JP7328762B2 - 抗ＣＤ１１ｄ抗体およびその使用 - Google Patents
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Description
本発明は医薬分野に関する。詳細には、本発明は、ＣＤ１１ｄに対する抗体、該ＣＤ１１ｄ抗体を含む組成物、ならびに脊髄損傷（ＳＣＩ）、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）などの中枢神経（ＣＮＳ）外傷およびＣＮＳ外傷後の全身性炎症反応（ＳＩＲＳ）を治療するための、該ＣＤ１１ｄ抗体の使用方法に関する。
β２インテグリン分子群は、αサブユニットと、αサブユニットと非共有結合したβサブユニットとを含む膜貫通性ヘテロダイマー分子群の一種である。この膜結合性分子群は、細胞接着に積極的に関与することが報告されている。インテグリンサブユニットα－ｄ（αｄ）とも称されるＣＤ１１ｄは、ヘテロダイマーであるβ２インテグリンタンパク質ＣＤ１１ｄ／ＣＤ１８のαサブユニットである。ＣＤ１１ｄは、好中球、単球、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞、Ｂ細胞の一部、Ｔ細胞の一部を含む様々な免疫細胞で発現していることが報告されている。ＣＤ１１ｄの発現、制御や分布について完全には理解されていないが、ＣＤ１１ｄが免疫反応や炎症反応において何らかの役割を担っていることが報告されている。
中枢神経（ＣＮＳ）損傷は、例えば、ＣＮＳ外傷などの、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）や脊髄損傷（ＳＣＩ）といった様々な病態を含む疾患群であり、世界中で大きな健康問題となっている。例えば、毎年、米国だけでも約１７０万人の一般人がＴＢＩを受傷しており（米国疾病対策センター）、約１２，０００人がＳＣＩを受傷している（全米脊髄損傷統計センター）と推定されている。ＴＢＩとＳＣＩの共通点としては、受傷後に典型的に衰弱症状が現れ、そしてその状態が、多くの場合、重篤かつ長期にわたることが挙げられる。ＴＢＩとＳＣＩのいずれにおいても、多くの場合、初期外傷後に炎症が起こり、この炎症が神経細胞やグリアを含む周囲組織に大きなダメージを及ぼしうる。現在、ＴＢＩとＳＣＩに対する治療選択肢として、外科的処置、物理的リハビリテーションや認知リハビリテーションに加えて、鎮痛薬、抗痙攣薬や鎮静薬が挙げられる。
また、外傷性ＣＮＳ損傷後に、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）を発症する場合がある。ＳＩＲＳは、炎症が体の大部分、さらには全身に波及している状態である。ＳＩＲＳは、炎症細胞が体循環から臓器に侵入するという特徴を有しており、臓器障害につながる可能性がある。動物モデルにおける研究から、ＴＢＩ後に脳から分泌されたサイトカインによりＳＩＲＳが誘発される可能性があること、また、ＳＩＲＳにより様々な副次的な臓器機能障害が起こり、その影響が神経系、精神系、心血管系、肺系や代謝系へと及ぶことが示されている。現在、ＳＩＲＳの症状を治療する方法としては、抗生物質およびステロイドが挙げられる。
ＣＤ１１ｄに対する抗体は公知である。例えば、米国特許第６，６２０，９１５号および米国特許公開第２００７／００９２５１５（Ａ１）号には、抗ＣＤ１１ｄ抗体、ならびにＩ型糖尿病、アテローム性動脈硬化症、多発性硬化症、喘息、乾癬、肺炎症、関節リウマチ、急性呼吸窮迫症、慢性疼痛およびＣＮＳ損傷を含む多くの疾患の治療への適用可能性を有する該抗体の使用が開示されている。しかし、これまで、治療上の使用において承認されたＣＤ１１ｄ標的抗体は存在せず、ＣＮＳ外傷を患う患者の治療選択肢はいまだ限られており、ここに満たされていないニーズがある。したがって、別のＣＤ１１ｄ抗体が求められている。具体的には、ＣＤ１１ｄに特異的に結合して炎症反応を抑制するとともに、ＣＮＳ外傷後の神経学的転帰を改善することができる別のＣＤ１１ｄ抗体が求められている。
今般、抗炎症活性を示す新規のＣＤ１１ｄ抗体の開発に成功した。
本発明の一態様において、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含むＣＤ１１ｄ抗体であって、前記ＬＣＶＲが、相補性決定領域（ＣＤＲ）であるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＶＲが、相補性決定領域（ＣＤＲ）であるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含み、前記ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列が、配列番号１３で示され、前記ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番号１４で示され、前記ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号１５で示され、前記ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列が、配列番号１６で示され、前記ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番号１７で示され、前記ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号１８で示されることを特徴とする抗体が提供される。
別の一態様において、ラットＣＤ１１ｄに対して約０．０５～５．０ｎｍの範囲の結合親和性を示し、ヒトＣＤ１１ｄと結合することができるヒト化抗体が提供される。
本発明におけるこれらの態様およびその他の態様について、本明細書において以下の図面を参照しながら説明する。
本発明は、ヒトＣＤ１１ｄに結合して中和する抗体であって、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、前記ＬＣＶＲが、相補性決定領域（ＣＤＲ）であるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＶＲが、相補性決定領域（ＣＤＲ）であるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含み、前記ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列が、配列番号１３で示され、前記ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番号１４で示され、前記ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号１５で示され、前記ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列が、配列番号１６で示され、前記ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番号１７で示され、前記ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号１８で示されることを特徴とする抗体を提供する。
この点に関して、配列番号１３で示されるアミノ酸配列の第４位のＸａａは、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、ＡｓｐまたはＧｌｕなどの電荷を有する非環式極性アミノ酸であってもよく、配列番号１４で示されるアミノ酸配列の第５位のＸａａは、ＡｓｐもしくはＧｌｕなどの荷電性アミノ酸、ＳｅｒもしくはＴｈｒなどの極性アミノ酸、またはＧｌｙ、Ａｌａ、ＶａｌもしくはＬｅｕなどの非極性アミノ酸を含む非環式アミノ酸であってもよく、配列番号１５で示されるアミノ酸配列の第６位のＸａａは、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕもしくはＭｅｔなどの中性かつ疎水性の、環式または非環式のアミノ酸であってもよく、配列番号１６で示されるアミノ酸配列の第８位のＸａａは、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、ＣｙｓもしくはＧｌｙ、Ａｌａ、ＶａｌもしくはＩｌｅなどの中性の、極性または非極性のアミノ酸であってもよく、配列番号１７で示されるアミノ酸配列の第６位のＸａａは、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、ＳｅｒまたはＣｙｓなどの非環式かつ中性の極性アミノ酸であってもよく、配列番号１８で示されるアミノ酸配列の第５位のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、ＭｅｔまたはＬｅｕなどの非環式疎水性アミノ酸であってもよく、配列番号１８で示されるアミノ酸配列の第６位のＸａａは、Ｔｙｒ、ＨｉｓまたはＰｈｅなどの環式芳香族アミノ酸であってもよい。
本発明の抗体の上記の実施形態のうち、いくつかの実施形態において、配列番号５で示されるアミノ酸配列の第４位のＸａａ、前記ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号６で示され、前記ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号７で示され、前記ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号８で示され、前記ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号９で示され、前記ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号１０で示される。
本発明の抗体の上記の実施形態のうち、別のいくつかの実施形態において、配列番号５で示されるアミノ酸配列の第４位のＸａａ、配列番号６で示されるアミノ酸配列の第５位のＸａａは、Ｇｌｕであり、配列番号７で示されるアミノ酸配列の第６位のＸａａは、Ｔｒｐであり、配列番号８で示されるアミノ酸配列の第８位のＸａａは、Ｔｈｒであり、配列番号９で示されるアミノ酸配列の第６位のＸａａは、Ａｓｎであり、配列番号１０で示されるアミノ酸配列の第５位のＸａａは、Ｉｌｅであり、配列番号１０で示されるアミノ酸配列の第６位のＸａａは、Ｔｙｒである。
本発明の抗体の上記の実施形態のうち、別のいくつかの実施形態において、配列番号５で示されるアミノ酸配列の第４位のＸａａは、Ａｒｇであり、配列番号６で示されるアミノ酸配列の第５位のＸａａは、Ｇｌｙであり、配列番号７で示されるアミノ酸配列の第６位のＸａａは、Ｐｈｅであり、配列番号８で示されるアミノ酸配列の第８位のＸａａは、Ｔｈｒであり、配列番号９で示されるアミノ酸配列の第６位のＸａａは、Ａｓｎであり、配列番号１０で示されるアミノ酸配列の第５位のＸａａは、Ｖａｌであり、配列番号１０で示されるアミノ酸配列の第６位のＸａａは、Ｈｉｓである。
本発明の抗体の上記の実施形態のうち、さらなるいくつかの実施形態において、配列番号５で示されるアミノ酸配列の第４位のＸａａは、Ｇｌｎであり、配列番号６で示されるアミノ酸配列の第５位のＸａａは、Ｇｌｕであり、配列番号７で示されるアミノ酸配列の第６位のＸａａは、Ｇｌｙであり、配列番号８で示されるアミノ酸配列の第８位のＸａａは、Ｔｈｒであり、配列番号９で示されるアミノ酸配列の第６位のＸａａは、Ｓｅｒであり、配列番号１０で示されるアミノ酸配列の第５位のＸａａは、Ｉｌｅであり、配列番号１０で示されるアミノ酸配列の第６位のＸａａは、Ｔｙｒである。
本発明の抗体の上記の実施形態のうち、いくつかの実施形態において、配列番号５で示されるアミノ酸配列の第４位のＸａａは、Ａｒｇであり、配列番号６で示されるアミノ酸配列の第５位のＸａａは、Ｇｌｙであり、配列番号７で示されるアミノ酸配列の第６位のＸａａは、Ｐｈｅであり、配列番号８で示されるアミノ酸配列の第８位のＸａａは、Ｔｙｒであり、配列番号９で示されるアミノ酸配列の第６位のＸａａは、Ａｓｎであり、配列番号１０で示されるアミノ酸配列の第５位のＸａａは、Ｉｌｅであり、配列番号１０で示されるアミノ酸配列の第６位のＸａａは、Ｈｉｓである。
本発明の抗体の上記の実施形態のうち、別のいくつかの実施形態において、配列番号５で示されるアミノ酸配列の第４位のＸａａは、Ｇｌｕであり、配列番号６で示されるアミノ酸配列の第５位のＸａａは、Ｇｌｕであり、配列番号７で示されるアミノ酸配列の第６位のＸａａは、Ｔｒｐであり、配列番号８で示されるアミノ酸配列の第８位のＸａａは、Ｔｈｒであり、配列番号９で示されるアミノ酸配列の第６位のＸａａは、Ｓｅｒであり、配列番号１０で示されるアミノ酸配列の第５位のＸａａは、Ｉｌｅであり、配列番号１０で示されるアミノ酸配列の第６位のＸａａは、Ｔｙｒである。
特定の一実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ１１ｄと結合する抗体、例えば、ヒト化抗体であって、ＬＣＶＲおよびＨＣＶＲを含み、前記ＬＣＶＲのアミノ酸配列が、配列番号３で示され、前記ＨＣＶＲのアミノ酸配列が、配列番号４で示されることを特徴とする抗体を提供する。さらなる特定の一実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ１１ｄと結合する抗体であって、軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）を含み、前記ＬＣのアミノ酸配列が、配列番号１で示され、前記ＨＣのアミノ酸配列が、配列番号２で示されることを特徴とする抗体を提供する。
また本発明は、治療を必要とする患者に本発明の抗体を有効量投与することを含む、ＣＮＳ外傷を治療する方法を提供する。特定のいくつかの実施形態において、本発明は、治療を必要とする患者に本発明の抗体を有効量投与することを含む、ＳＣＩ、ＴＢＩおよびＣＮＳ外傷後のＳＩＲＳの１以上を治療する方法を提供する。
さらに本発明は、本発明の抗体、および１以上の薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む医薬組成物を提供する。さらに本発明は、治療を必要とする患者に本発明の医薬組成物を有効量投与することを含む、脊髄損傷（ＳＣＩ）および外傷性脳損傷（ＴＢＩ）を含むＣＮＳ外傷を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、治療を必要とする患者に本発明の医薬組成物を有効量投与することを含む、ＣＮＳ外傷後の全身性炎症反応（ＳＩＲＳ）を治療する方法を提供する。
また本発明は、治療に使用するための、本発明の抗体を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、ＣＮＳ外傷の治療に使用するための、本発明の抗体を提供する。特定のいくつかの実施形態において、ＣＮＳ外傷は、ＳＣＩおよびＴＢＩから選択される１以上である。いくつかの実施形態において、本発明は、ＣＮＳ外傷後のＳＩＲＳの治療に使用するための、本発明の抗体を提供する。
一実施形態において、本発明は、ＣＮＳ外傷の治療用医薬の製造における本発明の抗体の使用を提供する。特定のいくつかの実施形態において、ＣＮＳ外傷は、ＳＣＩおよびＴＢＩから選択される１以上である。いくつかの実施形態において、本発明は、ＣＮＳ外傷後のＳＩＲＳの治療用医薬の製造における本発明の抗体の使用を提供する。
また本発明は、本発明の抗体をコードする核酸分子および発現ベクターに関する。一実施形態において、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を提供する。一実施形態において、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を提供する。さらなる一実施形態において、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列とを含むＤＮＡ分子を提供する。特定の一実施形態において、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１１で示され、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１２で示される。
さらに、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列とを含む宿主細胞を、抗体が発現される条件下で培養すること、ならびに該宿主細胞から、ＬＣおよびＨＣを含み、該ＬＣのアミノ酸配列が配列番号１で示され、該ＨＣのアミノ酸配列が配列番号２で示される抗体を回収することを含む方法により調製される抗体を提供する。
本明細書において、「抗体」は、ジスルフィド結合で相互に連結された２つのＨＣおよび２つのＬＣを含む免疫グロブリン分子である。各ＬＣおよび各ＨＣのアミノ末端部分は、それぞれ約１００～１２０個のアミノ酸からなる可変領域を含み、該可変領域は、当該領域内の複数のＣＤＲを介して抗原を認識する役割を主に担っている。ＣＤＲは、フレームワーク領域（「ＦＲ」）と称される、保存性の高い領域に散在している。ＬＣＶＲおよびＨＣＶＲは、それぞれ３つのＣＤＲと４つのＦＲとで構成されており、これらはアミノ末端からカルボキシ末端に向かって、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順で配置されている。ＬＣの３つのＣＤＲを、「ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３」と称し、ＨＣの３つのＣＤＲを「ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３」と称する。抗原と特異的な相互作用を形成する残基のほとんどが、ＣＤＲに含まれる。特定の抗原と結合するという抗体の機能的能力は、主にこれら６つのＣＤＲの影響を受ける。本発明の抗体のＬＣＶＲ領域内およびＨＣＶＲ領域内のアミノ酸の各ＣＤＲドメインへの割り当ては、周知のＫａｂａｔナンバリング法（Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９０：３８２－９３（１９７１）；Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２（１９９１））および周知のＮｏｒｔｈナンバリング法（Ｎｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ａ Ｎｅｗ Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＣＤＲ Ｌｏｏｐ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４０６：２２８－２５６（２０１１））に基づいている。
ＬＣはκ鎖またはλ鎖に分類されるが、これらは、当技術分野で知られているように、それぞれ特定の定常領域を有することを特徴とする。本発明のモノクローナル抗体は、κＬＣを含む。ＨＣは、γ鎖、μ鎖、α鎖、δ鎖またはε鎖に分類され、それぞれに対応する抗体のアイソタイプは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥと定義される。本発明のモノクローナル抗体は、ＩｇＧ ＨＣを含む。さらにＩｇＧ抗体は、複数のサブクラス、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４に分類される。特定の一実施形態において、本発明のモノクローナル抗体は、ＩｇＧ４である。各ＨＣのカルボキシ末端部分は、主にエフェクター機能に関わる定常領域を有することを特徴とする。
さらなる一実施形態において、ＣＤ１１ｄに対して特定の結合親和性を示すヒト化抗体が提供される。一実施形態において、ヒト化抗体は、ラットＣＤ１１ｄに対して約０．０５～５．０ｎＭの範囲の結合親和性を示す。このようなヒト化抗体は、ヒトＣＤ１１ｄに対しても結合親和性を示す。前記抗体がラットＣＤ１１ｄに対して、０．１ｎＭ未満、０．２ｎＭ未満、０．３ｎＭ未満、０．４ｎＭ未満または０．５ｎＭ未満の結合親和性を示すことは好ましく、また４．５ｎＭ超、４．０ｎＭ超、３．５ｎＭ超、３．０ｎＭ超、２．５ｎＭ超、２．０ｎＭ超または１．５ｎＭ超の結合親和性を示すことも好ましい。本発明の好ましい一実施形態において、前記抗体は、ラットＣＤ１１ｄに対して約０．５～２．０ｎＭの結合親和性を示す。ＣＤ１１ｄに対する結合親和性がこれらの範囲より高くても低くても、抗体の治療有用性は低減する可能性があり、例えば、抗体の抗炎症作用が著しく低減する可能性がある。ＣＤ１１ｄに対して上記の結合親和性を示すヒト化抗体は、例えば、配列番号１３、１４および１５で示されるＬＣＤＲと、配列番号１６、１７および１８で示されるＨＣＤＲとで構成される可変的なＣＤＲ、好ましくは配列番号５、６および７で示されるＬＣＤＲと、配列番号８、９および１０で示されるＨＣＤＲとで構成される可変的なＣＤＲを有する、ヒトＩｇＧ４などのヒトＩｇＧをベースとするものであってよい。
ＣＤ１１ｄ抗体の発現
本発明の抗体は、公知の方法、例えば、遺伝子工学技術により、調製および精製することができる。作動可能に連結された遺伝子を発現させることができる発現ベクターは、当技術分野で公知である。発現ベクターは、宿主細胞からの目的のポリペプチドの分泌を促進するシグナルペプチドをコードするものであってもよい。このシグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドであってもよく、異種のシグナルペプチドであってもよい。軽鎖および重鎖の各々は、１つのベクターを用いて、それぞれに対応する遺伝子が作動可能に連結されている別々のプロモーターから独立して発現させてもよく、また、軽鎖発現用と重鎖発現用の２つのベクターを用いて、それぞれに対応する遺伝子が作動可能に連結されている別々のプロモーターから独立して発現させてもよい。本発明の抗体の調製に用いられる適当なベクターの例は知られており、例えば、Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ社から市販されているベクターなどが挙げられる。
本発明の抗体は、公知の方法、例えば、遺伝子工学技術により、調製および精製することができる。作動可能に連結された遺伝子を発現させることができる発現ベクターは、当技術分野で公知である。発現ベクターは、宿主細胞からの目的のポリペプチドの分泌を促進するシグナルペプチドをコードするものであってもよい。このシグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドであってもよく、異種のシグナルペプチドであってもよい。軽鎖および重鎖の各々は、１つのベクターを用いて、それぞれに対応する遺伝子が作動可能に連結されている別々のプロモーターから独立して発現させてもよく、また、軽鎖発現用と重鎖発現用の２つのベクターを用いて、それぞれに対応する遺伝子が作動可能に連結されている別々のプロモーターから独立して発現させてもよい。本発明の抗体の調製に用いられる適当なベクターの例は知られており、例えば、Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ社から市販されているベクターなどが挙げられる。
配列番号１のアミノ酸配列を有する本発明の例示的ＣＤ１１ｄ抗体の例示的軽鎖をコードする具体的なＤＮＡポリヌクレオチド配列は、配列番号１１で提供される。配列番号２のアミノ酸配列を有する本発明のＣＤ１１ｄ抗体の例示的重鎖をコードする具体的なＤＮＡポリヌクレオチド配列は、配列番号１２で提供される。
宿主細胞としては、本発明の軽鎖のみ、本発明の重鎖のみもしくは本発明の軽鎖と重鎖の両方を発現する１以上の発現ベクターを安定的もしくは一時的にトランスフェクションした細胞、該ベクターで形質転換された細胞、該ベクターにより形質導入された細胞、または該ベクターに感染した細胞などが挙げられる。本発明のＣＤ１１ｄ抗体を産生する宿主細胞株は、当技術分野で公知の標準的技術により作製および単離することができる。本発明の融合化合物の発現において好ましい宿主細胞として、哺乳動物細胞が挙げられる。具体的な哺乳動物細胞としては、ＣＨＯ細胞およびＮＳ０細胞が挙げられる。当業者であれば十分に理解できるであろうが、哺乳動物細胞で抗体を発現させた場合、糖鎖付加反応が起こり、通常、Ｆｃ領域の高度に保存されたＮ－糖鎖付加部位に糖鎖が付加される。
本発明のＣＤ１１ｄ抗体は、培地、例えば、宿主細胞を培養する培地に分泌されたものであってもよく、該抗体は、慣用の技術により該培地から回収または精製することが可能である。例えば、プロテインＡまたはプロテインＧを利用したアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーまたはＣａｐｔｏ担体を利用したマルチモードクロマトグラフィーにより常法に従って、培地から本発明の抗体を回収することができる。さらに、可溶性凝集体および多量体を、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーまたはハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーなどの通常の技術により、効果的に除去することも可能である。回収した発現産物を、例えば－７０℃で直ちに凍結してもよく、凍結乾燥してもよい。
医薬組成物
本発明のＣＤ１１ｄ抗体を、単独でまたは薬学的もしくは生理学的に許容される担体と組み合わせて、単回用量または分割用量で患者に投与してもよい。「薬学的に許容される」または「生理学的に許容される」という表現は、医薬分野および獣医学分野において使用が許容されていること、すなわち、許容できない毒性を示すなどの生理的使用に不適な点が認められないことを意味する。
本発明のＣＤ１１ｄ抗体を、単独でまたは薬学的もしくは生理学的に許容される担体と組み合わせて、単回用量または分割用量で患者に投与してもよい。「薬学的に許容される」または「生理学的に許容される」という表現は、医薬分野および獣医学分野において使用が許容されていること、すなわち、許容できない毒性を示すなどの生理的使用に不適な点が認められないことを意味する。
本発明の抗体は、任意の適した投与経路による投与が意図されるものであることから、抗体を含む医薬組成物は、選択した投与方法に適したものに設計される。投与方法に見合った、分散剤、緩衝剤、界面活性剤、保存剤、可溶化剤、等張化剤、安定化剤などの薬学的に許容される希釈剤、担体および／または賦形剤が用いられる。本発明の医薬組成物は、例えば、医師に広く知られているような製剤技術の概要を示すＲｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，第１９版，Ｇｅｎｎａｒｏ編，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ社，イーストン，ペンシルバニア州，１９９５などに記載されている慣用の技術に従って設計することができる。医薬組成物に適した担体としては、本発明の抗体と併用した際に、当該分子の活性を維持しつつ、患者の免疫系による応答を惹起しない任意の物質が挙げられる。本発明の医薬組成物は、所望の化合物、および１以上の薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む。
一実施形態において、本発明の抗体は、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内などの非経口経路による投与に適した製剤に調製される。よって、本発明の抗体は、発熱物質を含まない滅菌水溶液（所望により緩衝液または等張液としてもよい）などの生理学的に許容される医療グレードの担体を用いて製剤化される。前記担体としては、蒸留水、糖（例えば、ショ糖もしくはデキストロース）を含む滅菌溶液、または塩化ナトリウムを含み、所望により緩衝液としてもよい滅菌生理食塩水が挙げられる。好適に用いられる滅菌生理食塩水は、様々な濃度の塩化ナトリウムを含んでいてもよく、例えば、通常の生理食塩水（０．９％）、１／２生理食塩水（０．４５％）、１／４生理食塩水（０．２２％）の他、これらより高濃度（例えば、３％～７％またはそれ以上）の塩化ナトリウムを含む溶液も使用できる。所望により、生理食塩水は塩化ナトリウム以外の成分、例えば、デキストロースなどの糖を含んでいてもよい。塩化ナトリウム以外の成分を含む生理食塩水としては、例えば、リンゲル液（例えば、乳酸リンゲル液または酢酸リンゲル液）、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、トリスヒドロキシメチルアミノメタン緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）、ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）、アール平衡塩類溶液（ＥＢＳＳ）、標準クエン酸生理食塩水（ＳＳＣ）、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＢＳ）、ゲイ平衡塩類溶液（ＧＢＳＳ）などが挙げられる。
別のいくつかの実施形態において、本発明の抗体は、以下の投与経路に限定されないが、経口、鼻腔内、腸内、局所、舌下、動脈内、髄内、子宮内、髄腔内、吸入、眼内、経皮、膣内、直腸内などの経路からの投与に適した製剤に調製され、各製剤はそれぞれの投与経路に適した担体を含む。経口投与する場合は、抗体を通常の生理食塩水に添加してもよく、食品に配合してもよく、カプセルに充填してもよく、乳化剤を用いて液体製剤の形態としてもよい。局所適用する場合は、クリーム剤、ローション剤および軟膏剤を、トリグリセリド基剤などの適当な基剤を用いて調製してもよい。このようなクリーム剤、ローション剤および軟膏剤は、界面活性剤をさらに含有していてもよい。好適な噴射剤を用いたエアロゾル製剤を調製してもよい。また、本発明の医薬組成物には、投与方法に拘わらず、他の補助剤を配合してもよく、例えば、微生物の増殖および／または長期保管中の分解を防ぐために、抗菌剤、酸化防止剤およびその他の保存剤を本発明の組成物に配合してもよい。
治療的使用
本発明の抗体または医薬組成物の有効量は、所望の治療効果または治療を達成するために、（用量、期間および投与方法において）必要な量を意味する。本発明の抗体または該抗体の医薬組成物の有効量は、個体の疾患の状態、年齢、性別および体重などの因子、ならびに前記抗体またはその部分断片が有する、個体において所望の反応を誘導する能力によって異なる。また有効量は、本発明の医薬組成物に含まれる抗体によってもたらされる有益な治療効果が毒性作用または有害作用を上回る量でもある。一般に、抗体の有効量は、約１ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇの範囲にある量である。
本発明の抗体または医薬組成物の有効量は、所望の治療効果または治療を達成するために、（用量、期間および投与方法において）必要な量を意味する。本発明の抗体または該抗体の医薬組成物の有効量は、個体の疾患の状態、年齢、性別および体重などの因子、ならびに前記抗体またはその部分断片が有する、個体において所望の反応を誘導する能力によって異なる。また有効量は、本発明の医薬組成物に含まれる抗体によってもたらされる有益な治療効果が毒性作用または有害作用を上回る量でもある。一般に、抗体の有効量は、約１ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇの範囲にある量である。
本明細書において、「治療」および／または「治療する」は、本明細書に記載の障害（例えば、ＳＣＩ、ＴＢＩなどのＣＮＳ外傷およびＣＮＳ外傷後のＳＩＲＳ）の進行の遅延、阻害、阻止、制御または抑止をもたらす可能性があるあらゆる処置を意味するものではあるが、必ずしも障害に伴うすべての症状が完全に解消されることを意図するものではない。治療は、ＣＤ１１ｄ量の低減またはＣＤ１１ｄの生物活性の低下による治療上の恩恵が見込まれる患者に対して、その疾患または病態を治療するために、本発明のＣＤ１１ｄ抗体または該抗体の医薬組成物を投与することを含む。治療は、（ａ）疾患のさらなる進行の抑制、すなわち、ＣＮＳ外傷の悪化抑制ならびに／またはＴＢＩ、ＳＣＩおよび／もしくはＣＮＳ外傷後のＳＩＲＳに関連する合併症の阻止；ならびに（ｂ）疾患の軽減、すなわち、ＴＢＩ、ＳＣＩなどのＣＮＳ外傷および／もしくはＣＮＳ外傷後のＳＩＲＳの回復促進、またはこれら疾患の症状もしくは合併症の緩和を含む。本発明のＣＤ１１ｄ抗体は、ＴＢＩ、ＳＣＩなどのＣＮＳ外傷および／またはＣＮＳ外傷後のＳＩＲＳの治療に有用であると考えられる。
「患者」、「対象」および「個体」という用語は、本明細書において同じ意味で用いられており、いずれもヒトおよび非ヒト哺乳動物を含む動物を示すものであるが、好ましくはヒトを示す。いくつかの実施形態において、前記対象は、ＴＢＩ、ＳＣＩなどのＣＮＳ外傷および／もしくはＣＮＳ外傷後のＳＩＲＳの治療が「必要である」もしくは必要となる「リスクを有する」との診断を受けた個体、または該治療を必要としている個体である。
以下の実施例において、ＳＣＩ、ＴＢＩなどのＣＮＳ外傷および／またはＣＮＳ外傷後のＳＩＲＳを治療するための本発明のＣＤ１１ｄ抗体を例示するが、これらは説明目的で記載されているものであって、本発明を限定するものではない。様々な変形が可能であることは、当技術分野における通常の技能を有する者であれば理解できるであろう。
実施例１：抗体スクリーニング試験
結合親和性
２１７Ｌモノクローナル抗体に対する予備的な特性評価から、フローサイトメトリー分析によって求められるヒトＣＤ１１ｄ親和性は約１．９ｎＭであること、また、立体構造エピトープがドメインＩに位置することが分かっている。ヒト化抗体が所望の特性を有しているかを確認するために、まず、ＣＤ１１ｄに対する親和性の高さが、ｉｎ ｖｉｖｏ効果の高さにつながるかどうかを調べた。ＣＤ１１ｄ親和性について、２１７Ｌモノクローナル抗体と、その他同様のラットＣＤ１１ｄまたはヒトＣＤ１１ｄに対するモノクローナル抗体とを比較した。その結果を下掲の表１に示す。
結合親和性
２１７Ｌモノクローナル抗体に対する予備的な特性評価から、フローサイトメトリー分析によって求められるヒトＣＤ１１ｄ親和性は約１．９ｎＭであること、また、立体構造エピトープがドメインＩに位置することが分かっている。ヒト化抗体が所望の特性を有しているかを確認するために、まず、ＣＤ１１ｄに対する親和性の高さが、ｉｎ ｖｉｖｏ効果の高さにつながるかどうかを調べた。ＣＤ１１ｄ親和性について、２１７Ｌモノクローナル抗体と、その他同様のラットＣＤ１１ｄまたはヒトＣＤ１１ｄに対するモノクローナル抗体とを比較した。その結果を下掲の表１に示す。
抗体は、ハイブリドーマ２１７Ｌ（米国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）アクセッション番号：ＨＢ－１２７０１）、ハイブリドーマ２２６Ｃ（ＡＴＣＣアクセッション番号：ＨＢ－１２５９２）もしくはハイブリドーマ２３６Ｇ（ＡＴＣＣアクセッション番号：ＨＢ－１２５９３）から分泌されたもの、または２１７Ｌ由来のものを用いた。
ＳＣＩモデルにおける損傷２４時間後のミエロペルオキシダーゼ活性（ＭＰＯ活性）
次に、モノクローナル抗体のＣＤ１１ｄ親和性の、損傷したラット脊髄における損傷２４時間後のＭＰＯ活性（存在する好中球量を反映する）に対する効果を調べた。ＭＰＯ活性の評価は、以下の手順により行う。各個体から摘出した脊髄の一部と、５容量（ｗ／ｖ）の５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液および５容量（ｗ／ｖ）の０．５％ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミドとを氷上でホモジネートする（これにより、好中球からＭＰＯを抽出する）。得られたホモジネート液を、１０，６２１ｇで２０分間遠心分離する。上清を採取し、ペレットは保存する。上清中のＭＰＯ活性の測定は、１．２５ｍｇ／ｍＬ ｒ－ジアニシジン二塩酸塩と０．０５％過酸化水素とを含む０．３ｍＬのリン酸カリウム緩衝液を添加して行う。各動物２サンプルずつ測定を行う。０．１ｍＬのサンプルの添加により、酵素活性を測定するための比色反応を開始し、５分後に、０．１ｍＬの０．１％アジ化ナトリウムの添加により、比色反応の進行を停止する。４６０ｎｍの吸光度を測定する。また、精製ヒトＭＰＯ（５０ｕｎｉｔ／ｍｇの凍結乾燥タンパク質、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、セントルイス、ミズーリ州）の１．０ｕｎｉｔ／１００μＬのストック溶液から調製した８種類の希釈液（０．００１ｕｎｉｔ／１００μＬ、０．０１ｕｎｉｔ／１００μＬ、０．０３ｕｎｉｔ／１００μＬ、０．０６ｕｎｉｔ／１００μＬ、０．１２５ｕｎｉｔ／１００μＬ、０．２５ｕｎｉｔ／１００μＬ、０．５ｕｎｉｔ／１００μＬおよび１．０ｕｎｉｔ／１００μＬ）を用いて検量線を作成する。供試サンプルのＭＰＯ活性を、組織１ｍｇ当たりの相対的な活性単位として示す。供試サンプルのタンパク質濃度は、ウシ血清アルブミンを標準物質とし、改変ブラッドフォード法（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ ＩＩ；Ｂｉｏ－Ｒａｄ社、ヘラクレス、カリフォルニア州）により求める。
３種類のモノクローナル抗体２１７Ｌ、２３６Ｇおよび２２６Ｃ（上掲の表中、網掛け表示）は、それぞれラットＣＤ１１ｄに対する結合親和性が４．４２ｎＭ、１．４０ｎＭおよび０．３３ｎＭであり、これらを選択して神経保護効果を確認するためのスクリーニング試験に供した。この試験は、脊髄損傷ラットに投与するＣＤ１１ｄモノクローナル抗体の親和性の高さが、神経保護効果の強さにつながるかどうかを調べるために行った。この試験において、下記の処置群：第１群：アイソタイプが同じである抗体対照群（１Ｂ７）；第２群：２１７Ｌモノクローナル抗体群；第３群：２３６Ｇモノクローナル抗体群；第４群：２２６Ｃモノクローナル抗体群を設けた。ラットの第４胸髄節を３５ｇのクリップを用いて圧迫し、ＳＣＩを作成した（各群ｎ＝１８）。各群、試験に用いる抗体の投与量は、０．５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇおよび３．０ｍｇ／ｋｇの３用量とした（各用量ｎ＝６）。損傷２時間後、ラットにモノクローナル抗体の静脈注射による処置を行った。損傷２４時間後、ラットに麻酔をかけ、冷却した生理食塩水で灌流処置を行い、損傷部位が中心となるように脊髄の一部を０．５ｃｍ摘出し、分析に供した。摘出した組織をホモジネートして、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）の測定を行った。ＭＰＯは、活性化好中球の確立されたマーカーであり、活性化好中球よりは少々劣るがマクロファージのマーカーでもある。
結果
ＳＣＩ作成後に２１７Ｌモノクローナル抗体または２３６Ｇモノクローナル抗体で処置したラットでは、１Ｂ７アイソタイプ対照モノクローナル抗体で処置したラットより自発運動活性の良好な回復が認められた。２１７Ｌモノクローナル抗体または２３６Ｇモノクローナル抗体で処置したラットの自発運動スコアの改善は、ＳＣＩ５週間後の時点で統計学的有意差が認められ、２３６Ｇモノクローナル抗体で処置したラットでは、ＳＣＩ６週間後においても有意差が維持されていた（図３）。
ＳＣＩ作成後に２１７Ｌモノクローナル抗体または２３６Ｇモノクローナル抗体で処置したラットでは、１Ｂ７アイソタイプ対照モノクローナル抗体で処置したラットより自発運動活性の良好な回復が認められた。２１７Ｌモノクローナル抗体または２３６Ｇモノクローナル抗体で処置したラットの自発運動スコアの改善は、ＳＣＩ５週間後の時点で統計学的有意差が認められ、２３６Ｇモノクローナル抗体で処置したラットでは、ＳＣＩ６週間後においても有意差が維持されていた（図３）。
上記試験から、意外にも、ラットＣＤ１１ｄに対する結合親和性が例えば１．４ｎＭ未満であったり４．４ｎＭを超えたりするモノクローナル抗体が、神経学的転帰の改善などのｉｎ ｖｉｖｏ活性を示すことが分かった。親和性の高いモノクローナル抗体（２２６Ｃなど）の有効性は、親和性の低いモノクローナル抗体（２１７Ｌおよび２３６Ｇなど）の有効性を上回らずとも少なくとも同等であると一般に考えられているため、この結果は予想外であった。
実施例２：人工ＣＤ１１ｄ抗体の発現
本発明の人工ＣＤ１１ｄ抗体の発現および精製は、基本的に以下の手順により実施することができる。配列番号１のＬＣアミノ酸配列をコードするＤＮＡ分子と、配列番号２のＨＣアミノ酸配列をコードするＤＮＡ分子とを含むグルタミン合成酵素（ＧＳ）発現ベクターを、エレクトロポレーションによりチャイニーズハムスター卵巣細胞株（ＣＨＯ）にトランスフェクションする。例えば、表２に記載の例示的ＣＤ１１ｄ抗体３のＬＣをコードする、配列番号１１で示されるポリヌクレオチド配列を有するＤＮＡ分子（但し、第７９位のｎはｃであり；第８０位のｎはａであり；第８１位のｎはａであり；第１５８位のｎはａであり；第２８０位のｎはｇであり；第２８１位のｎはｇであり；第２８２位のｎはｇである）、および表２に記載の例示的ＣＤ１１ｄ抗体３のＨＣをコードする、配列番号１２で示されるポリヌクレオチド配列を有するＤＮＡ分子（但し、第８８位のｎはａであり；第８９位のｎはｃであり；第９０位のｎはｃであり；第１６３位のｎはｔであり；第１６４位のｎはｃであり；第３０１位のｎはａであり；第３０３位のｎはｃであり；第３０４位のｎはｔであり；第３０６位のｎはｃである）が用いられる。上記発現ベクターは、ＳＶ４０初期（シミアンウイルス４０Ｅ）プロモーターおよびＧＳ遺伝子をコードしている。ＧＳの発現により、ＣＨＯ細胞にとって必要なアミノ酸の１つであるグルタミンの生化学的合成が可能になる。トランスフェクション後の細胞に対して、５０μＭ Ｌ－メチオニンスルホキシイミン（ＭＳＸ）を用いてバルク選別（ｂｕｌｋ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）を行う。ＭＳＸによるＧＳの阻害を利用することによって、より厳密な選別を行うことができる。ゲノムの転写活性領域に発現ベクターのｃＤＮＡが組み込まれた宿主細胞は、内在性レベルでＧＳを発現するＣＨＯ野生型細胞から選別することができる。トランスフェクションに成功した細胞のプールを低密度で播種し、安定発現する細胞をクローン増殖に近い状態で増殖させる。複数のマスターウェル（ｍａｓｔｅｒｗｅｌｌ）の中から、抗体を発現しているものをスクリーニングにより選択し、次いで、スケールアップして無血清で懸濁培養し、抗体産生に用いる。分泌された抗体が含まれる清澄化培地を、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）などの適合する緩衝液で平衡化したプロテインＡアフィニティーカラムに添加する。このカラムを１Ｍ ＮａＣｌで洗浄し、非特異結合成分を除去する。カラムに結合した抗体を、例えば、ｐＨ（約）３．５のクエン酸ナトリウムで溶出し、溶出画分を１Ｍトリス緩衝液で中和する。ＳＤＳ－ＰＡＧＥまたは分析的なサイズ排除法などにより抗体画分を確認し、該画分をプールする。可溶性凝集体および多量体は、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーなどの通常の技術により効果的に除去してもよい。本発明の人工ＣＤ１１ｄ抗体は、通常の技術により濃縮および／または滅菌ろ過してもよい。このようなクロマトグラフィー工程を実施することにより、ＣＤ１１ｄ抗体の純度は９５％を上回る。本発明のＣＤ１１ｄ抗体は、直ちに－７０℃で凍結してもよく、４℃で数ヶ月間保存してもよい。
本発明の人工ＣＤ１１ｄ抗体の発現および精製は、基本的に以下の手順により実施することができる。配列番号１のＬＣアミノ酸配列をコードするＤＮＡ分子と、配列番号２のＨＣアミノ酸配列をコードするＤＮＡ分子とを含むグルタミン合成酵素（ＧＳ）発現ベクターを、エレクトロポレーションによりチャイニーズハムスター卵巣細胞株（ＣＨＯ）にトランスフェクションする。例えば、表２に記載の例示的ＣＤ１１ｄ抗体３のＬＣをコードする、配列番号１１で示されるポリヌクレオチド配列を有するＤＮＡ分子（但し、第７９位のｎはｃであり；第８０位のｎはａであり；第８１位のｎはａであり；第１５８位のｎはａであり；第２８０位のｎはｇであり；第２８１位のｎはｇであり；第２８２位のｎはｇである）、および表２に記載の例示的ＣＤ１１ｄ抗体３のＨＣをコードする、配列番号１２で示されるポリヌクレオチド配列を有するＤＮＡ分子（但し、第８８位のｎはａであり；第８９位のｎはｃであり；第９０位のｎはｃであり；第１６３位のｎはｔであり；第１６４位のｎはｃであり；第３０１位のｎはａであり；第３０３位のｎはｃであり；第３０４位のｎはｔであり；第３０６位のｎはｃである）が用いられる。上記発現ベクターは、ＳＶ４０初期（シミアンウイルス４０Ｅ）プロモーターおよびＧＳ遺伝子をコードしている。ＧＳの発現により、ＣＨＯ細胞にとって必要なアミノ酸の１つであるグルタミンの生化学的合成が可能になる。トランスフェクション後の細胞に対して、５０μＭ Ｌ－メチオニンスルホキシイミン（ＭＳＸ）を用いてバルク選別（ｂｕｌｋ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）を行う。ＭＳＸによるＧＳの阻害を利用することによって、より厳密な選別を行うことができる。ゲノムの転写活性領域に発現ベクターのｃＤＮＡが組み込まれた宿主細胞は、内在性レベルでＧＳを発現するＣＨＯ野生型細胞から選別することができる。トランスフェクションに成功した細胞のプールを低密度で播種し、安定発現する細胞をクローン増殖に近い状態で増殖させる。複数のマスターウェル（ｍａｓｔｅｒｗｅｌｌ）の中から、抗体を発現しているものをスクリーニングにより選択し、次いで、スケールアップして無血清で懸濁培養し、抗体産生に用いる。分泌された抗体が含まれる清澄化培地を、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）などの適合する緩衝液で平衡化したプロテインＡアフィニティーカラムに添加する。このカラムを１Ｍ ＮａＣｌで洗浄し、非特異結合成分を除去する。カラムに結合した抗体を、例えば、ｐＨ（約）３．５のクエン酸ナトリウムで溶出し、溶出画分を１Ｍトリス緩衝液で中和する。ＳＤＳ－ＰＡＧＥまたは分析的なサイズ排除法などにより抗体画分を確認し、該画分をプールする。可溶性凝集体および多量体は、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーなどの通常の技術により効果的に除去してもよい。本発明の人工ＣＤ１１ｄ抗体は、通常の技術により濃縮および／または滅菌ろ過してもよい。このようなクロマトグラフィー工程を実施することにより、ＣＤ１１ｄ抗体の純度は９５％を上回る。本発明のＣＤ１１ｄ抗体は、直ちに－７０℃で凍結してもよく、４℃で数ヶ月間保存してもよい。
上記と基本的に同様の手順により調製した本発明の例示的ＣＤ１１ｄ抗体を表２に示す。表２に記載の例示的ＣＤ１１ｄ抗体は、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するＬＣと、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するＨＣとを含み、各配列の特定の位置にあるＸａａで示される残基は表２に記載の通りである。アミノ酸のナンバリングには、リニアナンバリング（ｌｉｎｅａｒ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ）を適用する。配列番号１の第２７位のＸａａは、配列番号５の第４位のＸａａに相当し；配列番号１の第５３位のＸａａは、配列番号６の第５位のＸａａに相当し；配列番号１の第９４位のＸａａは、配列番号７の６のＸａａに相当し；配列番号２の第３０位のＸａａは、配列番号８の第８位のＸａａに相当し；配列番号２の第５５位のＸａａは、配列番号９の第６位のＸａａに相当し；配列番号２の第１０１位のＸａａは、配列番号１０の第５位のＸａａに相当し；配列番号２の第１０２位のＸａａは、配列番号１０の第６位のＸａａに相当する。
結合親和性
表２に記載の例示的ＣＤ１１ｄ抗体のヒトＣＤ１１ｄおよびラットＣＤ１１ｄに対する結合親和性を、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析により調べた。ヒトＣＤ１１ｄ／ＣＤ１８を発現するＪＹ細胞またはラット全長ＣＤ１１ｄをトランスフェクションしたＪＹ細胞を、ヤギＩｇＧ（１ｍｇ／ｍＬ）を含むＦＡＣＳバッファーに懸濁する。準備した細胞液を、４．０×１０４個／５０μＬの密度になるよう９６ウェル丸底プレートの各ウェルに添加する。表２に記載の各例示的ＣＤ１１ｄ抗体（２５μＬ）またはアイソタイプ対照抗体（２５μＬ）を、１：３希釈により最終濃度が４．６ｎｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬの範囲になるようにウェルに添加する。プレートを氷上で３０分間インキュベートした後、２００μＬのＦＡＣＳバッファーを添加し、２０００ｒｐｍで３分間遠心分離して、液を捨てる。１：１５０希釈したフィコエリトリン結合抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社、製品番号：７０９－１１６－１４９）を５０μＬ添加して細胞を再懸濁し、氷上で２０分間インキュベートする。ＦＡＣＳバッファー（２００μＬ）を各ウェルに添加し、プレートを２０００ｒｐｍで３分間遠心する。液を捨て、細胞を２００μＬのＦＡＣＳバッファーで洗浄し、１％パラホルムアルデヒドを含む１２０μＬのＰＢＳに再懸濁して、９６ウェル平底プレートに移す。
表２に記載の例示的ＣＤ１１ｄ抗体のヒトＣＤ１１ｄおよびラットＣＤ１１ｄに対する結合親和性を、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析により調べた。ヒトＣＤ１１ｄ／ＣＤ１８を発現するＪＹ細胞またはラット全長ＣＤ１１ｄをトランスフェクションしたＪＹ細胞を、ヤギＩｇＧ（１ｍｇ／ｍＬ）を含むＦＡＣＳバッファーに懸濁する。準備した細胞液を、４．０×１０４個／５０μＬの密度になるよう９６ウェル丸底プレートの各ウェルに添加する。表２に記載の各例示的ＣＤ１１ｄ抗体（２５μＬ）またはアイソタイプ対照抗体（２５μＬ）を、１：３希釈により最終濃度が４．６ｎｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬの範囲になるようにウェルに添加する。プレートを氷上で３０分間インキュベートした後、２００μＬのＦＡＣＳバッファーを添加し、２０００ｒｐｍで３分間遠心分離して、液を捨てる。１：１５０希釈したフィコエリトリン結合抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社、製品番号：７０９－１１６－１４９）を５０μＬ添加して細胞を再懸濁し、氷上で２０分間インキュベートする。ＦＡＣＳバッファー（２００μＬ）を各ウェルに添加し、プレートを２０００ｒｐｍで３分間遠心する。液を捨て、細胞を２００μＬのＦＡＣＳバッファーで洗浄し、１％パラホルムアルデヒドを含む１２０μＬのＰＢＳに再懸濁して、９６ウェル平底プレートに移す。
染色した細胞を、フローサイトメトリーにより、アイソタイプ対照抗体にゲートを設定して解析する。ゲート内の比率（％）を、式［ゲート内％（供試抗体）－ゲート内％（アイソタイプ対照抗体）］により算出する：。Ｋｄは、一部位結合モデルを用いて、非線形回帰法により求める。上記と基本的に同様の手順により、表２に記載の例示的ＣＤ１１ｄ抗体のヒトＣＤ１１ｄおよびラットＣＤ１１ｄに対する結合親和性を求めた。
表３に示したデータより、本発明の例示的ヒト化ＣＤ１１ｄ抗体のラットＣＤ１１ｄに対する結合親和性は、約０．１３ｎＭ～約１．４５ｎＭであることが分かる。また同データより、これらの例示的ＣＤ１１ｄヒト化抗体は、ヒトＣＤ１１ｄにも結合し、約０．３ｎＭ～約０．５０ｎＭの範囲の結合親和性を有することが分かる。
ラットＳＣＩモデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏ炎症反応分析
ラットＳＣＩモデルにおけるＳＣＩ後の炎症の程度を評価するために、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性（好中球のマーカー）およびＥＤ－１発現（食細胞であるマクロファージのマーカー）を用いた。実験的ＳＣＩの作成は、体重２１０～２５０ｇの約７～８週齢雌性ウイスターラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ社、セント・コンスタント、ケベック州）８４匹を用い、脊髄の第８胸椎（Ｔ８）をクリップで圧迫することにより行う。これらのラットを、処置群（表２に記載の例示的ＣＤ１１ｄ抗体で処置）、アイソタイプ対照群および非ＳＣＩ対照群（各群ｎ＝６）に分け、さらに（下掲の表４に記載の通り）、２４時間処置群（ｎ＝４２）および７２時間処置群（ｎ＝４２）に分ける。
ラットＳＣＩモデルにおけるＳＣＩ後の炎症の程度を評価するために、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性（好中球のマーカー）およびＥＤ－１発現（食細胞であるマクロファージのマーカー）を用いた。実験的ＳＣＩの作成は、体重２１０～２５０ｇの約７～８週齢雌性ウイスターラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ社、セント・コンスタント、ケベック州）８４匹を用い、脊髄の第８胸椎（Ｔ８）をクリップで圧迫することにより行う。これらのラットを、処置群（表２に記載の例示的ＣＤ１１ｄ抗体で処置）、アイソタイプ対照群および非ＳＣＩ対照群（各群ｎ＝６）に分け、さらに（下掲の表４に記載の通り）、２４時間処置群（ｎ＝４２）および７２時間処置群（ｎ＝４２）に分ける。
ＳＣＩ２時間後、２４時間処置群のラットには、ａ）１ｍｇ／ｋｇの例示的抗体１；ｂ）１ｍｇ／ｋｇの例示的抗体２；ｃ）１ｍｇ／ｋｇの例示的抗体３；ｄ）１ｍｇ／ｋｇの例示的抗体４；ｅ）１ｍｇ／ｋｇの例示的抗体５；またはｆ）１ｍｇ／ｋｇの例示的ＩｇＧ４アイソタイプ対照を尾静脈注射により単回投与する。７２時間処置群のラットには、ＳＣＩ作成から２時間後、２４時間後および７２時間後に、上記ａ）～ｆ）のいずれかを尾静脈注射により投与する。それぞれの処置期間が終了した時点で、ラットを屠殺する。屠殺した各処置群および非ＳＣＩ対照群のラットから、Ｔ８脊椎領域の脊髄を採取する。
上記と基本的に同様の手順により、表２に記載の例示的ＣＤ１１ｄ抗体で処置したＳＣＩラットのＭＰＯ活性およびＥＤ－１発現を求めた。
表４に示した結果から、アイソタイプ対照抗体で処置したＳＣＩラットと比較して、表２に記載の例示的ＣＤ１１ｄ抗体で処置したＳＣＩラットにおける（脊髄損傷組織の）ＭＰＯ活性およびＥＤ－１発現が低くなっていることが分かる。
ラットＳＣＩモデルを用いたｉｎ ｖｉｖｏにおける機能的自発運動能力の評価
ＳＣＩ作成後のラットにおける自発運動能力の回復に関する機能的評価を行うために、Ｂａｓｓｏ、Ｂｅａｔｔｉｅ、Ｂｒｅｓｎａｈａｎ（ＢＢＢ）スケールを使用する。ＢＢＢスケールは、ラットの自発運動反応に基づく半定量的なスケールであり、０～２１の数値で示される。このスケール（０～２１）は、連続的な回復段階を示し、ラット後肢関節の動き、後肢３関節すべての動き（但し、歩行ではない）、歩行、前肢後肢の協調性、体幹の位置と安定性、足底の配置および尻尾の位置の組み合わせを分類したものである。概して、スコア０～７は、ラットにおいて、後肢関節の動きが全く観察されないか、後肢１～３関節の動きがそれぞれ単独で観察されるが、歩行は観察されないことを示し；スコア８～１３は、ラットにおいて、間隔を有する協調性のない荷重歩行であるが、荷重の漸増が認められる歩行が観察されることを示し；スコア１４～２１は、ラットにおいて、前肢後肢の協調性が観察されることを示す。
実験的ＳＣＩの作成は、体重２５０～３００ｇの約７～８週齢雌性ウイスターラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ社、セント・コンスタント、ケベック州）を用い、脊髄の第８胸椎（Ｔ８）をクリップで圧迫することにより行う。これらのラットを、２つの処置群に分け、ＳＣＩ作成から２時間後、２４時間後および４８時間後に、ａ）１ｍｇ／ｋｇの表２に記載の例示的ＣＤ１１ｄ抗体３（ｎ＝９）またはｂ）１ｍｇ／ｋｇのＩｇＧ４アイソタイプ対照（ｎ＝１０）を尾静脈注射により単回投与する。ラット処置群について盲検化された観察者（ｎ＝３）によって、ＳＣＩ作成から１０週間、自発運動の回復に関するＢＢＢスコアリングを毎週実施する。
上記と基本的に同様の手順により、表２に記載の例示的ＣＤ１１ｄ抗体３で処置したＳＣＩラットの機能的自発運動能力の評価（ＢＢＢスケールに基づく）を行った。その結果を表５に示す（二元配置分散分析で解析した結果）。
表５に示した結果から、表２に記載の例示的抗体３を投与したＳＣＩラットでは、アイソタイプ対照で処置したＳＣＩラットより、機能的自発運動能力の速やかかつ大幅な向上が見られることが分かる。表２に記載の例示的抗体３で処置したラットでは、アイソタイプ対照抗体で処置したラットと比較して、処置における有意な効果（ｐ＝０．００２９）、時間における有意な効果（ｐ＜０．０００１）、ならびに処置および時間における有意な相互作用（ｐ＝０．０００６）が示された。
配列
例示的ＬＣ（配列番号１）
但し、第２７位のＸａａは、Ｇｌｎ、ＡｒｇまたはＧｌｕであり；第５３位のＸａａは、ＧｌｕまたはＧｌｙであり；第９４位のＸａａは、Ｔｒｐ、ＰｈｅまたはＧｌｙである。
例示的ＨＣ（配列番号２）
但し、第３０位のＸａａは、Ｔｈｒ、ＴｙｒまたはＧｌｙであり；第５５位のＸａａは、ＡｓｎまたはＳｅｒであり；第１０１位のＸａａは、ＩｌｅまたはＶａｌであり；第１０２位のＸａａは、ＴｙｒまたはＨｉｓである。
例示的ＬＣＶＲ（配列番号３）
但し、第２７位のＸａａは、Ｇｌｎ、ＡｒｇまたはＧｌｕであり；第５３位のＸａａは、ＧｌｕまたはＧｌｙであり；第９４位のＸａａは、Ｔｒｐ、ＰｈｅまたはＧｌｙである。
例示的ＨＣＶＲ（配列番号４）
但し、第３０位のＸａａは、Ｔｈｒ、ＴｙｒまたはＧｌｙであり；第５５位のＸａａは、ＡｓｎまたはＳｅｒであり；第１０１位のＸａａは、ＩｌｅまたはＶａｌであり；第１０２位のＸａａは、ＴｙｒまたはＨｉｓである。
例示的ＬＣＤＲ１（配列番号５）
但し、第４位のＸａａは、Ｇｌｎ、ＡｒｇまたはＧｌｕである。
例示的ＬＣＤＲ２（配列番号６）
但し、第５位のＸａａは、ＧｌｕまたはＧｌｙである。
例示的ＬＣＤＲ３（配列番号７）
但し、第６位のＸａａは、Ｔｒｐ、ＰｈｅまたはＧｌｙである。
例示的ＨＣＤＲ１（配列番号８）
但し、第８位のＸａａは、Ｔｈｒ、ＴｙｒまたはＧｌｙである。
例示的ＨＣＤＲ２（配列番号９）
但し、第６位のＸａａは、ＡｓｎまたはＳｅｒである。
例示的ＨＣＤＲ３（配列番号１０）
但し、第５位のＸａａは、ＩｌｅまたはＶａｌであり；第６位のＸａａは、ＴｙｒまたはＨｉｓである。
配列番号１で示される例示的ＬＣをコードするヌクレオチド配列（配列番号１１）
但し、第７９位のｎはｃ、ａまたはｇであり；第８０位のｎはａまたはｇであり；第８１位のｎはａまたはｇであり；第１５８位のｎはａまたはｇであり；第２８０位のｎはｇまたはｔであり；第２８１位のｎはｇまたはｔであり；第２８２位のｎはｇまたはｔである。
配列番号２で示される例示的ＨＣをコードするヌクレオチド配列（配列番号１２）
但し、第８８位のｎはａ、ｇまたはｔであり；第８９位のｎはｃ、ｇまたはａであり；第９０位のｎはｃ、ａまたはｔであり；第１６３位のｎはａまたはｔであり；第１６４位のｎはａまたはｃであり；第３０１位のｎはａまたはｇであり；第３０３位のｎはｃまたはｔであり；第３０４位のｎはｔまたはｃであり；第３０６位のｎはｃまたはｔである。
例示的ＬＣ（配列番号１）
例示的ＨＣ（配列番号２）
例示的ＬＣＶＲ（配列番号３）
例示的ＨＣＶＲ（配列番号４）
例示的ＬＣＤＲ１（配列番号５）
例示的ＬＣＤＲ２（配列番号６）
例示的ＬＣＤＲ３（配列番号７）
例示的ＨＣＤＲ１（配列番号８）
例示的ＨＣＤＲ２（配列番号９）
例示的ＨＣＤＲ３（配列番号１０）
配列番号１で示される例示的ＬＣをコードするヌクレオチド配列（配列番号１１）
配列番号２で示される例示的ＨＣをコードするヌクレオチド配列（配列番号１２）
Claims (12)
- ヒトＣＤ１１ｄに結合するヒト化抗体であって、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、前記ＬＣＶＲが、相補性決定領域（ＣＤＲ）であるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＶＲが、相補性決定領域（ＣＤＲ）であるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含み、該ＬＣＶＲのアミノ酸配列が、配列番号３で示され、該ＨＣＶＲのアミノ酸配列が、配列番号４で示され、前記ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列が、配列番号５で示され、前記ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番号６で示され、前記ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号７で示され、前記ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列が、配列番号８で示され、前記ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番号９で示され、前記ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号１０で示され、ラットＣＤ１１ｄに対して０．１３ｎＭ～２．０ｎＭの範囲の結合親和性を示し、ヒトＣＤ１１ｄに対して０．３ｎＭ～０．５ｎＭの範囲の結合親和性を示すことを特徴とするヒト化抗体。
- 軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）を含み、該ＬＣのアミノ酸配列が、配列番号１で示され、該ＨＣのアミノ酸配列が、配列番号２で示されることを特徴とする、請求項１に記載の抗体。
- （ａ）配列番号５で示されるアミノ酸配列の第４位のＸａａが、Ｇｌｎであり；配列番号６で示されるアミノ酸配列の第５位のＸａａが、Ｇｌｕであり；配列番号７で示されるアミノ酸配列の第６位のＸａａが、Ｔｒｐであり；配列番号８で示されるアミノ酸配列の第８位のＸａａが、Ｔｈｒであり；配列番号９で示されるアミノ酸配列の第６位のＸａａが、Ａｓｎであり；配列番号１０で示されるアミノ酸配列の第５位のＸａａが、Ｉｌｅであり；配列番号１０で示されるアミノ酸配列の第６位のＸａａが、Ｔｙｒである、
（ｂ）配列番号５で示されるアミノ酸配列の第４位のＸａａが、Ａｒｇであり；配列番号６で示されるアミノ酸配列の第５位のＸａａが、Ｇｌｙであり；配列番号７で示されるアミノ酸配列の第６位のＸａａが、Ｐｈｅであり；配列番号８で示されるアミノ酸配列の第８位のＸａａが、Ｇｌｙであり；配列番号９で示されるアミノ酸配列の第６位のＸａａが、Ａｓｎであり；配列番号１０で示されるアミノ酸配列の第５位のＸａａが、Ｖａｌであり；配列番号１０で示されるアミノ酸配列の第６位のＸａａが、Ｈｉｓである、
（ｃ）配列番号５で示されるアミノ酸配列の第４位のＸａａが、Ｇｌｎであり；配列番号６で示されるアミノ酸配列の第５位のＸａａが、Ｇｌｕであり；配列番号７で示されるアミノ酸配列の第６位のＸａａが、Ｇｌｙであり；配列番号８で示されるアミノ酸配列の第８位のＸａａが、Ｔｈｒであり；配列番号９で示されるアミノ酸配列の第６位のＸａａが、Ｓｅｒであり；配列番号１０で示されるアミノ酸配列の第５位のＸａａが、Ｉｌｅであり；配列番号１０で示されるアミノ酸配列の第６位のＸａａが、Ｔｙｒである、
（ｄ）配列番号５で示されるアミノ酸配列の第４位のＸａａが、Ａｒｇであり；配列番号６で示されるアミノ酸配列の第５位のＸａａが、Ｇｌｙであり；配列番号７で示されるアミノ酸配列の第６位のＸａａが、Ｐｈｅであり；配列番号８で示されるアミノ酸配列の第８位のＸａａが、Ｔｙｒであり；配列番号９で示されるアミノ酸配列の第６位のＸａａが、Ａｓｎであり；配列番号１０で示されるアミノ酸配列の第５位のＸａａが、Ｉｌｅであり；配列番号１０で示されるアミノ酸配列の第６位のＸａａが、Ｈｉｓである、または
（ｅ）配列番号５で示されるアミノ酸配列の第４位のＸａａが、Ｇｌｕであり；配列番号６で示されるアミノ酸配列の第５位のＸａａが、Ｇｌｕであり；配列番号７で示されるアミノ酸配列の第６位のＸａａが、Ｔｒｐであり；配列番号８で示されるアミノ酸配列の第８位のＸａａが、Ｔｈｒであり；配列番号９で示されるアミノ酸配列の第６位のＸａａが、Ｓｅｒであり；配列番号１０で示されるアミノ酸配列の第５位のＸａａが、Ｉｌｅであり；配列番号１０で示されるアミノ酸配列の第６位のＸａａが、Ｔｙｒであることを特徴とする、請求項１または２に記載の抗体。 - 配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列および／または配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子。
- 配列番号１のアミノ酸配列を有する軽鎖と、配列番号２のアミノ酸配列を有する重鎖とを含む抗体を産生する方法であって、請求項４に記載のＤＮＡ分子を含む哺乳動物細胞を、前記抗体が発現される条件下で培養すること、ならびに発現された前記抗体を回収することを含む方法。
- 請求項５に記載の方法により産生された抗体。
- 請求項１～３のいずれか１項に記載の抗体、および１以上の薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む医薬組成物。
- 中枢神経外傷または中枢神経外傷後の全身性炎症反応症候群の治療に使用するための、請求項１～３のいずれか１項に記載の抗体。
- 前記中枢神経外傷が、脊髄損傷および外傷性脳損傷からなる群から選択されることを特徴とする、請求項８に記載の抗体。
- 中枢神経外傷または中枢神経外傷後の全身性炎症反応症候群の治療用医薬の製造に使用するための、請求項１～３のいずれか１項に記載の抗体。
- 前記中枢神経外傷が、脊髄損傷および外傷性脳損傷からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１０に記載の抗体。
- 治療に使用するための、請求項１～３のいずれか１項に記載の抗体。
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