂肪酸を用いることによって行うのが最も都合がよい。
この標識プローブはリパーゼの作用によって放たれた脂
肪酸と、FABP上の結合部位について競争する。次いで遊
離標識、すなわち、FABPに結合していない遊離標識の量
を測定するのが都合がよい。
そのような臨床試料中に存在するアルブミンは除去し
ないと、分析効果を妨げることが従来の経験から予想さ
れる。すなわち、Biochem.J.（1990）、266、435−439
およびBiochem.J.（1990）、270、163−166に見られる
初期の発見から、血漿アルブミンが脂肪酸と結合しうる
部位を有することが分かる。しかしながら、意外なこと
に、本発明の基質分析はアルブミンのような競合タンパ
ク質を前以て除く必要がないほど十分に高感度のもので
あることを見いだした。また、意外なことに、本発明の
酵素に基づく基質分析は非常に素早く完了するので、存
在する基質の定量測定が可能となる。
ないと、分析効果を妨げることが従来の経験から予想さ
れる。すなわち、Biochem.J.（1990）、266、435−439
およびBiochem.J.（1990）、270、163−166に見られる
初期の発見から、血漿アルブミンが脂肪酸と結合しうる
部位を有することが分かる。しかしながら、意外なこと
に、本発明の基質分析はアルブミンのような競合タンパ
ク質を前以て除く必要がないほど十分に高感度のもので
あることを見いだした。また、意外なことに、本発明の
酵素に基づく基質分析は非常に素早く完了するので、存
在する基質の定量測定が可能となる。
従って、上記の原理を用いて、酵素加水分解を行って
長鎖脂肪酸をアルブミン含有臨床試料に放つことのでき
る基質の定量分析法を提供する。この分析法は、アルブ
ミン含有臨床試料を、分析すべき基質に作用する酵素と
共に、基質から脂肪酸を放つのに有効な条件下でインキ
ュベートし、このようにして放たれた脂肪酸を脂肪酸結
合タンパク質（FABP）に結合し、そして脂肪酸のFABPへ
の結合を分析することを含むものである。
長鎖脂肪酸をアルブミン含有臨床試料に放つことのでき
る基質の定量分析法を提供する。この分析法は、アルブ
ミン含有臨床試料を、分析すべき基質に作用する酵素と
共に、基質から脂肪酸を放つのに有効な条件下でインキ
ュベートし、このようにして放たれた脂肪酸を脂肪酸結
合タンパク質（FABP）に結合し、そして脂肪酸のFABPへ
の結合を分析することを含むものである。
本発明はまた、本発明の分析を実施するためのキット
も包含し、このキットは脂肪酸結合タンパク質（FABP）
および分析すべき基質を加水分解して長鎖脂肪酸を放ち
うる酵素を含むものである。脂肪酸と競合してFABPに結
合する標識プローブがキットに含まれているのが好まし
い。
も包含し、このキットは脂肪酸結合タンパク質（FABP）
および分析すべき基質を加水分解して長鎖脂肪酸を放ち
うる酵素を含むものである。脂肪酸と競合してFABPに結
合する標識プローブがキットに含まれているのが好まし
い。
好ましい具体例の説明 本発明の分析法は原則としてどのような動物の血清に
も用いられるが、もちろん、主に人間に関する。
も用いられるが、もちろん、主に人間に関する。
本発明の重要な別の目的は、血液中のトリグリセリド
濃度を測定および／またはモニターすることである。こ
の分析法はまた、たとえば適当なコレステロールエステ
ラーゼを用いるアルブミン含有血清中のコルステロール
エステルの分析およびホスホリパーゼA2を用いるリン脂
質の分析にも用いられる。
濃度を測定および／またはモニターすることである。こ
の分析法はまた、たとえば適当なコレステロールエステ
ラーゼを用いるアルブミン含有血清中のコルステロール
エステルの分析およびホスホリパーゼA2を用いるリン脂
質の分析にも用いられる。
アルブミンは分析において競合する役割をする可能性
があるので、上で説明したように、通常はこれを除く必
要がある。しかしながら、本発明の分析法は高感度であ
るので、これは不必要であることがわかった。アルブミ
ンの影響をできるだけ小さくするために、臨床試料は１
μｌ以下であるのが好ましく、0.1−１μmlであるのが
適している。
があるので、上で説明したように、通常はこれを除く必
要がある。しかしながら、本発明の分析法は高感度であ
るので、これは不必要であることがわかった。アルブミ
ンの影響をできるだけ小さくするために、臨床試料は１
μｌ以下であるのが好ましく、0.1−１μmlであるのが
適している。
アルブミン含有血清試料は、酵素加水分解が生じるの
に有効な温度で酵素と共にインキュベートする。室温
（20−25℃）が最も都合よいが、15−40℃の温度でも通
常行うことができる。
に有効な温度で酵素と共にインキュベートする。室温
（20−25℃）が最も都合よいが、15−40℃の温度でも通
常行うことができる。
分析の第２工程で加える酵素は適した酵素であること
は無論のことである。従って、過剰のリパーゼを用いて
分析試料中のトリグリセリドの量を分析することができ
る。コレステロールエステラーゼはコレステロールエス
テルの分析に用いることができる。ホスホリパーゼA2は
リン脂質の分析に用いることができる。
は無論のことである。従って、過剰のリパーゼを用いて
分析試料中のトリグリセリドの量を分析することができ
る。コレステロールエステラーゼはコレステロールエス
テルの分析に用いることができる。ホスホリパーゼA2は
リン脂質の分析に用いることができる。
脂肪酸結合タンパク質（FABP）も、酵素の導入前、導
入中または導入後に、インキュベーション混合物に加え
る。用いうる各種のFABPがある。これらは細胞質ゾル性
であるのが好ましく、通常単離される組織によって呼ば
れ、たとえば小腸、心筋、肝臓および脂肪組織である。
肝性FABPが好ましく、ラット、ブタまたはウシのような
動物の肝臓から抽出するのが都合がよい。好ましい抽出
方法は、D.C.ウイルトンのBiochem.J.261、273−276（1
989）に説明されている。FABPは天然生成物である必要
はない。これは酸を結合する合成類似体でもよく、また
は組み換えDNA法によって得られた天然生成物の類似
体、たとえばE. Coliの遺伝子の圧出によって得られた
ラットの肝臓のFABPでもよい（J.B.Lowe等、J.Biol.Che
m.259、12696−12704（1984）およびA.F.Worrall等、Bi
ochem.J.、278、365−368、1991参照）。リパーゼによ
って放たれた酸の結合に効果的などのようなインキュベ
ーション条件を用いてもよい。だいたい加水分解工程と
同じ温度で行うことができる。
入中または導入後に、インキュベーション混合物に加え
る。用いうる各種のFABPがある。これらは細胞質ゾル性
であるのが好ましく、通常単離される組織によって呼ば
れ、たとえば小腸、心筋、肝臓および脂肪組織である。
肝性FABPが好ましく、ラット、ブタまたはウシのような
動物の肝臓から抽出するのが都合がよい。好ましい抽出
方法は、D.C.ウイルトンのBiochem.J.261、273−276（1
989）に説明されている。FABPは天然生成物である必要
はない。これは酸を結合する合成類似体でもよく、また
は組み換えDNA法によって得られた天然生成物の類似
体、たとえばE. Coliの遺伝子の圧出によって得られた
ラットの肝臓のFABPでもよい（J.B.Lowe等、J.Biol.Che
m.259、12696−12704（1984）およびA.F.Worrall等、Bi
ochem.J.、278、365−368、1991参照）。リパーゼによ
って放たれた酸の結合に効果的などのようなインキュベ
ーション条件を用いてもよい。だいたい加水分解工程と
同じ温度で行うことができる。
酸−FABP結合が生じたことを検出する必要もある。こ
れを行う好ましい方法は、FABP上の限られた数の結合部
位に対して、競合脂肪酸成分を酵素によって放たれた脂
肪酸と競合させる競合分析法によるものである。競合成
分をここでは“プローブ”と呼ぶ。これは酸基を除いて
一般的には９−19個の炭素原子を有しそして酸基に結合
した、標識タンパク質および長鎖脂肪族部分を含む。標
識部分はたとえば発蛍光団、発色団または発光団でもよ
い。放射性標識はあまり好ましくない。
れを行う好ましい方法は、FABP上の限られた数の結合部
位に対して、競合脂肪酸成分を酵素によって放たれた脂
肪酸と競合させる競合分析法によるものである。競合成
分をここでは“プローブ”と呼ぶ。これは酸基を除いて
一般的には９−19個の炭素原子を有しそして酸基に結合
した、標識タンパク質および長鎖脂肪族部分を含む。標
識部分はたとえば発蛍光団、発色団または発光団でもよ
い。放射性標識はあまり好ましくない。
好ましい具体例の１つは、標識が多環式発蛍光団、特
に極性に敏感な蛍光基を有するナフタレンまたはアント
ラセンである。極性に敏感な発蛍光基は、極性環境から
非極性環境へ移すにつれて、その蛍光放出（量子収量お
よび波長が最大）に変化があるものである。プローブが
FABP分子の非極性微細環境から極性微細環境（通常は水
性である分析媒質）に移動するにつれて、一定の波長に
おいて蛍光信号の大きな変化が観察される。プローブは
負に帯電しており、従って、通常は塩酸として存在す
る。特に好ましいそのようなプローブは式 Pc−Ｚ−NH−（CH2）ｎ−X- （式中、Pcはナフタレンまたはアントラセン残基であ
り、 Ｚは−CO−または−SO2−であり、 X-は酸基の陰イオン、好ましくはCOO−であり、 ｎは４−24、好ましくは８−19、特に８−12である） を有するものである。
に極性に敏感な蛍光基を有するナフタレンまたはアント
ラセンである。極性に敏感な発蛍光基は、極性環境から
非極性環境へ移すにつれて、その蛍光放出（量子収量お
よび波長が最大）に変化があるものである。プローブが
FABP分子の非極性微細環境から極性微細環境（通常は水
性である分析媒質）に移動するにつれて、一定の波長に
おいて蛍光信号の大きな変化が観察される。プローブは
負に帯電しており、従って、通常は塩酸として存在す
る。特に好ましいそのようなプローブは式 Pc−Ｚ−NH−（CH2）ｎ−X- （式中、Pcはナフタレンまたはアントラセン残基であ
り、 Ｚは−CO−または−SO2−であり、 X-は酸基の陰イオン、好ましくはCOO−であり、 ｎは４−24、好ましくは８−19、特に８−12である） を有するものである。
式 の11−（ダンシルアミノ）ウンデカン酸（DAUDA）の塩
が特に好ましい。このプローブは脂肪酸と競合してFABP
に結合することが知られている（T.C.I.ウイルキンソン
およびD.C.ウイルトン、Biochem.J.247、485−488（198
7）参照）。しかしながら、意外なことに、基質を含む
系と基質を加水分解して長鎖脂肪酸を放つことのできる
酵素との組み合わせを用いると、蛍光信号の変化を観察
することによって定量的に分析することができる完全で
急速な反応が生じることを見いだした。用いうる他の発
蛍光団は９−アントロイルオキシ脂肪酸（J.Storch等、
J.Biol.Chem.264、8708−8713（1989）参照）およびシ
ス−パリナリン酸（ポリエン脂肪酸）（H.J.K.Keuper
等、Chem.Phys.Lipids、38、159−178（1985）参照）。
が特に好ましい。このプローブは脂肪酸と競合してFABP
に結合することが知られている（T.C.I.ウイルキンソン
およびD.C.ウイルトン、Biochem.J.247、485−488（198
7）参照）。しかしながら、意外なことに、基質を含む
系と基質を加水分解して長鎖脂肪酸を放つことのできる
酵素との組み合わせを用いると、蛍光信号の変化を観察
することによって定量的に分析することができる完全で
急速な反応が生じることを見いだした。用いうる他の発
蛍光団は９−アントロイルオキシ脂肪酸（J.Storch等、
J.Biol.Chem.264、8708−8713（1989）参照）およびシ
ス−パリナリン酸（ポリエン脂肪酸）（H.J.K.Keuper
等、Chem.Phys.Lipids、38、159−178（1985）参照）。
あるいは、ヘミンのような発色プローブを用いてもよ
い。そのような分子もまた酵素によって放たれた脂肪酸
と競合してFABPに結合し、その色の変化を分光光度法に
よって分析することができる。使用しうる他の発色団は
ビリルビンである。
い。そのような分子もまた酵素によって放たれた脂肪酸
と競合してFABPに結合し、その色の変化を分光光度法に
よって分析することができる。使用しうる他の発色団は
ビリルビンである。
あるいは、“プローブ”は本質的に標識部分を含む必
要はなく、これを間接的に分析してもよい。その代わり
に、プローブはそれ自体、FABPからの置換による適当な
指示反応を調整しうる増強剤、抑制剤、コファクターま
たは他のトリガーとして作用しうる。
要はなく、これを間接的に分析してもよい。その代わり
に、プローブはそれ自体、FABPからの置換による適当な
指示反応を調整しうる増強剤、抑制剤、コファクターま
たは他のトリガーとして作用しうる。
さらに別の分析法は、分析媒質に標識酸、たとえば14
Cまたは3H放射性の標識を付けた酸、または発色団を付
けた酸を加え、そして限られた量のFABPに対して、リパ
ーゼによって放たれた酸と標識酸との競合後、溶液中に
残っている標識酸の量を測定することを含むものであ
る。標識酸は、これをLipidex1000（J.F.C.Glatzおよび
J.H.Veerkamp、Anal.Biochem.132、89−95（1983）参
照）の上で不溶化し、Lipidex 1000を分析媒質から分離
し、そしてその上の標識物質の量を測ることによって測
定する。
Cまたは3H放射性の標識を付けた酸、または発色団を付
けた酸を加え、そして限られた量のFABPに対して、リパ
ーゼによって放たれた酸と標識酸との競合後、溶液中に
残っている標識酸の量を測定することを含むものであ
る。標識酸は、これをLipidex1000（J.F.C.Glatzおよび
J.H.Veerkamp、Anal.Biochem.132、89−95（1983）参
照）の上で不溶化し、Lipidex 1000を分析媒質から分離
し、そしてその上の標識物質の量を測ることによって測
定する。
競合分析成分は、脂肪酸の添加前、添加と同時にまた
は添加後、そして酵素の添加前または分析混合物へ加え
ることができる。ある成分がFABPからの他の成分に取っ
て代わって可逆的結合反応に対して平行な位置を得たと
き、分析は“競合的な”ものとみなされる。競合成分が
FABPに結合すると、この結合は様々な方法で測定するこ
とができる。極性に敏感な発蛍光団の場合、蛍光の変化
は容易にモニターされる。発色団の色と強度または発光
団の強度における変化も測定可能である。あるいは、FA
BPプローブ成分を沈殿させ、沈殿物を分離し、そしてFA
BPに結合した標識の量または溶液に残っている遊離標識
の量を測定することも可能である。これはFABPに対する
固定抗体によって、たとえばFABPをアガロースのような
不溶性物質に直接結合することによって行うことができ
る。
は添加後、そして酵素の添加前または分析混合物へ加え
ることができる。ある成分がFABPからの他の成分に取っ
て代わって可逆的結合反応に対して平行な位置を得たと
き、分析は“競合的な”ものとみなされる。競合成分が
FABPに結合すると、この結合は様々な方法で測定するこ
とができる。極性に敏感な発蛍光団の場合、蛍光の変化
は容易にモニターされる。発色団の色と強度または発光
団の強度における変化も測定可能である。あるいは、FA
BPプローブ成分を沈殿させ、沈殿物を分離し、そしてFA
BPに結合した標識の量または溶液に残っている遊離標識
の量を測定することも可能である。これはFABPに対する
固定抗体によって、たとえばFABPをアガロースのような
不溶性物質に直接結合することによって行うことができ
る。
別の方法では、脂肪酸エステルを、たとえばこれを蛍
光リポーター基に結合することによって、酸部分で標識
化し、そして放たれた蛍光脂肪酸がFABPに結合している
量を、結合時に生じる適当なスペクトル変化によって測
定する。
光リポーター基に結合することによって、酸部分で標識
化し、そして放たれた蛍光脂肪酸がFABPに結合している
量を、結合時に生じる適当なスペクトル変化によって測
定する。
以下の実施例で本発明を説明する。
実施例１ 基質および蛍光プローブを含有する緩衝液を次のよう
に製造した： ステリリンチューブ中の、0.1MのNaClを含有するpH8.
0の0.1Mトリス緩衝剤20mlに、メタノールに11−（ダン
シルアミノ）ウンデカン酸（DAUDA）（0.38mM）を含む
もの0.05mlを加えた。混合物を少しの間振盪し、2mlの
この分析溶液を4mlのプラスチックの使い捨て蛍光計キ
ュベットに加え、次にこれをパーキン・エルマー LS 3
B蛍光計内に室温で置いた。励起波長は350nmであり、蛍
光は500nmで測定した。機械をゼロの目盛りにして、蛍
光のない示度にした。このタンパク質に対する合成遺伝
子の圧出から得た、組み換えラット肝臓FABP（1mg/ml）
を含有するＥ．Coli溶解産物の70％飽和硫酸アンモニウ
ム上澄み液0.02mlを加えた。0.02mlの血清試料（サザン
プトン・ジェネラル・ホスピタルの病理学研究所から得
た）を0.1％の非イオン洗浄剤トリトンＸ−100を含有す
る蒸留水で1mlに希釈した。0.01mlのこの希釈血清試料
を分析混合物へ加えた。蛍光計の感度は、チャート記録
計上に約90％の示度および注目される初期の示度が得ら
れるように設定した。
に製造した： ステリリンチューブ中の、0.1MのNaClを含有するpH8.
0の0.1Mトリス緩衝剤20mlに、メタノールに11−（ダン
シルアミノ）ウンデカン酸（DAUDA）（0.38mM）を含む
もの0.05mlを加えた。混合物を少しの間振盪し、2mlの
この分析溶液を4mlのプラスチックの使い捨て蛍光計キ
ュベットに加え、次にこれをパーキン・エルマー LS 3
B蛍光計内に室温で置いた。励起波長は350nmであり、蛍
光は500nmで測定した。機械をゼロの目盛りにして、蛍
光のない示度にした。このタンパク質に対する合成遺伝
子の圧出から得た、組み換えラット肝臓FABP（1mg/ml）
を含有するＥ．Coli溶解産物の70％飽和硫酸アンモニウ
ム上澄み液0.02mlを加えた。0.02mlの血清試料（サザン
プトン・ジェネラル・ホスピタルの病理学研究所から得
た）を0.1％の非イオン洗浄剤トリトンＸ−100を含有す
る蒸留水で1mlに希釈した。0.01mlのこの希釈血清試料
を分析混合物へ加えた。蛍光計の感度は、チャート記録
計上に約90％の示度および注目される初期の示度が得ら
れるように設定した。
Rhizopus arrhizusからの過剰のリパーゼ（0.005ml）
を加えた（6250単位）。蛍光の急速な低下が室温で30秒
以内に認められ、この値を記録した。しかしながら、反
応は１−２分のインキュベーション期間にわたってモニ
ターした。この間、蛍光の低下がしだいにゆっくりとな
るのが認められた（初期加水分解の２−モノグリセリド
生成物の加水分解によると考えられる）。目盛り定め
は、オレイン酸をリパーゼの不在下で全分析混合物に滴
定することによって、あるいはさらに都合よくは、予め
測定したトリグリセリド濃度の血清試料を使用すること
によって行いうる。
を加えた（6250単位）。蛍光の急速な低下が室温で30秒
以内に認められ、この値を記録した。しかしながら、反
応は１−２分のインキュベーション期間にわたってモニ
ターした。この間、蛍光の低下がしだいにゆっくりとな
るのが認められた（初期加水分解の２−モノグリセリド
生成物の加水分解によると考えられる）。目盛り定め
は、オレイン酸をリパーゼの不在下で全分析混合物に滴
定することによって、あるいはさらに都合よくは、予め
測定したトリグリセリド濃度の血清試料を使用すること
によって行いうる。
図１は、３種類の血清試料ａ）、ｂ）およびｃ）につ
いての蛍光置換トレース 試料ａ）（3.7mMのトリグリセリドを有するもので記
録した）を目盛り定めに用いると、これはａ）3.7mM、
ｂ）８−9mMおよびｃ）1.68mMのトリグリセリド値に相
当する。
いての蛍光置換トレース 試料ａ）（3.7mMのトリグリセリドを有するもので記
録した）を目盛り定めに用いると、これはａ）3.7mM、
ｂ）８−9mMおよびｃ）1.68mMのトリグリセリド値に相
当する。
実施例２ プラスチックの分光光度計キュベット中の、0.1MのNa
Clを含有するpH8.0の0.1Mトリス緩衝剤1mlに、0.04M水
酸化アンモニウムに0.4mMの血液を含むもの0.01mlを加
えた。同一のブランクキュベットも準備し、Hitachi U2
000分光光度計においてこれらの２つのキュベットを405
nmにてゼロの目盛りにして、吸収のない示度にした。こ
のタンパク質に対する合成遺伝子の圧出から得た、組み
換えFABP（1mg/ml）を含有するＥ．Coli溶解産物の70％
飽和硫酸アンモニウム上澄み液0.05mlを、反応キュベッ
トおよびブランクのための同様な容積の水に加えた。FA
BPに結合している血液による405nmでの増加吸収が記録
された。0.01mlの希釈血清（0.2μｌの血清に等しい）
を反応に加え、吸収を記録した後、Rhizopus arrhizus
からの過剰のリパーゼ（0.005ml）を加えた（6250単
位）。405nmでの吸収の低下を１−２分間にわたってモ
ニターした。
Clを含有するpH8.0の0.1Mトリス緩衝剤1mlに、0.04M水
酸化アンモニウムに0.4mMの血液を含むもの0.01mlを加
えた。同一のブランクキュベットも準備し、Hitachi U2
000分光光度計においてこれらの２つのキュベットを405
nmにてゼロの目盛りにして、吸収のない示度にした。こ
のタンパク質に対する合成遺伝子の圧出から得た、組み
換えFABP（1mg/ml）を含有するＥ．Coli溶解産物の70％
飽和硫酸アンモニウム上澄み液0.05mlを、反応キュベッ
トおよびブランクのための同様な容積の水に加えた。FA
BPに結合している血液による405nmでの増加吸収が記録
された。0.01mlの希釈血清（0.2μｌの血清に等しい）
を反応に加え、吸収を記録した後、Rhizopus arrhizus
からの過剰のリパーゼ（0.005ml）を加えた（6250単
位）。405nmでの吸収の低下を１−２分間にわたってモ
ニターした。
図２は、トリグリセリド濃度がそれぞれ3.7mMおよび1
1.9mMである２種類の血清試料ａ）およびｂ）について
の吸光度変位トレースを示す図である。30秒後の吸収の
変化をそれぞれの場合において測定した。明らかなよう
にこれらの変化（△ABS）はａ）0.006およびｂ）0.016
である。
1.9mMである２種類の血清試料ａ）およびｂ）について
の吸光度変位トレースを示す図である。30秒後の吸収の
変化をそれぞれの場合において測定した。明らかなよう
にこれらの変化（△ABS）はａ）0.006およびｂ）0.016
である。
Claims (13)
- 【請求項１】酸素加水分解を行って長鎖脂肪酸をアルブ
ミン含有臨床試料に放つことのできる基質のための定量
分析法であって、アルブミン含有臨床試料を、分析すべ
き基質に作用する酵素と共に、基質から脂肪酸を放つの
に有効な条件下でインキュベートし、このようにして放
たれた脂肪酸を脂肪酸結合タンパク質（FABP）に結合
し、そして、脂肪酸のFABPへの結合を分析する、上記の
方法。 - 【請求項２】脂肪酸と競合してFABPに結合する競合プロ
ーブをFABPと相互作用させ、そして遊離または結合競合
プローブを直接または間接的に分析する方法によって、
FABP脂肪酸結合を分析する、請求項１の方法。 - 【請求項３】プローブを蛍光変位によって分析する、請
求項２の方法。 - 【請求項４】プローブが11−（ダンシルアミノ）ウンデ
カン酸の陰イオンである、請求項３の方法。 - 【請求項５】プローブを比色法によって分析する、請求
項２の方法。 - 【請求項６】プローブがヘミンである、請求項５の方
法。 - 【請求項７】プローブが、FABPからの置換による指示反
応を調整しうるトリガーとして作用する、請求項２の方
法。 - 【請求項８】酵素がリパーゼであるトリグリセリドを分
析するための請求項１−７のいずれかの方法。 - 【請求項９】FABPが肝臓系のものである、請求項１−８
のいずれかの方法。 - 【請求項１０】臨床試料が血清試料である、請求項１−
９のいずれかの方法。 - 【請求項１１】臨床試料が0.1−１μｌである、請求項
１−10のいずれかの方法。 - 【請求項１２】脂肪酸結合タンパク質（FABP）および分
析すべき基質を加水分解して長鎖脂肪酸を放つことので
きる酵素を含む、請求項１−11のいずれかの分析を行う
ためのキット。 - 【請求項１３】さらに、FABPに結合する競合プローブを
含む、請求項12のキット。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB919105707A GB9105707D0 (en) | 1991-03-18 | 1991-03-18 | Assay |
| GB9105707.5 | 1991-03-18 | ||
| PCT/GB1992/000461 WO1992016847A1 (en) | 1991-03-18 | 1992-03-16 | Assay for the determination of ester substrates |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06505627A JPH06505627A (ja) | 1994-06-30 |
| JP2837273B2 true JP2837273B2 (ja) | 1998-12-14 |
Family
ID=10691764
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4505838A Expired - Lifetime JP2837273B2 (ja) | 1991-03-18 | 1992-03-16 | 分析法 |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5449607A (ja) |
| EP (1) | EP0576480B1 (ja) |
| JP (1) | JP2837273B2 (ja) |
| CA (1) | CA2105871A1 (ja) |
| DE (1) | DE69225794T2 (ja) |
| DK (1) | DK0576480T3 (ja) |
| ES (1) | ES2121849T3 (ja) |
| GB (2) | GB9105707D0 (ja) |
| NO (1) | NO933325L (ja) |
| WO (1) | WO1992016847A1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| DE19543204C2 (de) * | 1995-11-20 | 1997-09-18 | Bayer Ag | Verfahren zur Herstellung von nanodispersem Titandioxid und seine Verwendung |
| AU3395697A (en) * | 1997-06-13 | 1998-12-30 | Medical Biology Institute | Method of detection of cardiac ischemia using fatty acid binding protein |
| US6444432B1 (en) | 1997-06-13 | 2002-09-03 | Alan M. Kleinfeld | Method of detection of cardiac ischemia using fatty acid binding protein |
| US5998512A (en) * | 1998-07-20 | 1999-12-07 | The University Of Akron | Reduced-lipid natural rubber latex |
| US7202089B2 (en) * | 2001-09-14 | 2007-04-10 | Alan Kleinfeld | Early diagnosis of stroke |
| US7262017B2 (en) * | 2001-09-14 | 2007-08-28 | Torrey Pines Institute For Molecular Studies | Diagnostic markers for ischemia |
| AU2005227312B2 (en) * | 2004-03-22 | 2011-04-07 | Ffa Sciences, Llp | Development and use of fluorescent probes of unbound analytes |
| CA2563507C (en) | 2004-04-16 | 2015-03-31 | Idexx Laboratories, Inc. | Canine pancreatic lipase |
| DE602006020353D1 (de) | 2005-03-24 | 2011-04-07 | Univ Emory | Progesterone Dosierungsanweisung in der Behandlung einer traumatischen Verletzung des Gehirns |
| US20060257938A1 (en) * | 2005-05-10 | 2006-11-16 | Kleinfeld Alan M | Method of screening for drugs that block ligand binding to a lipid binding protein |
| US20090311729A1 (en) * | 2006-03-22 | 2009-12-17 | Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd | Diagnosis of acute enterocolitis by determination of intestinal fatty acid-binding protein in the blood |
| WO2008060841A2 (en) | 2006-10-27 | 2008-05-22 | Ffa Sciences, Llc | Use of probes for unbound metabolites |
| AU2008312575B2 (en) * | 2007-10-15 | 2012-02-23 | Idexx Laboratories, Inc. | Feline pancreatic lipase |
| WO2017040983A1 (en) * | 2015-09-03 | 2017-03-09 | The University Of Chicago | Systems and methods for characterization of hypertriglyceridemia |
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|---|---|---|---|---|
| US3983005A (en) * | 1974-03-25 | 1976-09-28 | Eastman Kodak Company | Integral element for the analysis of cholesterol |
| US4195126A (en) * | 1977-10-04 | 1980-03-25 | The Board Of Trustees Of The University Of Alabama | Albumin-dye complex for fatty acid determination |
| US4241178A (en) * | 1978-01-06 | 1980-12-23 | Eastman Kodak Company | Process and composition for the quantification of glycerol ATP and triglycerides |
| DE3545595A1 (de) * | 1985-12-21 | 1987-06-25 | Behringwerke Ag | Dispersionspolymere, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung |
| US4839298A (en) * | 1986-02-14 | 1989-06-13 | Akzo N.V. | Virus inactivating diluents used in immunoassays |
| GB8921156D0 (en) * | 1989-09-19 | 1989-11-08 | Nat Res Dev | Assay for enzyme activity |
-
1991
- 1991-03-18 GB GB919105707A patent/GB9105707D0/en active Pending
-
1992
- 1992-03-16 DE DE69225794T patent/DE69225794T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1992-03-16 CA CA002105871A patent/CA2105871A1/en not_active Abandoned
- 1992-03-16 JP JP4505838A patent/JP2837273B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1992-03-16 US US08/107,702 patent/US5449607A/en not_active Expired - Fee Related
- 1992-03-16 GB GB9205719A patent/GB2255406B/en not_active Expired - Fee Related
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- 1992-03-16 EP EP92906461A patent/EP0576480B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-03-16 DK DK92906461T patent/DK0576480T3/da active
- 1992-03-16 WO PCT/GB1992/000461 patent/WO1992016847A1/en active IP Right Grant
-
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- 1993-09-17 NO NO93933325A patent/NO933325L/no not_active Application Discontinuation
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| EP0576480A1 (en) | 1994-01-05 |
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