HUT77041A

HUT77041A - II. Típusú foszfolipáz-A2-t gátló aktivitású monoklonális antitest és annak egy részét tartalmazó fehérje

Info

Publication number: HUT77041A
Application number: HU9701893A
Authority: HU
Inventors: Yasushi Kawauchi; Yasuhiko Masuho; Jun Takasaki; Tomoe Yasunaga
Original assignee: Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority date: 1994-12-29
Filing date: 1995-12-27
Publication date: 1998-03-02
Also published as: NO973026D0; AU4355496A; PL321161A1; NO973026L; FI972754A0; FI972754A; NZ298145A; WO1996020959A1; CN1171792A; EP0799836A1; KR970707162A; MX9704879A; CA2204731A1

Description

DANUBIA SZABADALMI ÉS VÉDJEGY IRODA Kft

II. típusú foszfolipáz-A2-t gátló aktivitású monoklonális antitest és annak egy részét tartalmazó fehérje

A találmány tárgyát II. típusú foszfolipáz-A2-t jelentősen gátló hatású monoklonális antitestek és ezek részeit tartalmazó fehérjék képezik.

A találmány tárgyát közelebbről olyan monoklonális antitestek és ezek részeit tartalmazó fehérjék képezik, amelyek kiemelkedő affinitással rendelkeznek, erősen specifikusak II. típusú foszfolipáz-A2-re és II. típusú foszfolipáz-A2-t erősen gátló hatással rendelkeznek.

A találmány tárgyát képezik továbbá találmány szerinti monoklonális antitesteket és fehérjéket termelő sejtek is, valamint olyan DNS-ek, amelyek találmány szerinti monoklonális antitesteket és fehérjéket kódolnak, valamint rekombináns vektorok, melyek találmány szerinti DNS-eket tartalmaznak.

A találmány tárgyát képezik ezen felül olyan gyógyászati készítmények is, amelyek találmány szerinti monoklonális antitesteket és fehérjéket tartalmaznak, vagy a II. típusú foszfolipáz-A2 inhibitorai.

Aktaszámunk: 85681-8661A/PÁ

A találmány szerinti megoldás alkalmas II. típusú foszfolipáz-A2-vel kapcsolatos betegségek kezelésére.

A foszfolipáz-A2 úgy ismerjük, mint azt az enzimet, amely a biomembrán egyik összetevőjének, az 1,2-acilfoszfogliceridnek a C2-pozíciójában található észterkötés hidrolízisét katalizálja. Ez az enzim megtalálható az emlősök különböző szerveiben és sejtjeiben, és nem csak a biomembrán foszfolipidjeinek termelődését és metabolizmusát szabályozza, hanem mint az arachidonsav-kaszkád sebességmeghatározó enzimeként is hat. Az arachidonsav-kaszkád metabolikus termékei között számos olyant találunk prosztaglandin, leukotrién, tromboxán, PAF - amelyek különböző fiziológiai aktivitással rendelkeznek.

A foszfolipáz-A2-nek számos típusa ismert, úgymint I. típus, II. típus, intracelluláris típus, stb. [Atsumi és mtsai.: Nippon Rinsho, különkiadás, 202-206 old. (1994)]. Ezek közül a II. típusú foszfolipáz-A2 indukálódik a gyulladási hely váladékában és a gyulladási reakció során nagy mennyiségben kiválasztásra kerül a vérpályába. Számos publikáció utal arra, hogy ez az enzim súlyosabbá teszi a különböző gyulladásos megbetegedések tüneteit illetve részben ez okozza a tüneteket. Kikuchi-Yanoshita például beszámolt arról, hogy az enzim aktivitása emelkedik iszkémiás kardiopátia esetén patkányokban, amely a szívizom-infarktus állatmodelljeként szolgál a szerv előrehaladott károsodása esetén [Kikuchi-Yanoshita és mtsai.: J. Biochemistry 114 33 (1993)] . Leong számolt be arról, hogy az enzim nagyobb mennyiségben fordul elő szívizom-infarktusos betegek véréι ben, mint normál egyénekben [Leong és mtsai.: Clin. Exp. Pharm. Phys. 19 113 (1992)].

Lauritzen írta le, hogy ez az enzim fontos szerepet játszik az iszkémiás reperfúziós rendellenesség tüneteinek súlyosbodásában olyan betegek esetén, akik agyi infarktuson esnek át [Lauritzen és mtsai.: Brain Rés. 651 353 (1994)]. Bauer arról is beszámolt, hogy ez az enzim fontos szerepet játszik az akut vese-elégtelenség tüneteinek súlyosbodásában [Bauer és mtsai.: Kiin. Wochenschr. 67 196 (1989)]. Murakami hívta fel a figyelmet arra, hogy ez az enzim serkenti a hisztamin felszabadulást a hízósejtekből, (szöveti bazofil sejtek) amelyek központi szerepet játszanak olyan allergiás betegségekben, mint például asztma stb., valamint arra, hogy az enzim gátlása allergiás megbetegedések, mint például asztma stb., kezelésére alkalmas gyógyszerek kifejlesztéséhez vezethet [Murakami és mtsai.: J. Immun. 151

5675 (1993)].

Smith és Pruzanski számolt be az enzim egészséges egyénekhez képest megnövekedett mennyiségének megjelenéséről krónikus reumatoid arthritiszben szenvedő betegek vérében, ami arra utal, hogy ez az enzim az oka vagy súlyosbítója a betegségnek [Smith és mtsai.: British J. Rheumatol. 31 175 (1992); Pruzanski és mtsai.: J. Rheumatol. 15 1351 (1988)]. Hasonlóképpen, Pruzanski számolt be az enzim egészséges egyénekhez képest megnövekedett mennyiségének megjelenéséről oszteo-arthritiszben szenvedő betegek váladékában, ami arra utal, hogy ez az enzim lehet az oka vagy súlyosbítója a betegségnek [Pruzanski és mtsai.: Life Sci. 48 2457 (1991)] . Vadas és Green számolt be az enzim egészséges egyénhez képest megnövekedett mennyiségének megjelenéséről szeptikus sokkban szenvedő beteg vérében, ami arra utal, hogy ez az enzim a lehetséges oka vagy súlyosbítója a betegségnek [Vadas és mtsai.: Life Sci. 50 807 (1992); Green és mtsai.: Inflammation 15 355 (1991)].

Nevalainen számolt be nagymennyiségű enzim megjelenéséről különösen súlyos pankreatitiszben szenvedő betegek vérében, ami arra utal, hogy ez az enzim lehet az oka vagy súlyosbítója a betegségnek [Nevalainen és mtsai.: Gut 21 1133 (1993)] . Anderson írta le, hogy nagymennyiségű enzim jelenik meg pszoriázisban szenvedő betegek bőrében, ami arra utal, hogy ez az enzim lehet az oka vagy súlyosbítója a betegségnek [Anderson és mtsai.: Inflammation 18 1 (1994)].

Kőiké felhívta a figyelmet arra, hogy ez az enzim fontos szerepet játszik, mint a több szervre kiterjedő leállás (multiple organ failure, MOF) kórkép kiváltója [Kőiké és mtsai.: Surgery 112 173 (1992)]. Koeniger, Edelson és Romaschin számolt be az enzim egészséges egyénekhez képest megnövekedett mennyiségének megjelenéséről akut légzésbénulási szindrómát (acute respiratory distress syndrome, ARDS) mutató betegek vérében, ami arra utal, hogy ez az enzim lehet az oka vagy súlyosbítója a betegségnek [Koeninger és mtsai.: Kiin. Wochenschr. 67 212 (1989); Edelson és mtsai.: Am. Rév. Respir. Dis. 143 1102 (1991); Romaschin és mtsai.: Clin. Biochem. 25 55 (1992)].

Minami számolt be nagy mennyiségű enzim megjelenéséről Crohn-betegségben illetve fekélyes kolitiszben (ulcerative colitis) szenvedő betegek vérében, ami arra utal, hogy ez az enzim lehet az oka vagy súlyosbítója a betegségeknek [Minaki és mtsai.: Gut 33 914 (1992)].

Hozzátehetjük még, hogy megjelentek utalások az enzim szerepéről uveitiszben, újszülöttek légzésbénulási szindrómájában (respiratory distress syndrome of the newborn) , bronchopulmonáris diszpláziában (BRD) és más betegségekben.

Ami az anti-humán II. típusú foszfolipáz-A2 antitestet illeti, a következő antitestekről számoltak be.

Stoner humán II. típusú foszfolipáz-A2-t tisztított humán méhlepényből és szinoviális folyadékból, és a tisztított enzimet antigénként használva, monoklonális antitestet állított elő, amit egérben fejlesztett ki az antigén ellen [Stoner és mtsai.: J. Immun. Methods 145 127 (1991)]. Az eljárás szerint először BALB/cByJ törzsbe tartozó egeret szenzitizáltak a tisztított foszfolipáz-A2-vel, amit Freund-féle komplett adjuvánssal kevertek össze (5 μς) , amit 25 nap múlva ugyanez az enzim követett (3 pg) . A továbbiakban, 3 nappal a lépsejtek fuzionálását megelőzően az egeret ugyanezzel a preparátummal szenzitizálták (5 pg, összesen 36 nappal az eredeti szenzitizálás után). Ennek megfelelően az egeret összesen 13 μg immunogénnel immunizálták, három részre elosztva, 36 napon keresztül. Az izolált lépsejteket PAI-0 egér mielóma sejtekkel fuzionáltatták és HAT táptalajban szkrínelték. A táptalaj felülúszóját ELISA rendszerrel, foszfolipáz-A2-t használva vizsgálták a monoklonális antitestek kinyerésére (PLA184, PLA185, PLA186 és PLA187). Ezek az antitestek természetesen képesek voltak a humán foszfolipáz-A2 gátlására. Az antitestek más állatfajokból származó foszfolipáz-A2-t gátló aktivitását azonJ bán csak patkány eredetű II. típusú foszfolipáz-A2-vel vizsgálták meg. Beszámoltak arról, hogy ezek az antitestek csak kismértékű aktivitást, vagy semmiféle keresztreakció aktivitást nem mutattak a patkány eredetű II. típusú foszfolipáz-A2-vel szemben, és ennek megfelelően állatkísérletekben patkányok esetében nem voltak felhasználhatóak.

Takayama reumás beteg izületi folyadékából (synovia) tisztított humán II. típusú foszfolipáz-A2-t és ezt a tisztított enzimet antigénként használva egérben monoklonális antitestet termelt [Takayama és mtsai.: Biochem. Biophys. Rés. Com. 167 1309 (1990)]. Ebben az immunizációs eljárásban a tisztított humán II. típusú foszfolipáz-A2-t (10 pg) nitrocellulóz membránon abszorbeálták, homogenizálták és a kapott homogenizátumot BALB/c törzsbe tartozó egér lépébe injektálták, amelyet két héttel később egy hasonló immunizálás követett. így tehát az állatot összesen 20 pg immunizáló antigén két egyenlő részletével, 28 napos időtartam alatt immunizálták és ezután, az utolsó immunizálás után 3 nappal hajtották végre a lépsejtek és az egér mielóma sejtek fúzióját (X63-Ag8.6.5.3) . A táptalaj felülúszóját foszfolipáz-A2-t alkalmazva ELISA rendszer segítségével vizsgálták és így kapták a reagáló monoklonális antitesteket (HP-1, HP-2, HP-3 és HP-4). Ezek közül a HP-1 mutatta a legerősebb inhibitor aktivitást humán II. típusú foszfolipáz-A2-vel szemben. Azonban, a HP-1 még így is gyenge inhibitor aktivitást mutatott, mindössze százalékos gátló hatást mutatva 200-szoros moláris feleslegben hozzáadva.

McCord rekombináns humán II. típusú foszfolipáz-A2-t tisztított, és egérben ennek a tisztított enzimnek, mint antigénnek a felhasználásával monoklonális antitestet termelt [McCord és mtsai.: J. Invest. Dermatology 102 980 (1994)]. Állatok immunizálására CAF1 törzsbe tartozó egeret immunizáltak Freund-féle komplett adjuvánssal kevert foszfolipáz-A2-vel, amelyet - sorrendben megfeleltetve minden negyedik héten 100 pg, 50 pg és 25 pg mennyiségben alkalmaztak, és az utolsó immunizációt a lépsejtek fuzionáltatását megelőzően 3 nappal hajtották végre. így összesen körülbelül 200 pg immunogént használtak az immunizálásra, négy részre elosztva, 56 napos időtartam során. A lépsejteket SP2/0-AG14 jelű egér mielóma sejtekkel fuzionáltatták és HAT táptalajon szkrínelték pozitív sejtekre. A táptalaj felülúszóját foszfolipáz-A2-t alkalmazva vizsgálták inhibitor aktivitásra, hogy monoklonális antitesteket nyerjenek (3F10). Megvizsgálták az antitest (1 gg) inhibitor aktivitását humán foszfolipáz-A2-vel szemben, de, mivel nem közölték a felhasznált enzim mennyiségét, nehéz az inhibitor hatás becslése.

Továbbá, a Tokkai H4-506447 számú japán szabadalmi iratban Johnson kitanítást ad rekombináns humán foszfolipáz-A2 tisztításáról és poliklonális antitest előállításáról nyúlban, ahol a tisztított enzimet használja immunogénként. Ez az antitest nem monoklonális és továbbá, antigénként kétféle peptidet használt, amelyek a humán foszfolipáz-A2 szekvencia részeit alkotják, nevezetesen

GTKFLSYKFSNSGSRITC (az N-terminálisról a 67-85 közötti aminosavak) és NKTTYNKKYQYYSNKHSRGSTPRC (az N8 terminálisról a 109-132 közötti aminosavak). Az antitest inhibitor képességét anélkül vizsgálta, hogy megadná a vizsgálathoz felhasznált antitest és humán foszfolipáz-A2 mennyiségét, így megnehezíti az inhibitor hatás becslését.

A Tokkai H7-109300 számú japán szabadalmi iratban úgyszintén kitanítást találunk egy olyan antitestről, amely elősegíti a humán foszfolipáz-A2 kötődését szulfátéit poliszaharidhoz, anélkül, hogy az antitest humán II. típusú foszfolipáz-A2-t gátló hatását megerősítenék.

Továbbá, nem találunk információt a fent leírt ismert antitestek inhibitor aktivitására a majomból, egérből, nyúlból, macskából, kutyából és patkányból származó II. típusú foszfolipáz-A2-vel szemben, valamint a sejthez kötött humán II. típusú foszfolipáz-A2 felszabadító képességükről.

A humán enzimmel egeret immunizálva könnyen állíthatunk elő olyan antitestet, amely felismerni képes az aminosav szekvencia különbséget az egér és a humán eredetű enzimek között. Ezért tehát, amikor egeret immunizálunk humán II. típusú foszfolipáz-A2-vel, elméletileg feltételezhető, hogy csaknem az összes egér antitest, amely humán II. típusú foszfolipáz-A2-t köt, nem fog egér II. típusú foszfolipáz-A2-t kötni. Ugyanakkor a II. típusú foszfolipáz-A2 enzim aktív centruma és annak szomszédsága általában megmarad a különböző állatfajok között és a homológia az egér és a humán enzim között meglehetősen nagy. Amikor egeret humán II. típusú foszfolipáz-A2-vel immunizálunk, az immunológiai toleranciának köszönhetően nehéz olyan antitesteket nyerni, amelyek az enzim aktív centrumát és annak szomszédságát ismerik fel, amely végül a je9 len helyzethez vezet, amennyiben lehetetlen humán II. típusú foszfolipáz-A2-vel szemben erős gátló hatással rendelkező antitesteket előállítani.

Mostanáig nem ismert még olyan antitest, amely nem csak erősen gátolja a humán II. típusú foszfolipáz-A2-t, hanem úgyszintén gátolja az egér eredetű II. típusú foszfolipáz-A2-t és/vagy a majom eredetű II. típusú foszfolipáz-A2-t is. Új gyógyszerek embereken való klinikai kipróbálását megelőzően előfeltétel, hogy ezek gyógyszerhatásait állatkísérletekben tisztázzák. Ezért tehát szükséges, hogy olyan monoklonális antitestekkel rendelkezzünk, amelyek kísérleti állatokban gyógyszerhatást mutatnak, ez különösen kis állatokban jelentős, mint például egér és majom, azaz olyan monoklonális antitestekre van szükségünk, amely nem csak a humán II. típusú foszfolipáz-A2-t gátolja, hanem az ezekből az állatokból származó foszfolipáz enzimet is .

Az is ismert, hogy a foszfolipáz-A2 sejtekhez kell, hogy kötődjön, amikor az enzim kifejti hidrolitikus aktivitását membrán foszfolipideken [Suga és mtsai.: Eur. J. Biochem. 218 807 (1993); Murakami és mtsai.: J. Bioi. Chem.

268 839 (1993)]. Ennek megfelelően, ha az antitestek nem csak a véráram és az váladékok szabad foszfolipáz-A2-jét képesek gátolni, hanem képesek a sejtekhez kötött enzimet is felszabadítani, - amely sejtek membrán foszfolipidjei kerülnek hidrolízisre - akkor ezekről az antitestekről feltételezzük, hogy új hatásmechanizmuson alapuló erős gátló hatással rendelkeznek foszfolipáz-A2-vel szemben. Továbbá, amikor antitest kötődik a sejtfelszínhez kapcsolódó foszfolipáz-A2-höz, komplement és/vagy effektor sejtek megtámadhatják az ilyen sejtet, és ezzel kedvezőtlen mellékhatásokat válthatnak ki a sejten. Azonban olyan antitestek, amelyek a sejthez kötött II. típusú foszfolipáz-A2-t képesek lennének felszabadítani, még nem lettek kifejlesztve.

Ezért tehát nagy igény van gyógyszerészeti felhasználhatóságú II. típusú foszfolipáz-A2 elleni antitestekre, amely antitestek nem csak a humán eredetű II. típusú foszfolipáz-A2-t gátolják erősen, hanem a más állat fajokból származó azonos enzimet is, és úgyszintén rendelkeznek a sejthez kötött II. típusú foszfolipáz-A2-t felszabadító képességgel.

A feltalálók erőfeszítéseket tettek a fent ismertetett problémák megoldására és a találmány megvalósításához a következő ismeretekre tettek szert.

így tehát egeret immunizáltunk rekombináns humán II.

típusú foszfolipáz-A2-vel, amelyet Freund-féle komplett adjuvánssal kevertünk össze és egerenként 20 pg mennyiségben használtuk 8 alkalommal, 2-3 hetes időközökben. így eljárásunk abban tér el más kutatók módszerétől, hogy az immunológiai tolerancia elkerülésére megnöveltük az immunizáció gyakoriságát és meghosszabbítottuk az immunizációs időtartamot. A továbbiakban megkíséreltük az antitestek szkrínelésére szolgáló foszfolipáz-A2 gátlás vizsgáló rendszer tökéletesítését.

Ennek megfelelően Escherichia coliból származó foszfolipidet használtunk, mint a foszfolipáz-A2 aktivitás mérésének nagy érzékenységű szubsztrátját [Jacobson és mtsai.: Biochem. Pharm. 39 1557 (1990)] és úgyszintén tökéletesítettük az E. coli eredetű foszfolipidek, mint szubsztrátok, előállítására szolgáló eljárást is. Ennek megfelelően SN17 jelű foszfolipáz-A2 hiányos Escherichia coli törzset használtunk (plcLA, pla-2, thr-1, leuB6, thi) [Dói és mtsai.: J. Biochem. 80 1247 (1976)], és tríciumjelölt olaj savat építettünk be a baktériumba a foszfolipidek előállítására. Ennek a mikroorganizmusnak a felhasználásával képesek voltunk magas specifikus aktivitással rendelkező trícíum-jelölt E. coli foszfolipidet hatékonyan előállítani anélkül, hogy kitettük volna az E. coli foszfolipáz-A2 okozta lebontásnak. Továbbá, egy hosszabb enzimes reakcióidővel és a hagyományos eljárásnál magasabb érzékenységgel rendelkező vizsgálati rendszert használva [J. Bioi. Chem. 261 4239 (1986)] - hatékonyan és precízen tudtuk szkrínelni a kívánt antitestet termelő hibridómát. így vizsgáltuk végig gátló hatásukat a különböző állatokból származó foszfolipáz-A2 aktivitással szemben.

Annak érdekében, hogy az így nyert antitestek egy új hatását is megvizsgáljuk, az antitestek sejthez kötött foszfolipáz-A2 felszabadító képességének tesztelésére vizsgálati rendszert használtunk.

Ezek eredményeképpen sikeresen előállítottunk olyan monoklonális antitestet, amely az alábbi jellemző tulajdonságokkal rendelkezik.

A feltalálók által előállított monoklonális antitest reagál a humán II. típusú foszfolipáz-A2-vel és jelentős mértékben gátolja az aktivitását. Úgyszintén, az antitest keresztreakciót ad majom és egér eredetű, vérlemezkéből nyert II. típusú foszfolipáz-A2-vel. Ezért tehát, a találmány tárgyát képező antitest alkalmazásával állatkísérletek hajthatók végre egéren és majommal új gyógyszerek humán klinikai kipróbálását megelőzően. Továbbá, a találmány tárgyát képező monoklonális antitest nem csak a véráramban és váladékban található szabad enzim gátlására képes, hanem a sejthez kötött II. típusú foszfolipáz-A2-t is képes felszabadítani. A II. típusú foszfolipáz-A2 a sejtfelszíni heparin-szulfáton és más hasonlókon keresztül kötődik a sejthez és tudjuk róla, hogy hepatocitához, endotél sejthez, stb. kötődik, ahol heparin-szulfát és más hasonlóak vannak a sejtfelszínen. A találmány tárgyát képező monoklonális antitestre jellemző, hogy nem csak a véráramban és váladékban található szabad II. típusú foszfolipázA2 működését gátolja, hanem a sejt-kötött enzimet is felszabadítja a sejtmembránból.

Hozzátehetjük még, hogy a találmány tárgyát képezi olyan fehérje is, amely a találmányi leírás szerinti tulajdonságokkal rendelkező monoklonális antitest részét tartalmazza és antigén-kötő képessége azonos a monoklonális antitest kötőképességével. Úgyszintén a találmány tárgyát képezik a fehérje redukált alkilezett származékai is, valamint olyan változatok, amelyeket a monoklonális antitest aminosav szekvenciájából nyerünk, egy vagy több aminosav hozzáadásával, deléciójával, helyettesítésével vagy mutációjával; amennyiben az így nyert változat megtartja a monoklonális antitesttel azonos antigén-kötő kapacitását; és amely monoklonális antitestet állatok immunizálásával állítunk elő.

Továbbá, a feltalálók olyan cDNS-eket izoláltak, amelyek a találmány szerinti antitestet termelő 1.4 hibridóma és 10.1 hibridóma sejtvonalakból származó antitest H- és L-láncainak variábilis régióját kódolja és meghatározták a teljes bázis szekvenciát. Ez nem csak az antitest nagy méretben történő előállítását teszi lehetővé génsebészeti technikák alkalmazásával, hanem egyúttal lehetőséget biztosít a találmány szerinti antitestek egyszerű módosítására antitest szerkesztési technikák alkalmazásával. Az 1.4 hibridóma sejtvonal segítségével meghatározott bázis szekvenciákat az 1. azonosítási szám szerinti szekvenciában (L-lánc) és a 3. azonosítási szám szerinti szekvenciában (H-lánc) mutatjuk be. Úgyszintén, a bázis szekvenciáknak megfelelő vélelmezett aminosav szekvenciákat a 2. azonosítási szám szerinti szekvencia (L-lánc) és a 4. azonosítási szám szerinti szekvencia (H-lánc) mutatja be. A hibridóma 10.1 sejtvonal segítségével meghatározott bázis szekvenciákat az 5. azonosítási szám szerinti szekvenciában (L-lánc) és a 7. azonosítási szám szerinti szekvenciában (H-lánc) mutatjuk be. Úgyszintén, a bázis szekvenciáknak megfelelő vélelmezett aminosav szekvenciákat a 6. azonosítási szám szerinti szekvencia (L-lánc) és a 8. azonosítási szám szerinti szekvencia (H-lánc) mutatja be.

Ezeknek megfelelően a találmány tárgyát az alábbiak képezik:

1) Monoklonális antitest, vagy ennek egy részét tartalmazó ilyen aktivitású fehérje, amely képes a humán II. típusú foszfolipáz-A2 aktivitásának gátlására, hasonló mó14 dón képes a majomból és/vagy egérből származó II. típusú foszfolipáz-A2 aktivitásának gátlására,

2) Monoklonális antitest, vagy ennek egy részét tartalmazó ilyen aktivitású fehérje, amely képes a sejtmembránhoz kötődő II. típusú foszfolipáz-A2 felszabadítására,

3) A 2) pont szerinti monoklonális antitest vagy fehérje, amely által gátolt foszfolipáz-A2 humán eredetű,

4) Monoklonális antitest, vagy ennek egy részét tartalmazó ilyen aktivitású fehérje, amely nem csak a humán II. típusú foszfolipáz-A2 aktivitásának gátlására, és hasonló módon a majomból és/vagy egérből származó II. típusú foszfolipáz-A2 aktivitásának gátlására képes, hanem a sejtmembránhoz kötődő II. típusú foszfolipáz-A2-t fel is szabadítja,

5) Monoklonális antitest, vagy ennek egy részét tartalmazó fehérje, amelyet a 12H5 (FERM BP-5300), 1.4 (FERM BP-5297) és 10.1 (FERM BP-5298) hibridómák bármelyike termel, vagy olyan monoklonális antitest vagy ennek egy részét tartalmazó fehérje, amely aktivitása a II. típusú foszfolipáz-A2-vel szemben egyenértékű az említett monoklonális antitesttel vagy fehérjével,

6) Az 1. vagy 2. pontok szerinti monoklonális antitest, vagy ennek egy részét tartalmazó fehérje, amely monoklonális antitest vagy fehérje olyan fehérjét tartalmaz, amelynek aminosav szekvenciája megfelel a 2., a 4., a

6. vagy a 8. azonosítási szám szerinti szekvenciák bármelyikének vagy ezen szekvenciákban található egy vagy több aminosav szubsztitúciójával, deléciójával vagy beillesztésével kapott módosított szekvenciának,

7) Az 1. vagy 2. pontok szerinti monoklonális antitest, vagy ennek egy részét tartalmazó fehérje, amely monoklonális antitest vagy fehérje olyan fehérjét tartalmaz, amelynek aminosav szekvenciája megfelel a 9-20. azonosítási szám szerinti szekvenciák bármelyikének vagy ezen szekvenciákban található egy vagy több aminosav szubsztitúciójával, deléciójával vagy beillesztésével kapott módosított szekvenciának,

8) Sejt, amely az 1-7. pontok bármelyike szerinti monoklonális antitestet vagy fehérjét termel,

9) A 8. pont szerinti sejt, amely sejt hibridóma eredetű,

10) A 8. pont szerinti sejt, amely sejt rekombináns DNS segítségével transzformált sejt,

11) Eljárás az 1-7. pontok bármelyike szerinti monoklonális antitest vagy fehérje termelésére, amely eljárás részét képezik a 8. pont szerinti sejt tenyésztésére szolgáló módszerek és a monoklonális antitestek és fehérjék kinyerése a táptalaj felülúszójából,

12) DNS, amely az 1-7. pontok bármelyike szerinti monoklonális antitestet vagy fehérjét kódolja,

13) A 12. pont szerinti DNS, amely DNS bázis szekvenciája tartalmazza az 1., a 3., az 5 vagy a 7. azonosítási szám szerinti szekvenciák bármelyikét, vagy az ezen szekvenciákban található egy vagy több aminosav szubsztitúciójával, deléciójával vagy beillesztésével kapott bármelyik módosított szekvenciát,

14) Rekombináns vektor, amely a 12. vagy 13. pontok szerinti DNS-t tartalmazza,

15) Orvosi felhasználású készítmény, amely az 1-7. pontok bármelyike szerinti monoklonális antitestet vagy fehérjét és farmakológiailag elfogadott hordozóanyagot tartalmaz,

16) II. típusú foszfolipáz-A2 inhibitor, amely az 17. pontok bármelyike szerinti monoklonális antitestet vagy fehérjét tartalmaz.

A találmány tárgyát képező fehérje tetszés szerinti számú aminosavból álló fehérje lehet, beleértve a kisebb aminosav számú peptidet is. Úgyszintén, a találmány tárgyát képező monoklonális antitestet vagy fehérjét termelő sejt bármely sejt lehet, úgymint baktériumsejt, élesztősejt, emlőssejt, stb. amennyiben a sejt a találmány szerinti monoklonális antitest illetve fehérje előállítására képes .

A találmány tárgyát képező monoklonális antitest előállítható egér hibridóma táptalajban, vagy egér hasűri folyadékban történő tenyésztésével. Az antitest részei, úgymint F(ab')2, Fab, Fab', stb. előállíthatóak a termelt antitest proteolítikus enzimmel történő emésztésével, majd megfelelő tisztításával, amely proteolítikus enzim az alábbiak bármelyike lehet: tripszin, papain vagy pepszin.

A találmány tárgyát képező hibridómák, mint a 12H5,

1.4 és 10.1 hibridómák előállíthatóak BALB/c törzsbe tartozó egér lépsejtjeinek és egér P3x63Ag8/Ul (P3U1) mielóma sejtek fúziójával, - ahol a BALB/c törzsbe tartozó egér normál humán eredetű II. típusú foszfolipáz-A2-vel lett szenzitizálva, növekvő gyakorisággal és megnyújtott immunizációs időtartammal - standard eljárásokat alkalmazva, mint ·

• · · « · ·

·.« · például a Kohler és Milstein által leírt sejtfúziós eljárás (lásd az alábbi példát).

A feltalálók által előállított, és a találmány tárgyát képező hibridómák az alábbiak szerint kerültek letétbe :

12H5 hibridóma letét:

a) A letétbe helyező neve és címe:

Név: National Institute of Bioscience and HumanTechnology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry

Cím: Higashi 1-1-3, Tsukuba-shi, Ibaragi-ken 305, Japán

b) A letétbe helyezés dátuma (eredeti letétbe helyezés dátuma):

1994 november 22-én

c) Leltári szám:

Seimeiken-Jo-Ki szám: 5300 (FERM BP-5300)

1.4 hibridóma letét:

a) A letétbe helyező neve és címe:

Cím: Higashi 1-1-3, Tsukuba-shi, Ibaragi-ken 305, Japán

b) A letétbe helyezés dátuma (eredeti letétbe helyezés dátuma):

1994 november 22-én

c) Leltári szám:

Seimeiken-Jo-Ki szám: 5297 (FERM BP-5297) * » « · • · * ·· • *··ν · ··· *«· ·

10.1 hibridóma letét:

a) A letétbe helyező neve és címe:

Cím: Higashi 1-1-3, Tsukuba-shi, Ibaragi-ken 305, Japán

b) A letétbe helyezés dátuma (eredeti letétbe helyezés dátuma):

1994 november 22-én

c) Leltári szám:

Seimeiken-Jo-Ki szám: 5298 (FERM BP-5298)

A hibridómák táptalajául a Dulbecco által módosított minimális esszenciális Eagle táptalajt használjuk, (a továbbiakban DMEM-ként rövidítve) , amit fötális borjúsavóval, L-glutaminnal, glükózzal, nátrium-piruváttal, 2-merkaptoetanollal és antibiotikumokkal (például penicillin G, sztreptomicin, gentamicin, stb.), stb. egészítünk ki.

A hibridómákat általában 37 °C-on, 5 % CO₂ - 95 % levegő atmoszférában, 2-4 napig tenyésztjük a táptalajban; vagy 2,6,10,14-tetrametil-pentadekánnal (például pristan, Aldrich) előkezelt BALB/c törzsbe tartozó egér hasüregében tenyésztjük 10-20 napig, amíg az antitest a tisztításhoz szükséges mennyiségben rendelkezésre nem áll.

Hozzátehetjük még, hogy a találmány tárgyát képező monoklonális antitest, vagy annak részét tartalmazó fehérje úgy is előállítható, hogy a találmány szerinti antitestet, vagy annak részét kódoló gént részben vagy egészben expressziós vektorban illesztjük és az expressziós vektort • · ··· * · · · · • · • · · * 9 9 9 99

9 ·

E. coli, élesztő vagy emlős sejtbe juttatjuk, amely majd ezeket termelni fogja.

Az így előállított monoklonális antitest a tenyésztő táptalaj felülúszójának vagy a hasűri folyadéknak a frakcionálásával tisztítható, a fehérjék izolálására és tisztítására szolgáló általánosan használt eljárásokat alkalmazva. Ezek az eljárások magukba foglalnak például centrifugálást, dialízist, ammónium-szulfátos kicsapást, oszlopkromatográfiás elválasztásokat DEAE-cellulózon, hidroxil-apatiton és protein-A agarózon, stb.

Az így megtisztított antitestből az aktív fragmensek, például F(ab')2, Fab, Fab', Fv előállíthatóak az antitest proteolítikus enzimes (pepszin, papain, stb.) emésztésével, amit a hasított termék izolálása és tisztítása követ, általánosan használt eljárások alkalmazásával. Továbbá, az antitest redukált, alkilezett származékai is előállíthatóak, - amelyekben a H- és L-láncokat csak a nem-kovalens kötések tartják össze - a H-H-láncokat és/vagy a H-L-láncokat áthidaló diszulfid kötések reduktív alkilezésével, ditiotreitolt és jódacetamidot, stb. alkalmazva [Useful Immunological Experimental Method 39. old., Kodansha

Scientific Book] .

Hozzátehetjük még, hogy az effektor hatás visszaszorítása érdekében a találmány szerinti monoklonális antitest Fc régiójának, - vagy annak részének - aminosav szekvenciája módosítható [Duncan és mtsai.: Natúré 332 738 (1988); Tao és mtsai.: J. Exp. Med. 178 661 (1993); Lund: J. Immunology 147 2657 (1991)]. Az is elképzelhető, hogy az Fc fragmenst más fehérjével helyettesítjük. Szintén elképzel20 hető, hogy az Fc fragmenst más fehérjével fuzionálhatjuk, hogy így új hatást kapjunk.

Timikor a találmány szerinti monoklonális antitestet vagy annak részét tartalmazó fehérjét emberek kezelésére használjuk, előnyösen olyan antitestet, vagy annak részét tartalmazó fehérjét használunk, amely nagy arányban tartalmaz emberi eredetű elemeket. Az ilyen monoklonális antitestekre példa lehet: 1) az úgynevezett kiméra antitest, amelynek aminosav szekvenciája csak a variábilis régióban származik állatból, mint például egérből, stb., és a konstans régió humán eredetű; és a 2) úgynevezett humanizált antitest, amely állatból, például egérből származó aminosav szekvenciát csak a komplementer-meghatározó régióban tartalmaz (a továbbiakban CDR-nek rövidítjük, vagy hipervariábilis régiónak nevezzük) és a többi régiók aminosav szekvenciája humán eredetű. Az ilyen típusú antitestek úgyszintén a találmány tárgyát képezik. Ezek a kiméra antitestek illetve humanizált antitestek a szakember számára könnyen előállíthatóak, a variábilis régiónak, vagy a CDRnek megfelelő gén izolálásával· a találmány szerinti hibridómából, a humán antitest génnel való rekombinálással, és az így nyert gén gazdasejtbe való bejuttatásával, ahol a gén expresszálódik [lásd például: Int. J. Cancer 44 424 (1989); Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 8095 (1990)]. Úgyszintén, ahogy a gén bázis szekvenciája meghatározásra kerül, lehetségessé válik a megfelelő szintetizált szekvenciát tartalmazó gén alkalmazása, valamint a hibridóma eredetű vagy humán antitest termelő sejt eredetű gén és a szintetikus gén kombinációjának alkalmazása. A variábilis régiónak illetve a CDR-nek megfelelő génként legelőnyösebben bármelyik, az 1., 3., 5. vagy 7. azonosítási szám szerinti szekvenciákban bemutatott bázis szekvencia alkalmazható, vagy olyan DNS-ek alkalmazhatóak, amelyek a fenti bázis szekvenciák CDR-régiójának megfelelő bázis szekvenciát tartalmazzák. Előnyösen alkalmazhatóak olyan DNS-ek, amelyek bázis szekvenciája bármelyik, a 2., 4., 6. vagy 8. azonosítási szám szerinti szekvenciáknak megfelelő aminosav szekvenciát, - vagy azoknak CDR-régióját - kódoló bázis szekvenciát tartalmazzák, illetve olyan DNS-gének, amelyek a fenti DNSek egy vagy több bázisának szubsztitúcióval, delécióval vagy beillesztéssel történő módosításával előállított bázis szekvenciát illetve azok részét tartalmazzák. Gének mutagenézise megoldható szubsztitúció, deléció vagy beillesztés útján, ismert módszerek alkalmazásával [Gillamn és mtsai.: Gene 8_ 81 (1979); Roberts és mtsai.: Natúré 328 731 (1987)] . Előnyös tulajdonságokkal rendelkező aminosav szekvenciát kódoló szekvencia kiválasztására az így előállított variáns bázis szekvenciák közül különböző eljárások, - beleértve a fág-display eljárást is - alkalmazhatóak [Ann Rév. Immunoi. 12 433 (1994)]. Különösen az úgynevezett humanizált antitest állítható elő a szakember számára könnyen, ismert eljárásokat alkalmazva [Natúré 321 522 (1986); Science 239 1534 (1988); Proc. Natl. Acad. Sci. USA

10029 (1989); Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 2869 (1991)]. Továbbá, ezeknek az irodalmi adatoknak megfelelően humanizált antitest előállítására előnyösen olyan humán antitestet alkalmazunk, amely nagymértékben homológ az embertől különböző állattal, amelyből az átültetésre szánt

CDR-régió származik, azaz, a humán antitestet csak a CDRrégiójában helyettesítjük embertől különböző állati eredetű régióval. Az így felhasznált, a humanizált antitest alapvázát alkotó antitestet humán receptor antitestnek nevezzük. Ahogyan ezt a 7. példában bemutatjuk, a feltalálók által előállított és a találmány tárgyát képező egér eredetű antitesthez nagymértékben homológ humán antitestek például az alábbiak voltak: Pag-1 antitest [Hughes-Johns és mtsai.: Biochem J. 2 68 135 (1990); WEA antitest [Goni és mtsai.:

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 4837 (1983)]; ΙΊΉ5-2 antitest [Chin és mtsai.: Immunoi. Letter 44 25 (1995); ITC48 antitest [Ohlin és mtsai.: Mól. Immunoi. 31 983 (1994)]. Ezek az antitestek előnyösen elképzelhetőek, mint humán receptor antitestek a humanizált antitestek előállításához.

Kiméra antitest a szakember számára egyszerűen elkészíthető az ismert eljárásokat alkalmazva [Natúré 314 268 (1985); Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 3439 (1987); Proc.

Natl. Acad. Sci. USA 84 214 (1987); Proc. Natl. Acad. Sci.

USA 81 6851 (1984)].

A találmány tárgyát képező előnyös monoklonális antitestre vagy fehérjékre például szolgálnak a 12H5 vagy 1.4 monoklonális antitestek, amelyeket a találmányi leírás szerint állatok humán II. típusú foszfolipáz-A2-vel történő szenzitizálása utján állítunk elő, valamint ezek fragmensei, úgymint F(ab')2, Fab, Fab', stb. Úgyszintén, a találmány tárgyát képezik olyan monoklonális antitestek, amelyek ezeknek a monoklonális antitesteknek, vagy fragmenseiknek a variábilis vagy hiper-variábilis régióit tartalmazzák, és ezen felül más humán eredetű régiókat tartalmaznak .

A találmány tárgyát képező orvosi felhasználású készítmények különösen hatásosak parenterálisan beadva, azaz szubkután, intramuszkulárisan vagy intravénásán beadva. A parenterális beadásra összeállított készítmény szokás szerint egy oldat, amely a monoklonális antitestet vagy annak részét magába foglaló fehérjét tartalmazza beadható hordozóban oldva - előnyösen vizes hordozóban. Különböző vizes hordozók, mint például víz, vizes puffer, 0,4 %-os sóoldat, 0,3 %-os glicin oldat, 5 %-os glükóz oldat, humán albumin oldat, stb. alkalmazható. Ezeket az oldatokat sterilizálni kell és általában nem tartalmaznak látható részecskéket alkotó anyagokat. Ezek a készítmények hagyományos, jól ismert sterilizációs eljárásokkal sterilizálhatóak. Ezek a készítmények tartalmazhatnak a gyógyszertechnológiában elfogadott kiegészítőket, amelyek közelebb hozzák azokat a fiziológiás körülményekhez, például tartalmazhatnak pufferoló és izotóniás anyagokat, beleértve például nátrium-acetátot, nátrium-kloridot, kálium-kloridot, kalcium-kloridot, nátriumlaktatót, nátrium-citrátot, stb. A parenterálisan beadható aktuális készítmény előállítható a szakember által, megalapozott és jól ismert eljárások alkalmazásával, mint amilyenek leírásra kerültek például a következő kiadványban: Remington's Pharmaceutical Science, 15. kiadás, Mack Publishing Company, Easton, PA (1980) .

A találmány tárgyát képező monoklonális antitestek, fehérjék vagy orvosi célú készítmények fagyasztva vagy fagyasztva szárítva tárolhatóak, és használat esetén a megfe24 lelő oldószerben feloldhatóak. Fagyasztva szárítás és kiolvasztás, valamint a készítmény feloldása ismert eljárások alkalmazásával a szakember által elvégezhető.

Az 1. ábra, sorrendben megfeleltetve, bemutatja az ELISA eredményeket a 12H5, 10.1 és 1.4 monoklonális antitestekre, rekombináns humán II. típusú foszfolipáz-A2-vel szemben.

A 2. ábra, sorrendben megfeleltetve, bemutatja az ELISA eredményeket a 12H5, 10.1 és 1.4 monoklonális antitestekre, patkány vérlemezkéből származó foszfolipáz-A2-vel szemben.

A 3. ábra, sorrendben megfeleltetve, bemutatja a 12H5, 10.1 és 1.4 monoklonális antitestek gátló hatását rekombináns humán II. típusú foszfolipáz-A2 aktivitással szemben.

A 4. ábra, sorrendben megfeleltetve, bemutatja a 12H5, 10.1 és 1.4 monoklonális antitestek gátló hatását patkány eredetű II. típusú foszfolipáz-A2 aktivitással szemben.

Az 5. ábra bemutatja a 12H5 monoklonális antitest gátló hatását különböző állatok vérlemezkéjéből származó foszfolipáz-A2-vel szemben.

A 6. ábra bemutatja a 10.1 monoklonális antitest gátló hatását különböző állatok vérlemezkéjéből származó foszfolipáz-A2-vel szemben.

A 7. ábra bemutatja az 1.4 monoklonális antitest gátló hatását különböző állatok vérlemezkéjéből származó foszfolipáz-A2-vel szemben.

A 8. ábra, sorrendben megfeleltetve, bemutatja a 12H5, 10.1 és 1.4 monoklonális antitest aktivitását BRL-3A sejtekhez kötődő foszfolipáz-A2 felszabadítására.

A 9. ábra bemutatja a rögzített (anchored) PCR eljárást az 1.4 antitest H- és L-láncai variábilis régiói cDNS-ének klónozására.

A 10. ábra bemutatja az 1.4 antitest L-lánc variábilis régiójának cDNS-szekvenciáját, valamint a lefordított aminosav szekvenciát. A CDR-szekvenciának megfelelő vélelmezett szekvenciát aláhúzással jelöltük.

A 11. ábra bemutatja az 1.4 antitest H-lánc variábilis régiójának cDNS-szekvenciáját, valamint a lefordított aminosav szekvenciát. A CDR-szekvenciának megfelelő vélelmezett szekvenciát aláhúzással jelöltük.

A 12. ábra bemutatja az eljárást az antitest H- és Lláncai variábilis régiója cDNS-ének klónozására PCR segítségével .

A 13. ábra bemutatja a 10.1 antitest L-lánc variábilis régiójának cDNS-szekvenciáját, valamint a lefordított aminosav szekvenciát. A CDR-szekvenciának megfelelő vélelmezett szekvenciát aláhúzással jelöltük.

A 14. ábra bemutatja a 10.1 antitest H-lánc variábilis régiójának cDNS-szekvenciáját, valamint a lefordított aminosav szekvenciát. A CDR-szekvenciának megfelelő vélelmezett szekvenciát aláhúzással jelöltük.

A következőkben a találmány szerinti megoldások egyes példáit ismertetjük anélkül, hogy a találmány érvényességi körét és az igénypontokban részletezett védelmi kört bármilyen módon korlátoznánk.

1. példa

12H5, 1.4 és 10.1 jelzésű hibridómák előállítása

A) II. típusú humán rekombináns foszfolipáz-A2 előállítása .

A találmány szerinti monoklonális antitestek előállíthatóak állatok rekombináns humán II. típusú foszfolipázA2-vel történő immunizálásával, amelyet teljes egészében a Tokkai H5-192167 számú japán szabadalmi irat eljárása szerint állítottunk elő.

B) Szenzitizált lépsejtek előállítása.

Az 1A példa szerint tisztított rekombináns humán II. típusú foszfolipáz-A2-t (állatonként 20 pg) fiziológiás sóoldatban oldottuk (0,1 mL) , egyenlő térfogatú Freund-féle komplett adjuvánssal kevertük össze, hogy emulziót kapjunk és peritoneálisan BALB/c törzsből származó egérbe injektáltuk (az egér hathetes volt az immunizáció kezdetén) (első immunizáció). Ezután ugyanilyen mennyiségű foszfolipáz-A2 és azonos mennyiségű Freund-féle komplett adjuváns keverékének emulzióját adtuk be, mint gyorsító (booster) , hét alkalommal, 2-3 hetes intervallumokban. A hetedik immunizáció után huszonnégy nappal fiziológiás sóoldatban (0,2 mL) oldott foszfolipáz-A2-t (állatonként 20 pg) adtunk be peritoneálisan (végső immunizálás). Három nappal a végső immunizálás után egy egérből lépsejteket nyertünk és DMEM táptalajban szuszpendáltuk.

C) 12H5, 1.4 és 10.1 hibridómák előállítása.

A fentiek szerint előállított lépsejteket (1 x 10^ssejt) egér P3 x 63Ag8 U1 (P3U1) mielóma sejtekkel (2 χ 10⁷sejt) fuzionáltattuk Kohler és Milstein eljárása szerint [lásd: Natúré 256 495 (1975) ] . Azaz, a lépsejteket és a P3U1 sejteket DMEM táptalajjal többször mostuk, együtt egy 50 mL-es műanyag centrifugacsőbe helyeztük és alaposan öszszekevertük. Ezután, a táptalajt centrifugálással elválasztva és eltávolítva, 37 °C-ra előmelegített 1 mL DMEMtáptalajt, - ami 50 % (vegyes %) polietilén-glikolt (Sigma, átlagos molekulatömeg 3350) tartalmazott - adtunk hozzá lassan, folyamatos kevertetés közben, 1 perc alatt.

Ezután 37 °C-ra előmelegített 10 mL DMEM-táptalajt adtunk hozzá cseppenként a fenti keverékhez, a fuzionáltatás leállítására. Az így kapott reakcióelegyet a felülúszó eltávolítására centrifugáltuk és a maradékhoz HAT-táptalajt adtunk (DMEM-táptalaj, ami 10 % fötális borjúsavót tartalmaz, kiegészítve hipoxantinnal (1 x 10~⁴ Μ) , aminopterinnel (4 x 10 Μ) , és timidinnel (1,6 x 10'⁵ M) ) , amivel a koncentrációt 6 x 10⁵ lépsejt/mL-re állítottuk. Ezt a sejtszuszpenziót 96-lyukas műanyag plate lyukaiba osztottuk el, 200 μύ/lyuk mennyiségben (1,2 x 10⁵ lépsejt). Tizenegy nappal később a táptalaj fele térfogatát leszívtuk, és a fent leírt friss HAT-táptalajt adtuk a maradékhoz. A sejtfúziót követően 7-10 nappal hibridóma proliferációt figyeltünk meg a lyukak körülbelül felében. Az antitest aktivitását a felülúszóban a D) pontban leírásra kerülő eljárással vizsgáltuk. A pozitív kiónokat 48-lyukas műanyag plate-re vittük át, majd később 24-lyukas plate-re, amelyben azonos táptalajban tenyésztettük a sejteket tovább, azzal a különbséggel, hogy a táptalaj nem tartalmazott aminopterint. Az antitest aktivitás reprodukálhatóságának megerősítését 24-lyukas plate-ben végeztük a tenyészet fe28 lülúszójának felhasználásával, a D) pontban leírásra kerülő eljárás szerint. Ugyanakkor az antitest enzimgátló aktivitását is meghatároztuk az E) pontban leírásra kerülő eljárás szerint.

Annak érdekében, hogy meggyőződjünk az enzimgátló aktivitást mutató három klón monoklonális voltáról, további klónozást végeztünk a határhígítás módszerével. Az így nyert kiónok által termelt monoklonális antitesteket - sorrendben megfeleltetve - 12H5, 1.4 és 10.1 jelöléssel láttuk el.

D) Antitest aktivitás meghatározása ELISA segítségével .

A tisztított rekombináns humán II. típusú foszfolipáz-A2-t 20 mM-os Trisz-pufférőit fiziológiás sóoldatban (TBS, pH 7,4) oldottuk 0,05 pg/mL koncentrációban. Az enzimoldat kisebb részleteit (egyenként 100 pL) elhelyeztük egy 96-lyukú lapos fenekű mikrotiter lap mindegyik lyukába és párásított kamrában 4 ²C-on éjszakán ét inkubáltuk. Az oldatot eldobtuk és mindegyik lyukba 1 % marha szérum albumint (BSA) tartalmazó TBS-t (egyenként 200 pL) adtunk és 37 °C-on állni hagytuk, hogy mindegyik lyuk szabad kötőfelületét blokkoljuk. Utána minden lyukat többször mostuk 0,05 % Tween 20-t tartalmazó TBS-sel (TBSTween). A hibridóma tenyészet táptalajának felülúszóját, illetve a hasűri folyadékot, vagy tisztított antitest preparátumot olyan TBS-Tween-nel hígítottuk, amely 0,2 % BSA-t tartalmazott (BSA-TBS-Tween), és az oldat kisebb részleteit (egyenként 100 pL) adtuk mindegyik lyukba, és szobahőmérsékleten 2 órán keresztül inkubáltuk.

A lyukakat a fentiekkel azonos módon mostuk TBSTween-nel, és utána egérellenes antitesthez (Zymed) konjugált torma-peroxidázt - amit 2000-szeresre hígítottunk BSATBS-Tween-nel - adtunk mindegyik lyukhoz, egyenként 100 pL mennyiségben, és 2 órán keresztül szobahőmérsékleten inkubáltuk. A reakció után a lyukakat a fenti módszer szerint mostuk TBS-Tween-nel és 0,1 M acetát - nátrium-citrát puffért (pH 5,8), - ami 0,006 % hidrogén-peroxidot és 3,3',5,5'-tetrametil-benzidint (0,1 mg/mL), mint enzim szubsztrátot tartalmazott - adtunk mindegyik lyukhoz, egyenként 100 pL mennyiségben. Miután 30 percig hagytuk állni szobahőmérsékleten, mindegyik lyukhoz 25 pL 3 M-os kénsavat adtunk a reakció leállítására, és ezután a reakcióelegy fényelnyelő képességét 450 nm-en meghatároztuk.

E) Foszfolipáz-A2-t gátló aktivitás vizsgálata

Az antitest foszfolipáz-A2 ellenes gátló hatásának meghatározását a Journal of Biological Chemistry folyóiratban leírt eljárás alábbiak szerinti kismértékű módosításával [Pepinsky és mtsai.: J. Bioi. Chem. 261(9) 4239 (1986)].

Rekombináns humán II. típusú foszfolipáz-A2 tisztított preparátumát (0,5 ng) és hibridóma tenyésztáptalaj felülúszóját - vagy antitest tisztított preparátumát - 125 mM-os Trisz pufferben (pH 8,0) (100 pL), amely 150 mM nátrium-kloridot, 12,5 mM kalcium-kloridot és marha szérum albumint (250 pg/mL) tartalmaz, szobahőmérsékleten 2 órán át inkubáljuk. Ezután SN17 Escherichia coli - amely trícium jelölt olajsavat épített be a sejtbe korábban - autoklávozott preparátumát (25 pL, 50.000-100.000 beütésszám (cpm)) adjuk a reakcióelegyhez és a kapott keveréket 37 °C-on 30 percig inkubáljuk. A reakcióelegyet ezután jégre helyezzük és a reakciót 4 N sósav (25 pL) hozzáadásával leállítjuk. A reakció leállítása után 25 pL marha szérum albumint (40 mg/mL) adunk az elegyhez és összekeverjük, majd a kapott keveréket 30 percig jégen tartjuk.

Ezután 15.000-es fordulatszámmal (rpm) 2 percig centrifugáljuk és a felülúszó radioaktivitását megmérjük. Az így kapott radioaktivitás értékből kivonjuk a negatív kontroll radioaktivitását (olyan minta radioaktivitása, amely nem tartalmazott sem foszfolipáz-A2-t, sem antitestet) , és a kapott értékkel jellemezzük a foszfolipáz-A2 aktivitását. Az antitest gátló hatásának mértékét a következő számítás segítségével adjuk meg, alapként a pozitív kontroll (olyan minta foszfolipáz-A2 aktivitása, amely az enzimet tartalmazza, de antitestet nem tartalmaz) foszfolipáz-A2 aktivitását tekintve:

Foszfolipáz-A2-vel szembeni gátló hatás foka = {1 - (foszfolipáz-A2 aktivitása, amelyet a tenyésztáptalaj felülúszójával vagy tisztított antitesttel inkubálunk)/(a pozitív kontroll foszfolipáz-A2 aktivitása)} x 100

A trícium-jelölt olajsavat felvett E. coli autoklávozott preparátumot, amit a foszfolipáz-A2 aktivitás vizsgálata során foszfolipáz-A2 szubsztrátként alkalmaztunk, a Tokkai H5-192167 számú japán szabadalmi irat 8. oldalán leírt eljárás szerint készítettük el.

2. példa

Monoklonális antitest kifejlesztése és előállítása

A) Monoklonális antitest kifejlesztése

0,5 mL 2,6,10,14-tetrametil-pentadekánt (pristan, Sigma) injektáltunk BALB/c törzsbe tartozó egér hasüregébe (az egér 5-6 hetes korában) és 14-21 nappal később 0,5 mL fiziológiás sóoldatban szuszpendált hibridóma sejtet (5 x 10⁶) injektáltunk a hasüregbe. 10-20 nappal később összegyűjtöttük a termelődött hasűri folyadékot a feláldozott és ventrotomizált egérből. A monoklonális antitestet tartalmazó hasűri folyadékot egerenként 5-10 mL-es mennyiségben nyertük.

B) Monoklonális antitest előállítása

A hasűri folyadék centrifugálása után, aminek során eltávolítottuk az oldhatatlan anyagokat, azonos térfogatú telített ammónium-szulfát oldatot adtunk hozzá és a keveréket jégen 1 órán át kevertettük. A kicsapódott anyagot centrifugálással kinyertük, kismennyiségű 0,1 M-os foszfát pufferben (pH 7,4) feloldottuk, amely puffer 0,9 % NaCl-t tartalmazott, és 100-szoros térfogatú azonos pufferrel szemben dializáltuk 4 °C-on éjszakán át, hogy nyers gammaglobulin frakciót kapjunk. Ebből a frakcióból IgG-t tisztítottunk MAPS-II egér monoklonális antitest tisztító reagens készlet alkalmazásával (BioRad Laboratories).

Azaz, a gamma-globulin frakcióhoz egyenlő térfogatú kötő puffért adtunk és összekevertük. A kapott keveréket oszlopra vittük, amely Protein A - Sepharose CL4B-vel volt töltve (Pharmacia) és amelyet ugyanezzel a kötő pufferrel teljes mértékben egyensúlyba hoztunk (a gélágy térfogata 20 « · · · · mL) , majd az oszlopot 3 térfogat kötő pufferrel mostuk. Az IgG-t körülbelül 3 oszloptérfogat elúciós pufferrel mostuk le az oszlopról - a reagens készlethez adott elúciós puffért alkalmazva. Az így eluált IgG-t dializáltuk, például 20 mM-os Trisz-pufférőit (pH 7,4) fiziológiás sóoldattal szemben, hogy megkapjuk az antitest preparátumot. Általában 1 mL hasűri folyadékból 5-10 mg IgG-t nyertünk ki.

3. példa

Antitest alosztály meghatározása

A hibridóma tenyésztáptalaj felülúszójába kerülő antitestek IgG alosztályát egér monoklonális antitest tipizáló reagens készlet segítségével vizsgáltuk (Amersham). Az ELISA alapú eljárás alkalmazásával a 12H5, 1.4 és 10.1 monoklonális antitestek alosztályait - sorrendben megfeleltetve - IgG2a, IgG2a és IgGl alosztályokként határoztuk meg.

4. példa

Antitestek keresztreakciója

A) II. típusú patkány eredetű foszfolipáz-A2 tisztítása .

Patkány eredetű, vérlemezkében gazdag plazmához (platelet-rich plasma, PRP) egyötöd térfogat ACD oldatot - 2 % (vegyes %) glükóz oldat, amely 65 mM citromsavat és mM nátrium-citrátot tartalmaz - adtunk és a keveréket

2500 g-vel 10 percig centrifugáltuk. Az így leülepített vérlemezkéhez ACD/F10 táptalaj 1:5 arányú keverékét adtuk (F10, Gibco), hogy a szuszpenzió 2 x 10⁹ vérlemezkét tar33

talmazzon milliliterenként, és a kapott szuszpenziót 2500 g-vel 10 percig centrifugáltuk. Az így leülepített vérlemezkéket F10 táptalajban újra szuszpendáltuk, hogy a szuszpenzió sűrűsége 2 χ 10⁹ vérlemezke legyen milliliterenként, majd a kapott szuszpenzióhoz egymást követően 1 M kalcium-kloridot és trombint (2.500 egység/mL) adtunk, hogy végső koncentrációjuk - sorrendben megfeleltetve - 2 mM és 2,5 egység legyen.

A kapott keveréket 37 °C-on 5 percig inkubáltuk, 3000 g-vel 15 percig centrifugáltuk a felülúszó kinyerésére (trombinnal stimulált patkány vérlemezke felülúszó), amelyet a későbbiekben használtunk fel. A foszfolipáz-A2-t a Tokkai H5-192167 számú japán szabadalmi irat 12. oldalán közölt eljárás kismértékű módosításával tisztítottuk. Azaz, a trombin-stimulált patkány vérlemezke felülúszóját szulfátéit cellulofine (Seikagaku-Kogyo) oszlopon engedtük keresztül (20 mL oszloptérfogat, Econocolumn, BioRad), amelyet ezt megelőzően 0,1 M acetát pufferrel (pH 6,0) hoztuk egyensúlyba. Az oszlopot alaposan mostuk 200 mL mosópufferrel (0,1 M acetát puffer, amely 0,5 M NaCl-t tartalmaz, pH 6,0), és utána 30 mL eluáló pufferrel (0,1 M acetát puffer, amely 1,5 M NaCl-t tartalmaz, pH 6,0) eluáltuk, hogy megkapjuk a szulfátéit cellulofine-kötő frakciót, amelyet utána HPLC segítségével tovább frakcionáltunk.

A HPLC elválasztást LC-4A HPLC rendszeren (Shimazu

Seisaku-sho) végeztük, CAPCELL PÁK C18 oszlopot (4,6 mm belső átmérő x 25 cm, Shiseido) használva, végig 1 mL/perc áramlási sebességet alkalmazva. A szulfátéit cellulofine-

kötő frakciót keresztülengedtük az oszlopon, amelyet utána 60 percig 0,1 % trifluor-ecetsavas oldat átáramoltatásával mostunk. A foszfolipáz-A2-t ezután acetonitril lineáris gradiensével eluáltuk, 0-50 % tartományban, 0, 1 % trifluorecetsav jelenlétében. A foszfolipáz-A2-t, amely 30 % acetonitril körül, egy csúcsban eluálódott, visszanyertük.

SDS-poliakrilamid gél elektroforézissel az így viszszanyert frakció ezüstfestéssel egyetlen fehérjesávot adott, ezzel megerősítve, hogy ez a frakció patkány eredetű II. típusú foszfolipáz-A2-t tartalmaz.

Β) II. típusú humán, majom, kutya, nyúl, macska és egér vérlemezke eredetű foszfolipáz-A2 előállítása.

Különböző állatfajokból származó, vérlemezke eredetű II. típusú foszfolipáz-A2-t tisztítottunk a humán vérlemezkék szonikátuma (ultrahangos roncsolással feltárt sejtszuszpenzió) előállítására a Journal of Biological Chemistry folyóiratban leírt eljárás szerint [J. Bioi. Chem. 264(10) 5768 (1989)].

Emberből, rhesus majomból, kutyából, nyúlból, egérből és macskából nyert PRP-hez EDTA-t adtunk 2 mM-os végső koncentrációig, és a keveréket 2500 g-vel 10 percig centrifugáltuk a sejtek kinyerésére. A sejteket 120 mM NaCl-ot és 2 mM EDTA-t tartalmazó 30 mM-os Trisz-HCl pufferben (pH 7,4) szuszpendáltuk és ismét 2500 g-vel 10 percig centrifugáltuk. Ezt a procedúrát kétszer megismételtük és az így kapott sejteket 120 mM NaCl-ot és 2 mM EDTA-t tartalmazó 30 mM-os Trisz-HCl pufferben (pH 7,4) szuszpendáltuk 2 x 10⁹sejt/mL koncentrációban majd folyékony nitrogénben lefagyasztottuk .

A lefagyasztott sejtszuszpenziót felengedtük, azonos térfogatú 0,36 N kénsavval összekevertük és a keveréket BIOMC 7040 ULTRA SONIC PROCESSOR-t használva szonikáltuk (Seiko; kimenet 80, 15 sec, 6-szor egymás után). Az így kapott sejt szonikátumot 60 percig jégen hagytuk és utána 4 °C-on 10.000 g-vel 30 percig centrifugáltuk a felülúszó kinyerésére. A csapadékot a felülúszó egyharmadának megfelelő térfogatú 0,18 N kénsavban újra felszuszpendáltuk, 60 percig jégen hagytuk és utána 4 °C-on 10.000 g-vel 30 percig centrifugáltuk a felülúszó kinyerésére. Mindkét felülúszót egyesítettük és éjszakán át dializáltuk 200 mM NaCl-ot tartalmazó 50 mM-os acetát pufferrel (pH 4,5) szemben. A dializált szonikátumot 4 °C-on 15.000 g-vel 40 percig centrifugáltuk a felülúszó kinyerésére, amit mint vérlemezke eredetű foszfolipáz-A2-t használtunk fel.

C) ELISA reaktivitás.

A 2B) példa szerint előállított különböző monoklonális antitestek tisztított preparátumait a következő kísérletnek vetettük alá:

Az IgG preparátum koncentrációját BSA-TBS-Tween segítségével 10 gg/mL-re állítottuk be, és háromszoros sorozat hígítást készítettünk belőle. Az ELISA vizsgálatot az ID) példa szerint ezzel a sorozat hígítással végeztük el, hogy megvizsgáljuk a preparátum keresztreakcióját rekombináns humán II. típusú foszfolipáz-A2-vel és a patkány eredetű II. típusú foszfolipáz-A2-vel szemben. A patkány eredetű II. típusú foszfolipáz-A2-vel végzett ELISA vizsgálatnál az ID) példában szereplő rekombináns humán II.

• · · · · ·« · · típusú főszfolipáz-A2-t patkány eredetű II. típusú főszfölipáz-A2-vel helyettesítettük.

Az eredményeket az 1. és 2. ábra mutatja be, az antitest koncentrációját az x-tengelyen és a 450 nm-nél mért fényelnyelést az y-tengelyen feltüntetve. Patkány eredetű foszfolipáz-A2-vel szembeni keresztreakciót a 12H5 és 1.4 antitestekkel figyeltünk meg de nem tapasztaltuk a 10.1 antitesttel .

D) Különböző állatokból származó foszfolipáz-A2-t gátló aktivitás.

A 2B) példa szerint előállított különböző monoklonális antitestek tisztított preparátumait a következő kísérleteknek vetettük alá:

1) Rekombináns humán eredetű II. típusú foszfolipázA2-t gátló aktivitás.

Az 1A) aktuális példában leírt rekombináns humán II. típusú foszfolipáz-A2-t alkalmazva, az 1E) példa szerint meghatároztuk az antitestek foszfolipáz-A2-vel szembeni gátló aktivitását. A 3. ábrán bemutatjuk az egyes antitestek rekombináns humán II. típusú foszfolipáz-A2-vel szembeni gátlási fokát, a foszfolipáz-A2-vel előinkubált antitest minták koncentrációját az x-tengelyen ábrázolva. A 12H5 és 1.4 antitestek csaknem teljesen gátolták a foszfolipáz-A2 aktivitást 10 pg/mL koncentrációban. Másrészről a 10.1 antitest gátlási foka 80 %-ot ért el 3 pg/mL koncentrációnál.

2) Patkány eredetű II. típusú foszfolipáz-A2-t gátló aktivitás.

A patkány eredetű II. típusú foszfolipáz-A2-t gátló aktivitást úgy teszteltük, hogy az 1E) példában szereplő ·· ··· · rekombináns humán II. típusú foszfolipáz-A2-t a 4A) aktuális példa szerinti patkány eredetű II. típusú foszfolipázA2 tisztított preparátumával (0,5 ng) helyettesítettük. A

4. ábrán bemutatjuk az egyes antitestek patkány eredetű II. típusú foszfolipáz-A2-vel szembeni gátlási fokát, a foszfolipáz-A2 mintával előinkubált antitestek koncentrációit az x-tengelyen ábrázolva. A 12H5 és 1.4 antitestek patkány eredetű II. típusú foszfolipáz-A2-t is gátoltak, és a foszfolipáz-A2 aktivitás 50 %-os gátlásához szükséges antitest koncentráció a 12H5 antitesttel 5 pg/mL volt.

3) Humán, majom, kutya, nyúl, macska és egér vérlemezkéből származó II. típusú foszfolipáz-A2-t gátló aktivitás.

A főszfolipáz-A2 elleni gátló aktivitást úgy teszteltük, hogy az 1E) aktuális példában szereplő rekombináns humán II. típusú foszfolipáz-A2-t az egyes vérlemezke szonikátumok előre meghatározott mennyiségével helyettesítettük (20-40 pL). Az 5-7. ábrákon bemutatjuk az egyes antitestek foszfolipáz-A2-vel szembeni gátlási fokát, a vérlemezke szonikátummal előinkubált antitestek koncentrációit az x-tengelyen ábrázolva. A 12H5, 1.4 és 10.1 antitestek hasonló mértékben gátolták a humán vérlemezkéből előállított foszfolipáz-A2-t mint a rekombináns humán II. típusú foszfolipáz-A2-t, ezzel jelezve, hogy a találmány szerinti rekombináns humán II. típusú foszfolipáz-A2 elleni antitest rendelkezik a természetes humán II. típusú foszfolipáz-A2-t gátló aktivitással. Másrészről, a találmány szerinti antitestek gátolták a rhesus majom és az egér vérlemezkéből előállított foszfolipáz-A2-t, részlegesen gá··· * tolták a kutya vérlemezkéből izoláltat, de nem gátolták a nyúl és a macska vérlemezkéből származó foszfolipáz-A2-t.

5. példa

Antitest aktivitás a sejthez kötött II. típusú foszfolipáz-A2 felszabadítására

Hepatocitát tenyésztettünk (BRL-3A, Dainippon Pharmaceutical-tól beszerezve) 96-lyukas lapos fenekű plate-ben (Falcon Co.) F12K/10 % FCS táptalajt használva (F12K, Dainihon Pharmaceutical Co.). A sejteket összeérésig tenyésztettük, majd a tenyésztő táptalajt eltávolítottuk, és ¹²⁵I jelölt rekombináns humán II. típusú foszfolipáz-A2-t (4 ng) tartalmazó 50 gL F12K/10 % FCS táptalajt adtunk a lyukakban levő sejtekhez, majd 37 °C-on inkubáltuk, hogy a foszfolipáz-A2 a sejtekhez hozzákössön. Egy óra múlva tisztított antitest preparátumot tartalmazó F12K/10 % FCS táptalajt, vagy csak F12K/10 % FCS táptalajt (50-50 gL) adtunk a lyukakhoz és újabb két órán keresztül inkubáltuk. Az inkubálás után a tenyésztő táptalajt visszanyertük és megmértük a radioaktivitását. Ezzel egyidőben a reakció rendszerhez adott ⁱ²⁵I jelölt foszfolipáz-A2 (4 ng) radioaktivitását külön lemértük.

Az antitest aktivitását - a foszfolipáz-A2 sejtből való felszabadítására - százalékosan adjuk meg; azaz az antitest különböző koncentrációival inkubált táptalaj radioaktivitását osztjuk a hozzáadott foszfolipáz-A2 radioaktivitásával, amelyből kivonjuk a táptalaj radioaktivitását, amelyhez csak F12K/10 % FCS táptalajt adtunk a foszfolipázA2 - sejt kötési reakció után és így inkubáltuk.

·*·· _ O Q _ · · ♦··· · · «

J 27 »···.·«

A rekombináns humán II. típusú foszfolipáz-A2-t a következő eljárás szerint jelöltük ¹²⁵I-ös izotóppal: 30 pg rekombináns humán II. típusú foszfolipáz-A2-t tartalmazó 100 μΐ, 100 mM-os Trisz-HCl puffért (pH 7,4) tettünk IODOGEN-nel (10 μg, Pierce) bevont üveg kémcsőbe és ehhez 6 pL Na¹²⁵I oldatot (100 mCi/mL, ICN) adtunk, majd a keveréket 20 percig hagytuk állni szobahőmérsékleten. A reakciót a reakcióelegy kémcsőből való eltávolításával állítottuk le, és az elreagálatlan Na¹²⁵I-ot gélszűréssel távolítottuk el.

A foszfolipáz-A2-t kötött sejteket különböző koncentrációjú tisztított antitest preparátummal inkubáltuk és az inkubációs táptalaj radioaktivitását megmértük. Az egyes antitestek aktivitását a sejthez kötött foszfolipáz-A2 felszabadítására a 8. ábrán mutatjuk be, ahol a táptalajhoz adott antitest koncentrációját az x-tengelyen ábrázoltuk. A kontrollként használt egér antitest egyáltalán nem szabadított fel foszfolipáz-A2-t a sejtből, míg a 12H5, 10.1 és

1.4 antitestek koncentráció függően felszabadították ezt az enzimet a sejtből.

6. példa cDNS klónozása az antitest H- és L-láncainak változó régiójában

A cDNS klónozásához szükséges hírvivő RNS-t (mRNS) körülbelül 10⁷ hibridóma sejtből készítettünk QuickPrep Micro mRNS-tisztító reagens készletet alkalmazva (Pharmacia). Azaz, a sejteket az extrakciós pufferben •· ··»· szuszpendáltuk, majd a mRNS-t az oligo(dT)-cellulóz alkalmazásával izoláltuk.

Az 1.4 antitest H- és L-láncai variábilis régiójának megfelelő cDNS-t 5' RACE System reagens készlet (Gibco) alkalmazásával készítettük el a 9. ábrán feltüntetett eljárás szerint. Azaz, a konstans régió génjével (C) hibridizáló primereket felhasználva és 1 pg hírvivő RNS-t templátként alkalmazva, reverz transzkriptáz segítségével (SUPER SCRIPT II Reverse Transcriptase) egyszálú cDNS-t szintetizáltunk. Az alkalmazott primer pár a következő volt: GSP1L, azaz 5'GGCACCTCCAGATGTTAACTGC-3' (21. azonosítási szám szerinti szekvencia) az L-lánchoz és GSP1H, azaz 5'GGAA (AG) TA (AGC) CCCTTGACCAGGC-3' (22. azonosítási szám szerinti szekvencia) a H-lánchoz. A zárójelben levő szekvenciák a GSPIH-primerben a degenerált bázisoknak felelnek meg. A templátként szolgáló mRNS-t ezután RNáz H-val emésztettük és az egyszálú cDNS-t GLASS MAX Spin Cartridge segítségével tisztítottuk. Poli(dC) farkat kapcsoltunk az egyszálú cDNS 3'-végére dCTP és terminális deoxinukleotidtranszferáz segítségével. A H- és L-láncok variábilis régió génjeit (V) a poli(dC) farokkal hibridizáló rögzítő primer

5'-CUACUACUACUAGGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG-3' (23. azonosítási szám szerinti szekvencia) - és a konstans régió génjével (C) hibridizáló primer, az L-lánc esetében GSP2L, azaz 5'-TATAGAGCTCAAGCTTGGATGGTGGGAAGAT GGATACAG

TTGGTGC-3' (24. azonosítási szám szerinti szekvencia) segítségével; a H-lánc esetében a GSP2H, azaz 5'-TATAGAGC

TCAAGCTTCCAGTGGATAGAC(CAT)GATGGGG(GC)TGT(TC)GTTTTGGC-3' primer és LA Tag segítségével (Takara Shuzo) amplifikáltuk.

····· ·· ·· ···· • · · · · · « • · · · · · · • ······ · · · · • · · ·· ··· ··

A zárójelben levő szekvenciák a GSP2H primerben a degenerált bázisoknak felelnek meg. Ezek a PCR termékek 1,2 %-os agaróz gél elektroforézis során mind a H- mind az L-láncok esetén egyetlen sávot adtak, amely körülbelül 550-570 bázispár nagyságnak felel meg.

Ugyanakkor a 10.1 antitest H- és L-láncai variábilis régióinak megfelelő cDNS-t a 12. ábrán bemutatott eljárás szerint készítettük el, Marathon cDNS amplifikációs reagens készletet alkalmazva (Clontec). Azaz, az egyszálú cDNS-t a Marathon cDNS-szintézis primer és reverz transzkriptáz segítségével szintetizáltuk, templátként 1 pg hírvivő RNS-t alkalmazva. A reakcióelegyet ez után RNáz H-val, DNS Ipolimerázzal és DNS-ligázzal kezeltük a kettős-szálú cDNSszintetizálásához. Ezután ezt a reakcióelegyet T4 DNSpolimerázzal reagáltattuk, hogy a kettős-szálú cDNS-végeket tompa végekké alakítsuk. A Marathon cDNS-adaptert a kettősszálú cDNS-hez T4 DNS-ligáz segítségével kapcsoltuk hozzá. A H- és L-láncok variábilis régió génjeit (V), adapter primer segítségével amplifikáltuk, amely az adapterrel, és az L-lánc esetében a GSP2L-primerrel, míg a H-lánc esetében a GSP2H-primerrel hibridizál, LA Taq polimerázt alkalmazva Takara Shuzo) . Ezek a PCR termékek 1,2 %-os agaróz gél elektroforézis során mind a H-, mind az L-láncok esetén egyetlen sávot adtak, amely körülbelül 550-570 bázispár nagyságnak felel meg.

Szekvenálás céljára a PCR segítségével amplifikált fragmenseket TA klónozó reagens készlet (Invitrogen) segítségével pCR™II vektorba illesztettük. A fragmenset tartalmazó pCR™II plazmiddal kompetens JM109 Escherichia coli • · · · · • ·· · • · «· · ·· · · sejteket (Takara Shuzo) transzformáltunk. A lemezen kialakult telepeket és pCR^mII-vel hibridizáló UD 5'-prímért, azaz 5'-ACCGAGCTCGGATCCACTAG-3' (26. azonosítási szám szerinti szekvencia) felhasználva, valamint DU 3'-prímért, azaz 5'-ATGCATGCTCGAGCGGCCGCC-3' (27. azonosítási szám szerinti szekvencia) felhasználva Taq polimeráz segítségével (Takara Shuzo) telep-PCR-t hajtottunk végre. Az amplifikált DNS-fragmenseket 1,2 %-os agaróz gél elektroforézissel analizáltuk és a 600-620 bázispár nagyságú amplifikált fragmenst tartalmazó telepekből három kiónt választottunk ki az 1.4 antitest L-láncához és négy kiónt választottunk ki az antitest H-láncához, míg a 10.1 antitest L-láncához két kiónt, a H-láncához négy kiónt választottunk ki. Mindegyik E. coli kiónt növesztettük és QIAwell-8 plazmid tisztító reagens készlet segítségével (Quiagen) plazmid DNS-t preparáltunk belőlük.

Az egyes kiónokból preparált plazmid DNS-t, valamint UD-primert, DU-primert, az L-lánchoz GSP2L-primert, a Hlánchoz GSP2H-primert alkalmazva DNS-szekvenáló reagens készlet (Perkin-Elmer) segítségével elvégeztük a szekvenálási reakciót és 373DNS Szekvenátorral (ABI) analizáltuk a kiónokat. Sorrendben megfeleltetve, az 1.4 antitest három L-lánc specifikus és négy H-lánc specifikus kiónja, valamint két L-lánc specifikus és négy H-lánc specifikus klón ugyanazt a szekvenciát tartalmazta. Sorrendben megfeleltetve, a 10. ábra (1. és 2. azonosítási szám szerinti szekvenciák) az 1.4 antitest L-láncára vonatkozóan;

és a 11. ábra (3. és 4. azonosítási szám szerinti szekvenciák) ugyanannak az antitestnek a H-láncára vonatkozóan mu43 tatja be a variábilis régió cDNS-szekvenciáját, valamint annak vélelmezett aminosav szekvenciáját. A 13. ábra (5. és 6. azonosítási szám szerinti szekvenciák) a 10.1 antitest

L-láncára vonatkozóan; és a 14. ábra (7. és 8. azonosítási szám szerinti szekvenciák) ugyanannak az antitestnek a Hláncára vonatkozóan mutatja be a variábilis régió cDNSszekvenciáját, valamint annak vélelmezett aminosav szekvenciáját. Mindegyik ábrán aláhúztuk a CDR-régiónak megfelelő vélelmezett szekvenciát. (Sorrendben megfeleltetve, az 1.4 antitest L-láncának, az 1.4 antitest H-láncának, a 10.1 antitest L-láncának, és a 10.1 antitest H-láncának vélelmezett CDR-szekvenciáit a 9-11. azonosítási szám szerinti szekvenciák, a 12-14. azonosítási szám szerinti szekvenciák, a 15-17. azonosítási szám szerinti szekvenciák, és a 18-20. azonosítási szám szerinti szekvenciák mutatják be.)

7. példa

Aminosav szekvencia homológja keresése humán antitest és az 1.4 és 10.1 antitestek H- és L-láncainak változó régió j ában

A 6. példa szerint nyert 1.4 és 10.1 antitestek H- és L-láncainak variábilis régiói aminosav szekvenciájával nagyfokú homológiát mutató humán antitestet kerestünk a GenBank, EMBL, SWISS-PROT, PÍR és PRF adatbázisokban. A homológia keresést BLASTP 1.4.8MP program segítségével végeztük [Altschul és mtsai.: J. Mól. Bioi. 215 403 (1990)]. A keresés eredményeként azt találtuk, hogy az 1.4 antitest például nagymértékben homológ a Pag-1 antitesttel [HughesJones és mtsai.: Biochem. J. 268 135 (1990)] és a WEA anti• · · · · • · · · testtel [Goni és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 4837 (1983)] . Ugyanakkor azt találtuk, hogy a 10.1 antitest például nagymértékben homológ az ITH5-2 antitesttel (Chin és mtsai.: Immunoi. Letter 44 25 (1995)] és az ITC48 antitesttel [Ohlin és mtsai.: Mól. Immunoi. 31 983 (1994)].

Ipari alkalmazhatóság

A találmány szerinti monoklonális antitest és annak részét tartalmazó fehérje reagál a humán II. típusú foszfolipáz-A2-vel és erős gátló hatást fejt ki az enzimre. Mivel az antitest és a fehérje keresztreagál a majom és/vagy egér eredetű, vérlemezkéből Izolált II. típusú foszfolipáz-A2-vel, és bevihető ezekbe a kísérleti állatokba, előnyösen alkalmazható majommal és/vagy egérrel végzett állatkísérletben a humán farmakológiai kipróbálást megelőzően. Hozzátehetjük még, hogy mivel a találmány szerinti monoklonális antitest, és annak részét tartalmazó fehérje képes a sejthez kötött II. típusú foszfolipáz-A2 felszabadítására, ezek speciálisan gátolják a II. típusú foszfolipáz-A2-t és feltételezhetően nem indukálnak mellékhatásokat, amelyeket a komplement és/vagy effektor sejtek támadása okozna.

A találmány szerinti monoklonális antitest és annak részét tartalmazó fehérje gyógyszerként alkalmazható különböző betegségekben, amelyekről úgy tudjuk, hogy humán II. típusú foszfolipáz-A2 okozza, vagy annak tüneteit súlyosbítja (beleértve a szívinfarktust, agyi infarktust, akut vese-elégtelenséget, allergiás megbetegedéseket, mint például az asztma, krónikus reumatizmust, oszteo-arthritiszt, ····· ·· ·· ···· • · · · · · · • · · · · · · • ··«··· · · · · • · · ·· ··· ·· szeptikus sokkot, pankreatitiszt, pszoriázist, több szervre kiterjedő leállást (multiple organ failure, MOF), akut légzésbénulási szindrómát (acute respiratory distress syndrome, ARDS), Crohn-betegséget és fekélyes kolitiszt, uveitiszt, újszülöttek légzésbénulási szindrómáját (respiratory distress syndrome of the newborn, RDS) , bronchopulmonáris diszpláziát (BPD), stb.).

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Monoklonális antitest vagy annak aktív részletét tartalmazó fehérje, amely a humán II. típusú foszfolipázA2, valamint a majomból és/vagy egérből származó II. típusú foszfolipáz-A2 aktivitását gátló hatású.
2. Monoklonális antitest vagy annak aktív részletét tartalmazó fehérje, amely a sejtmembránhoz kötődő II. típusú foszfolipáz-A2-t képes felszabadítani.
3. A 2. igénypont szerinti monoklonális antitest vagy fehérje, amely humán eredetű foszfolipáz-A2-t gátló hatású.
4. Monoklonális antitest vagy annak aktív részletét tartalmazó fehérje, amely a humán II. típusú foszfolipáz-A2 és a majomból és/vagy egérből származó II. típusú foszfolipáz-A2 aktivitását gátló hatású, és a sejtmembránhoz kötődő II. típusú foszfolipáz-A2-t képes felszabadítani .
5. A 12H5 (FERM BP-5300), 1.4 (FERM BP-5297) és 10.1 (FERM BP-5298) hibridómák bármelyike által termelt monoklonális antitest vagy annak egy részét tartalmazó fehérje, vagy olyan monoklonális antitest vagy annak aktív részletét tartalmazó fehérje, melynek aktivitása a II. típusú foszfolipáz-A2-vel szemben egyenértékű az említett hibridómák által termelt monoklonális antitestével vagy fehér j éével.
6. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti monoklonális antitest vagy fehérje, amely a 2., a 4., a 6 vagy 8. azonosí66 tási számú szekvenciák bármelyikének, vagy ezen szekvenciákban található egy vagy több aminosav szubsztitúciójával, deléciójával vagy beillesztésével kapott módosított szekvenciának megfelelő szekvenciájú fehérjét tartalmaz.
7. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti monoklonális antitest vagy fehérje, amely a 9-20. azonosítási szám szerinti szekvenciák bármelyikének vagy ezen szekvenciákban található egy vagy több aminosav szubsztitúciójával, deléciójával vagy beillesztésével kapott módosított szekvenciának megfelelő szekvenciájú fehérjét tartalmaz.
8. Sejt, amely 1-7. igénypontok bármelyike szerinti monoklonális antitestet vagy fehérjét termel.
9. A 8. igénypont szerinti sejt, amely hibridómaeredetű.
10. A 8. igénypont szerinti sejt, amely rekombináns DNS-sel transzformált sejt.
11. Eljárás az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti monoklonális antitest vagy fehérje előállítására, azzal jellemezve, hogy 8. igénypont szerinti sejteket tenyésztünk és a monoklonális antitestet vagy fehérjét a táptalaj felülúszójából kinyerjük.
12. DNS, amely 1-7. igénypontok bármelyike szerinti monoklonális antitestet vagy fehérjét kódol.
13. A 12. igénypont szerinti DNS, melynek bázissorrendje tartalmazza az 1., a 3., az 5 vagy a 7. azonosítási szám szerinti szekvenciák bármelyikét, vagy az ezen szekvenciákban található egy vagy több aminosav szubsztitúciójával, deléciójával vagy beillesztésével kapott módosított szekvenciák bármelyikét.
14. Rekombináns vektor, amely 12. vagy 13. igénypont szerinti DNS-t tartalmaz.
15. Gyógyászati készítmény, amely 1-7. igénypontok bármelyike szerinti monoklonális antitestet vagy fehérjét és farmakológiailag elfogadható hordozóanyagot tartalmaz.
16. II. típusú foszfolipáz-A2 inhibitor, amely 1-7. igénypontok bármelyike szerinti monoklonális antitestet vagy fehérjét tartalmaz.