JPH0892103A - 硫酸化糖を有効成分とするホスホリパーゼａ２ 阻害剤 - Google Patents
硫酸化糖を有効成分とするホスホリパーゼａ２ 阻害剤Info
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- JPH0892103A JPH0892103A JP22785394A JP22785394A JPH0892103A JP H0892103 A JPH0892103 A JP H0892103A JP 22785394 A JP22785394 A JP 22785394A JP 22785394 A JP22785394 A JP 22785394A JP H0892103 A JPH0892103 A JP H0892103A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 新規なヒトII型ＰＬＡ2 阻害剤を提供する。
【構成】 硫酸化糖（但し、ヘパリン由来のものを除
く）を有効成分とするヒトII型ホスホリパーゼＡ2 阻害
剤。
く）を有効成分とするヒトII型ホスホリパーゼＡ2 阻害
剤。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒトII型ホスホリパー
ゼＡ2 とヘパリンとの結合阻害活性を有する硫酸化糖に
関する（但し、ヘパリン由来のものを除く）
ゼＡ2 とヘパリンとの結合阻害活性を有する硫酸化糖に
関する（但し、ヘパリン由来のものを除く）
【０００２】
【従来の技術及び発明が解明しようとする課題】プロテ
オグリカンは、コアプロテインに１個以上のグリコサミ
ノグリカンの糖類が結合した巨大分子であり、細胞間隙
や細胞表層に付着して存在し、細胞間あるいは細胞基質
間相互作用に関与する構造多様性のある物質である。硫
酸化グリコサミノグリカンであるヘパリンは、その血液
凝固阻止活性を利用して、５０年以上にも渡り血栓症に
対する重要な治療薬として医薬に用いられ続けている。
近年では、ヘパリン以外の硫酸化多糖（フコイダン、デ
キストラン硫酸、スルファチド等）にも同様の生理活性
が認識されている。また最近、これらの硫酸化多等によ
るヘパラナーゼ阻害活性に基づく抗炎症作用も示唆され
ている（ＷＯ８８／０５３０１号明細書）。
オグリカンは、コアプロテインに１個以上のグリコサミ
ノグリカンの糖類が結合した巨大分子であり、細胞間隙
や細胞表層に付着して存在し、細胞間あるいは細胞基質
間相互作用に関与する構造多様性のある物質である。硫
酸化グリコサミノグリカンであるヘパリンは、その血液
凝固阻止活性を利用して、５０年以上にも渡り血栓症に
対する重要な治療薬として医薬に用いられ続けている。
近年では、ヘパリン以外の硫酸化多糖（フコイダン、デ
キストラン硫酸、スルファチド等）にも同様の生理活性
が認識されている。また最近、これらの硫酸化多等によ
るヘパラナーゼ阻害活性に基づく抗炎症作用も示唆され
ている（ＷＯ８８／０５３０１号明細書）。
【０００３】ホスホリパーゼＡ2 （以下ＰＬＡ2 ）は細
胞膜リン脂質の２位のエステル結合を加水分解する酵素
であり、膜結合性ＰＬＡ2 と膵性ＰＬＡ2 、細胞質由来
ＰＬＡ2 の存在が知られている。このうち、膜結合性Ｐ
ＬＡ2 は、リン脂質からアラミドン酸を遊離させる。こ
のアラミドン酸から、種々の炎症性疾患や、アレルギー
を惹き起こす生理活性物質であるプロスタグランジン
類、トロンボキサン類及びロイコトリエン類が生成され
る。従って、ＰＬＡ2 を阻害することは、生理活性前駆
物質であるアラキドン酸の遊離を抑制でき、炎症性疾患
及びアレルギー性疾患の治療に有用であると考えられ
る。
胞膜リン脂質の２位のエステル結合を加水分解する酵素
であり、膜結合性ＰＬＡ2 と膵性ＰＬＡ2 、細胞質由来
ＰＬＡ2 の存在が知られている。このうち、膜結合性Ｐ
ＬＡ2 は、リン脂質からアラミドン酸を遊離させる。こ
のアラミドン酸から、種々の炎症性疾患や、アレルギー
を惹き起こす生理活性物質であるプロスタグランジン
類、トロンボキサン類及びロイコトリエン類が生成され
る。従って、ＰＬＡ2 を阻害することは、生理活性前駆
物質であるアラキドン酸の遊離を抑制でき、炎症性疾患
及びアレルギー性疾患の治療に有用であると考えられ
る。
【０００４】近年、ヒト炎症疾患や、炎症モデル動物の
炎症局所からＰＬＡ2 （以下II型ＰＬＡ2 という）が精
製され、その性状が明らかになった（工藤一郎、井上圭
三；生化学６４，１３３０〜１３４０（１９９２））。
このII型ＰＬＡ2 は、炎症反応を進展させると考えられ
ている。従って、その活性を阻害することによってプロ
スタグランジン及びロイコトリエン両方の生合成を抑
え、ステロイド系薬剤や非ステロイド系薬剤に比べて副
作用が少なく、且つ強い抗炎症作用及び抗アレルギー作
用が得られるものと期待される。
炎症局所からＰＬＡ2 （以下II型ＰＬＡ2 という）が精
製され、その性状が明らかになった（工藤一郎、井上圭
三；生化学６４，１３３０〜１３４０（１９９２））。
このII型ＰＬＡ2 は、炎症反応を進展させると考えられ
ている。従って、その活性を阻害することによってプロ
スタグランジン及びロイコトリエン両方の生合成を抑
え、ステロイド系薬剤や非ステロイド系薬剤に比べて副
作用が少なく、且つ強い抗炎症作用及び抗アレルギー作
用が得られるものと期待される。
【０００５】また、このII型ＰＬＡ2 はヘパリンと強い
親和性をもち、炎症に伴い細胞外に分泌される。更にそ
の生理活性が働くためにはＦＧＦと同様、他の組織又
は、細胞に取り込まれることが必要であり、この現象に
ヘパリンもしくはヘパラン硫酸が重要な役割を果たして
いることが明らかにされている（井上圭三ら 実験医学
１１，１４６０（１９９３））。
親和性をもち、炎症に伴い細胞外に分泌される。更にそ
の生理活性が働くためにはＦＧＦと同様、他の組織又
は、細胞に取り込まれることが必要であり、この現象に
ヘパリンもしくはヘパラン硫酸が重要な役割を果たして
いることが明らかにされている（井上圭三ら 実験医学
１１，１４６０（１９９３））。
【０００６】従って、II型ＰＬＡ2 とヘパリン等との結
合を阻害する薬剤は、この酵素が標的とする細胞もしく
は組織へのこの酵素の移行を妨げ、延いてはこの酵素の
生理活性の発揮をも阻害して、抗炎症的な作用を有する
新規なII型ＰＬＡ2 阻害剤を提供すると期待される。
合を阻害する薬剤は、この酵素が標的とする細胞もしく
は組織へのこの酵素の移行を妨げ、延いてはこの酵素の
生理活性の発揮をも阻害して、抗炎症的な作用を有する
新規なII型ＰＬＡ2 阻害剤を提供すると期待される。
【０００７】本発明者らは、褐藻類より抽出されたフコ
イダン、デキストランを硫酸化したデキストラン硫酸、
及びウシの脳より抽出されたスルファチド等の硫酸化糖
が、ヘパリンに替わりII型ＰＬＡ2 に対して結合性を有
することを知見して本発明に到達したものである。
イダン、デキストランを硫酸化したデキストラン硫酸、
及びウシの脳より抽出されたスルファチド等の硫酸化糖
が、ヘパリンに替わりII型ＰＬＡ2 に対して結合性を有
することを知見して本発明に到達したものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】すなわち本発明は、硫酸
化糖（但し、ヘパリン由来のものを除く）を有効成分と
するヒトII型ＰＬＡ2 阻害剤である。
化糖（但し、ヘパリン由来のものを除く）を有効成分と
するヒトII型ＰＬＡ2 阻害剤である。
【０００９】本発明のヒトII型ＰＬＡ2 阻害剤とは、そ
のＰＬＡ2 阻害作用が、例えばヒトII型ホスホリパーゼ
Ａ2 とヘパリンとの結合阻害活性作用に基づくものをい
い、その有効成分である硫酸化糖としては、ヘパリンを
除くものであって、例えばフコイダンイ、デキストラン
硫酸、スルファチド及びこれらの限定分解物糖を挙げる
ことができる。
のＰＬＡ2 阻害作用が、例えばヒトII型ホスホリパーゼ
Ａ2 とヘパリンとの結合阻害活性作用に基づくものをい
い、その有効成分である硫酸化糖としては、ヘパリンを
除くものであって、例えばフコイダンイ、デキストラン
硫酸、スルファチド及びこれらの限定分解物糖を挙げる
ことができる。
【００１０】また、本発明は、有効量の硫酸化糖（但
し、ヘパリン由来のものを除く）と製薬学的に許容され
る賦形剤とからなる医薬組成物である。
し、ヘパリン由来のものを除く）と製薬学的に許容され
る賦形剤とからなる医薬組成物である。
【００１１】本発明のヒトII型ＰＬＡ2 阻害剤におい
て、その指標となるヒトII型ＰＬＡ2阻害活性は、ヒトI
I型ＰＬＡ2 特異的抗体を使用するＥＬＩＳＡ（Enzyme
Linked Immunosolvent Assay ）系により、ヒトII型Ｐ
ＬＡ2 とヘパリンの結合阻害活性によって測定する。こ
の測定法は、in vitroにヒトII型ＰＬＡ2 とヘパリンの
結合を再現すべく、ＢＳＡとコンジュゲートさせたブタ
小腸由来ヘパリン（Analytical Biochemistry １２６，
４１４・４１２（１９８２））をコーティングした９６
穴プレートを用いるものである。このプレートには、ヒ
トII型ＰＬＡ2 を添加し、次いでヒトII型ＰＬＡ2 特異
的マウスモノクローナル抗体ＬＡＭ１―１（特願平５―
２５５６４６号に記載されている方法で得ることができ
る）とプレート上のブタ小腸由来ヘパリンに結合したヒ
トII型ＰＬＡ2 を反応させる。次いで、抗マウスＩｇＧ
―アルカリホスファターゼとヘパリン―ヒトII型ＰＬＡ
2 に結合したマウスモノクローナル抗体を反応させ、基
質（パラニトロフェニルリン酸二ナトリウム）を発色さ
せＯＤ405 で測定する。この測定結果から、硫酸化糖の
存在によって、ヒトII型ＰＬＡ2 とプレート上にコーテ
ィングされたブタ小腸由来ヘパリンとの結合阻害現象が
確認され、ひいては硫酸化糖がヒトII型ＰＬＡ 2 の阻害
活性を有することが判る。
て、その指標となるヒトII型ＰＬＡ2阻害活性は、ヒトI
I型ＰＬＡ2 特異的抗体を使用するＥＬＩＳＡ（Enzyme
Linked Immunosolvent Assay ）系により、ヒトII型Ｐ
ＬＡ2 とヘパリンの結合阻害活性によって測定する。こ
の測定法は、in vitroにヒトII型ＰＬＡ2 とヘパリンの
結合を再現すべく、ＢＳＡとコンジュゲートさせたブタ
小腸由来ヘパリン（Analytical Biochemistry １２６，
４１４・４１２（１９８２））をコーティングした９６
穴プレートを用いるものである。このプレートには、ヒ
トII型ＰＬＡ2 を添加し、次いでヒトII型ＰＬＡ2 特異
的マウスモノクローナル抗体ＬＡＭ１―１（特願平５―
２５５６４６号に記載されている方法で得ることができ
る）とプレート上のブタ小腸由来ヘパリンに結合したヒ
トII型ＰＬＡ2 を反応させる。次いで、抗マウスＩｇＧ
―アルカリホスファターゼとヘパリン―ヒトII型ＰＬＡ
2 に結合したマウスモノクローナル抗体を反応させ、基
質（パラニトロフェニルリン酸二ナトリウム）を発色さ
せＯＤ405 で測定する。この測定結果から、硫酸化糖の
存在によって、ヒトII型ＰＬＡ2 とプレート上にコーテ
ィングされたブタ小腸由来ヘパリンとの結合阻害現象が
確認され、ひいては硫酸化糖がヒトII型ＰＬＡ 2 の阻害
活性を有することが判る。
【００１２】本発明の硫酸化糖は、通常、全身的または
局所的に、経口また非経口の形で投与される。投与量
は、年令、症状、治療効果、投与方法、投与時間等によ
り異なるが、通常、成人一人当たり、一回につき、１ｍ
ｇから１０００ｍｇの範囲で投与され、例えば一日一回
から数回経口又は非経口投与されるか、または好ましく
は一日１時間から２４時間の範囲で静脈内に持続投与さ
れる。もちろん前記したように、投与量は、種々の条件
により変動するので、上記投与量より少ない量で十分な
場合もあるし、また範囲を越えて必要な場合もある。
局所的に、経口また非経口の形で投与される。投与量
は、年令、症状、治療効果、投与方法、投与時間等によ
り異なるが、通常、成人一人当たり、一回につき、１ｍ
ｇから１０００ｍｇの範囲で投与され、例えば一日一回
から数回経口又は非経口投与されるか、または好ましく
は一日１時間から２４時間の範囲で静脈内に持続投与さ
れる。もちろん前記したように、投与量は、種々の条件
により変動するので、上記投与量より少ない量で十分な
場合もあるし、また範囲を越えて必要な場合もある。
【００１３】本発明の硫酸化糖（但し、ヘパリン由来の
ものを除く）を有効成分とするヒトII型ＰＬＡ2 阻害剤
は、上記のような有効量の硫酸化糖と製薬学的に許容さ
れる賦形剤とからなる医薬組成物とすることによって、
固体ないし液体状の医薬組成物を直接あるいは、必要に
応じて、公知の例えばステアリン酸マグネシウム、タル
ク等の滑沢剤；ゼラチン、セラミク、ポリビニルピロリ
ドン、メチルセルロース等の結合剤；アルギン酸ナトリ
ウム、デンプン等の崩壊剤；保湿剤；抗酸化剤；吸収促
進剤；界面活性剤；等張剤等とともに公知の方法で、軟
カプセル剤、硬カプセル剤、錠剤、丸剤、顆粒剤、散
剤、懸濁剤、液剤、シロップ剤、乳濁剤、エリキシル剤
等の経口剤、注射剤、坐剤、ペッサリーまたは外用剤
（液剤、軟膏、塗布剤）として提供される。
ものを除く）を有効成分とするヒトII型ＰＬＡ2 阻害剤
は、上記のような有効量の硫酸化糖と製薬学的に許容さ
れる賦形剤とからなる医薬組成物とすることによって、
固体ないし液体状の医薬組成物を直接あるいは、必要に
応じて、公知の例えばステアリン酸マグネシウム、タル
ク等の滑沢剤；ゼラチン、セラミク、ポリビニルピロリ
ドン、メチルセルロース等の結合剤；アルギン酸ナトリ
ウム、デンプン等の崩壊剤；保湿剤；抗酸化剤；吸収促
進剤；界面活性剤；等張剤等とともに公知の方法で、軟
カプセル剤、硬カプセル剤、錠剤、丸剤、顆粒剤、散
剤、懸濁剤、液剤、シロップ剤、乳濁剤、エリキシル剤
等の経口剤、注射剤、坐剤、ペッサリーまたは外用剤
（液剤、軟膏、塗布剤）として提供される。
【００１４】本発明の製薬学的に許容される賦形剤とし
ては、植物油（例えばトウモロコシ油、綿実油、ココナ
ッツ油、アーモンド油、落花生油、オリーブ油等）、中
鎖脂肪酸グリセライド油等の油状エステル、鉱物油、ト
リカプリリン、トリアセチン等のグリセリンエステル
類、トラガント、アラビヤゴム等のゴム類、エタノール
等のアルコール類、生理食塩水、プロピレングリコー
ル、ポリエチレングリコール、ワセリン動物油脂、セル
ロース誘導体（結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセ
ルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチ
ルセルロース）、ポリビニルピロリドン、デキストリ
ン、乳糖、アンニトール、ソルビトール、デンプン等が
挙げられる。
ては、植物油（例えばトウモロコシ油、綿実油、ココナ
ッツ油、アーモンド油、落花生油、オリーブ油等）、中
鎖脂肪酸グリセライド油等の油状エステル、鉱物油、ト
リカプリリン、トリアセチン等のグリセリンエステル
類、トラガント、アラビヤゴム等のゴム類、エタノール
等のアルコール類、生理食塩水、プロピレングリコー
ル、ポリエチレングリコール、ワセリン動物油脂、セル
ロース誘導体（結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセ
ルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチ
ルセルロース）、ポリビニルピロリドン、デキストリ
ン、乳糖、アンニトール、ソルビトール、デンプン等が
挙げられる。
【００１５】本発明の硫酸化糖は、例えばヒトII型ＰＬ
Ａ2 とヘパリンとの結合を阻害する糖のヒトII型ＰＬＡ
2 阻害作用を有する。したがって、本発明の硫酸化糖を
有効成分とするヒトII型ＰＬＡ2 阻害剤、及び有効量の
硫酸化糖と製薬学的に許容される賦形剤とからなる医薬
組成物は、体内で分泌されたII型ＰＬＡ2 が他の組織ま
たは細胞に移行しその活性が発揮される現象を抑制する
ことで、種々の炎症性疾患（例えば慢性関節リウマチ、
臓器炎症）、喘息、アレルギー疾患、汎発性血管ない血
液凝固症（ＤＩＣ）、虚血性血管障害（心筋梗塞、脳梗
塞）、レステノーシス（再狭窄）、潰瘍、敗血症、ＡＲ
ＤＳ、腎炎、膵炎、その重傷化及び多臓器障害の予防及
び／または治療に有効である。
Ａ2 とヘパリンとの結合を阻害する糖のヒトII型ＰＬＡ
2 阻害作用を有する。したがって、本発明の硫酸化糖を
有効成分とするヒトII型ＰＬＡ2 阻害剤、及び有効量の
硫酸化糖と製薬学的に許容される賦形剤とからなる医薬
組成物は、体内で分泌されたII型ＰＬＡ2 が他の組織ま
たは細胞に移行しその活性が発揮される現象を抑制する
ことで、種々の炎症性疾患（例えば慢性関節リウマチ、
臓器炎症）、喘息、アレルギー疾患、汎発性血管ない血
液凝固症（ＤＩＣ）、虚血性血管障害（心筋梗塞、脳梗
塞）、レステノーシス（再狭窄）、潰瘍、敗血症、ＡＲ
ＤＳ、腎炎、膵炎、その重傷化及び多臓器障害の予防及
び／または治療に有効である。
【００１６】
【実施例】以下、参考例及び実施例により本発明を詳細
に説明する。
に説明する。
【００１７】［参考例１］（１）ヒトII型ＰＬＡ2 の調製 II型ＰＬＡ2 のｃＤＮＡはJ.J. Seilhamerらの報告（J.
Biol. Chem., ２６４，５３３５（１９８９））に記載
の方法によって調製した。すなわち、ヒト胎盤由来ＲＮ
Ａ（クローンテック社より購入）から、逆転写酵素ＲＡ
Ｖ―２（宝酒造）を添付プロトコールに従って用いるこ
とにより、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。
Biol. Chem., ２６４，５３３５（１９８９））に記載
の方法によって調製した。すなわち、ヒト胎盤由来ＲＮ
Ａ（クローンテック社より購入）から、逆転写酵素ＲＡ
Ｖ―２（宝酒造）を添付プロトコールに従って用いるこ
とにより、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。
【００１８】次に、（５′）ＡＡＣＴＣＴＡＧＡＣＣＡ
ＴＧＡＡＧＡＣＣＣＴＣＣ（３′）および（５′）ＡＧ
ＡＡＧＡＴＣＴＣＣＴＧＣＣＴＧＧＣＣＴＣＴＡ
（３′）なる配列の一本鎖合成ＤＮＡプライマーを用い
たＰＣＲ法によりII型ＰＬＡ2 ｃＤＮＡを増幅した。反
応はパーキンエルマー社のＴａｑポリメラーゼを添付プ
ロトコールに従って用いることにより行った。約５６０
ｂｐのII型ＰＬＡ2 ｃＤＮＡ断片は、アガロースゲル電
気泳動により精製した。
ＴＧＡＡＧＡＣＣＣＴＣＣ（３′）および（５′）ＡＧ
ＡＡＧＡＴＣＴＣＣＴＧＣＣＴＧＧＣＣＴＣＴＡ
（３′）なる配列の一本鎖合成ＤＮＡプライマーを用い
たＰＣＲ法によりII型ＰＬＡ2 ｃＤＮＡを増幅した。反
応はパーキンエルマー社のＴａｑポリメラーゼを添付プ
ロトコールに従って用いることにより行った。約５６０
ｂｐのII型ＰＬＡ2 ｃＤＮＡ断片は、アガロースゲル電
気泳動により精製した。
【００１９】続いて、II型ＰＬＡ2 ｃＤＮＡを、合成Ｄ
ＮＡリンカーを介してバキュロウイルス組換えベクター
ｐＡＣ ＹＭ１（Matsuura, Y. et al, T. Gen. Viro
l., ６８，１２３３〜１２５０（１９８７）；国立予防
衛生研究所、松浦善治博士より分与された）のＢａｍＨ
Ｉサイトに組み込んだ。
ＮＡリンカーを介してバキュロウイルス組換えベクター
ｐＡＣ ＹＭ１（Matsuura, Y. et al, T. Gen. Viro
l., ６８，１２３３〜１２５０（１９８７）；国立予防
衛生研究所、松浦善治博士より分与された）のＢａｍＨ
Ｉサイトに組み込んだ。
【００２０】これを、夜蛾科のバキュロウイルス（Ａｃ
ＮＰＶ）ＤＮＡと共に昆虫細胞Ｓｆ―９にトランスフェ
クションすることにより、組換えウイルスを得た。Ｓｆ
―９細胞はインビトロジェン社より購入したものであ
り、トランスフェクションおよび組換えウイルスの純化
の操作手順については添付のプロトコールに従った。
ＮＰＶ）ＤＮＡと共に昆虫細胞Ｓｆ―９にトランスフェ
クションすることにより、組換えウイルスを得た。Ｓｆ
―９細胞はインビトロジェン社より購入したものであ
り、トランスフェクションおよび組換えウイルスの純化
の操作手順については添付のプロトコールに従った。
【００２１】次にＳｆ―９細胞を２０ｍｌ／フラスコ
（ファルコン社製）のスケールで静置培養し、ＭＯＩ＝
１で上記組換えウイルスを感染させ、２５℃で４日間培
養した後、その培養上清を回収した。
（ファルコン社製）のスケールで静置培養し、ＭＯＩ＝
１で上記組換えウイルスを感染させ、２５℃で４日間培
養した後、その培養上清を回収した。
【００２２】この培養上清から、ヘパリンセファロース
カラム（ファルマシアＣＬ―６Ｂ）を用いることにより
II型ＰＬＡ2 を精製した。すなわち、φ１．５×５ｃｍ
のカラムを用い、１．１リットルの培養上清を通した
後、１０ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ緩衝液（ｐ
Ｈ７．４）、５０ｍｌの０．３Ｍ ＮａＣｌ／５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．４）緩衝液、５０ｍｌの
０．６Ｍ ＮａＣｌ／５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐ
Ｈ７．４）緩衝液を順に通したところ、０．６ＭのＮａ
Ｃｌの画分にII型ＰＬＡ２が溶出した。
カラム（ファルマシアＣＬ―６Ｂ）を用いることにより
II型ＰＬＡ2 を精製した。すなわち、φ１．５×５ｃｍ
のカラムを用い、１．１リットルの培養上清を通した
後、１０ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ緩衝液（ｐ
Ｈ７．４）、５０ｍｌの０．３Ｍ ＮａＣｌ／５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．４）緩衝液、５０ｍｌの
０．６Ｍ ＮａＣｌ／５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐ
Ｈ７．４）緩衝液を順に通したところ、０．６ＭのＮａ
Ｃｌの画分にII型ＰＬＡ２が溶出した。
【００２３】次にこの溶出液を、ウォーターズ６００Ｅ
ＨＰＬＣシステムに組み合わせた逆相カラム（Ｖｙｄ
ａｃTMＣ―４カラム、φ２．２×２５ｃｍ）にかけてさ
らに精製した。用いた緩衝液は０．１％ＴＦＡ／Ｈ2 Ｏ
で、アセトニトリルの０％→５０％のリニアーグラジエ
ント（６０分）をかけた。ここで述べた精製法および次
に述べる抗体作製法はMethods in Enzymology,１９７，
２２３〜２３３を参考とした。かくして、II型ＰＬＡ2
は精製され、次に述べる免疫に用いた。なお、精製II型
ＰＬＡ2 はＨＰＬＣで単一ピークであり、Ｌａｅｍｌｉ
の系のＰＡＧＥで単一バンドであった。
ＨＰＬＣシステムに組み合わせた逆相カラム（Ｖｙｄ
ａｃTMＣ―４カラム、φ２．２×２５ｃｍ）にかけてさ
らに精製した。用いた緩衝液は０．１％ＴＦＡ／Ｈ2 Ｏ
で、アセトニトリルの０％→５０％のリニアーグラジエ
ント（６０分）をかけた。ここで述べた精製法および次
に述べる抗体作製法はMethods in Enzymology,１９７，
２２３〜２３３を参考とした。かくして、II型ＰＬＡ2
は精製され、次に述べる免疫に用いた。なお、精製II型
ＰＬＡ2 はＨＰＬＣで単一ピークであり、Ｌａｅｍｌｉ
の系のＰＡＧＥで単一バンドであった。
【００２４】（２）II型ＰＬＡ2 と反応するモノクロー
ナル抗体（ＬＡＭ１―１）の作製 実施例１で調製したII型ＰＬＡ２ １０μｇをフロイン
ドのコンプリートアジュバント（ＢＡＣＴＯ社製、１：
１）とともに、２週間毎にＢａｌｂ／ｃマウス（６週
齢、オス）にｉ．ｐ．投与した。これを４回行なった
後、５回目は細胞融合の３日前に上記混合物５０μｌを
ｉ．ｖ．投与した。
ナル抗体（ＬＡＭ１―１）の作製 実施例１で調製したII型ＰＬＡ２ １０μｇをフロイン
ドのコンプリートアジュバント（ＢＡＣＴＯ社製、１：
１）とともに、２週間毎にＢａｌｂ／ｃマウス（６週
齢、オス）にｉ．ｐ．投与した。これを４回行なった
後、５回目は細胞融合の３日前に上記混合物５０μｌを
ｉ．ｖ．投与した。
【００２５】細胞融合の直前にマウスを殺し、脾細胞を
ＰＢＳ中でホモジナイズし、残渣をナイロンメッシュで
濾過後、ＰＢＳで遠心洗浄を１回行なった。この脾細胞
２×１０7 個をマウスミエローマ（Ｐ３―Ｘ６３―Ａｇ
８―Ｕ１）４×１０7 と常法（Kohler, Milstein; Natu
re, ２５６，４９５〜４９７（１９７５））に従って細
胞融合した。
ＰＢＳ中でホモジナイズし、残渣をナイロンメッシュで
濾過後、ＰＢＳで遠心洗浄を１回行なった。この脾細胞
２×１０7 個をマウスミエローマ（Ｐ３―Ｘ６３―Ａｇ
８―Ｕ１）４×１０7 と常法（Kohler, Milstein; Natu
re, ２５６，４９５〜４９７（１９７５））に従って細
胞融合した。
【００２６】すなわち、両細胞を混合後遠沈し、Ｃｅｌ
ｌ Ｐａｃｋにしてから１ｍｌの５０％ポリエチレング
リコール（和光純薬、２０００）ＨＡＴ培地（ＧＩＴ培
地、和光純薬）を２分間かけて滴下し、さらに５分間か
けて１０ｍｌのＨＡＴ培地でポリエチレングリコールを
希釈した後、最終的に同培地で１００ｍｌにしてから２
００μｌ／ウェルで９６ウェルプレート５枚に分注し
た。５％ＣＯ2 、３７℃で一週間培養後、半量（１００
μｌ／ウェル）を除去し、ＨＴ培地（ＧＩＴ培地、和光
純薬）を加えた（１００μｌ／ウェル）。二週間後に以
下に述べるII型ＰＬＡ2 をコートしたプレートによるス
クリーニングを行なった。
ｌ Ｐａｃｋにしてから１ｍｌの５０％ポリエチレング
リコール（和光純薬、２０００）ＨＡＴ培地（ＧＩＴ培
地、和光純薬）を２分間かけて滴下し、さらに５分間か
けて１０ｍｌのＨＡＴ培地でポリエチレングリコールを
希釈した後、最終的に同培地で１００ｍｌにしてから２
００μｌ／ウェルで９６ウェルプレート５枚に分注し
た。５％ＣＯ2 、３７℃で一週間培養後、半量（１００
μｌ／ウェル）を除去し、ＨＴ培地（ＧＩＴ培地、和光
純薬）を加えた（１００μｌ／ウェル）。二週間後に以
下に述べるII型ＰＬＡ2 をコートしたプレートによるス
クリーニングを行なった。
【００２７】すなわち、II型ＰＬＡ2 の５０ｍＭ Ｎａ
ＣＯ3 緩衝液（ｐＨ９．５）溶液（１μｇ／ｍｌ）を９
６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ社、ＰＶＣ製）に各ウ
ェル当り５０μｌづつ分注し、３７℃で１時間放置し
た。洗浄後、３％ＢＳＡ／ＰＢＳを各ウェル当り２００
μｌ加えて３７℃で１時間ブロッキングした。再度洗浄
後、各ウェル当り５０μｌの培養上清を加え、室温で１
時間放置し、０．０５％Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳで３回洗浄
した。
ＣＯ3 緩衝液（ｐＨ９．５）溶液（１μｇ／ｍｌ）を９
６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ社、ＰＶＣ製）に各ウ
ェル当り５０μｌづつ分注し、３７℃で１時間放置し
た。洗浄後、３％ＢＳＡ／ＰＢＳを各ウェル当り２００
μｌ加えて３７℃で１時間ブロッキングした。再度洗浄
後、各ウェル当り５０μｌの培養上清を加え、室温で１
時間放置し、０．０５％Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳで３回洗浄
した。
【００２８】次に、３％ＢＳＡおよび０．２％スキムミ
ルクを含むＰＢＳで２０００倍に希釈したやぎ抗マウス
ＩｇＧ―アルカリホスファターゼコンジュゲート（Ｔａ
ｇｏ社）をウェル当り５０μｌ加え、室温で１時間放置
した。再度洗浄し、０．２５ｍＭの塩化マグネシウムを
含む１Ｍジエタノールアミン緩衝液（ｐＨ９．８）に溶
解したｐ―ニトロフェニルホスフェート二ナトリウム塩
（和光純薬）の１ｍｇ／ｍｌ溶液をウェル当り１００μ
ｌ加え、室温で３０分間反応させた。この４０５ｎｍに
おける吸光度を、９６ウェルプレート用のＥＬＩＳＡリ
ーダー測定器（Molecular Davice社Ｖｍａｘ）を用いて
調べ、II型ＰＬＡ2 と結合するモノクローナル抗体を分
泌するハイブリドーマを選択した。
ルクを含むＰＢＳで２０００倍に希釈したやぎ抗マウス
ＩｇＧ―アルカリホスファターゼコンジュゲート（Ｔａ
ｇｏ社）をウェル当り５０μｌ加え、室温で１時間放置
した。再度洗浄し、０．２５ｍＭの塩化マグネシウムを
含む１Ｍジエタノールアミン緩衝液（ｐＨ９．８）に溶
解したｐ―ニトロフェニルホスフェート二ナトリウム塩
（和光純薬）の１ｍｇ／ｍｌ溶液をウェル当り１００μ
ｌ加え、室温で３０分間反応させた。この４０５ｎｍに
おける吸光度を、９６ウェルプレート用のＥＬＩＳＡリ
ーダー測定器（Molecular Davice社Ｖｍａｘ）を用いて
調べ、II型ＰＬＡ2 と結合するモノクローナル抗体を分
泌するハイブリドーマを選択した。
【００２９】このように選択したハイブリドーマについ
て、限界希釈法によるクローニングを２回行ない、株化
した。具体的にはマウス腹腔浸出細胞をＨＴ培地中１０
6 個／ｍｌの割合に調製したものを各ウェルに分注し、
これにウェル当り０．５個の割合でＨＴ培地に懸濁した
ハイブリドーマ細胞を播き込んだ。５％ＣＯ2 のＣＯ 2
インキュベーター内で、３７℃で２週間培養し、その培
養上清について上記ＥＬＩＳＡ法でスクリーニングし、
単一コロニーをピックアップすることで株化を行なっ
た。
て、限界希釈法によるクローニングを２回行ない、株化
した。具体的にはマウス腹腔浸出細胞をＨＴ培地中１０
6 個／ｍｌの割合に調製したものを各ウェルに分注し、
これにウェル当り０．５個の割合でＨＴ培地に懸濁した
ハイブリドーマ細胞を播き込んだ。５％ＣＯ2 のＣＯ 2
インキュベーター内で、３７℃で２週間培養し、その培
養上清について上記ＥＬＩＳＡ法でスクリーニングし、
単一コロニーをピックアップすることで株化を行なっ
た。
【００３０】［参考例２］ヘパリン結合プレートの作製 ＥＬＩＳＡ用９６穴プレートの各ウェルに１０μｇ／ｍ
ｌのＢＳＡconjugatedHeparinを含むリン酸緩衝食塩水
（以下ＰＢＳ）を５０μｌずつ添加し、３７℃にて１時
間以上インキュベーションした後蒸留水にて２回洗浄
後、３ｍｇ／ｍｌＢＳＡ―ＰＢＳ溶液を２００μｌずつ
各ウェルに加え、３７℃で１時間インキュベーションし
た後、４℃にて保存した。
ｌのＢＳＡconjugatedHeparinを含むリン酸緩衝食塩水
（以下ＰＢＳ）を５０μｌずつ添加し、３７℃にて１時
間以上インキュベーションした後蒸留水にて２回洗浄
後、３ｍｇ／ｍｌＢＳＡ―ＰＢＳ溶液を２００μｌずつ
各ウェルに加え、３７℃で１時間インキュベーションし
た後、４℃にて保存した。
【００３１】ＢＳＡconjugated Heparinは（Analytical
Biochemistry １２６，１４１―４２１（１９８９））
ブタ小腸由来ヘパリン２０ｍｇ、ＮａＢＨ３ＣＮ２０ｍ
ｇ、及びＢＳＡ１０ｍｇを２ｍｌの０．２Ｍリン酸水素
カリウム溶液（ｐＨ９．０）に溶解し６０℃にて７−１
０日反応させて調製を行った。
Biochemistry １２６，１４１―４２１（１９８９））
ブタ小腸由来ヘパリン２０ｍｇ、ＮａＢＨ３ＣＮ２０ｍ
ｇ、及びＢＳＡ１０ｍｇを２ｍｌの０．２Ｍリン酸水素
カリウム溶液（ｐＨ９．０）に溶解し６０℃にて７−１
０日反応させて調製を行った。
【００３２】［測定方法］ヒトII型ホスホリパーゼＡ2 ―ヘパリン結合阻害活性測
定 ＢＳＡconjugated Heparinをコーティングしたプレート
（９６穴）を３７℃、１時間プレインキュベーションし
た後、蒸留水にて２回プレートを洗浄する。
定 ＢＳＡconjugated Heparinをコーティングしたプレート
（９６穴）を３７℃、１時間プレインキュベーションし
た後、蒸留水にて２回プレートを洗浄する。
【００３３】硫酸化多糖を、１％ニワトリ卵白アルブミ
ン（以下 ovalbumin）を含むトリス緩衝食塩水（以下Ｔ
ＢＳ，ｐＨ７．０）を用いて、１００μｇ／ｍｌより２
倍段階稀釈して調製した溶液を、各濃度５０μｌ／well
で添加して３７℃にて３０分インキュベートする。さら
に、０．５μｇ／ｍｌ（ＴＢＳ―１％ovalbumin 溶液）
ヒトII型ＰＬＡ2 を５０μｌ／wellずつ加え、３７℃に
て３０分反応させる。反応終了後、１０ｍＭ ＰＢＳ―
０．５％ Ｔｗｅｅｎ２０にてプレートを洗浄する。
（洗浄装置を使用 ３回洗浄後、プレート向きを変えて
更に３回洗浄）。次に、１μｇ／ｍｌのマウス抗ヒトII
型ＰＬＡ2 モノクローナル抗体ＬＡＭ１−１を含む１０
ｍＭ ＰＢＳ―３％ＢＡＳ溶液を、各ウェルにつき５０
μｌずつ加えて３７℃にて１時間反応させた後、１０ｍ
Ｍ ＰＢＳ―０．５％Ｔｗｅｅｎ２０にてプレートを洗
浄する。（洗浄装置を使用 ３回洗浄後、プレート向き
を変えて更に３回洗浄）。最後に、１０ｍＭ ＰＢＳ―
３％ＢＡＳにて２０００倍稀釈をしたヤギ抗マウスＩｇ
Ｇアルカリフォスファターゼ（ＴＡＧＯ社）を各ウェル
につき５０μｌずつ添加して３７℃１時間反応させ、１
０ｍＭ ＰＢＳ―０．５％Ｔｗｅｅｎ２０にてプレート
を洗浄する（洗浄装置を使用 ４回洗浄後、プレート向
きを変えて更に４回洗浄）。１ｍｇ／ｍｌの基質（パラ
ニトロフェニルリン酸二ナトリウム）を１００μｌ／we
ll加えて、発色をＯＤ405 にて検出する。
ン（以下 ovalbumin）を含むトリス緩衝食塩水（以下Ｔ
ＢＳ，ｐＨ７．０）を用いて、１００μｇ／ｍｌより２
倍段階稀釈して調製した溶液を、各濃度５０μｌ／well
で添加して３７℃にて３０分インキュベートする。さら
に、０．５μｇ／ｍｌ（ＴＢＳ―１％ovalbumin 溶液）
ヒトII型ＰＬＡ2 を５０μｌ／wellずつ加え、３７℃に
て３０分反応させる。反応終了後、１０ｍＭ ＰＢＳ―
０．５％ Ｔｗｅｅｎ２０にてプレートを洗浄する。
（洗浄装置を使用 ３回洗浄後、プレート向きを変えて
更に３回洗浄）。次に、１μｇ／ｍｌのマウス抗ヒトII
型ＰＬＡ2 モノクローナル抗体ＬＡＭ１−１を含む１０
ｍＭ ＰＢＳ―３％ＢＡＳ溶液を、各ウェルにつき５０
μｌずつ加えて３７℃にて１時間反応させた後、１０ｍ
Ｍ ＰＢＳ―０．５％Ｔｗｅｅｎ２０にてプレートを洗
浄する。（洗浄装置を使用 ３回洗浄後、プレート向き
を変えて更に３回洗浄）。最後に、１０ｍＭ ＰＢＳ―
３％ＢＡＳにて２０００倍稀釈をしたヤギ抗マウスＩｇ
Ｇアルカリフォスファターゼ（ＴＡＧＯ社）を各ウェル
につき５０μｌずつ添加して３７℃１時間反応させ、１
０ｍＭ ＰＢＳ―０．５％Ｔｗｅｅｎ２０にてプレート
を洗浄する（洗浄装置を使用 ４回洗浄後、プレート向
きを変えて更に４回洗浄）。１ｍｇ／ｍｌの基質（パラ
ニトロフェニルリン酸二ナトリウム）を１００μｌ／we
ll加えて、発色をＯＤ405 にて検出する。
【００３４】［実施例１］上記測定方法に従い、濃度１
００μｇ／ｍｌより２倍段階希釈した１００，５０，２
５，１２．５，０μｇ／ｍｌフコイダン（ＳＩＧＭＡ社
製）、デキストラン硫酸（ファルマシア社製）、及びス
ルファチド（ＳＩＧＭＡ社製）についてＰＬＡ2 とヘパ
リンの結合阻害活性（阻害率％）を測定した。対照例と
してブタ小腸由来ヘパリン（ＳＩＧＭＡ社製）を用い
た。結果を図１に示す。プレートにコーティングしたダ
フ小腸由来ヘパリンに比べ、有意にＢＳＡconjugated H
eparinとＰＬＡ2 の結合を阻害していることが明らかで
ある。フコイダン、デキストラン硫酸、フコイダンのい
ずれの硫酸化糖に関してもブタ小腸ヘパリンよりも強い
ＰＬＡ2 結合阻害活性を示した。
００μｇ／ｍｌより２倍段階希釈した１００，５０，２
５，１２．５，０μｇ／ｍｌフコイダン（ＳＩＧＭＡ社
製）、デキストラン硫酸（ファルマシア社製）、及びス
ルファチド（ＳＩＧＭＡ社製）についてＰＬＡ2 とヘパ
リンの結合阻害活性（阻害率％）を測定した。対照例と
してブタ小腸由来ヘパリン（ＳＩＧＭＡ社製）を用い
た。結果を図１に示す。プレートにコーティングしたダ
フ小腸由来ヘパリンに比べ、有意にＢＳＡconjugated H
eparinとＰＬＡ2 の結合を阻害していることが明らかで
ある。フコイダン、デキストラン硫酸、フコイダンのい
ずれの硫酸化糖に関してもブタ小腸ヘパリンよりも強い
ＰＬＡ2 結合阻害活性を示した。
【図１】図１は実施例１における本発明の硫酸化糖によ
るヒトII型ＰＬＡ2 とヘパリンとの結合阻害活性の評価
の結果を示す。図中、□、●、△印は各々、本発明の硫
酸化糖であるフコイダン、デキストラン硫酸、スルファ
チドを示し、×印は対照例であるヘパリンを示す。
るヒトII型ＰＬＡ2 とヘパリンとの結合阻害活性の評価
の結果を示す。図中、□、●、△印は各々、本発明の硫
酸化糖であるフコイダン、デキストラン硫酸、スルファ
チドを示し、×印は対照例であるヘパリンを示す。
Claims (6)
- 【請求項１】 硫酸化糖（但し、ヘパリン由来のものを
除く）を有効成分とするヒトII型ホスホリパーゼＡ2 阻
害剤。 - 【請求項２】 ヒトII型ホスホリパーゼＡ2 阻害が、ヒ
トII型ホスホリパーゼＡ2 とヘパリンとの結合阻害活性
に基づくものである請求項１記載のヒトII型ホスホリパ
ーゼＡ2 阻害剤。 - 【請求項３】 硫酸化糖が、フコイダンである請求項１
記載のヒトII型ホスホリパーゼＡ2 阻害剤。 - 【請求項４】 硫酸化糖が、デキストラン硫酸である請
求項１記載のヒトII型ホスホリパーゼＡ2 阻害剤。 - 【請求項５】 硫酸化糖が、スルファチドである請求項
１記載のヒトII型ホスホリパーゼＡ2 阻害剤。 - 【請求項６】 有効量の硫酸化糖（但し、ヘパリン由来
のものを除く）と製薬学的に許容される賦形剤とからな
る医薬組成物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22785394A JPH0892103A (ja) | 1994-09-22 | 1994-09-22 | 硫酸化糖を有効成分とするホスホリパーゼａ２ 阻害剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22785394A JPH0892103A (ja) | 1994-09-22 | 1994-09-22 | 硫酸化糖を有効成分とするホスホリパーゼａ２ 阻害剤 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0892103A true JPH0892103A (ja) | 1996-04-09 |
Family
ID=16867401
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP22785394A Pending JPH0892103A (ja) | 1994-09-22 | 1994-09-22 | 硫酸化糖を有効成分とするホスホリパーゼａ２ 阻害剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0892103A (ja) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996024362A1 (fr) * | 1995-02-07 | 1996-08-15 | Shiseido Company, Ltd. | Agents anti-inflammatoires |
| KR100786358B1 (ko) * | 2007-01-12 | 2007-12-17 | 재단법인 제주하이테크산업진흥원 | 항염활성을 나타내는 참그물바탕말 추출물 |
| US8722098B2 (en) * | 2007-09-06 | 2014-05-13 | Pukyong National University Industry-Academic Cooperation | Ecklonia cava extracts for alleviating or preventing asthmatic reactions |
| CN112575057A (zh) * | 2020-12-11 | 2021-03-30 | 深圳上泰生物工程有限公司 | 一种组合物及其在检测脂蛋白相关磷脂酶a2活性中的应用 |
| WO2021211044A1 (en) * | 2020-04-15 | 2021-10-21 | Tx Medic Ab | Treatment of sepsis and hypercytokinemia |
| WO2022120784A1 (zh) * | 2020-12-11 | 2022-06-16 | 深圳上泰生物工程有限公司 | 一种组合物及其在检测脂蛋白相关磷脂酶a2活性中的应用 |
-
1994
- 1994-09-22 JP JP22785394A patent/JPH0892103A/ja active Pending
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996024362A1 (fr) * | 1995-02-07 | 1996-08-15 | Shiseido Company, Ltd. | Agents anti-inflammatoires |
| US5872109A (en) * | 1995-02-07 | 1999-02-16 | Shiseido Company, Ltd. | Anti-inflammatory agent |
| KR100786358B1 (ko) * | 2007-01-12 | 2007-12-17 | 재단법인 제주하이테크산업진흥원 | 항염활성을 나타내는 참그물바탕말 추출물 |
| US8722098B2 (en) * | 2007-09-06 | 2014-05-13 | Pukyong National University Industry-Academic Cooperation | Ecklonia cava extracts for alleviating or preventing asthmatic reactions |
| WO2021211044A1 (en) * | 2020-04-15 | 2021-10-21 | Tx Medic Ab | Treatment of sepsis and hypercytokinemia |
| CN112575057A (zh) * | 2020-12-11 | 2021-03-30 | 深圳上泰生物工程有限公司 | 一种组合物及其在检测脂蛋白相关磷脂酶a2活性中的应用 |
| CN112575057B (zh) * | 2020-12-11 | 2021-07-30 | 深圳上泰生物工程有限公司 | 一种组合物及其在检测脂蛋白相关磷脂酶a2活性中的应用 |
| WO2022120784A1 (zh) * | 2020-12-11 | 2022-06-16 | 深圳上泰生物工程有限公司 | 一种组合物及其在检测脂蛋白相关磷脂酶a2活性中的应用 |
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