KR20170127407A - 특발성 폐섬유증의 치료 방법 - Google Patents

특발성 폐섬유증의 치료 방법 Download PDF

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레나토 헤라르뒤스 실바노 히리비
요제프 마리아 헨드릭 라츠
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모디퀘스트 비.브이.
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Abstract

본 발명은 의학적 치료를 위한 방법 및 제제, 특히 특발성 폐섬유증(IPF)의 치료를 위한 방법 및 제제의 분야이다. 본 발명은, 선택된 시트룰린화 에피토프와 반응하는 항체 또는 그의 단편을 IPF의 치료에 사용하는, 상기 방법을 제공한다. 히스톤 폴리펩티드 H2A 및 H4의 아미노 말단에 위치한 시트룰린화 에피토프에 대한 항체가 특히 유용한 것으로 밝혀졌다. 그러므로, 본 발명은 특발성 폐섬유증의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 탈이민화 히스톤 H2A 또는 H4의 N-말단 상의 시트룰린화 에피토프와 특이적으로 반응하는 항체에 관한 것이다.

Description

특발성 폐섬유증의 치료 방법{METHOD FOR THE TREATMENT OF IDIOPATHIC PULMONARY FIBROSIS}
본 발명은 의학적 치료를 위한 방법 및 제제, 특히 특발성 폐섬유증(IPF)의 치료를 위한 방법 및 제제의 분야에 관한 것이다. 본 발명은, 선택된 시트룰린화 에피토프와 반응하는 항체 또는 그의 단편을 IPF의 치료에 사용하는, 상기 방법을 제공한다. 히스톤 폴리펩티드 H2A 및 H4의 아미노 말단에 위치한 시트룰린화 에피토프에 대한 항체가 특히 유용한 것으로 밝혀졌다.
특발성 폐섬유증(IPF)은, 발생률이 증가하고 있는, 병인이 알려지지 않은 복합적 만성 섬유증식성 폐질환이다. 상기 질환은 간질조직내 세포외기질의 진행성 축적을 특징으로 한다. 상기 질환은 단지 36개월의 추정 중앙 생존기간을 갖는 진행성이고 비가역적인 질환이다. 역사적으로, 면역억제제(예를 들면, 아자티오프린) 및/또는 N-아세틸시스테인과 함께 코르티코스테로이드(예를 들면, 프레드니솔론)가 IPF에 대해 적정하지만 증명되지 않은 치료 전략으로서 지지되어 왔다. 일본, 유럽, 인도 및 캐나다에서 IPF의 치료에 승인된 또 다른 약물은 피르페니돈(Pirfenidone)이다. 피르페니돈은 폐섬유증의 실험 모델에서 복합된 소염, 산화방지 및 항-섬유화 작용을 갖는 경구 투여되는 피리딘이지만, 정확한 작용 기전은 알려지지 않았다. 상기 피르페니돈은 개선된 무진행 생존 기간이 관찰된 유일한 약물이다. 현재, 현행 치료 전략이 IPF에서 섬유증을 역전시킬 수 있음을 시사하는 과학적인 증거는 없고, 연구중인 치료법의 현실적인 목표는 질환 진행의 속도를 안정화시키거나 감소시키는 것이다.
IPF에 대한 보다 우수하고 보다 효과적인 치료법이 절실히 필요함은 명백하다.
본 발명자들은 본원에서, 탈이민화 히스톤 H2A 또는 H4의 N-말단으로부터 유래된 펩티드 상의 시트룰린화 에피토프에 대해 유도된 항체가 IPF의 치료를 필요로하는 대상에게 투여될 때 IPF의 증상들이 예방되거나 개선되거나 제거될 수 있다는 증거를 제공한다. 시트룰린 잔기를 포함하는 탈이민화 H2A 또는 H4로부터 유래된 N-말단 펩티드로 면역화시킴으로써 동일한 효과가 달성될 수 있다.
도 1: 블레오마이신 유도된 폐섬유증 모델을 이용하여 체중 감소에 대한 MQ22.101의 영향을 검사하였다. 제0일에 마우스에게 PBS(다이아몬드) 또는 블레오마이신(0.045 단위/마우스)(삼각형 및 사각형)을 구강인두 점적주입하였다. 제0일, 제2일 및 제5일에, 마우스를 1 mg MQ22.101(삼각형), 1 mg 대조군 항체 MQ20.101(사각형) 또는 PBS(다이아몬드)로 복강내 처리하였다. 동물들은 제0일로부터 시작하여 제14일까지 하루걸러 계량하였다.
도 2: 블레오마이신 유도된 폐섬유증 모델을 이용하여 폐 염증/섬유증에 대한 MQ22.101의 영향을 검사하였다. 도 2A 및 2B에 나타낸 실험에 사용된 마우스들은 제0일에 PBS를 구강인두 점적주입한 반면, 도 2C 내지 2F에 나타낸 실험에 사용된 마우스들은 블레오마이신(0.045 단위/마우스)을 구강인두 점적주입하였다. 제0일, 제2일 및 제5일에, 도 2C 및 2D로부터의 마우스들은 1 mg MQ22.101로 복강내 처리하였고, 도 2E 및 2F로부터의 마우스들은 1 mg 대조군 항체 MQ20.101로 복강내 처리하였다. 마우스들을 14일(도 2A, 2C 및 2E) 또는 21일(도 2B, 2D 및 2F) 후에 희생시키고, 폐를 고정하고, 파라핀 포매시키고, 염증/섬유증의 양을 측정하기 위해 절편들을 마손(Masson) 염색시켰다.
도 3: 단백질(도 3a) 및 세포 함량(도 3b 내지 e)을 측정하기 위해 각 실험 군의 2마리 마우스들로부터의 BAL액을 수득하였다. BAL액을 수집하기 위해, 캐뉼라를 미리 준비된 기관내에 삽입한 후에, 폐를 3 부피의 PBS(총 부피 1 ml)로 세척하였다. 단백질 함량을 측정하였으며, 전체 세포수 및 감별 세포 수는 BAL액을 사용한 세포원심분리를 수행하고, 세포를 염색시키고, 그의 형태에 근거하여 상이한 세포 유형을 계수하고 확인함으로써 평가하였다.
도 4: 블레오마이신 유도된 폐섬유증 모델을 이용하여 폐에서의 염증 및 섬유증에 대한 MQ22.101 및 MQ22.101 b/d의 영향을 검사하였다. 제0일에 마우스들에게 블레오마이신을 구강인두 점적주입하였다. 제0일, 제2일 및 제5일에, 블레오마이신 처리된 군은 1 mg 마우스 항체 MQ22.101, 1 mg 마우스 항체 MQ20.101(무관한 이소타입 매칭된 대조군 항체) 또는 PBS를 함유하는 복강내 주사를 맞았다. 2개의 추가 블레오마이신 처리군은 제2일 및 제5일에 1 mg 인간화 MQ22.101(MQ22.101b/d) 또는 1 mg 인간 항체 MQR2.101(인간 대조군 항체)을 투여받았다. MQR2.101은 대조군 항체이다. 피르페니돈을 제0일부터 제13일까지 매일 투약하였다. 블레오마이신 또는 PBS 점적주입 2 주후에, 과다용량의 케타민 하이드로클로라이드(나르케탄) 및 자일라진 하이드로클로라이드(롬푼)를 사용하여 마우스를 안락사시켰다. 폐를 계량하고, 조직병리학적 분석을 위해 10% 완충 포르말린으로 고정시켰다. 매드테스 점수분석은 표 3 및 4에 따라 수행하였다. 점수: 0 내지 10. *비히클에 대한 p<0.05, 만-휘트니(Mann-Whitney) 검사.
본 발명을 이끈 실험들에서, 본 발명자들은 IPF에 대해 용인된 마우스 모델을 사용하였다. 상기 모델에서는, 실시예 1에서 상술된 바와 같이 블레오마이신의 구강인두 점적주입에 의해 C57BL/6 마우스의 폐에서 섬유증을 유도하였다. 대조군 동물들에겐 PBS를 구강인두 점적주입하였다.
탈이민화 히스톤 H2A 또는 H4의 N-말단 상의 시트룰린화 에피토프와 특이적으로 반응하는 항체를 블레오마이신-처리된 동물들에게 투여하였으며, IPF의 증상을 치료하는데 효과적인 것으로 나타났다. 상기 항체들은 이하에서 ACPA로 약칭되는 항-시트룰린 단백질 항체로 지칭된다.
ACPA는 숙련된 자에게 자체로 공지되어 있는 많은 상이한 방법들로 수득될 수 있다. 예를 들면, ACPA는, 실험 동물을 적절한 항원, 예를 들면, 탈이민화 히스톤 H2A 또는 H4의 N-말단 상의 시트룰린화 에피토프를 포함하는 펩티드로 면역화시킴으로써 생성될 수 있다. 상기 펩티드의 대표적인 예는 다음 아미노산 서열을 포함할 수 있다: SGCitGKQGGKARA(서열번호 1) 및 SGCitGKGGKGLGKGGAKRHRKVLR(서열번호 2), 표 1.
상기와 같이 수득된 항체는 히스톤 H2A 또는 H4의 N-말단 상의 시트룰린화 에피토프에 대한 그의 결합 특이성에 대해 검사될 수 있다. 상기 검사는 유리하게는, 서열번호 1 또는 서열번호 2에 따른 펩티드에 대한 항체의 결합을 히스톤 H2A 또는 H4의 N-말단 상의 시트룰린화 에피토프를 갖지 않는 대조군 펩티드와 비교함으로써 수행될 수 있다. 히스톤 H2A 또는 H4의 N-말단 상의 시트룰린화 에피토프를 함유하지 않는 펩티드의 대표적인 예는, 예를 들면, 아미노산 서열 SGRGKQGGKARA(서열번호 3) 및 SGRGKGGKGLGKGGAKRHRKVLR(서열번호 4)(표 1)을 포함하는 펩티드이다.
펩티드들
　서열번호 아미노산 서열
　서열번호 1 S G Cit G K Q G G K A R A
　서열번호 2 S G Cit G K G G K G L G K G G A K R H R K V L R
　서열번호 3 S G R G K Q G G K A R A
　서열번호 4 S G R G K G G K G L G K G G A K R H R K V L R
탈이민화 히스톤 H2A 또는 H4의 N-말단 상의 시트룰린화 에피토프에 대한 항체의 결합은, 항체가 탈이민화 히스톤 H2A 또는 H4의 N-말단 상의 시트룰린화 에피토프에 결합하는 반면, 히스톤 H2A 또는 H4의 N-말단 상의 시트룰린화 에피토프를 포함하지 않는 대조군 펩티드에는 더 적은 친화도하에 결합하는 경우, 특이적인 것으로 간주된다. 이와 관련하여 더 적은 친화도는 50% 이상 더 적은, 예를 들면, 75%, 90%, 95% 또는 95% 이상 더 적은 결합을 의미한다. 보다 바람직하게, 탈이민화 히스톤 H2A 또는 H4의 N-말단 상의 시트룰린화 에피토프에 대한 항체의 결합은 용이하게 검출가능한 반면, 시트룰린 잔기가 아르기닌 잔기로 치환된 동일 아미노산 서열을 갖는 펩티드에 대한 항체의 결합은 검출가능하지 않다.
본원에 개시된 특이적으로 반응하는 항체(RhmAb2.102, RhmAb2.108, RhmAb2. 109, RhmAb2.110, RhmAb2.111, RhmAb2.112, MQ22.101, MQ22.102 및 MQ22.101b/d)는 모두 서열번호 1 또는 서열번호 2에 따른 펩티드와 반응하는 것으로 밝혀졌으며, 이때 이들은 서열번호 3 또는 서열번호 4에 따른 펩티드에 대한 결합에 음성이었다. 상기 항체들은 또한 WO2011/070172호 및 WO2009/147201호에서 이미 개시되었다.
마우스 단일클론 항체 Rmmab22.101(본원에서 MQ22.101로 약칭)을, 탈이민화 히스톤 H2A 또는 H4의 N-말단 상의 시트룰린화 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체들의 부류를 대표하는 모델 항체로서 선택하였다.
MQ22.101 항체의 치료 활성은 다음과 같이 규명하였다. 블레오마이신 처리된 마우스는 단일클론 항체 MQ22.101 1 mg 또는 모디퀘스트 리서치 비.브이.(ModiQuest Research B.V.)로부터 입수된 이소타입 매칭된 대조군 항체 MQ20.101(카탈로그 번호, MQ20.101) 1mg를 함유하는 복강내 주사를 주입받았다.
제0일, 제2일 및 제5일에 동물들에게 단일클론 항체를 투여하였다. 제0일로부터 시작하여 제14일까지 하루걸러 모든 동물들의 체중을 측정하였다. 동물들의 체중 감소는 질환 중증도에 대한 척도로 간주되었다.
블레오마이신 + MQ20.101로 처리된 마우스가, 체중이 감소되지 않은 PBS 처리된 대조군 동물들에 비해 제14일째에 32%의 체중 감소하에 시간 경과에 따라 점차적으로 체중이 감소된 것이 관찰되었다(도 1). MQ22.101 처리된 군에서, 동물들은 제6일에 최대 17%의 감소하에 대량의 체중 감소로부터 보호되었고, 그 후 동물들은 시간경과에 따라 점차 체중이 증가되었음을 발견하였다(제0일에 비해 제14일에 10% 체중 감소).
블레오마이신 또는 PBS 점적주입 2주 또는 3주후에, 이소플루레인 마취하에 경추 탈골에 의해 마우스를 죽이고, 폐 및 기관지폐포세척(BAL)액을 수집하였다. 폐를 고정시키고, 파라핀 포매시키고, 염증/섬유증의 양을 평가하기 위해 절편들을 마손 염색하였다(도 2).
블레오마이신 + MQ20.101 처리된 마우스들이 섬유증의 징후를 나타내지 않은 대조군 마우스(PBS 처리)로부터의 폐에 비해 대량의 섬유증성 조직이 폐에 존재하는 것으로 관찰되었다. MQ22.101은 블레오마이신 처리된 마우스를 폐에서의 염증 반응 및 따라서 섬유증 형성으로부터 보호할 수 있었다(도 2).
BAL 중 총 단백질은 폐 손상에 대한 척도이다. 블레오마이신 + MQ20.101 처리된 마우스로부터의 BAL액은 식염수 처리된 마우스 및 MQ22.101 처리된 마우스에 비해 각각 4배 및 2배 더 많은 단백질을 함유하였다(도 3a). 또한, 전체 세포수 및 감별 세포수(호중구, 대식세포 및 림프구)를 BAL액에서 측정하였다. 총 세포량은 식염수 처리 마우스 및 MQ22.101 처리 마우스와 비교시 블레오마이신 + MQ20.101 처리된 마우스에서 현저하게 증가하였다(도 3b). 감별 세포수를 검토시(도 3c 내지 e), 가장 두드러진 차이는 호중구에서 확인되었고; 블레오마이신 + MQ20.101 처리된 마우스로부터의 BAL은 20% 호중구를 함유한 반면, 식염수 처리 마우스 및 MQ22.101 처리 마우스로부터의 BAL 중 호중구의 백분율은 0%에 가까웠다(도 3c).
전술한 실험을, 실시예 2에 기술된 바와 같은 약간의 미미한 변경하에, MQ22.101의 인간화 변이체를 사용하여 반복하였다. MQ22.101의 인간화 변이체인, MQ22.101b/d의 제조는 실시예 7에 기술되어 있다. MQ22.101로부터의 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL) 단편들을 인간 IgG1 카파 주쇄에 클로닝하였다. 이어서 VH 및 VL 도메인을 CDR 그라프팅에 의해 인간화시켰다. 표 2는 IMGT(http://www.imgt.org/)에 따른 VH CDR1, -2 및 -3 폴리펩티드(서열번호 5, 6 및 7) 및 VL CDR1, -2 및 -3 폴리펩티드(서열번호 8, 9 및 10)를 나타낸다.
실시예 2에 기술된 실험에서, 폐에서의 염증 및 섬유증의 조직병리학적 분석을 매드테스 점수(Madtes scoring)[Madtes DK et al., A J Respir Cell Mol Biol 20, 924-934, 1999]를 이용하여 평가하였다. 항체 MQ22.101 및 그의 인간화 대응물 MQ22.101b/d만이 대조군 항체 MQ20.101 및 MQR2.101과 비교시 폐에서의 염증 및 섬유증을 감소시켰다(도 4). 모디퀘스트 리서치 비.브이.로부터 입수된 MQR2.101(카탈로그 번호, MQ20.101)은 MQ22.101b/d에 대한 이소타입 매칭된 대조군 항체이다.
MQ22.101b/d로부터 유도된 VH 및 VL CDR 서열*
서열번호 VH 또는 VL CDR 아미노산 서열
서열번호 5 VH CDR1 GYTFTNY
서열번호 6 VH CDR2 INTYSGEA
서열번호 7 VH CDR3 LRGYTYQSFDEGGDY
서열번호 8 VL CDR1 QSLLDSDGKTY
서열번호 9 VL CDR2 LVS
서열번호 10 VL CDR3 WQGTHFPYT
*IMGT 데이터베이스에 따른 CDR 주석.
ACPA 및 특히 MQ22.101 및 그의 인간화 대응물 MQ22.101b/d는 마우스를 폐에서의 염증 및 섬유증으로부터 보호하는 것으로 결론지었다.
여기서 선택된 모델 시스템은 IPF의 인간 버전을 대표하는 것이므로, 탈이민화 히스톤 H2A 또는 H4의 N-말단 상의 시트룰린화 에피토프와 특이적으로 반응하는 항체는 특발성 폐섬유증의 예방 또는 치료에 사용될 수 있는 것으로 결론지어진다.
전술한 바와 같은 수동적 치료 백신접종(항체의 투여)에서의 사용에 이어서, 본 발명은 또한 그를 필요로 하는 대상에서 생체내에서 면역 반응을 유도함으로써 수행될 수 있다. 상기 목적으로, 본 발명자들은 탈이민화 히스톤 H2A 또는 H4의 N-말단 상의 시트룰린화 에피토프를 포함하는 펩티드를 사용하였다. 상기 펩티드들은 마우스에서 피하로(능동적 치료 백신접종) 투여되었으며, 수동적으로 면역화된 마우스에서 나타난 역가와 동일한 역가의 특이적 ACPA를 마우스에서 유도하였다. 상기 마우스들은 블레오마이신 점적주입에 더 이상 반응성이지 않았으며 그들의 수동적 면역화된 대응물과 동일한 증상의 부재를 나타내었다.
이와 관련하여, 용어 "시트룰린과 특이적으로 반응하는" 또는 "시트룰린화 에피토프와 반응하는" 또는 "시트룰린화 에피토프와 특이적으로 반응하는"은, 시트룰린 잔기를 함유하는 펩티드와 같은 구조물과 반응하는 항체 또는 항체 단편을 말하는 반면, 상기 항체 또는 항체 단편은 시트룰린 잔기 대신 아르기닌 잔기를 함유하는 동일한 구조물과는 덜 반응하거나 바람직하게는 전혀 반응하지 않는다. 용어 "펩티드"는 본원에서 기술된 바와 같은 항체와의 면역반응성에 대한 적절한 환경에서, 바람직하게는 인간 또는 동물 신체에서 나타나는 바와 동일한 환경에서, 바람직하게는 천연 폴리펩티드의 환경에서, 시트룰린 잔기를 제공할 수 있는 구조물로서 이해해야 한다. 천연 항체(면역글로불린으로도 알려져 있음)는 척추동물의 혈액 또는 다른 체액에서 발견될 수 있는 감마 글로불린 단백질이며, 세균 및 바이러스와 같은 외래 물질을 확인하고 중화시키기 위해 면역계에 의해 사용된다.
천연 항체는 전형적으로, 예를 들면, 1개 단위를 갖는 단량체, 2개 단위를 갖는 이량체 또는 5개 단위를 갖는 오량체를 형성하는 기본 구조 단위(각각 2개의 큰 중쇄 및 2개의 작은 경쇄를 가짐)로 이루어진다. 항체는 B 세포로 불리는 백혈구 세포에 의해 생성된다. 여러 상이한 유형의 중쇄가 존재하여, 상이한 종류들의 항체를 제공한다. 항체들은 그들이 갖는 중쇄를 기준으로 상이한 이소타입으로 분류될 수 있다. 상이한 역할을 수행하는 5개의 상이한 항체 이소타입들이 포유동물에서 알려져 있으며, 그들이 접하는 각각의 상이한 유형의 외래 물질에 대해 적절한 면역 반응을 유도하는 것을 돕는다. 낙타과(예를 들면, 라마) 및 상어와 같은 일부 동물 종은 비정상적인 항체 구조를 가질 수 있다.
모든 항체들의 일반적인 구조는 매우 유사하지만, 단백질의 끝에 있는 소(小)영역은 매우 가변적이어서, 약간 상이한 끝부분 구조를 갖는 수백만개의 항체가 존재하게 된다. 상기 영역은 초가변 영역으로 알려져 있다. 이들 변이체들 각각은 항원으로 알려진 상이한 표적에 결합할 수 있다. 항체들의 이러한 무한한 다양성은 면역계로 하여금 동일하게 광범위하게 다양한 항원들을 인식하게 한다.
항체에 의해 인식되는 항원의 독특한 부분을 에피토프라고 부른다. 상기 에피토프들은, 항체로 하여금 유기체를 구성하는 수백만개의 상이한 분자들의 중앙에서 그들의 독특한 항원을 확인하고 상기 항원에만 결합하게 하는 매우 특이적인 상호작용하에 그의 항체에 결합한다. 항체에 의한 항원의 인식은 면역계의 다른 부분들에 의한 공격에 대해 상기 항원을 표지화한다. 항체는 또한, 예를 들면, 감염을 야기하기 위해 필요한 병원체의 일부에 결합함으로써 표적을 직접 중화시킬 수 있다.
항체들의 크고 다양한 집단은, 상이한 항원 결합 부위(또는 파라토프)를 암호화하는 한 세트의 유전자 분절들의 무작위적 조합에 이어, 추가의 다양성을 제공하는, 항체 유전자의 상기 영역에서의 무작위 돌연변이에 의해 생성된다. 항체 유전자들은 또한, 중쇄의 염기를 또 다른 염기로 변화시키는 종류 변환으로 불리는 과정에서 재구성되어, 항원 특이적 가변 영역을 보유하는 항체의 상이한 이소타입을 생성한다. 이로 인해 단일 항체가 면역계의 여러 상이한 부분들에 의해 여러 상이한 이소타입들에서 사용될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이 용어 "항체들" 또는 "항체"는 흔히 "항원"으로 지칭되는 표적 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 구조물, 바람직하게는 단백질 또는 폴리펩티드 구조물을 말한다.
항체는 단일쇄 항체, 단일쇄 가변 단편(scFv), 단편 항원 결합 영역(Fab), 재조합 항체, 단일클론 항체, 천연 항체 또는 압타머(aptamer)의 항원-결합 도메인을 포함하는 융합 단백질, VHH 항체로도 알려진 단일 도메인 항체(sdab), 나노바디(nanobody)(낙타과 유래 단일 도메인 항체), VNAR로 불리는 상어 IgNAR 유래 단일 도메인 항체 단편, 또는 그의 단편 또는 일부로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
또 다른 바람직한 태양에서, 항체는 천연 항체의 항원-결합 도메인을 포함하는 융합 단백질이다.
항체 또는 다른 특이적 결합 분자의 배경에서 용어 "그의 일부" 또는 "그의 단편"은 항체 또는 특이적 결합 분자의 특이적 결합 부위를 구성하는 항체 또는 특이적 결합 분자의 부분을 말하는 것을 의미하며, 전체 항체 또는 특이적 결합 분자와 동일한 에피토프와 여전히 반응할 수 있는 항체 또는 특이적 결합 분자의 부분으로서 이해될 수 있다.
인간 항체 또는 그의 단편은 본 발명의 바람직한 실시양태이다. 바람직하게, IgG1 중쇄 및 람다 또는 파카 경쇄를 갖는 IgG1 항체가 유리하게 사용될 수 있다. 그러나, 카파 또는 람다 경쇄와 함께 IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgAsec, IgD 및 IgE를 포함하여 다른 인간 항체 이소타입들도 또한 본 발명에 포함된다. 또한 다양한 이소타입의 모든 동물-유래 항체도 본 발명에 사용될 수 있다. 항체는 전체-크기 항체, 또는 Fab, F(ab')2, 단일쇄 Fv 단편, 또는 단일 도메인 VHH, VH 또는 VL 단일 도메인을 포함하여 항체의 항원-결합 단편일 수 있다.
용어 "시트룰린화 에피토프와 반응하는 항체"는 펩티드 또는 펩티드 핵산 또는 펩티드 모방 구조물과 같은 보다 큰 구조물의 배경에서 시트룰린 잔기와 특이적으로 반응하는 항체로서 이해되어야 한다.
시트룰린은 정상적인 번역시에는 단백질에 혼입되지 않는 아미노산이지만, 펩티딜아르기닌 데이미나제(PAD)에 의한 아르기닌 잔기의 번역후 변형에 의해 생성될 수 있다.
시트룰린화는, 펩티딜아르기닌 데이미나제(PAD)에 의해 촉진되는, 아르기닌 잔기의 시트룰린 잔기로의 번역후 전환이다. 펩티딜아르기닌 데이미나제(PAD; EC 3.5.3.15) 효소는 단백질에서 아르기닌 잔기의 시트룰린 잔기로의 전환을 촉진한다. 시트룰린을 위한 tRNA는 존재하지 않으며, 단백질중 시트룰린 잔기의 존재는 전적으로 번역후 변형의 결과이다. 포유동물(인간, 마우스 및 래트)에서, 각각 별개의 유전자에 의해 암호화되는 5개의 PAD 이소타입들(PAD1 내지 PAD6; "PAD4" 및 "PAD5"는 동일한 이소타입에 사용된다)이 확인되었다[Vossenaar et al, Bioessays 25, 1106-1118, 2003]. 모든 상기 효소들은 활성에 있어서 Ca2 +의 존재에 강하게 의존하며, 유리 L-아르기닌을 유리 L-시트룰린으로 전환시킬 수 없다. 유리 L-아르기닌은, 진핵생물에서 산화질소 합성효소(EC 1.14.13.39)에 의해 또는 세균에서 아르기닌 데이미나제(EC 3.5.3.6)에 의해 유리 L-시트룰린으로 전환될 수 있다. 이들 효소는 Ca2 + 의존성이 아니다.
매우 상동성인 PAD 효소들 사이의 가장 확연한 차이는 그들의 조직-특이적 발현이다. 표피에서, PAD1(동의어: PAD I, I형 PAD)은 케라틴세포 분화의 최종 단계시 케라틴 필라멘트의 시트룰린화에 수반되며, 이것은 각화 피막의 재구성에 중요하다. 표피에서 또 다른 시트룰린화 부위는 모공으로, 상기 모공은 PAD3(동의어 PAD III, III형 PAD) 및 그의 천연 기질인 트리코히알린(THH)을 함유한다. THH는 내모근초 세포 및 모공의 수질층, 및 보다 적게, 다른 분화된 상피의 주요 구조 단백질이다. 가장 최근에 확인된 PAD 이소타입인 PAD6(동의어: ePAD)은, 초기 배발생에서 중요한 역할을 하는 마우스 난모세포의 세포질 시트에서 발견되었다. 그의 인간 상동분자(orthologue)의 발현은 난소, 고환 및 말초혈 백혈구에 제한되는 것으로 밝혀졌다[Chavanas et al., Gene 330; 19-27, 2004]. 원래, 상기 PAD 이소타입은 ePAD로 명명되었지만, 다른 PAD들의 체계적인 번호지정에 근거하여, 상기 이소타입은 PAD6으로 재명명되었다[Vossenaar et al., Bioessays 25 1106-1118, 2003]. 가장 광범위하게 발현되는 이소타입인 PAD2(동의어 PAD II, II형 PAD, PAD-H19)는 골격근, 뇌, 비장, 분비선 및 대식세포와 같은 많은 상이한 조직들에 존재한다. 상기 광범위한 발현 패턴에도 불구하고, 수초 염기성 단백질(MBP) 및 비멘틴만이 천연 기질로서 확인되었다. 다발성 경화증(MS)에서, 환자들은 MBP에 대해 자가면역 반응을 나타낸다. MBP는 수초의 풍부한 단백질이며, 그의 시트룰린화는 중추신경계의 발생시에 일어난다. 비멘틴의 시트룰린화는 인간 및 마우스 대식세포의 칼슘-이오노포어 유도된 세포자살시에 관찰되었으며, 전술한 바와 같이, 시트룰린화된 비멘틴은 RA-특이적 항-Sa 자가항체들의 표적인 것으로 나타났다. 모두 주로 세포의 세포질에 편재된(localized), 상기에서 논의된 PAD들과 대조적으로, PAD4 이소타입(동의어: PAD IV, IV형 PAD, HL-60 PAD, PAD V, V형 PAD, PADI4)은 핵에 편재된다. PAD4의 핵 편재화 신호는 단백질의 N-말단 영역에서 발견되었다. PAD4는 주로 말초혈 과립구 및 단핵구에서 발현된다. 핵내 PAD4의 기질은 히스톤 코어 단백질(H2A, H3 및 H4), 및 리보솜 조립체, 핵세포질 수송 및 중심체 복제에서 작용하는 핵인 단백질인 뉴클레오포스민/B23이다.
본원에 개시된 바와 같은 단일클론 항체와 경쟁하는 항체들은 또한 유리하게 본 발명에 사용될 수 있다. 상기 경쟁 항체들은 표준 절차에 의해 선별될 수 있다. 요약하면, 탈이민화 히스톤 H2A 또는 H4의 N-말단 상의 시트룰린화 에피토프를 포함하는 펩티드를 고체 지지체 상에 고정화시키는 ELISA와 같은 결합 분석법이 개발될 수 있다. 본원에 개시된 바와 같은 단일클론 항체들은 표지화될 수 있으며, 고정화된 항원에 대한 그의 결합의 방해는 통상적인 분석에 의해 용이하게 측정될 수 있다. 상기 및 기타 더 복잡한 방법들이 숙련된 자들에게 공지되어 있으며 통상적인 실험실 환경에서 통상적으로 수행될 수 있다.
특히, 고체 지지체상에 고정화된 서열번호 1 또는 서열번호 2에 따른 임의의 항원 펩티드를 사용하여 분석법들이 용이하게 개발될 수 있다. RhmAb2.102, RhmAb2.108, RhmAb2.109, RhmAb2.110, RhmAb2.111, RhmAb2.112, MQ22.101, MQ22.102 및 MQ22.101b/d로 이루어진 군에서 선택된 단일클론 항체들은 표지화되고 검사 항체의 존재 및 부재하에서 고정화된 항원과 접촉될 수 있다. 검사 항체가 결합을 방해하는 경우, 즉, 임의의 표지된 항체를 사용하여 수득된 신호를 저하시키는 경우, 상기 검사 항체는 표지된 항체의 결합과 경쟁하는 것으로 결론지을 수 있다. 그렇다면 상기 경쟁 항체는 본 발명의 방법에 사용하기에 적합할 것이나, 단 상기 항체는 시트룰린 잔기가 아르기닌 잔기로 치환된 동일 서열을 갖는 펩티드와 반응하지 않아야 한다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 항체는 필수적으로 2가지 방법으로 생성될 수 있다. 먼저, 이들은 본원에 제공된 바와 같은 항체 및 그의 서열들로부터 유도될 수 있다. 항체들의 반응성은 심지어 부위-지향 돌연변이유발, 쇄 셔플링, 성적 PCR에 의해, 또는 당해 분야에 숙련된 자에게 공지된 항체 유도 및 최적화를 위한 다른 방법들에 의해 개선될 수 있다. 또는, 항체는 본원에 기술된 바와 같은 특이적으로 반응하는 에피토프, 특히 탈이민화 히스톤 2A, 서열번호 1 또는 서열번호 2에 따른 서열을 포함하는 펩티드 및 다른 특별하게 반응성인 펩티드 중 어느 하나로 패닝(panning)함으로써 수득될 수 있다.
당해 분야에 숙련된 자라면, 예를 들면, 하기 실시예에서 기술되는 바와 같은 cDNA 또는 게놈 서열을 클로닝하거나 생성하기 위해 본원에 기술된 서열들을 사용할 수 있다. pcDNA3(인비트로겐(In Vitrogen))과 같은 적절한 진핵세포 발현 벡터 또는 그의 유도체들에서 상기 서열들의 클로닝, 및 적절한 경쇄 및 중쇄 함유 벡터의 조합에 의한 포유동물 세포(CHO 세포와 같은)의 후속 형질감염은 필요한 항체들의 발현 및 분비를 야기할 것이다.
마우스 단일클론 MQ22.101은 기탁된 바와 같은 그들 각각의 하이브리도마 세포주(DSMZ 수탁번호 ACC3031)에 의해 직접 발현되고 분비될 수 있다.
숙련된 자라면 또한 항체 서열의 특이적 결합 도메인을 사용하여 본원에 기술된 바와 같은 특이적 결합 분자의 유사체를 제조하고, 폴리펩티드, 예를 들면, 융합 단백질과 같은 상이한 배경에서 이들을 발현시킬 수 있다. 이것은 당해 분야에 공지되어 있다.
본 문서 및 특허청구범위에서, 동사 "포함하다" 및 그의 활용형은, 비-제한적 의미에서 상기 단어 뒤에 오는 대상들이 포함되지만 구체적으로 언급되지 않은 대상들이 배제되지 않음을 의미하기 위해 사용된다. 또한, 단수형 표현에 의한 요소들에 대한 언급은, 문맥이 1개 및 오직 1개의 요소가 존재하는 것을 명백히 요구하지 않는 한, 하나보다 많은 요소가 존재할 가능성을 배제하지 않는다. 따라서, 단수형 표현은 통상적으로 "적어도 하나"를 의미한다.
이론에 결부시키고자 하는 것은 아니지만, MQ22.101 및 그의 인간 대응물 표적은 호중구 세포외 덫(Neutrophil Extracellular Trap, NET)에서 히스톤을 탈이민화시킴으로써, 활성화 및 따라서 염증성 호중구의 유입을 억제함으로써 염증 과정을 차단할 수 있다고 가정한다. NET는 염증에 수반될 뿐 아니라 섬유아세포 분화에 대한 그의 영향을 통해 이어지는 섬유증에도 수반되는 것이 문헌 [Chrysanthopoulou et al. J Pathol 233, 294-307, 2014]에서 밝혀졌으므로, 본 발명에 따른 항체 치료에 주목되는 표적이 된다. 본 발명에 따른 항체 치료는, 면역계 또는 다른 일반적인 하우스 홀딩 경로를 방해하지 않기 때문에 심각한 부작용을 갖지 않는다.
실시예
실시예 1: 섬유증에 대한 실험 동물 모델
암컷 C57BL/6 마우스(6 내지 8 주령)를 잭슨 래버러토리(Jackson Laboratory)로부터 구입하였다. 모든 마우스를 무병원체 조건하에서 유지시켰으며, 음식과 물은 자유롭게 제공하였다. 마우스가 8 내지 10 주령(19 내지 21 g 계량)이 되었을 때 제0일에, 블레오마이신(0.045 단위/마우스)의 구강인두 점적주입에 의해 폐 손상을 유도하였다. 대조군 동물들은 PBS의 구강인두 점적주입을 투여받았다. 제0일, 제2일 및 제5일에, 블레오마이신 처리된 군은 1 mg MQ22.101 또는 1 mg의 대조군 항체 MQ20.101(무관한 이소타입 매칭된 대조군 항체)을 함유하는 복강내 주사를 투여받았다. 제0일로부터 시작하여 제14일까지 하루걸러 모든 동물들의 체중을 측정하였다(도 1).
블레오마이신 또는 PBS 점적주입 2주 또는 3주후에, 이소플루레인 마취하에 경추 탈골에 의해 마우스를 죽이고, 폐 및 기관지폐포세척(BAL)액을 수집하였다. 폐를 고정시키고, 파라핀 포매시키고, 염증/섬유증의 양을 평가하기 위해 절편들을 마손 염색하였다(도 2). 단백질 함량뿐 아니라 전체 세포수 및 감별 세포수(호중구, 대식세포 및 림프구)를 BAL에서 측정하였다. 단백질 함량을 측정하였으며, 전체 세포수 및 감별 세포수는 BAL액을 사용하여 세포원심분리(cytospin)를 수행하고, 세포를 염색하고, 그의 형태에 근거하여 상이한 세포 유형을 계수하고 확인함으로써 평가하였다(도 3).
실시예 2: 확인 실험
실시예 1에서 수득된 결과를 약간 변화된 실험 구성하에 별개의 독립적인 실험에서 확인하였다.
수컷 C57BL/6N 마우스(도착시 19 내지 21 g)를 찰스 리버(Charles River)로부터 구입하였다. 모든 마우스를 무병원체 조건하에서 유지시켰으며, 음식과 물은 자유롭게 제공하였다. 마우스가 8 내지 10 주령(19 내지 21 g 계량)이 되었을 때 제0일에, 블레오마이신의 비강내 투여에 의해 폐 손상을 유도하였다. 블레오마이신 설페이트를 0.4 mg/ml의 블레오마이신의 농도에 이르도록 0.9% NaCl 용액에 용해시키고(10 mg/25 ml), 이어서 1 ml의 분취량으로 분할하고, -20 ℃에서 저장하였다. 투여하기 위한 블레오마이신 용액의 용량은 50 ㎕/마우스였다. 대조군 동물들은 PBS를 비강내 투여받았다. 피르페니돈은 블레오마이신 유도된 폐 섬유증 동물 모델에서 폐 섬유증에 대한 확립된 치료제로 사용되어 왔다. 매일 아침, 0.5% 카복시메틸 셀룰로스 나트륨 염 중에 적절한 양의 피르페니돈을 용해시켜 일일 투약을 위한 피르페니돈을 제조하였다. 투여 부피는 10 ml/kg 체중이었다. 피르페니돈은 매일 2회, 두번의 투여 사이에 7.5 시간의 간격하에 경구적으로 투여하였다. 주말동안, 마우스는 아침에 총 일일 용량을 투여받았다.
처리: 제0일, 제2일 및 제5일에, 블레오마이신 처리된 군은 1 mg 마우스 항체 MQ22.101, 1 mg 마우스 항체 "MQ20.101"(무관한 이소타입 매칭된 대조군 항체) 또는 PBS를 함유하는 복강내 주사를 투여받았다. 2개의 추가 블레오마이신 처리 군은 제2일 및 제5일에 1 mg 인간화 MQ22.101("MQ22.101b/d") 또는 1 mg 인간 "MQR2.101"(인간 대조군 항체)을 투여받았다. MQR2.101은 대조군 항체이다. 피르페니돈은 제0일로부터 제13일까지 매일 투여되었다. 블레오마이신 또는 PBS 점적주입 2 주후에, 과다용량의 케타민 하이드로클로라이드(나르케탄(Narketan)) 및 자일라진 하이드로클로라이드(롬푼(Rompun))를 사용하여 마우스를 안락사시켰다. 조직병리학적 분석을 위해 폐를 10% 완충 포르말린으로 고정시켰다(매드테스 점수: 표 3 및 4).
조직병리학적 평가를 위해, 전체 폐를 파라핀에 포매시키고 말로리(Mallory)에 따라 염색하였다. 폐의 조직학적 변화는 매드테스 점수 방법[Madtes DK et al. Am J Respir Cell Mol Biol 20: 924-934, 1999]을 이용하여 평가하였다. 매드테스 점수 체계는 섬유증 및 염증 파라미터를 고려한다(표 3 및 4; 도 4). 10개의 로우 파워 필드(low power field)(LPF, 즉 50x 배율)를 염증 점수 체계(표 3 참조)에 따라 염증에 대해 검사하고, 섬유증 점수 체계(표 4 참조)에 따라 섬유증에 대해 검사하였다. 스크리닝 필드는 좌측 및 우측 폐엽을 커버하였다: 좌폐(4xLPF) 및 우폐(전엽 2xLPF, 후엽 2xLPF, 중엽 1xLPF 및 부엽 1xLPF). 각 동물들에 대해 최종 점수를 10개 LPF로부터의 중앙값으로서 산출하였다.
염증 점수
염증 점수
정상 폐(무염증) 0
전체 폐 면적의 <50% 경미한 염증 1
전체 폐 면적의 >50% 경미한 염증 2
전체 폐 면적의 <50% 중간정도 염증 3
전체 폐 면적의 >50% 중간정도 염증 4
전체 폐 면적의 <50% 현저한 염증 5
전체 폐 면적의 >50% 현저한 염증 6
섬유증 점수 체계
섬유증 점수
정상 폐(무섬유증) 0
염증이 발생된 면적의 <50%에서 미세한 결합성 피브릴 1
염증이 발생된 면적의 >50%에서 미세한 결합성 피브릴 2
염증 면적의 <50%에서 거친 다발과 함께
염증이 발생된 면적 100%에서 미세한 결합성 피브릴		 3
염증 면적의 >50%에서 거친 다발과 함께
염증이 발생된 면적 100%에서 미세한 결합성 피브릴		 4
총 매드테스 점수 = 염증 + 섬유증 점수
실시예 3: ACPA의 생성
WO 2011/070172호에서 이미 기술된 바와 같이 DBA/J1 마우스에서 서열번호 1 및 서열번호 2에 따른 펩티드로 마우스를 면역화시킴으로써 탈이민화 히스톤 H2A 또는 H4의 N-말단 상의 시트룰린화 에피토프를 포함하는 펩티드에 대한 항체를 증대시켰다.
간략하게, 면역화 과정을 개시한 지 125일 후에 혈청 샘플을 수거하고 시트룰린 특이적 항원 반응에 대해 분석하였다. 이것은, 항원으로서 서열번호 3에 따른 펩티드를 사용한 ELISA와 비교시 항원으로서 서열번호 1에 따른 펩티드를 사용한 ELISA에서 수득된 신호를 비교함으로써 수행되었다. 모든 마우스들은 검사한 시점들에서 특이적 항원 특이적 혈청 역가를 나타내었다.
하이브리도마 세포주를 생성하기 위해, 마지막 항원접종후에 비장을 절개하고 비장으로부터 비장세포를 수거하고 표준 절차에 따라서 마우스 골수종 세포주(NS-1)와 융합시켰다. 하이브리도마 상등액 중에서의 항체 특이성은 시트룰린 함유 항원상에서 뿐만 아니라 비-시트룰린화 등가물 상에서도 스크리닝하였다.
이에 의해 MQ22.101(DSMZ 수탁번호 ACC3031)을 생성하는 하이브리도마 클론이 생성되었다. 이어서 서열번호 11 및 서열번호 12 각각에 따른 중쇄 및 경쇄의 후속 서열분석을 수행하였다.
실시예 4: ACPA의 에피토프 지도분석
96-웰 ELISA 플레이트를 4 ℃에서 밤새 배양하여 뉴트라비딘(0.1 ㎍/웰)으로 코팅하였다. 웰을 PBS-트윈20(PBS-T)으로 5회 세척하고 실온(RT)에서 1 시간동안 PBS-T + 1% 소 혈청 알부민(BSA)과 함께 배양하여 차단하였다. PBS-T로 5회 이상 세척후, 웰을 RT에서 1 시간동안, 서열번호 1 및 서열번호 2에 따른, 히스톤 H2A 유도된 시트룰린 및 비오틴 함유 펩티드(0.3 ㎍/웰)와 함께 배양하였다. 모든 사용된 펩티드들은 유리 N-말단 NH2 기를 함유하였다. PBS-T로 5회 이상 더 세척한 후, 웰을 RT에서 1 시간동안 10 ㎍/웰의 농도에서 시작하여 PBS-T + 1% BSA 중의 MQ22.101 또는 MQ22.101b/d의 연속 희석물과 함께 배양하였다. 웰을 PBS-T로 5회 세척하고 RT에서 토끼-항-인간-HRP(1:2000)와 함께 1 시간동안 배양한 후 PBS-T로 5회 세척하고 PBS로 3회 세척하였다. 웰을 TMB 기질과 함께 5 분동안 배양한 후에 2M H2SO4로 반응을 중단시켰다. 450 nm에서 광학 밀도를 측정하였으며, 이것은 사용된 항체의 친화도에 대한 척도이다.
MQ22.101 및 MQ22.101b/d는 히스톤 H2A의 N-말단 시트룰린화 펩티드(서열번호 1)에는 결합하지만 아르기닌 함유 펩티드(서열번호 3)에는 결합하지 않았다. 히스톤 H4의 N-말단 시트룰린화 펩티드(서열번호 2)에 대한 MQ22.101 및 MQ22.101b의 결합은 유사한 결과를 나타내었다.
실시예 5: 시트룰린-함유 펩티드를 사용한 백신접종은 생체내에서 보호 면역 반응을 일으킨다
서열번호 1 또는 서열번호 2(표 1)의, 시트룰린 잔기를 함유하는 합성 히스톤 펩티드에 대한 면역 반응을 C57BL/6N 마우스(도착시 19 내지 21 g)에서 유도하였다. 면역화 과정 개시후 제57일과 제80일 사이에서 혈청 샘플을 수거하고 시트룰린 함유 펩티드 특이적 항원 반응에 대해 분석하였다. 서열번호 1 및/또는 서열번호 2에 따른 시트룰린 함유 펩티드와 반응성인 특이적 항원 혈청 역가를 나타내지만 서열번호 3 및 서열번호 4에 따른 아르기닌 함유 펩티드와는 반응하지 않는 마우스를, 실시예 1에서 설명한 바와 같이 블레오마이신의 구강인두 점적주입에 의해 폐 손상을 유도하기 위해 사용하였다. 모든 동물들의 체중은 제0일로부터 시작하여 제21일까지 하루걸러 측정하였다.
블레오마이신 또는 PBS 점적주입 2주 및 3주후에, 이소플루레인 마취하에 경추 탈골에 의해 마우스를 죽이고, 폐 및 기관지폐포세척(BAL)액을 수집하였다. 폐를 고정시키고, 파라핀 포매시키고, 염증/섬유증의 양을 평가하기 위해 절편들을 마손 염색하였다. 단백질 함량뿐만 아니라 전체 세포수 및 감별 세포수(호중구, 대식세포 및 림프구)를 BAL에서 측정하였다. 단백질 함량을 측정하였으며, 전체 세포수 및 감별 세포수는 BAL액을 사용하여 세포원심분리를 수행하고, 세포를 염색하고, 그의 형태에 근거하여 상이한 세포 유형을 계수하고 확인함으로써 평가하였다
상기 마우스들의 임상 파라미터들에 관한 결과는, ACPA 항체 MQ22.101로 수동 면역화된 마우스와 동일하지 않으면, 필적하였다.
실시예 6: ACPA에 대한 검출 분석
치료 성질을 갖는 항체들을 구별하는 분석은 고체 지지체상에 고정화된 서열번호 1 또는 서열번호 2에 따른 항원 단백질을 이용하여 용이하게 개발될 수 있다. 예를 들면, MQ22.101(또는 치료 성질을 갖는 임의의 다른 ACPA)을 표지화하고 검사 항체의 존재 및 부재하에서 고정화된 항원과 접촉시킬 수 있다. 검사 항체가 결합을 방해하는 경우, 즉, 표지된 MQ22.101을 사용하여 수득된 신호를 저하시키는 경우, 상기 검사 항체는 표지된 MQ22.101의 결합과 경쟁하는 것으로 결론지을 수 있다. 그런 경우 상기 경쟁 항체는 본 발명의 방법에 사용하기에 적합할 것이나, 단 상기 항체는 시트룰린 잔기가 아르기닌 잔기로 치환된 동일 서열(서열번호 3 및 서열번호 4)을 갖는 펩티드와 반응하지 않아야 한다.
실시예 7: MQ22.101b/d의 제조
하이브리도마 MQ22.101로부터의 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL) 단편들을 RT-PCR에 의해 수득하였으며, 인간 IgG1 및 인간 카파 불변 도메인을 함유하는 발현 벡터내에 클로닝하였다. 이어서, VH 및 VL 도메인들을 CDR 그라프팅에 의해 인간화시키고 생식세포화시켰다. 표 2는 MQ22.101b/d로부터의 VH CDR1, -2 및 -3 폴리펩티드(서열번호 5, 6 및 7) 및 VL CDR1, -2 및 -3 폴리펩티드(서열번호 8, 9 및 10)를 나타낸다.
DSMZ DSMACC3031 20091202
SEQUENCE LISTING <110> ModiQuest B.V. <120> METHOD FOR THE TREATMENT OF IDIOPATHIC PULMONARY FIBROSIS <130> 287 WO <140> PCT/EP2015/079443 <141> 2015-12-11 <150> EP 14197374.3 <151> 2014-12-11 <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> Xaa <222> (3)..(3) <223> Xaa is citrulline <400> 1 Ser Gly Xaa Gly Lys Gln Gly Gly Lys Ala Arg Ala 1 5 10 <210> 2 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> Xaa <222> (3)..(3) <223> Xaa is citrullin <220> <221> Xaa <222> (3)..(3) <223> Xaa is citrulline <400> 2 Ser Gly Xaa Gly Lys Gly Gly Lys Gly Leu Gly Lys Gly Gly Ala Lys 1 5 10 15 Arg His Arg Lys Val Leu Arg 20 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Ser Gly Arg Gly Lys Gln Gly Gly Lys Ala Arg Ala 1 5 10 <210> 4 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Ser Gly Arg Gly Lys Gly Gly Lys Gly Leu Gly Lys Gly Gly Ala Lys 1 5 10 15 Arg His Arg Lys Val Leu Arg 20 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 1 5 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Ile Asn Thr Tyr Ser Gly Glu Ala 1 5 <210> 7 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Leu Arg Gly Tyr Thr Tyr Gln Ser Phe Asp Glu Gly Gly Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 8 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr 1 5 10 <210> 9 <211> 3 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Leu Val Ser 1 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Tyr Thr 1 5 <210> 11 <211> 367 <212> DNA <213> mus musculus <400> 11 cggatccagt tggtgcagtc tggacctgaa ctgaagaagc ctggtgaggc agtcaagatc 60 tcctgtaagg cttctggata taccttcaca aactatggta tgcactggat gaaacagact 120 ccaggaaagg attttaggtg gatgggctgg ataaacacct acagtggaga ggcaacatat 180 gttgatgact tcaagggacg cttcgccttc tctttgggaa cctctgccag cactgcctat 240 ttgcagatca acaacctcaa gaatgacgac acggctacat atttctgttt aagaggctat 300 acttaccaaa gtttcgacga agggggcgac tactggggcc agggcaccgc tctcacagtc 360 tcctcag 367 <210> 12 <211> 338 <212> DNA <213> mus musculus <400> 12 gatgttgtga tgacccagac tccactcact ttgtcggtta ccactggaca accagcctcc 60 atctcttgca agtcaagtca gagcctcttg gatagtgatg gaaagacata tttgaattgg 120 ttgtttcaga ggccaggcca gtctccaaag cgcctaatat atctggtgtc taaactggac 180 tctggagtcc ctgacaggtt cactggcagt ggatcaggga cagatttcac actgaaaatc 240 agcagagtgg aggctgagga tttgggaatt tattattgct ggcaaggtac acattttccg 300 tacacgttcg gaggggggac caatttggaa ataaaacg 338

Claims (7)

  1. 특발성 폐섬유증의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 탈이민화 히스톤 H2A 또는 H4의 N-말단 상의 시트룰린화 에피토프와 특이적으로 반응하는 항체.
  2. 제1항에 있어서,
    시트룰린화 에피토프가 서열번호 1 또는 서열번호 2에 따른 서열을 포함하는 펩티드 상에 존재하는, 항체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    단일클론 항체인 항체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열번호 5에 따른 폴리펩티드를 포함하는 중쇄 CDR1 도메인, 서열번호 6에 따른 폴리펩티드를 포함하는 중쇄 CDR2 도메인, 서열번호 7에 따른 폴리펩티드를 포함하는 중쇄 CDR3 도메인, 서열번호 8에 따른 폴리펩티드를 포함하는 경쇄 CDR1 도메인, 서열번호 9에 따른 폴리펩티드를 포함하는 경쇄 CDR2 도메인, 및 서열번호 10에 따른 폴리펩티드를 포함하는 경쇄 CDR3 도메인을 포함하는 항체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    수탁번호 ACC3031 하에 DSMZ에 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생성된 단일클론 항체 RmmAb 22.101에 함유된 중쇄 및 경쇄를 포함하는 항체.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열번호 1 또는 서열번호 2에 따른 펩티드에 대한 결합에 있어서 단일클론 항체 RmmAb 22.101과 경쟁하는 항체.
  7. 탈이민화 히스톤 H2A 또는 H4의 N-말단을 포함하는 펩티드를 포함하되, 상기 N-말단이 시트룰린화 에피토프를 포함하는, 특발성 폐섬유증의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 조성물.
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