JPS6366517B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、遊離脂肪酸（以後FFAと略す。）の
酸素的測定方法に関するものである。血中の
FFAは、体内の糖質及び脂質の代謝の動態を鋭
敏に反映することが知られており、血中のFFA
の測定は臨床検査上肝疾患、内分泌疾患および糖
尿病などの疾患の鑑別診断や治療経過の判定に極
めて有効であり、種々の方法が開発され使用され
ている。 最近開発された酵素的なFFAの測定法は、そ
の操作が簡便でかつ再現性も良く優れた方法であ
るが、血中のFFA濃度が低く、通常の光学的測
定法において測定する際には、現在の通常の発色
系では発色感度が低く、血清の濁り等の影響を受
け易く、またこれを回避するためには血清ブラン
クを取るという煩雑さが生ずる。 特に、病的に血中のリポ蛋白が増量して白濁し
ている、いわゆる高脂血症患者血清、また食後の
カイロミクロンを多く含む血清をサンプルとする
場合には、その濁りの影響を回避するため、どう
しても検体ブランクを取る必要が生ずる。 従来、血清の濁りを回避する方法としては、リ
ポ蛋白リパーゼを添加し、血清の濁りの原因とな
るリポ蛋白を分解する方法が知られていた。 しかし、この方法をFFAの測定法に適用する
場合には、通常の添加方法によつて処理すると、
リポ蛋白リパーゼによりリポ蛋白が加水分解され
てFFAが生成するため、FFA値は人為的条件に
よつて上昇し、真の値は得られない。 そこで、本発明者等はFFAの測定時における
血清の濁りによる防害を回避する方法について鋭
意検討した結果、FFAの測定値に影響を与える
ことなく血清の濁りを清澄化せしめることに成功
し、本発明を完成した。 すなわち、本発明の要旨は、FFA、コエンザ
イムＡ（以下CoAという。）、アデノシン―5′―ト
リホスフエート（以下ATPという。）およびリポ
蛋白を含む試料に、アシルコエンザイムＡシンセ
ターゼ（以下ACSという。E.C.6.2.1.3）を作用さ
せてアシルコエンザイムＡ（以下アシルCoAとい
う。）、アデノシン―5′―モノホスフエート（以下
AMPという。）およびピロ燐酸を生成させ、反応
液中に残存するCoA，ATPまたはACSを不活化
させ、次いで反応液にリポ蛋白リパーゼを作用さ
せた後、アシルCoAまたはAMPを定量すること
を特徴とするFFAの測定方法に存する。 以下に、本発明を詳細に説明する。 本発明方法においてFFAを測定しようとする
試料は、通常FFAおよびリポ蛋白を含む検体
（例えば動物の血液や血清）に、必要に応じて
CoAおよびATPを添加したものが挙げられるが、
それ以外でもFFA，CoA，ATPおよびリポ蛋白
を含むものであれば試料として用いうる。 FFAおよびリポ蛋白を含む検体としては、例
えば乳び血清と呼ばれている血清が挙げられる。
血清は本来淡黄色の澄明な液体であるが、乳び血
清とは、白色または乳白色に濁つた半透明または
不透明な血清であり、食後20〜60分間に採取した
血清、または脂質代謝障害によりリポ蛋白が異常
に多い血清がこれに該当する。 リポ蛋白は試料の濁りの原因となるので、本発
明方法は、試料中のリポ蛋白量をFFA量に換算
した値として50μ当量／以上の濃度で含む試料
を用いた場合に、とくに大きな効果が認められ
る。 ACSは次式に示す様に、FFA，CoAおよび
ATPに作用して、アシルCoA，AMPおよびピロ
燐酸にする酵素である。 従つて、試料中のFFA量を測定するためには、
試料中にはFFAに対し当量以上のCoAおよび
ATPが含まれていることが必要である。CoAお
よびATPの反応液中の濃度は、FFAの濃度によ
り異なるが、通常ATPは２〜10μmole／ｍ、
CoAは0.05〜2μmole／mlであることが好ましい。 ACSの量は、反応液中の濃度として0.005〜
1U／mlが適当である。 ACSを作用させるACS反応は、通常用いられ
る条件により行えばよく、使用するACS量、温
度等により反応時間は異なるが、通常５〜60分で
ある。 また、ACS反応の平衡を回避するため、ミオ
キナーゼ等を使用してもよい。 このようにして、ACS反応を実質的に完了さ
せた後、CoA，ATPまたはACSを不活化させる。
不活化は、例えば化学的な方法でも、酵素的な方
法でも行なうことができる。 CoAの不活化は、例えば通常SH試薬といわれ
るマレイミド誘導体、ヨードアセトアミド、４，
4′―ビスメチルアミノベンツヒドロール等をCoA
のメルカプト基と化学的に結合させる等の化学的
方法や、CoA分解酵素によるCoAの分解不活化
等の酵素的方法により行うことができ、これらの
中ではSH試薬を用いる方法が最も好適である。 ATPの不活化は、例えばATP分解酵素による
ATPの分解不活化等の酵素的方法により行うこ
とができる。 ACSの不活化は、例えばEDTA等のキレート
剤によるMgイオンの捕捉等の化学的方法により
行行うことができる。 勿論、CoA、ATPおよびACSのうち二つ以上
を不活化させてもよい。 本発明に使用するリパーゼとは、その名の如く
リポ蛋白と結合した中性脂質（トリグリセライ
ド）を加水分解するリパーゼを意味する。 その起源としては微生物および動物臓器由来の
ものがあるが、実用的には微生物由来のものが好
ましい。例えば、細菌、例えばシユードモナス
（Pseudomonas）属、クロモバクテリウム
（Chromobacterium）属等の菌株の培養物から得
られるリポ蛋白リパーゼが好適である。その添加
量は、リポ蛋白の量、反応温度、および反応時間
により異なるが通常反応液50μl当り10〜1000U、
好ましくは100〜500Uである。 リポ蛋白リパーゼは、前記のCoA，ATPまた
はACSを不活化させた反応液に作用させる。 リポ蛋白リパーゼを作用させる条件としては、
PHは通常５〜９、温度は通常室温〜40℃の間が好
ましく、又時間としては添加するリポ蛋白リパー
ゼの量、温度にもよるが通常５分〜30分が好まし
い。 リポ蛋白リパーゼによる処理は、後記するよう
に、アシルCoAまたはAMPの定量と同時に行う
こともできる。 本発明方法においては、試料中のFFA量に化
学量論理的に対応しているアシルCoAまたは
AMPを定量することにより、FFA量の測定が可
能である。 アシルCoAまたはAMPの定量は、そのまま行
つてもよいが、通常は更に他の化合物に誘導して
測定を行う。このような方法としては、例えば下
式 （ADP：アデノシン―5′―ジホスフエート NADH：還元型ニコチンアミド―アデニンジ
ヌクレオチド NAD：ニコチンアミド―アデニンジヌクレオ
チド） で示す反応を組み合わせて、AMPの生成量を
NADHの減少量に変換するいわゆる紫外部比色
法、下式 で示す反応を組み合わせて、アシルCoAの生成
量を呈色物質の生成量に変換するいわゆる可視部
比色法および下式 で示す反応により、色素を還元したり、ロイコ色
素を発色させる方法等が挙げられ、これらの中で
は可視部比色法を用いる場合に、本発明の効果が
大ききく現れる。 これらの方法で、リポ蛋白リパーゼによる処理
と、アシルCoAまたはAMPの定量を同時に行う
には、前記したCoA，ATPまたはACSを不活化
した反応液に、発色剤とリポ蛋白リパーゼを同時
に添加すればよい。例えば、可視部比色法の場合
には、反応系に残存するCoAをSH試薬により不
活化した後、リポ蛋白リパーゼを含む発色を添加
することにより、試料の濁りの除去と発色とを同
時に進行させ、測定操作を短時間に行なうとがで
きる。 使用するアシルCoAまたはAMPの定量法の種
類により、本発明方法で不活化させるCoA，
ATP，ACSは適宜選択する必要がある。 本発明方法によれば、従来の方法では濁りを有
するために精度良く定量するとが難しかつたリポ
蛋白を含む試料中のFFAを、精度良く簡便に測
定するとができ、かつ試料ブランクの測定を省略
することも可能である。 以下に実施例を挙げて、本発明を更に詳細に説
明するが、本発明はその要旨を超えない限り、以
下の実施例により何等の限定を受けるものではな
い。 実施例 １ 〔試薬〕 反応試液 ACS2.5U、ミオキナーゼ4U、ATP.2Na（ATP
の２ナトリウム塩）10mg、CoA2.5mg、
MgCl₂6H₂O0.51mg、KCl18.6mg、ｐ―トルエンス
ルホン酸ソーダ100mg、Triton―100（商標名、ロ
ームアンドハース社非イオン性界面活性剤、以下
活性剤Ｔと略す）３mgを0.1Mトリス塩酸緩衝液
（PH7.85、25℃）5.0mlに溶解した。 反応停止液 Ｎ―エチルマレイミド6.25mgを、1/100Ｎ塩酸
５mlに溶解した。 発色試薬 ACO2.5U、POD0.1mg、４―アミノアンチピリ
ン塩酸塩1.4mg、ジエチルｍ―トルイジン2.5mg、
KCl600mgを20mM Ｎ，Ｎ―ビス（２―ヒドロキ
シエチル）―２―アミノエタン スルホン酸（以
後BESと略す。）緩衝液（PH7.5）20ml溶解した。 (注) ACS ヨーロピアン ジヤーナルオブ バイオケミス
トリー（European Journal of Biochemistry）
93巻197〜203ページ（1979年）の方法により精製
し、50％グリセリン―10mM燐酸カリウム緩衝液
（PH7.4）、活性剤T0.063％、２―メルカプトエタ
ノール2.5mMの溶液として用いた。 ACO 昭和54年脂質性化学研究会（富山）購演要旨集
144ページの方法に従つて精製し、50mM燐酸カ
リウム緩衝液、（PH7.4）―50％飽和硫安サスペン
シヨンとして用いた。 〔測定操作〕 検体50μl反応試薬0.5mlを試験管にとり、良く
混合後、37℃、15分間反応させる。次に反応停止
液0.5mlを添加し、よく混和後、発色試薬2.0mlを
添加し、混合後37℃、10分間インキユベート後、
550nmで吸度光を測定する。 測定に当つては標準試料として、オレイン酸カ
リ０〜2000μEq／を含む水溶液を50μサンプ
リングして、上記方法にて吸光度を調べ、FFA
の検量線を求め、次にこれを用いて未知試料中の
FFA値（μEq／）を算出する。 新鮮乳び血清12種類について、下記の実験を行
なつた。すなわち、先ず血清の濁りを評価するた
め、上記の測定法において、反応試薬としては
0.1MトリスHCl緩衝液（PH7.85）、反応停止液は
前述の通り、発色試薬としては20mM BES緩衝
液（PH7.5）とした系を用いてOD550nmを測定
し、これを血清のブランクとした。一方、血清の
FFA値は上記の測定法をそのまま用いた。 次に、クロモバクテリウム属細菌のリポ蛋白リ
パーゼ（東洋醸造社製品）1600Uを、20ml（10検
体分）の発色反応液中に添加し、これを用いてリ
ポ蛋白リパーゼ添加による血清ブランクおよび血
清FFA値を測定した。それぞれの測定値を表―
１に示した。 表―１から明らかな如く、12種の乳び血清はそ
の濁りだけでもFFAの検量線で計算する値にし
て40〜700μEq／程度あるが、これにリポ蛋白
リパーゼを添加することにより、その値は10〜
150μEq／、その大半は10〜40μEq／程度の
清澄な液となり、従つてリポ蛋白リパーゼを添加
しない場合の真のFFA値である(B)―(A)（これを
ｙとする）とリポ蛋白リパーゼを添加した場合の
見かけ上のFFA値(D)（これをｘとする）の相関
を求めるとその回帰式はｙ＝0.98x＋30、ｒ＝
0.999、ｎ＝12、また(B)―(A)（これをｙとする。）
とリポ蛋白リパーゼを添加した場合の直のFFA
値(D)―(C)（これをx₁とする。）との相関はｙ＝
0.96x₁＋23.1、ｒ＝1.00、ｎ＝12となる。この結
果より乳び血清でもリポ蛋白リパーゼを添加すれ
ば、血液ブランクを省略することも出ることを示
している。なお、通常の濁りの少ない血清10種に
ついて上記の如き実験を行なつたが、FFAの測
定値に有意差はなかつた。

【表】 実施例 ２ 41種の血清についてのFFA値を測定した。結
果を表―２に示した。 第一群はリポ蛋白リパーゼを添加しない場合、
第２群はリポ蛋白リパーゼを１検体当り160U添
加した場合の測定値、第３群は三菱化成工業〓製
FFA測定キツト（UV法）による測定値、第４群
は第一群の値から血清ブランク（実施例１の場合
と同様の処理を行なつたもの）の値を引いたも
の、なお血清No.30〜No.39は弱い乳び血清であつ
た。 第４群（リポ蛋白リパーゼ無添加―血清ブラン
クをx₂、第２群（リポ蛋白リパーゼ添加）をy₂と
する時の相関の回帰式はy₂＝1.01x₂＋1.9、ｒ＝
0.999と極めて良く又第３群（UV法測定値）を
x₃、第２群をy₃とした時も回帰式はy₃＝1.09x₃＋
10、ｒ＝0.995と極めて良好であつた。

【表】

【表】 実施例３ （リポ蛋白含有液を用いた実験） ５〜10人分の乳び血清をプールし、比重を
1.063とし分離用超遠心機により、50000r.p.m.で
22時間遠心分離後、遠心管の上層部分（白く濁つ
た部分）を採取し、テスト試料とした。まず、リ
ポ蛋白による濁りの除去と酵素の添加量の関係を
調べた。実施例１で用いたリポ蛋白リパーゼを、
検体当り所定量含む発色液を調製した。 実施例１の測定作法において最初にリポ蛋白試
料50μlを添加せずにACS反応試液0.5ml次いで反
応停止液0.5ml更に反応試液を２ml添加後上記試
料50μl添加し、37℃、10分間放置後550nmのC.D.
を測定した。結果を表―３に示した。

【表】 ＊ ブランクを引いた値
下段のリポ蛋白含有液の吸光度は、液の濁りを
表わし、リポ蛋白により濁り除去の効果は、リポ
蛋白リパーゼ10〜1000U／検体で確認された。た
だし、ブランクの吸光度は酵素が1000U／検体で
は、それ自身の濁りから高くなつた。 従つて至適添加量は100〜500U／検体と考えら
れる。次に同じリポ蛋白含有液を最初に50μl採取
し実施例１の方法で酵素の添加量と濁り除去の効
果をみた。結果を表―４に示した。

【表】 ＊ ブランクを引いた値
上表よりリポ蛋白含有液のリポ蛋白リパーゼ無
添加系ではリポ蛋白含有液はその濁りが加算され
吸光度は0.113であり、1mMオレイン酸ソーダの
標準液の吸光度から計算して見かけ上のFFA値
は420μEq／であるが、同じサンプルに100〜
1000U／検体のリポ蛋白リパーゼを添加した系で
はその吸光度から計算してFFA値は220―
200μEq／となり、これが、正しいFFA値と考
えられ、この約200μEq／の差は表―４の結果
と考え合せてリポ蛋白含有溶液の濁りに基づくも
のと考えられる。 なお、標準として用いた1mMオレイン酸ソー
ダ溶液の吸光度が酵素濃度を上げていくと下落す
る傾向があるが、リポ蛋白リパーゼに反応阻害が
あるものと思われる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 遊離脂肪酸、コエンザイムＡ、アデノシン―
   5′―トリホスフエートおよびリポ蛋白を含む試料
   に、アシルコエンザイムＡシンセターゼを作用さ
   せてアシルコエンザイムＡ、アデノシン―5′―モ
   ノホスフエートおよびピロ燐酸を生成させ、反応
   液中に残存するコエンザイムＡ、アデノシン―
   5′―トリホスフエートまたはアシルコエンザイム
   Ａシンセターゼを不活化させ、次いで反応液にリ
   ポ蛋白リパーゼを作用させた後、アシルコエンザ
   イムＡまたはアデノシン―5′―モノホスフエート
   を定量することを特徴とする遊離脂肪酸の測定方
   法。