JP2009519713A - 血漿中及び組織中のスフィンゴエミリン及びホスファチジルコリンの酵素的測定方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】細菌のSMアーゼを用い、スフィンゴミエリンを、ホスホリルコリン及びn−アシルスフィンゴシンに加水分解し、アルカリ性ホスファターゼを用いてステップ1から生じるホスホリルコリンからコリンを生成させ、コリンオキシダーゼを添加して過酸化水素を生成させ、過酸化水素と、DAOS、4−アミノアンチピリン及びペルオキシダーゼを用いて青紫色を発色させる方法。並びに、細菌由来のホスホリパーゼDを用い、ホスファチジルコリンを、コリン及びホスファチジン酸に加水分解し、コリンオキシダーゼを添加して過酸化水素を生成させ、過酸化水素と、DAOS、4−アミノアンチピリン及びペルオキシダーゼを用いて青紫色を発色させる方法。
【選択図】図1
Description
1)細菌由来のSMアーゼを用いて、スフィンゴミエリンをホスホリルコリン及びn−アシルスフィンゴシンに加水分解するステップと、
2)アルカリ性ホスファターゼを用いて、ステップ1から生じるホスホリルコリンからコリンを生成させるステップと、
3)コリンオキシダーゼを添加して過酸化水素を生成させるステップと、
4)過酸化水素と、DAOS(N−エチル−N−(2−ハイドロキシ−3−スルホプロピル)−3,5−ジメトキシアニリン ナトリウム塩)、4−アミノアンチピリン及びペルオキシダーゼを用いて青紫色(好ましくは595nmの最大吸収スペクトルを有する)を発色させるステップを含んでなる。
1)細菌由来のホスホリパーゼDを用いて、ホスファチジルコリンをコリン及びホスファチジン酸に加水分解するステップと、
2)コリンオキシダーゼを添加して過酸化水素を生成させるステップと、
3)過酸化水素と、DAOS(N−エチル−N−(2−ハイドロキシ−3−スルホプロピル)−3,5−ジメトキシアニリン ナトリウム塩)、4−アミノアンチピリン及びペルオキシダーゼを用いて青紫色(好ましくは595nmの最大吸収スペクトルを有する)を発色させるステップを含んでなる。
1)脂質の抽出、
2)薄層クロマトグラフ(TLC)、
3)薄層クロマトグラフィープレート上の対応するスポットからSM及びPC抽出、
4)各抽出のホスフェートの定量。全てのステップは多くの時間を要し、また感度が低い。全コリン含有リン脂質(PC+SM)を測定する単純な方法であれば存在するが(Wako Pure Chemical社製)、直接SM及びPCを測定のための方法は存在しない。
試薬:
SMアーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、コリンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ及び4−アミノアンチピリン、並びにスタンダードSM及びスタンダードPCは、Sigma−Aldrich社から購入した。ホスホリパーゼDは、BIOMOL International社から購入した。DAOS(N−エチル−N−(2−ハイドロキシ−3−スルホプロピル)−3,5−ジメトキシアニリン ナトリウム塩)は、Dojindo Molecular Technologies社から購入した
血漿中のSMレベルの酵素学的な測定を、以下の4ステップで行った(図1A):
1)細菌由来のSMアーゼでSMをホスホリルコリン及びn−アシルスフィンゴシンに加水分解させるステップと、
2)アルカリ性ホスファターゼでホスホリルコリンからコリンを生成させるステップと、
3)コリンを用い、コリンオキシダーゼによる触媒反応に供し、過酸化水素を生成させるステップと、
4)過酸化水素を、DAOS(N−エチル−N−(2−ハイドロキシ−3−スルホプロピル)−3,5−ジメトキシアニリン ナトリウム塩)、4−アミノアンチピリン及び触媒としてのペルオキシダーゼと共に用いて、青紫色の発色物質(595nmの最大吸収スペクトル)を生成させるステップ。反応バッファを、0.05MのTris塩酸、5mg/dlの塩化カルシウム(pH8)とした。50mlの反応バッファ中の酵素濃度を以下の通りとした:
SMアーゼ:25U、
アルカリ性ホスファターゼ:500U、
コリンオキシダーゼ:25U及び
ペルオキシダーゼ:1000U。
DAOSの濃度を0.73mMとし、4−アミノアンチピリンの濃度を0.73mMとした。5μlの血漿を100μl反応バッファ(+酵素)に添加し、37℃で45分インキュベートした後、595nmの吸光度を分光光度測定用のプレートリーダーで測定した。
5mgのSMを、10mlの2%トリトンX−100/エタノール溶液に溶解させて調製した。
血漿中のPCレベルの酵素学的な測定を、以下の3ステップで行った(図2B):
1)細菌由来のホスホリパーゼD(PC特異的、SMと反応しない)を用いて、PCをコリン及びホスファチジン酸に加水分解させるステップと、
2)コリンを用い、コリンオキシダーゼによる触媒反応に供し、過酸化水素を生成させるステップと、
3)過酸化水素を、DAOS(N−エチル−N−(2−ハイドロキシ−3−スルホプロピル)−3,5−ジメトキシアニリン ナトリウム塩)、4−アミノアンチピリン及び触媒としてのペルオキシダーゼと共に用いて、青紫色の発色物質(595nmの最大吸収スペクトル)を生成させるステップ。反応バッファを、0.05MのTris塩酸、5mg/dlの塩化カルシウム(pH7)とした。50mlの反応バッファ中の酵素濃度を以下の通りとした:
ホスホリパーゼD:6000U(測定時に添加)、
コリンオキシダーゼ:25U、
ペルオキシダーゼ:1000U。
DAOSの濃度を0.73mMとし、4−アミノアンチピリンの濃度を0.73mMとした。5μlの血漿を100μl反応バッファ(+酵素)に添加し、37℃で45分インキュベートした後、595nmの吸光度を測定した。
10mgのPCを、10mlの2%トリトンX−100/エタノール溶液に溶解させて調製した。
血漿中のコリン含有リン脂質(PC+SM)の全量を酵素的方法(Wako Pure Chemical社製)で測定した。
血漿中のSM又はPC濃度の酵素学的測定を、新規な4ステップ又は3ステップによる方法を用いて実施した(図1)。図2に示すように、SM測定の直線領域は0.5〜5μgであり、PCでは2.5〜20μgであった(図2)。SM及びPC濃度は、プールされた異なる量の血漿について測定し、両方のアッセイの直線領域が2.5μl〜10μlであることを見出した(図3)。
SM及びPCは、1つのサンプルあたり20回測定した。SMアッセイのアッセイ間の変動係数は1.7+0.05%であり、PCアッセイでは3.1±0.13%であった。
**市販のキット(Wako Pure Chemical)で測定。
SM:スフィンゴミエリン、PC:ホスファチジルコリン。値を平均+SD(n=17)で示す。
SM測定法の感度を増加させ、溶血を回避するために、フェノールの代わりに、DAOS(595nmの最大吸収スペクトル)を反応の最終ステップに用いた。この変更により、測定感度の増加(10mg/dl未満のSMを検出できる)のみならず、溶血も回避することが可能となる。
スタンダードSM(0.35〜3.5μg)を用いた標準曲線は、SM測定法において直線性を有していた。スタンダードPC(6〜24μg)を用いた標準曲線は、PC測定法において直線性を有していた。血漿中SMのアッセイの直線領域は10〜120mg/dlであった。血漿中PCのアッセイの直線領域は10〜250mg/dlであった。
新規な測定方法により、SM及びPCを、1サンプルあたり20回測定した。SMアッセイにおけるアッセイ間の変動係数は1.7+0.05%であった。PCアッセイにおけるアッセイ間の変動係数は3.1+0.13%であった。
Claims (3)
- 血漿及び組織中のスフィンゴミエリン及びホスファチジルコリンの測定方法であって、
1)細菌由来のSMアーゼを用いて、スフィンゴミエリンを、ホスホリルコリン及びn−アシルスフィンゴシンに加水分解するステップと、
2)アルカリ性ホスファターゼを用いて、ステップ1から生じるホスホリルコリンからコリンを生成させるステップと、
3)コリンオキシダーゼを添加して過酸化水素を生成させるステップと、
4)過酸化水素と、DAOS(N−エチル−N−(2−ハイドロキシ−3−スルホプロピル)−3,5−ジメトキシアニリン ナトリウム塩)、4−アミノアンチピリン及びペルオキシダーゼを用いて青紫色を発色させるステップを含んでなる方法。 - 血漿及び組織中のスフィンゴミエリン及びホスファチジルコリンの測定方法であって、
1)細菌由来のホスホリパーゼDを用いて、ホスファチジルコリンを、コリン及びホスファチジン酸に加水分解するステップと、
2)コリンオキシダーゼを添加して過酸化水素を生成させるステップと、
3)過酸化水素と、DAOS(N−エチル−N−(2−ハイドロキシ−3−スルホプロピル)−3,5−ジメトキシアニリン ナトリウム塩)、4−アミノアンチピリン及びペルオキシダーゼを用いて青紫色を発色させるステップを含んでなる方法。 - ステップ1の細菌由来のホスホリパーゼDを用いて、ホスファチジルコリンを、コリン及びホスファチジン酸に加水分解するステップを更に含んでなる、請求項1記載の方法。
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