JPH0526479B2 - - Google Patents
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- JPH0526479B2 JPH0526479B2 JP8225084A JP8225084A JPH0526479B2 JP H0526479 B2 JPH0526479 B2 JP H0526479B2 JP 8225084 A JP8225084 A JP 8225084A JP 8225084 A JP8225084 A JP 8225084A JP H0526479 B2 JPH0526479 B2 JP H0526479B2
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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- C12Q1/28—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving peroxidase
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Description
〔産業上の利用分野〕
本発明は、過酸化水素定量用試薬および定量方
法に関し、更に詳しくは、特に生体試料等の分析
において、酸化酵素を用いて生成される過酸化水
素を定量する際に還元物質の影響を受けることな
く用いることができる試薬および方法に関する。 〔従来技術〕 近年、臨床検査における生体試料分析では、各
種の酸化酵素を用いて過酸化水素を生成させ、そ
れを定量にする方法がよく用いられている。この
定量法として、ペルオキシダーゼの存在下で色原
体を酸化縮合させて有色色素とし、これを光学的
に吸光度測定する方法がある。 これを血液中の遊離脂肪酸を例にとつて説明す
る。 血中遊離脂肪酸は、体内の糖質および脂肪代謝
の動態を鋭敏に反映することが知られており、臨
床検査上、血中遊離脂肪酸の測定は、肝疾患、内
分泌疾患をはじめ糖尿病などの一連の糖質代謝異
常を示す各種疾患の鑑別診断や治療経過の判定に
きわめて有効な手段である。これらの血中遊離脂
肪酸の定量に多く用いられる原理は次の反応式に
従うものである： Ｒ−COOH＋ATP＋CoAACS ―――→ Mg2+アシル−CoA＋PPi＋AMP (1) アシル−CoA＋O2ACOD ―――→ ２，３−トランスエノイルCoA＋H2O2 (2) H2O2＋色原体POD ―――→ 有色色素 (3) すなわち、この反応ではアデノシン三リン酸
（ATP）とコエンザイムＡ（CoA）の存在下、脂
肪酸（Ｒ−COOH）にアシルCoA合成酵素
（ACS：EC6、２、１、３）を作用させてアシル
CoA、ピロリン酸（PPi）およびアデノシン−リ
ン酸（AMP）を生成させる。ここで生じたアシ
ルCoAをアシル−CoA酸化酵素（ACOD：EC）
により酸化し、２，３−トランスエノイルCoA
と共に発生する過酸化水素（H2O2）（反応(2)）
を、トリンダー反応等により、呈色させ（反応
(3)）遊離脂肪酸を測定するものである。 しかし、この時反応(1)、(2)、(3)を同一反応液内
で行なわせると、(1)の反応後に残存するCoAが
もともと還元力が強いため、それが(2)、(3)の反応
により生じる有色色素に影響を与え、その呈色の
安定性を阻害し、退色させるという欠点を有して
いる。さらに、色原体としてフエノール、トルイ
ジン誘導体、アニリン誘導体あるいはアニシジン
誘導体と４−アミノアンチピリンがよく用いられ
ているが、このとき生じた有色色素は特に生体試
料のように非常に多くの成分を含む場合、その試
料中の還元物質の影響を受けやすいことが指摘さ
れている。 〔発明の目的〕 本発明の目的は、還元性物質の影響を受けるこ
となく過酸化水素を定量することができる試薬お
よび方法を提供することにある。 〔発明の構成〕 本発明の要旨は、ペルオキシダーゼの存在下に
用いる、色原体である。水素受容体および水素供
与体として一般式： 〔式中、R1はハロゲンまたはスルホン基、R2は
炭素数１〜４のアルキル基または−COOR3基
（ここで、R3は炭素数１〜４のアルキル基であ
る。）を表わす。〕 で示されるピラゾロン誘導体を含んで成る過酸化
水素定量用試薬、およびペルオキシダーゼの存在
下、色原体である水素受容体および水素供与体を
用いて過酸化水素を定量する方法において、水素
供与体としてピラゾロン誘導体（）を用いるこ
とを特徴とする定量方法に存する。 ピラゾロン誘導体（）としては、１−（4′−
スルホフエニル）−３−カルボエトキシ−５−ピ
ラゾロン（以下、SCEPという。）、１−（4′−スル
ホフエニル）−３−メチル−５−ピラゾロン（以
下、SMPという。）、１−（4′−スルホフエニル）
−３−カルボキシ−５−ピラゾロン（以下、
SCOPという。）、さらに１位にハロフエニル基を
持つ対応化合物が好ましく用いられる。 水素受容体としては、従来から用いられている
ものがいずれも使用可能であり、就中、４−アミ
ノアンチピリン、が好ましい。 特に好ましい組合せは、４−アミノアンチピリ
ンとSCEPである。 本発明の定量方法で生成した有色色素は、通常
の分光光度計等を用い、透過率または吸光度を測
定することにより定量的に測定することができ
る。また、生成した有色色素は最大吸収に達した
後、その吸光度が長時間安定であるという利点を
有する。 本発明の定量用試薬は、特に近年自動化の進ん
でいる臨床検査の分野で優れた試薬として各種の
自動分析装置での使用が可能であるのみならず、
一般の成分分析における分野でも利用することが
できる。 〔実施例〕 次に実施例を示し、本発明に具体的に説明する
が、これらにより本発明が限定されるものではな
い。 実施例 １ ４−アミノアンチピリン（1.0mM）、ピラゾロ
ン誘導体（）（1.0mM）およびペルオキシダー
ゼ（10プルプロガロン単位）を含むリン酸緩衝液
（100mM、PH7.0）を反応液とした。この反応液
2.8ml中に過酸化水素（30％Ｗ／Ｖ）の水溶液
（0.01％）20μを加え、37℃恒温槽中で１分間反
応させ、還元性物質であるCoA−3Li（10mM）を
50μ加え、５分間反応させた後、CoA−3Liの
添加前と添加後について、有色色素の生成を極大
吸光度波長（525nｍ）で吸光度を測定して調べ
た。 第１表は、水素供与体としてピラゾロン誘導体
（）（SCEP、SMP、SCOP）または対照として
ピラゾロン誘導体の代りにフエノールを用いた場
合の結果を示す。
法に関し、更に詳しくは、特に生体試料等の分析
において、酸化酵素を用いて生成される過酸化水
素を定量する際に還元物質の影響を受けることな
く用いることができる試薬および方法に関する。 〔従来技術〕 近年、臨床検査における生体試料分析では、各
種の酸化酵素を用いて過酸化水素を生成させ、そ
れを定量にする方法がよく用いられている。この
定量法として、ペルオキシダーゼの存在下で色原
体を酸化縮合させて有色色素とし、これを光学的
に吸光度測定する方法がある。 これを血液中の遊離脂肪酸を例にとつて説明す
る。 血中遊離脂肪酸は、体内の糖質および脂肪代謝
の動態を鋭敏に反映することが知られており、臨
床検査上、血中遊離脂肪酸の測定は、肝疾患、内
分泌疾患をはじめ糖尿病などの一連の糖質代謝異
常を示す各種疾患の鑑別診断や治療経過の判定に
きわめて有効な手段である。これらの血中遊離脂
肪酸の定量に多く用いられる原理は次の反応式に
従うものである： Ｒ−COOH＋ATP＋CoAACS ―――→ Mg2+アシル−CoA＋PPi＋AMP (1) アシル−CoA＋O2ACOD ―――→ ２，３−トランスエノイルCoA＋H2O2 (2) H2O2＋色原体POD ―――→ 有色色素 (3) すなわち、この反応ではアデノシン三リン酸
（ATP）とコエンザイムＡ（CoA）の存在下、脂
肪酸（Ｒ−COOH）にアシルCoA合成酵素
（ACS：EC6、２、１、３）を作用させてアシル
CoA、ピロリン酸（PPi）およびアデノシン−リ
ン酸（AMP）を生成させる。ここで生じたアシ
ルCoAをアシル−CoA酸化酵素（ACOD：EC）
により酸化し、２，３−トランスエノイルCoA
と共に発生する過酸化水素（H2O2）（反応(2)）
を、トリンダー反応等により、呈色させ（反応
(3)）遊離脂肪酸を測定するものである。 しかし、この時反応(1)、(2)、(3)を同一反応液内
で行なわせると、(1)の反応後に残存するCoAが
もともと還元力が強いため、それが(2)、(3)の反応
により生じる有色色素に影響を与え、その呈色の
安定性を阻害し、退色させるという欠点を有して
いる。さらに、色原体としてフエノール、トルイ
ジン誘導体、アニリン誘導体あるいはアニシジン
誘導体と４−アミノアンチピリンがよく用いられ
ているが、このとき生じた有色色素は特に生体試
料のように非常に多くの成分を含む場合、その試
料中の還元物質の影響を受けやすいことが指摘さ
れている。 〔発明の目的〕 本発明の目的は、還元性物質の影響を受けるこ
となく過酸化水素を定量することができる試薬お
よび方法を提供することにある。 〔発明の構成〕 本発明の要旨は、ペルオキシダーゼの存在下に
用いる、色原体である。水素受容体および水素供
与体として一般式： 〔式中、R1はハロゲンまたはスルホン基、R2は
炭素数１〜４のアルキル基または−COOR3基
（ここで、R3は炭素数１〜４のアルキル基であ
る。）を表わす。〕 で示されるピラゾロン誘導体を含んで成る過酸化
水素定量用試薬、およびペルオキシダーゼの存在
下、色原体である水素受容体および水素供与体を
用いて過酸化水素を定量する方法において、水素
供与体としてピラゾロン誘導体（）を用いるこ
とを特徴とする定量方法に存する。 ピラゾロン誘導体（）としては、１−（4′−
スルホフエニル）−３−カルボエトキシ−５−ピ
ラゾロン（以下、SCEPという。）、１−（4′−スル
ホフエニル）−３−メチル−５−ピラゾロン（以
下、SMPという。）、１−（4′−スルホフエニル）
−３−カルボキシ−５−ピラゾロン（以下、
SCOPという。）、さらに１位にハロフエニル基を
持つ対応化合物が好ましく用いられる。 水素受容体としては、従来から用いられている
ものがいずれも使用可能であり、就中、４−アミ
ノアンチピリン、が好ましい。 特に好ましい組合せは、４−アミノアンチピリ
ンとSCEPである。 本発明の定量方法で生成した有色色素は、通常
の分光光度計等を用い、透過率または吸光度を測
定することにより定量的に測定することができ
る。また、生成した有色色素は最大吸収に達した
後、その吸光度が長時間安定であるという利点を
有する。 本発明の定量用試薬は、特に近年自動化の進ん
でいる臨床検査の分野で優れた試薬として各種の
自動分析装置での使用が可能であるのみならず、
一般の成分分析における分野でも利用することが
できる。 〔実施例〕 次に実施例を示し、本発明に具体的に説明する
が、これらにより本発明が限定されるものではな
い。 実施例 １ ４−アミノアンチピリン（1.0mM）、ピラゾロ
ン誘導体（）（1.0mM）およびペルオキシダー
ゼ（10プルプロガロン単位）を含むリン酸緩衝液
（100mM、PH7.0）を反応液とした。この反応液
2.8ml中に過酸化水素（30％Ｗ／Ｖ）の水溶液
（0.01％）20μを加え、37℃恒温槽中で１分間反
応させ、還元性物質であるCoA−3Li（10mM）を
50μ加え、５分間反応させた後、CoA−3Liの
添加前と添加後について、有色色素の生成を極大
吸光度波長（525nｍ）で吸光度を測定して調べ
た。 第１表は、水素供与体としてピラゾロン誘導体
（）（SCEP、SMP、SCOP）または対照として
ピラゾロン誘導体の代りにフエノールを用いた場
合の結果を示す。
【表】
これらの結果から、明らかなようにピラゾロン
誘導体はフエノールに比較し、強力な還元性物質
であるCoA−3Liの影響を受けないことがわか
る。 実施例 ２ 実施例１の結果に基づき、血清中の遊離脂肪酸
の定量方法を次に示す。 実施例１で用いた反応液100ml当り塩化マグネ
シウム・６水化物30.5mg、CoA−3Li塩40mg、
ATP−2Na60.5mg、EDTA−2Na7.4mg、ACS50
単位およびACOD50単位を加え、これを定量用
試薬とした。この定量用試薬３mlに人血清および
標準液（オレイン酸1mEq／）を各50μ加え、
37℃の恒温槽で５分間反応させた後、精製水を対
照として525nｍで吸光度を測定した。結果を第
１図および第２図に示す。 第１図は試料添加後の反応の経過を示したもの
で、この結果から１時間以上呈色は安定している
ことがわかる。また第２図は検量線を示したもの
で、この結果から2.0mEq／まで直線が得られ
る。
誘導体はフエノールに比較し、強力な還元性物質
であるCoA−3Liの影響を受けないことがわか
る。 実施例 ２ 実施例１の結果に基づき、血清中の遊離脂肪酸
の定量方法を次に示す。 実施例１で用いた反応液100ml当り塩化マグネ
シウム・６水化物30.5mg、CoA−3Li塩40mg、
ATP−2Na60.5mg、EDTA−2Na7.4mg、ACS50
単位およびACOD50単位を加え、これを定量用
試薬とした。この定量用試薬３mlに人血清および
標準液（オレイン酸1mEq／）を各50μ加え、
37℃の恒温槽で５分間反応させた後、精製水を対
照として525nｍで吸光度を測定した。結果を第
１図および第２図に示す。 第１図は試料添加後の反応の経過を示したもの
で、この結果から１時間以上呈色は安定している
ことがわかる。また第２図は検量線を示したもの
で、この結果から2.0mEq／まで直線が得られ
る。
第１図は実施例２で用いた反応液3.0mlに標準
液、人血清およびブランク（精製水）を各々50μ
加えた後の呈色の経時変化を示したグラフ、お
よび第２図は標準液を用いて作成した検量線を示
す。
液、人血清およびブランク（精製水）を各々50μ
加えた後の呈色の経時変化を示したグラフ、お
よび第２図は標準液を用いて作成した検量線を示
す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ペルオキシダーゼの存在下に用いる、色原体
である水素受容体および水素供与体として 一般式： 〔式中、R1はハロゲンまたはスルホン基、R2は
炭素数１〜４のアルキル基または−COOR3基
（ここで、R3は炭素数１〜４のアルキル基であ
る。）を表わす。〕 で示されるピラゾロン誘導体を含んで成る過酸化
水素定量用試薬。 ２ 水素受容体が４−アミノアンチピリンである
特許請求の範囲第１項記載の試薬。 ３ ペルオキシダーゼの存在下、色原体である水
素受容体および水素供与体を用いて過酸化水素を
定量する方法において、水素供与体として 一般式： 〔式中、R1はハロゲンまたはスルホン基、R2は
炭素数１〜４のアルキル基または−COOR3基
（ここで、R3は炭素数１〜４のアルキル基であ
る。）を表わす。〕 で示されるピラゾロン誘導体を用いることを特徴
とする定量方法。 ４ 水素受容体が４−アミノアンチピリンである
特許請求の範囲第３項記載の定量方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8225084A JPS60225061A (ja) | 1984-04-23 | 1984-04-23 | 過酸化水素定量用試薬および定量方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8225084A JPS60225061A (ja) | 1984-04-23 | 1984-04-23 | 過酸化水素定量用試薬および定量方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60225061A JPS60225061A (ja) | 1985-11-09 |
| JPH0526479B2 true JPH0526479B2 (ja) | 1993-04-16 |
Family
ID=13769184
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8225084A Granted JPS60225061A (ja) | 1984-04-23 | 1984-04-23 | 過酸化水素定量用試薬および定量方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60225061A (ja) |
-
1984
- 1984-04-23 JP JP8225084A patent/JPS60225061A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS60225061A (ja) | 1985-11-09 |
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