CN112575057B - 一种组合物及其在检测脂蛋白相关磷脂酶a2活性中的应用 - Google Patents

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Abstract

一种组合物及其在检测脂蛋白相关磷脂酶A2活性中的应用，该组合物含有底物、稳定剂，所述稳定剂选自冠醚类化合物、葡聚糖类化合物中的至少一种，所述底物可结合至脂蛋白相关磷脂酶A2，结合至所述脂蛋白相关磷脂酶A2的底物会发生分解。稳定剂的加入，使底物更加稳定，不易发生水解，有效控制试剂的空白吸光度，使得试剂的有效期达12个月以上。

Description

一种组合物及其在检测脂蛋白相关磷脂酶A2活性中的应用
技术领域
本发明涉及医学检验技术领域。特别的，具体涉及一种组合物及其在检测脂蛋白相关磷脂酶A2活性中的应用。
背景技术
研究显示，中国等国家心血管病患病率处于持续上升阶段。研究表明，动脉粥样硬化是心脑血管疾病的病理基础。
脂蛋白相关磷脂酶A2(简称Lp-PLA2)能通过水解动脉内膜上氧化低密度脂蛋白(LDL)上的氧化磷脂而生成溶血磷脂酰胆碱(lysophosphatidylcholine，Lyso-PC)和氧化型游离脂肪酸(oxidized free fatty acids，ox-FA)，这两种促炎介质能刺激黏附因子和细胞因子的产生，促进动脉粥样硬化的发生和发展，导致血栓形成和心血管事件的发生。因此，Lp-PLA2可作为心血管疾病中一种新的炎症酶，是心血管疾病(CVD)、冠心病(CHD)、以及缺血性脑卒中的独立危险因素。检测人外周血Lp-PLA2浓度能给临床医生提供预防和治疗心脑血管疾病的新靶点，为临床疾病的早期干预、临床应用治疗提供新思路和新方向。
临床上主要通过浓度或者活性来检测血液中脂蛋白相关磷脂酶A2。检测浓度的方法存在定量准确性差、操作时间长、假阴性以及自动化程度低等缺点，而酶法是基于酶催化底物而建立的，操作简便、抗干扰能力强、检测迅速，便于推广使用。
目前酶活的测定原理主要有两种：一是使用PAF硫酯类为底物，Lp-PLA2水解底物上sn-2位的硫酯基团释放出游离硫醇，然后加入可以检测硫醇的5，5-二硫(二硝苯甲酸)，在405nm处检测吸光度的变化。此方法的优点是底物来源方便，可自己合成或购买，但该反应易受巯基基团的影响，准确度不高。二是以sn-2位带有4-硝基苯酚基团的PAF类似物为底物，Lp-PLA2水解底物后释放出带有4-硝基苯酚基团的物质，该物质不稳定，在水溶液中迅速降解生成对硝基苯酚，可通过检测405nm波长下吸光度的变化测定Lp-PLA2的活性。该方法受到外界的影响较少且操作简单，可以上全自动生化分析仪。但该方法的底物PAF类似物为脂类，几乎不溶于水，且样本中血清酶等也能水解PAF类似物，使得测定结果不准确。用乙醇或者甘油虽可以促进底物形成水相，使得测定结果准确，但底物的稳定性大大降低，很容易发生降解，进而影响试剂的空白吸光度及试剂效期。目前市售的试剂盒多为Rl、R2a、R2b三试剂，使用前需将R2a和R2b按比例混合，混合后的试剂有效期为28天，使用不方便，配制后试剂稳定性差，有效期短。
发明内容
本发明提供一种组合物及其在检测脂蛋白相关磷脂酶A2活性中的应用。
根据第一方面，一种实施例中提供一种组合物，该组合物含有底物、稳定剂，所述稳定剂选自冠醚类化合物、葡聚糖类化合物中的至少一种，所述底物可结合至脂蛋白相关磷脂酶A2，结合至所述脂蛋白相关磷脂酶A2的底物会发生分解。
根据第二方面，一种实施例中提供一种试剂组合，包括第一方面所述组合物。
根据第三方面，一种实施例中提供一种试剂盒，包括第一方面所述组合物或第二方面所述试剂组合。
根据第四方面，一种实施例中提供第一方面所述组合物，或第二方面所述试剂组合，或第三方面所述试剂盒在测定脂蛋白相关磷脂酶A2活性中的应用。
依据上述实施例的一种组合物及其在检测脂蛋白相关磷脂酶A2活性中的应用，由于稳定剂的加入，使底物更加稳定，不易发生水解，有效控制试剂的空白吸光度，显著延长试剂的有效期，在一些实施例中，稳定剂可使得试剂的有效期达12个月以上。
附图说明
图1显示为实施例1的校准曲线图；
图2显示为为实施例1的试剂盒与现有的DiaSys试剂盒检测结果关系曲线图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。其中不同实施方式中类似元件采用了相关联的类似的元件标号。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本申请能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他元件、材料、方法所替代。在某些情况下，本申请相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本申请的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。
另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时，方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此，说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例，并不意味着是必须的顺序，除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。
本文中为部件所编序号本身，例如“第一”、“第二”等，仅用于区分所描述的对象，不具有任何顺序或技术含义。
定义
本文中，脂蛋白相关磷脂酶A2(Lipoprotein-associated phospholipaseA2，简称Lp-PLA2)又称血小板活化因子乙酞水解酶(PAF-AH)，是一种炎性细胞分泌的能促使氧化磷脂水解的磷脂酶，是磷脂酶A2(PLA2)超家族中的一员，相对分子质量为45.4kD(441个氨基酸)。
本文中，“第一试剂”也可表示为“R1试剂”或“试剂1”，“第二试剂”也可表示为“R2试剂”或“试剂2”。
本文中，“盐”是指一类金属离子或铵根离子(NH4 +)与酸根离子结合的化合物。
本文中，“试剂盒”包括一个或更多个包含本文公开的组合物的容器和/或一个或更多个包含本文公开的试剂的组分的容器。公开的试剂盒还包括一个或更多个递送系统或施加系统，和/或使用说明，和/或容器。
在一些实施例中，第一试剂、第二试剂独立分装在不同的容器中，使用前再进行混合。
根据第一方面，在一些实施例中，提供一种组合物，该组合物含有底物、稳定剂，所述稳定剂选自冠醚类化合物、葡聚糖类化合物中的至少一种，所述底物可结合至脂蛋白相关磷脂酶A2，结合至所述脂蛋白相关磷脂酶A2的底物会发生分解。加入的稳定剂使底物更加稳定，不易发生水解，有效控制试剂的空白吸光度，显著提升试剂的有效期。
在一些实施例中，所述冠醚类化合物包括但不限于18-冠醚-6(CAS登录号：17455-13-9)、二环己烷并-18-冠醚-6(CAS登录号：16069-36-6)、2-氨基甲基-18-冠-6(CAS登录号：83585-61-9)、12-冠醚-4(CAS登录号：294-93-9)、15-冠醚-5(CAS登录号：33100-27-5)、二苯并-18-冠醚-6(CAS号登录号：14187-32-7)等等中的至少一种。
在一些实施例中，所述葡聚糖类化合物包括但不限于葡聚糖40、葡聚糖70、二乙胺乙基葡聚糖、硫酸葡聚糖等等中的至少一种。
在一些实施例中，所述稳定剂在所述组合物中的浓度可以为0.01-0.5wt％，具体可以包括但不限于0.01wt％、0.02wt％、0.03wt％、0.04wt％、0.05wt％、0.06wt％、0.07wt％、0.08wt％、0.09wt％、0.1wt％、0.2wt％、0.3wt％、0.4wt％、0.5wt％等等。“wt％”是指质量百分浓度。此处浓度仅仅是示例性列举，也可以是其他浓度。稳定剂使得底物不易分解，试剂更加稳定。
在一些实施例中，所述底物为血小板激活因子类似物。
在一些实施例中，所述底物的sn-2位带有4-硝基苯酚基团，所述底物的sn-2位带有4-硝基苯酚基团，所述脂蛋白相关磷脂酶A2与所述底物结合后，所述底物发生水解，释放出带有4-硝基苯酚基团的物质，该物质在溶液中降解，生成对硝基苯酚。以sn-2位带有4-硝基苯酚基团的血小板激活因子(PAF)类似物为底物，Lp-PLA2水解底物后释放出带有4-硝基苯酚基团的物质，该物质不稳定，在水溶液中迅速降解生成对硝基苯酚，可通过检测接近405nm波长下吸光度的变化测定Lp-PLA2的活性。
在一些实施例中，所述底物包括但不限于1-十四酰基-2-4-对硝基苯酚丁二酸酐-3-磷脂酰乙醇胺、1-十四酰基-2-4-对硝基苯酚丁二酸酐-3-磷脂酰甘油、1-十四酰基-2-4-对硝基苯酚丁二酸酐-3-磷脂酰胆酰等等中的至少一种。
在一些实施例中，所述底物在所述组合物中的浓度可以为0.001-0.5wt％，具体可以包括但不限于0.001wt％、0.002wt％、0.003wt％、0.004wt％、0.005wt％、0.006wt％、0.007wt％、0.008wt％、0.009wt％、0.01wt％、0.02wt％、0.03wt％、0.04wt％、0.05wt％、0.06wt％、0.07wt％、0.08wt％、0.09wt％、0.1wt％、0.2wt％、0.3wt％、0.4wt％、0.5wt％等等。此处浓度仅仅是示例性列举，也可以是其他浓度。
在一些实施例中，所述组合物还含有助溶剂。由于PAF类似物(即底物)为脂类，在水中的溶解度有限，因此，助溶剂可提高Lp-PLA2底物在水中的溶解性。
在一些实施例中，所述助溶剂包括但不限于有机溶剂。
在一些实施例中，所述助溶剂包括但不限于乙腈、乙醇、甘油、二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)等等中的至少一种。
在一些实施例中，所述助溶剂在所述组合物中的浓度可以为2-10wt％，具体可以包括但不限于2wt％、3wt％、4wt％、5wt％、6wt％、7wt％、8wt％、9wt％、10wt％等等。此处浓度仅仅是示例性列举，也可以是其他浓度。
在一些实施例中，所述组合物还含有有机酸、第二抑制剂中的至少一种。
在一些实施例中，所述有机酸可以包括但不限于柠檬酸、乙酸、草酸、羟基乙酸、氨基磺酸、柠檬酸、丁二酸、苯甲酸等等中的至少一种。
在一些实施例中，所述有机酸在所述组合物中的浓度可以为5-100mmol/L，具体可以包括但不限于5mmol/L、6mmol/L、7mmol/L、8mmol/L、9mmol/L、10mmol/L、20mmol/L、30mmol/L、40mmol/L、50mmol/L、60mmol/L、70mmol/L、80mmol/L、90mmol/L、100mmol/L等等。此处浓度仅仅是示例性列举，也可以是其他浓度。有机酸在试剂中具有缓冲剂的作用。
在一些实施例中，第二抑制剂可以包括但不限于3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐、3-[(3-胆胺丙基)二甲基氨基]-2-羟基-1-丙磺酸内盐、正壬烷磺酸钠、戊烷磺酸钠、己烷磺酸钠、1-庚烷磺酸钠等等中的至少一种。
在一些实施例中，所述第二抑制剂在所述组合物中的浓度可以为2-50mmol/L，具体可以包括但不限于2mmol/L、3mmol/L、4mmol/L、5mmol/L、6mmol/L、7mmol/L、8mmol/L、9mmol/L、10mmol/L、20mmol/L、30mmol/L、40mmol/L、50mmol/L等等。此处浓度仅仅是示例性列举，也可以是其他浓度。抑制剂可以抑制人血样中的其他酶(如卵磷脂胆固醇脂酰转移酶和对氧磷酶)对PAF类底物的水解。
在一些实施例中，所述组合物的pH可以为3.0-7.0，具体可以包括但不限于3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0等等。此处pH仅仅是示例性列举，也可以是其他pH值。
根据第二方面，在一些实施例中，提供一种试剂组合，包括第一方面所述组合物。
在一些实施例中，所述试剂组合包括第一试剂、第二试剂，所述第二试剂含有第一方面所述组合物。
在一些实施例中，所述第二试剂为第一方面所述组合物。
在一些实施例中，所述第一试剂含有缓冲剂、螯合剂、第一抑制剂、盐中的至少一种。此处仅仅是部分列举，第一试剂中还可以含有其他组份。
在一些实施例中，所述缓冲剂包括但不限于磷酸盐(PB)、3-吗啉丙磺酸(MOPS)、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸(MOPSO)、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)等等中的至少一种。
在一些实施例中，所述缓冲剂在所述第一试剂中的浓度可以为50-300mmol/L，具体可以包括但不限于50mmol/L、60mmol/L、70mmol/L、80mmol/L、90mmol/L、100mmol/L、110mmol/L、120mmol/L、130mmol/L、140mmol/L、150mmol/L、160mmol/L、170mmol/L、180mmol/L、190mmol/L、200mmol/L、210mmol/L、220mmol/L、230mmol/L、240mmol/L、250mmol/L、260mmol/L、270mmol/L、280mmol/L、290mmol/L、300mmol/L等等。此处浓度仅仅是示例性列举，也可以是其他浓度。
在一些实施例中，所述螯合剂包括但不限于氨基三亚甲基膦酸(ATMP)、乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)、乙二胺四亚甲基膦酸(EDTMP)、乙二胺四乙酸(EDTA)等等中的至少一种。
在一些实施例中，所述螯合剂在所述第一试剂中的浓度可以为5-50mmol/L，具体可以包括但不限于5mmol/L、6mmol/L、7mmol/L、8mmol/L、9mmol/L、10mmol/L、11mmol/L、12mmol/L、13mmol/L、14mmol/L、15mmol/L、16mmol/L、17mmol/L、18mmol/L、19mmol/L、20mmol/L、21mmol/L、22mmol/L、23mmol/L、24mmol/L、25mmol/L、26mmol/L、27mmol/L、28mmol/L、29mmol/L、30mmol/L、31mmol/L、32mmol/L、33mmol/L、34mmol/L、35mmol/L、36mmol/L、37mmol/L、38mmol/L、39mmol/L、40mmol/L、41mmol/L、42mmol/L、43mmol/L、44mmol/L、45mmol/L、46mmol/L、47mmol/L、48mmol/L、49mmol/L、50mmol/L等等。此处浓度仅仅是示例性列举，也可以是其他浓度。
在一些实施例中，所述第一抑制剂包括但不限于3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐、3-[(3-胆胺丙基)二甲基氨基]-2-羟基-1-丙磺酸内盐、正壬烷磺酸钠、戊烷磺酸钠、己烷磺酸钠、1-庚烷磺酸钠等等中的至少一种。
在一些实施例中，所述第一抑制剂在所述第一试剂中的浓度可以为1-50mmol/L，具体可以包括但不限于1mmol/L、2mmol/L、3mmol/L、4mmol/L、5mmol/L、6mmol/L、7mmol/L、8mmol/L、9mmol/L、10mmol/L、11mmol/L、12mmol/L、13mmol/L、14mmol/L、15mmol/L、16mmol/L、17mmol/L、18mmol/L、19mmol/L、20mmol/L、21mmol/L、22mmol/L、23mmol/L、24mmol/L、25mmol/L、26mmol/L、27mmol/L、28mmol/L、29mmol/L、30mmol/L、31mmol/L、32mmol/L、33mmol/L、34mmol/L、35mmol/L、36mmol/L、37mmol/L、38mmol/L、39mmol/L、40mmol/L、41mmol/L、42mmol/L、43mmol/L、44mmol/L、45mmol/L、46mmol/L、47mmol/L、48mmol/L、49mmol/L、50mmol/L等等。此处浓度仅仅是示例性列举，也可以是其他浓度。
在一些实施例中，所述盐包括但不限于氯化钠、氯化钾、氯化镁、氯化钙、硫酸铜等等中的至少一种。
在一些实施例中，所述盐在所述第一试剂中的浓度可以为50-500mmol/L，具体可以包括但不限于50mmol/L、60mmol/L、70mmol/L、80mmol/L、90mmol/L、100mmol/L、110mmol/L、120mmol/L、130mmol/L、140mmol/L、150mmol/L、160mmol/L、170mmol/L、180mmol/L、190mmol/L、200mmol/L、210mmol/L、220mmol/L、230mmol/L、240mmol/L、250mmol/L、260mmol/L、270mmol/L、280mmol/L、290mmol/L、300mmol/L、310mmol/L、320mmol/L、330mmol/L、340mmol/L、350mmol/L、360mmol/L、370mmol/L、380mmol/L、390mmol/L、400mmol/L、410mmol/L、420mmol/L、430mmol/L、440mmol/L、450mmol/L、460mmol/L、470mmol/L、480mmol/L、490mmol/L、500mmol/L等等。此处浓度仅仅是示例性列举，也可以是其他浓度。
在一些实施例中，所述第一试剂的pH可以为7.0-9.0，具体可以包括但不限于7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0等等。此处pH仅仅是示例性列举，也可以是其他pH值。
根据第三方面，在一些实施例中，提供一种试剂盒，包括第一方面所述组合物或第二方面所述试剂组合。该试剂盒是液态稳定的双试剂，包括R1试剂和R2试剂，无需在检测前临时配制R2试剂，即开即用。
在一些实施例中，所述试剂盒包括所述第一试剂、第二试剂时，所述第一试剂、第二试剂独立分装于不同的容器中。
在一些实施例中，试剂盒是液态稳定的双试剂，包括R1试剂(即第一试剂)和R2试剂(即第二试剂)，无需配制，即开即用。R1试剂中，由3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐(CHAPS)和正壬烷磺酸钠配制的缓冲液能抑制血清中酯酶样活性；R2试剂中的助溶剂(如乙腈、乙醇、甘油、DMSO或DMF等)可以促进疏水性底物形成水相，使检测更快速灵敏，检测结果准确可靠；同时R2试剂中加入的稳定剂使底物更加稳定，不易发生水解，使得试剂的有效期达12个月以上。
在一些实施例中，所述试剂盒包括所述第一试剂、第二试剂时，所述第一试剂、第二试剂独立分装于不同的容器中，使用前再将取适量第一试剂、第二试剂混合。
根据第四方面，在一些实施例中，提供第一方面所述组合物，或第二方面所述试剂组合，或第三方面所述试剂盒在测定脂蛋白相关磷脂酶A2活性中的应用。
在一些实施例中，包括将待测样品、第一试剂、第二试剂混合，得到可用于测定脂蛋白相关磷脂酶A2活性的混合液。
在一些实施例中，还包括对所述混合液进行分析，计算得到待测样品中的脂蛋白相关磷脂酶A2活性。此处的分析可以是采用全自动生化分析仪进行分析，相应的计算可以是通过仪器上的软件自动完成。
在一些实施例中，检测原理包括：以sn-2位带有4-硝基苯酚基团的血小板激活因子(PAF)类似物为底物，Lp-PLA2水解底物后释放出带有4-硝基苯酚基团的物质，该物质不稳定，在水溶液中迅速降解生成对硝基苯酚，可通过检测405nm波长(或者接近405nm的波长)下吸光度的变化测定Lp-PLA2的活性，通常是计算某一时间段内，溶液在405nm波长(或者接近405nm的波长)下吸光度的变化率，换算得到Lp-PLA2在样品中的浓度或者活性。
在一些实施例中，包括将待测样品包括但不限于血清。
需要说明的是，上述应用是以离体样品为对象，所检测得到的结果仅仅是中间结果，仅仅是作为临床参考，单纯依据上述应用的检测结果不能得出受试者的最终诊断结果和/或健康状况，因此，上述应用不属于疾病的诊断方法，更不属于疾病的治疗方法。上述应用也可以用于相关疾病候选新药的筛选等非诊断治疗目的。
实施例1
本实施例的检测试剂组合包括：
试剂1(或称R1试剂、第一试剂)的组成如下：
100mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、15mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)、9mmol/L 3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基丙磺酸内盐(CHAPS)、10mmol/L正壬烷磺酸钠、200mmol/L氯化钠，余量为水；试剂1的pH为7.6。
试剂2(或称R2试剂、第二试剂)的组成如下：
20mmol/L柠檬酸、15mmol/L正壬烷磺酸钠、5wt％乙醇、3mmol/L 1-十四酰基-2-4-对硝基苯酚丁二酸酐-3-磷脂酰胆酰、0.05wt％18-冠醚-6、0.1wt％葡聚糖40(亦称右旋糖酐-40、Dextran-40、葡聚糖T-40、Dextran T-40)，余量为水；试剂2的pH为4.5。试剂2中提及的质量百分浓度是指对应组分在试剂2中的质量百分浓度。
实施例2
实施例2与实施例1中的Lp-PLA2测定试剂盒的区别仅在于试剂R2中的稳定剂为0.05wt％18-冠醚-6，其它与实施例1相同，此处不再赘述。
实施例3
实施例3与实施例1中的Lp-PLA2测定试剂盒的区别仅在于试剂R2中的稳定剂为0.05wt％15-冠醚-5、0.1wt％葡聚糖40，其它与实施例1相同，此处不再赘述。
实施例4
实施例4与实施例1中的Lp-PLA2测定试剂盒的区别仅在于试剂R2中的稳定剂为0.05wt％18-冠醚-6、0.1wt％葡聚糖70，其它与实施例1相同，此处不再赘述。
实施例5
实施例5与实施例1中的Lp-PLA2测定试剂盒的区别仅在于试剂R2中的稳定剂为0.05wt％二环己烷并-18-冠醚-6、0.1wt％葡聚糖40，其它与实施例1相同，此处不再赘述。
实施例6
实施例6与实施例1中的Lp-PLA2测定试剂盒的区别仅在于试剂R2中的稳定剂为0.05wt％18-冠醚-6、0.1wt％硫酸葡聚糖，其它与实施例1相同，此处不再赘述。
实施例7
实施例7与实施例1中的Lp-PLA2测定试剂盒的区别仅在于试剂R2中的稳定剂为0.05wt％18-冠醚-6、0.1wt％二乙胺乙基葡聚糖，其它与实施例1相同，此处不再赘述。
实施例8
实施例8与实施例1中的Lp-PLA2测定试剂盒的区别仅在于试剂R2中的稳定剂为0.05wt％二环己烷并-18-冠醚-6、0.1wt％葡聚糖70，其它与实施例1相同，此处不再赘述。
实施例9
实施例9与实施例1中的Lp-PLA2测定试剂盒的区别仅在于试剂R2中的稳定剂为0.05wt％2-氨基甲基-18-冠-6、0.1wt％葡聚糖70，其它与实施例1相同，此处不再赘述。
实施例10
实施例10与实施例1中的Lp-PLA2测定试剂盒的区别仅在于试剂R2中的稳定剂为0.05wt％12-冠醚-4、0.1wt％葡聚糖70，其它与实施例1相同，此处不再赘述。
实施例11
实施例11与实施例1中的Lp-PLA2测定试剂盒的区别仅在于试剂R2中的稳定剂为0.05wt％15-冠醚-5、0.1wt％葡聚糖70，其它与实施例1相同，此处不再赘述。
实施例12
实施例12与实施例1中的Lp-PLA2测定试剂盒的区别仅在于试剂R2中的稳定剂为0.05wt％二苯并-18-冠醚-6、0.1wt％葡聚糖70，其它与实施例1相同，此处不再赘述。
实施例13
实施例13与实施例1中的Lp-PLA2测定试剂盒的区别仅在于试剂R2中的稳定剂为0.05wt％15-冠醚-5、0.1wt％硫酸葡聚糖，其它与实施例1相同，此处不再赘述。
对照例1
该对照例与实施例1中的Lp-PLA2测定试剂盒的区别仅在于试剂R2中没有添加稳定剂，其它与实施例1相同，此处不再赘述。
检测实验
测定仪器：全自动生化分析仪，日立7180型。
分析方法：RATE；
反应方向：+；
测定波长(次/主)：无/410nm；
反应时间：10min；
测量点：20/34点；
样品量：4μL；
R1试剂量：200μL；
R2试剂量：50μL。
根据1961年国际酶学会议规定，酶活力的度量单位是指：1个酶活力单位是指在25℃下，在1分钟内能转化1微摩尔底物的酶量。通常表示为U(active unit)。
以下检测实验中，底物是过量的，酶是不足的。由于不同的生化分析仪的波长选择不同，当该仪器没有405nm时，通常是寻找接近405nm的波长作为样品检测的波长，因此，以下实施例中使用的日立7180型全自动生化分析仪没有405nm波长，因此，选择的测定波长为410nm，其接近405nm。
以下检测实验中，反应度是指检测试剂与样品的混合液在第6.5到10分钟内的410nm处吸光度变化率。
将R1试剂与血清混合，37℃孵育4.5min后加入R2试剂，37℃孵育2min后读取吸光度值A，测定6.5min到10min内的吸光度变化率△A/min，根据校准曲线，计算得出样本中Lp-PLA2的活性。
整个反应均在日立7180型全自动生化分析仪上进行，取出4μL样品(根据检测需要，可以是血清、校准品或质控品等)与200μL的R1试剂混合，在37℃下孵育4.5min后，加入50μL的R2试剂，混匀，37℃孵育2分钟后读取吸光度值，测定第6.5min到第10min内的吸光度变化率(△A样品/min)，即为试剂的反应度。表1所示为标准品中Lp-PLA2的浓度及其对应的反应度，标准品浓度是指标准品中Lp-PLA2的浓度。
校准品中Lp-PLA2活性为289.8U/L和497.3U/L，质控品中Lp-PLA2活性为144.5U/L和495.5U/L，校准品、质控品独立地含有稀释液以及上述浓度的Lp-PLA2，稀释液含有如下终浓度的组分：50mmol/L HEPES、0.09wt％氯化钠、30％(w/v)BSA、0.05wt％ProClin 300。HEPES是指4-羟乙基哌嗪乙磺酸。
表1
校准品 校准品浓度(U/L) 反应度
S1 289.8 669
S2 497.3 1176
图1显示为本实施例的校准曲线图，横坐标为采用本实施例的试剂检测得到的样品中Lp-PLA2浓度，单位为U/L；纵坐标为本实施例的试剂的反应度，单位为△A/min。
根据图1的校准曲线，计算样本的Lp-PLA2的浓度，公式如下：
Figure BDA0002830351270000101
其中，C样本是指样本中Lp-PLA2的浓度。
试剂性能的检测
1、效期稳定性
将R1试剂、R2试剂分开包装，R1试剂与R2试剂的体积比为4：1，具体地，R1试剂可以为40mL，R2试剂可以为10mL，将两种试剂避光储存于2℃-8℃冰箱中，分别在0、3、6、9、12、13个月进行校准并记录试剂的空白吸光度，每次测试均新开启密封试剂。试剂的校准结果如表2所示，空白吸光度的变化如表3所示。空白吸光度的测定方法如下：将纯化水与200μL的R1试剂混合，纯化水的体积与样品的体积相同，均为4μL，在37℃保温4.5min后，加入50μL的R2试剂混匀，37℃孵育2分钟后读取吸光度值，记录10min时的吸光度值，即为空白吸光度。可以将初始的空白吸光度看做是基础值，如果存放一段时间后空白吸光度升高，说明底物有水解。
表2校准品反应度
Figure BDA0002830351270000102
从表2的结果可以看出，实施例1的试剂在放置13个月内各阶段的反应度相对于0月份的偏差均在10％以内，相对于其他实施例及对照例更加稳定，其次是实施例3、4、6、13相对较好。
表3空白吸光度
Figure BDA0002830351270000103
Figure BDA0002830351270000111
从表3的结果可以看出，由于底物降解会使试剂空白吸光度升高，实施例1中稳定剂的加入可以保护底物使其不易水解，故实施例1的试剂空白吸光度与其他实施例和对照例相比升高很小，其中实施例8、10、11、12及对照例1在6个月后试剂空白吸光度大于10000，不能满足试剂性能的要求，实施例2、5、7、9在9个月后不能满足试剂性能的要求，实施例3、6在12个月后不能满足试剂性能的要求，实施例4在13个月不能满足试剂性能的要求。不论是反应度还是试剂空白吸光度，实施例1都要比其他实施例及对照例更加稳定，保证了试剂的效期在12个月以上。故实施例1为较优实施例，选择实施例1的试剂进行后续实验。
2、热稳定性
取实施例1的R1试剂、R2试剂各两套，其中一套试剂避光于37℃恒温培养箱中加热处理7天后，以质控作为样本进行精密度实验。结果如表4所示。
表4
Figure BDA0002830351270000112
表4中，AV是指平均值，SD是指标准偏差，CV为变异系数，CV＝SD/AV。
从表4的结果可以看出，实施例1的试剂热稳定性较好。
3、机载稳定性
取实施例1的R1、R2试剂，保持仪器(日立7180型全自动生化分析仪)处于24小时电源通电状态，R1、R2试剂保持24小时开瓶状态，放置于仪器冷藏试剂盘中，自开瓶之日起，不定期测试质控品和任一随机血清样品，测试方法同血清检测方法，质控品与血清无需分成多管，每次测完放回2-8℃密封保存。根据测值结果计算平均值的相对偏差。
表5
Figure BDA0002830351270000121
从表5的结果可以看出，开瓶31天以内，相对偏差保持在±10％以内，稳定性高，说明稳定剂对底物起到了良好的稳定作用，有效抑制底物水解。
4、临床样本比对
分别按照实施例1的试剂盒和DiaSys试剂盒的说明书参数进行校准，质控通过后检测40例新鲜血样，进行相关性比对，原始数据结果如表6所示，样本比对结果如图2所示，图2中，横坐标为DiaSys试剂的检测结果，单位为U/L；纵坐标为实施例1的试剂检测结果，单位为U/L。
表6
Figure BDA0002830351270000122
Figure BDA0002830351270000131
从表6和图2的结果可知，实施例1的试剂与DiaSys试剂比对，得到线性函数为y＝0.93x+7.2277，R2＝0.9984，两试剂的相关性好，偏差小，符合临床要求。
以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。

Claims (8)

1.一种组合物，其特征在于，所述组合物含有底物、稳定剂，所述稳定剂为冠醚类化合物以及葡聚糖类化合物，所述冠醚类化合物选自18-冠醚-6，所述葡聚糖类化合物选自葡聚糖40，所述冠醚类化合物在所述组合物中的浓度为0.05 wt %，所述葡聚糖类化合物在所述组合物中的浓度为0.1 wt%，所述底物可结合至脂蛋白相关磷脂酶A2，结合至所述脂蛋白相关磷脂酶A2的底物会发生分解，所述底物的sn-2位带有4-硝基苯酚基团，所述脂蛋白相关磷脂酶A2与所述底物结合后，所述底物发生水解，释放出带有4-硝基苯酚基团的物质，该物质在溶液中降解，生成对硝基苯酚。
2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述底物为血小板激活因子类似物；
所述底物选自1-十四酰基-2-4-对硝基苯酚丁二酸酐-3-磷脂酰乙醇胺、1-十四酰基-2-4-对硝基苯酚丁二酸酐-3-磷脂酰甘油、1-十四酰基-2-4-对硝基苯酚丁二酸酐-3-磷脂酰胆酰中的至少一种；
所述底物在所述组合物中的浓度为0.001-0.5 wt%；
所述组合物还含有助溶剂；
所述助溶剂选自有机溶剂；
所述助溶剂选自乙腈、乙醇、甘油、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺中的至少一种；
所述助溶剂在所述组合物中的浓度为2-10 wt %；
所述组合物还含有有机酸、第二抑制剂中的至少一种；
所述有机酸选自柠檬酸、乙酸、草酸、羟基乙酸、氨基磺酸、丁二酸、苯甲酸中的至少一种；
所述有机酸在所述组合物中的浓度为5-100 mmol/L；
所述第二抑制剂选自3-[3-（胆酰胺丙基）二甲氨基]丙磺酸内盐、3-[(3-胆胺丙基)二甲基氨基]-2-羟基-1-丙磺酸内盐、正壬烷磺酸钠、戊烷磺酸钠、己烷磺酸钠、1-庚烷磺酸钠中的至少一种；
所述第二抑制剂在所述组合物中的浓度为2-50 mmol/L；
所述组合物的pH为3.0-7.0。
3.一种试剂组合，包括权利要求1-2任意一项所述的组合物。
4.如权利要求3所述的试剂组合，包括第一试剂、第二试剂，所述第二试剂含有权利要求1-2任意一项所述组合物；
所述第一试剂含有缓冲剂、螯合剂、第一抑制剂、盐中的至少一种；
所述缓冲剂选自磷酸盐、3-吗啉丙磺酸、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、三羟甲基氨基甲烷中的至少一种；
所述缓冲剂在所述第一试剂中的浓度为50-300 mmol/L；
所述螯合剂选自氨基三亚甲基膦酸、乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸、乙二胺四亚甲基膦酸、乙二胺四乙酸中的至少一种；
所述螯合剂在所述第一试剂中的浓度为5-50 mmol/L；
所述第一抑制剂选自3-[3-（胆酰胺丙基）二甲氨基]丙磺酸内盐、3-[(3-胆胺丙基)二甲基氨基]-2-羟基-1-丙磺酸内盐、正壬烷磺酸钠、戊烷磺酸钠、己烷磺酸钠、1-庚烷磺酸钠中的至少一种；
所述第一抑制剂在所述第一试剂中的浓度为1-50 mmol/L；
所述盐选自氯化钠、氯化钾、氯化镁、氯化钙、硫酸铜中的至少一种；
所述盐在所述第一试剂中的浓度为50-500 mmol/L；
所述第一试剂的pH为7.0-9.0。
5.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-2任意一项所述组合物或权利要求3-4任意一项所述试剂组合。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求4中所述第一试剂、第二试剂时，所述第一试剂、第二试剂独立分装于不同的容器中。
7.如权利要求1-2任意一项所述组合物，或权利要求3-4任意一项所述试剂组合，或权利要求5-6任意一项所述试剂盒在测定脂蛋白相关磷脂酶A2活性中的非诊断治疗目的的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，包括将待测样品、权利要求4中所述第一试剂混合后，加入权利要求4中所述第二试剂，得到可用于测定脂蛋白相关磷脂酶A2活性的混合液；
还包括对所述混合液的吸光度进行测定，计算得到待测样品中的脂蛋白相关磷脂酶A2活性；
通过计算所述混合液在405nm波长下吸光度的变化率，计算得到待测样品中的脂蛋白相关磷脂酶A2活性；
所述变化率是指混合液在第6.5到10分钟内的吸光度变化率。
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