CN107108725B - 特发性肺纤维化的治疗方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于用于医学治疗、特别是特发性肺纤维化(IPF)的治疗的方法和制剂的领域。本发明提供了这些方法，在所述方法中将与所选瓜氨酸化表位反应的抗体或其片段用于IPF的治疗。发现针对位于组蛋白多肽H2A和H4的氨基端处的瓜氨酸化表位的抗体是特别有用的。因此，本发明涉及与脱亚胺基组蛋白H2A或H4的N‑端上的瓜氨酸化表位特异性反应的抗体，其用于特发性肺纤维化的预防或治疗。

Description

特发性肺纤维化的治疗方法

技术领域

本发明属于用于医学治疗、特别是特发性肺纤维化(IPF)的治疗的方法和制剂的领域。本发明提供了这些方法，在所述方法中将与所选瓜氨酸化表位反应的抗体或其片段用于IPF的治疗。发现针对位于组蛋白多肽H2A和H4的氨基端处的瓜氨酸化表位的抗体是特别有用的。

背景技术

特发性肺纤维化(IPF)是一种病因学未知的复杂的慢性纤维增殖性肺病，具有越来越高的发病率。所述疾病的特征在于间质内细胞外基质的逐渐积累。它是渐进性且不可逆的疾病，估计的存活时间中值仅为36个月。在历史上，已提出将皮质类固醇(例如泼尼松龙)与免疫抑制剂(例如硫唑嘌呤)和/或N-乙酰半胱氨酸的组合作为用于IPF的合理但未被证实的治疗策略。另一种在日本、欧洲、印度和加拿大已被批准用于IPF治疗的药物是吡非尼酮。吡非尼酮是一种口服给药的吡啶，其在肺纤维化的实验模型中具有组合的消炎、抗氧化和抗纤维化作用，尽管确切的作用机制尚不了解。它是已观察到无进展存活时间延长的唯一药物。目前，没有科学证据表明当前的治疗策略可以在IPF中逆转纤维化；正在调查的疗法的现实目标是使疾病发展的速率稳定或降低。

显然，迫切地需要用于IPF的更好且更有效的治疗。

发明内容

在本文中，我们提供了当将针对源自于脱亚胺基组蛋白H2A或H4的N-端的肽上的瓜氨酸化表位的抗体给药到需要这样的治疗的受试者时，可以阻止、改善或废除IPF的症状这一证据。通过用源自于脱亚胺基组蛋白H2A或H4的包含瓜氨酸残基的N-端肽进行免疫接种，可以实现同样的效果。

发明详述

在产生本发明的实验中,我们利用了公认的用于IPF的小鼠模型。在该模型中，通过如实施例1中详细描述的博来霉素的口咽滴注，在C57BL/6小鼠的肺中诱导纤维化。对照动物接受PBS的口咽滴注。

与脱亚胺基组蛋白H2A或H4的N-端上的瓜氨酸化表位特异性反应的抗体被给药到博来霉素处理的动物，并显示出在治疗IPF的症状中有效。这些抗体在后文中被称为抗瓜氨酸蛋白抗体，简写为ACPA。

ACPA可以以本身被专业技术人员所知的多种不同方式获得。例如，ACPA可以通过用适合的抗原例如包含脱亚胺基组蛋白H2A或H4的N-端上的瓜氨酸化表位的肽免疫实验动物来产生。这些肽的代表性实例可以包含下列氨基酸序列：SGCitGKQGGKARA(SEQ ID NO：1)和SGCitGKGGKGLGKGGAKRHRKVLR(SEQ ID NO：2)，表1。

可以试验由此获得的抗体与所述组蛋白H2A或H4的N-端上的瓜氨酸化表位结合的特异性。有利的是，这可以通过将所述抗体与符合SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的肽的结合同与不携带所述组蛋白H2A或H4的N-端上的瓜氨酸化表位的对照肽的结合进行比较来进行。不含所述组蛋白H2A或H4的N-端上的瓜氨酸化表位的肽的代表性实例是例如包含表1的氨基酸序列SGRGKQGGKARA(SEQ ID NO：3)和SGRGKGGKGLGKGGAKRHRKVLR(SEQ ID NO：4)的肽。

表1：肽

SEQ ID NO：	氨基酸序列
		SEQ ID NO：1	S G Cit G K Q G G K A R A
SEQ ID NO：2	S G Cit G K G G K G L G K G G A K R H R K V L R
		SEQ ID NO：3	S G R G K Q G G K A R A
SEQ ID NO：4	S G R G K G G K G L G K G G A K R H R K V L R

如果抗体结合于脱亚胺基组蛋白H2A或H4的N-端上的瓜氨酸化表位，而它以较低的亲和性结合于不包含所述组蛋白H2A或H4的N-端上的瓜氨酸化表位的对照肽，则认为所述抗体与脱亚胺基组蛋白H2A或H4的N-端上的瓜氨酸化表位的结合是特异性的。在这种情形中，较低的亲和性意味着结合低至少50％，例如低75％、90％、95％或超过95％。更优选地，所述抗体与所述脱亚胺基组蛋白H2A或H4的N-端上的瓜氨酸化表位的结合可以容易地检测，而所述抗体与具有相同氨基酸序列但其中瓜氨酸残基被精氨酸残基置换的肽的结合不可检测到。

已发现，本文中公开的特异反应性抗体(RhmAb2.102、RhmAb2.108、RhmAb2.109、RhmAb2.110、RhmAb2.111、RhmAb2.112、MQ22.101、MQ22.102和MQ22.101b/d)都与符合SEQID NO：1或SEQ ID NO：2的肽反应，其中它们与具有SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4的肽的结合是阴性的。这些抗体以前也已公开在WO2011/070172和WO2009/147201中。

选择小鼠单克隆抗体Rmmab22.101(在本文中简写为MQ22.101)作为模型抗体，其代表了特异性结合于脱亚胺基组蛋白H2A或H4的N-端上的瓜氨酸化表位的抗体类别。

MQ22.101抗体的治疗活性如下确立。博来霉素处理的小鼠接受含有1mg单克隆抗体MQ22.101或1mg从ModiQuest Research B.V.获得的同种型匹配的对照抗体MQ20.101(目录号MQ20.101)的腹膜内注射液。

在第0、2和5日将单克隆抗体给药到所述动物。从第0日起直至第14日，每隔一日评估所有动物的体重。取动物的体重减轻作为疾病严重性的度量。

我们观察到，与体重没有任何减轻的PBS处理的对照小鼠相比，用博来霉素+MQ20.101处理的小鼠体重随时间逐渐减轻，在第14日体重减轻32％(图1)。在MQ22.101处理的组中，我们发现动物受到保护以对抗体重的巨大减轻，最大值为第6日的17％，随后动物的体重随时间逐渐增加(与第0日相比，第14日体重减轻10％)。

在博来霉素或PBS滴注后2或3周，在异氟烷麻醉下通过颈椎脱位杀死小鼠，并收集肺和支气管肺泡灌洗(BAL)液。将肺固定，石蜡包埋，并将切片进行Masson染色，以便评估炎症/纤维化的量(图2)。

我们观察到，与来自于没有任何纤维化征兆的对照小鼠(PBS处理)的肺相比，博来霉素+MQ20.101处理的小鼠在肺中存在大量纤维化组织。MQ22.101能够保护所述博来霉素处理的小鼠免于肺中的炎性应答以及因此纤维化的形成(图2)。

BAL中的总蛋白是肺损伤的度量。与盐水处理和MQ22.101处理的小鼠相比，来自于博来霉素+MQ20.101处理的小鼠的BAL液含有分别高4和2倍的蛋白(图3A)。此外，在BAL液中测量了总细胞和差别细胞计数(嗜中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞)。如果与盐水处理和MQ22.101处理的小鼠相比，在博来霉素+MQ20.101处理的小鼠中细胞的总数显著增加(图3B)。当着眼于差别细胞计数(图3C-E)时，对嗜中性粒细胞发现了最显著的差异；来自于博来霉素+MQ20.101处理的小鼠的BAL含有20％的嗜中性粒细胞，而来自于盐水处理和MQ22.101处理的小鼠的BAL中的嗜中性粒细胞的百分率接近0％(图3C)。

使用MQ22.101的人源化版本重复上面描述的实验，并如实施例2中所述进行了一些微小修改。MQ22.101的人源化版本MQ22.101b/d的制造，描述在实施例7中。将来自于MQ22.101的可变重链(VH)和可变轻链(VL)片段克隆到人IgG1κ骨架中。随后通过CDR嫁接将VH和VL结构域人源化。表2示出了符合IMGT(http://www.imgt.org/)的VH CDR1、-2和-3多肽(SEQ ID NO：5、6和7)和VL CDR1、-2和-3多肽(SEQ ID NO：8、9和10)。

在实施例2中描述的实验中，使用Madtes评分(Madtes DK等，A J Respir CellMol Biol 20,924-934,1999)评估了肺中炎症和纤维化的组织病理学分析。如果与对照抗体MQ20.101和MQR2.101相比，只有MQ22.101及其人源化对应物MQ22.101b/d减少了肺中的炎症和纤维化(图4)。从ModiQuest Research B.V.获得的MQR2.101(目录号MQ20.101)是MQ22.101b/d的同种型匹配的对照抗体。

表2：源自于MQ22.101b/d的VH和VL CDR序列*

SEQ ID NO:	VH或VL	CDR	氨基酸序列
				SEQ ID NO：5	VH	CDR1	GYTFTNY
SEQ ID NO：6	VH	CDR2	INTYSGEA
				SEQ ID NO：7	VH	CDR3	LRGYTYQSFDEGGDY
SEQ ID NO：8	VL	CDR1	QSLLDSDGKTY
				SEQ ID NO：9	VL	CDR2	LVS
SEQ ID NO：10	VL	CDR3	WQGTHFPYT

*CDR注释根据IMGT数据库。

结论是，ACPA、特别是MQ22.101及其人源化对应物MQ22.101b/d，保护小鼠免于肺中的炎症和纤维化。

由于这里所选的模型系统代表了IPF的人类版本，因此得出结论，与脱亚胺基组蛋白H2A或H4的N-端上的瓜氨酸化表位特异性反应的抗体可能被用于特发性肺纤维化的预防或治疗。

从如上所述的在被动治疗性疫苗接种(抗体的给药)中的用途，接下来，本发明还可以通过在需要的受试者中体内诱导免疫应答来实践。为此目的，我们使用了包含脱亚胺基组蛋白H2A或H4的N-端上的瓜氨酸化表位的肽。将这些肽在小鼠中皮下给药(主动治疗性疫苗接种)，并在小鼠中引发与在被动免疫接种的小鼠中发现的滴度相同的滴度的特异性ACPA。这些小鼠不再对博来霉素滴注响应，并显示出与它们的被动免疫接种的对应物相同的症状缺失。

术语：在本文中，“与瓜氨酸特异性反应”或“与瓜氨酸化表位反应的”或“与瓜氨酸表位特异性反应的”是指抗体或抗体片段与诸如含有瓜氨酸残基的肽的结构反应，然而所述抗体或抗体片段与含有精氨酸残基代替所述瓜氨酸残基的相同结构反应较低或优选地完全不反应。术语肽应该被解释为能够在用于与本文中所描述的抗体的免疫反应的正确背景中，优选地在与它在人类或动物体内表现出的相同的背景中，优选地在天然多肽的背景中，呈递瓜氨酸残基的结构。天然抗体(也被称为免疫球蛋白)是可以在脊椎动物的血液或其他体液中发现，并被免疫系统用于识别和中和外来物体例如细菌和病毒的γ球蛋白。

天然抗体通常由基本结构单元构成，每个基本结构单元具有两条大的重链和两条小的轻链，以形成例如具有一个单元的单体、具有两个单元的二聚体或具有5个单元的五聚体。抗体由被称为B细胞的白细胞产生。存在几种不同类型的重链，产生不同类型的抗体。抗体可以根据它们具有的重链分成不同的同种型。在哺乳动物中已知5种不同的抗体同种型，它们执行不同功能，并帮助指导对于它们遇到的每种不同类型的外来物体来说适合的免疫应答。某些动物物种例如骆驼科动物(例如美洲鸵)和鲨鱼可能具有异常的抗体结构。

尽管所有抗体的通用结构非常相似，但在所述蛋白顶端处的小区域极为可变，允许存在数百万计的具有略微不同的顶端结构的抗体。该区域被称为超变区。每个这些变体可以结合被称为抗原的不同的靶。这种巨大的抗体多样性允许免疫系统识别同样广泛多样化的抗原。

所述抗原被抗体识别的独特部分被称为表位。这些表位与它们的抗体以高特异性相互作用结合，允许抗体在构成生物体的数百万不同分子中仅仅识别并结合它们的独特抗原。抗原被抗体的识别将它做出标记，以被免疫系统的其他部分攻击。抗体也可以例如通过结合到病原体的引起感染所需的部分，直接中和靶。

抗体的大且多样的群体通过一组编码不同抗原结合位点(或补位)的基因区段的随机重组，然后通过产生进一步多样性的该抗体基因区域中的随机突变来产生。抗体基因也在被称为类别转换的过程中重新组织，所述类别转换将重链的碱基改变成另一个碱基，产生所述抗体的保留了抗原特异性可变区的不同同种型。这允许单一抗体以几种不同的同种型被免疫系统的几个不同部分使用。

当在本文中使用时，术语“抗体”是指能够特异性结合到通常被称为“抗原”的靶分子的结构，优选为蛋白质或多肽结构。

抗体可以选自单链抗体、单链可变片段(scFv)、片段抗原结合区(Fab)、重组抗体、单克隆抗体、包含天然抗体的抗原结合结构域或适体的融合蛋白、也被称为VHH抗体的单结构域抗体(sdab)、纳米抗体(骆驼科动物来源的单结构域抗体)、被称为VNAR的鲨鱼IgNAR来源的单结构域抗体片段，或其片段或部分。

在另一个优选实施方式中，抗体是包含天然抗体的抗原结合结构域的融合蛋白。

在抗体或其他特异性结合分子的情形中，术语“或其部分”或“其片段”意指抗体或特异性结合分子的构成所述抗体或特异性结合分子的特异性结合位点的部分，并且可以被解释为抗体或特异性结合分子的仍然能够与所述整个抗体或特异性结合分子的相同的表位反应的部分。

人类抗体或其片段是本发明的优选实施方式。优选地，可以有利地使用具有IgG1重链和λ或κ轻链的的IgG1抗体。然而，其他人类抗体同种型也被本发明涵盖，包括IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgAsec、IgD和IgE与κ或λ轻链的组合。此外，也可以在本发明中使用所有动物来源的各种不同同种型的抗体。所述抗体可以是全尺寸抗体或抗体的抗原结合片段，包括Fab、F(ab’)2、单链Fv片段或单结构域VHH、VH或VL单结构域。

术语“与瓜氨酸化表位反应的抗体”应该被解释为与较大的结构例如肽或肽核酸或肽模拟结构的背景中的瓜氨酸残基特异性反应的抗体。

瓜氨酸是一种在正常翻译期间不掺入到蛋白质中的氨基酸，然而，它可以通过精氨酸残基被肽酰精氨酸脱亚胺酶(PAD)的翻译后修饰来产生。

瓜氨酸化是精氨酸残基向瓜氨酸残基的翻译后转化，其由肽酰精氨酸脱亚胺酶(PAD)催化。肽酰精氨酸脱亚胺酶(PAD；EC 3.5.3.15)催化蛋白质中精氨酸残基向瓜氨酸残基的转变。不存在用于瓜氨酸的tRNA，蛋白质中瓜氨酸残基的存在完全是翻译后修饰的结果。在哺乳动物(人类、小鼠和大鼠)中，已经鉴定到5种PAD同种型(PAD1–PAD6；“PAD4”和“PAD5”被用于同一同种型)，各自由不同基因编码(Vossenaar等，Bioessays 25,1106-1118,2003)。所有这些酶的活性强烈依赖于Ca2+的存在，并且不能将游离L-精氨酸转变成游离L-瓜氨酸。游离L-精氨酸可以被真核生物中的一氧化氮合酶(EC1.14.13.39)或细菌中的精氨酸脱亚胺酶(EC 3.5.3.6)转变成游离L-瓜氨酸。这些酶不是Ca2+依赖性的。

高度同源的PAD酶之间的最显著差异是它们的组织特异性表达。在表皮中，PAD1(同义词：PAD I，PAD I型)在角化蛋白分化的最终阶段中参与角蛋白丝的瓜氨酸化，其对于角质化包膜的重新组织来说是重要的。表皮中的另一个瓜氨酸化位点是毛囊，其含有PAD3(同义词：PAD III，PAD III型)及其天然底物毛透明蛋白(THH)。THH是内根鞘细胞和毛囊的髓质层以及较低程度上其他特化表皮的主要结构蛋白。最近鉴定到的PAD同种型PAD6(同义词：ePAD)存在于小鼠卵母细胞的细胞质板中，其在早期胚胎发生中发挥重要作用。已发现，它的人类直系同源物的表达局限于卵巢、睾丸和外周血白细胞(Chavanas等，Gene 330；19-27,2004)。最开始，这种PAD同种型被称为ePAD，但在其他PAD的系统编号的基础上，这种同种型被重新命名为PAD6(Vossenaar等，Bioessays 25 1106-1118,2003)。最广泛表达的同种型PAD2(同义词：PAD II，PAD II型，PAD-H19)存在于许多不同组织例如骨骼肌、脑、脾、分泌腺和巨噬细胞中。尽管存在这种广泛表达模式，但只有髓鞘碱性蛋白(MBP)和波形蛋白已被鉴定为天然底物。在多发性硬化症(MS)中，患者发生针对MBP的自体免疫应答。MBP是髓鞘的丰富蛋白，并且它的瓜氨酸化发生在中枢神经系统发育期间。在钙离子载体诱导的人类和小鼠巨噬细胞的凋亡期间观察到波形蛋白的瓜氨酸化，并且如上所述已显示瓜氨酸化的波形蛋白是RA特异性抗Sa自体抗体的靶。与上面讨论的全都主要位于细胞的细胞质中的PAD相反，PAD4同种型(同义词：PAD IV，PAD IV型，HL-60PAD，PAD V，PAD V型，PADI4)位于核中。PAD4的核定位信号存在于所述蛋白质的N-端区域中。PAD4主要表达在外周血粒细胞和单核细胞中。在核中PAD4的底物是组蛋白核心蛋白(H2A、H3和H4)和核仁磷酸蛋白/B23，后者是一种在核糖体装配、核细胞质运输和中心体复制中发挥作用的核仁蛋白。

与本文中公开的单克隆抗体竞争的抗体也可以在本发明中有利地使用。这些竞争抗体可以通过标准程序来选择。简单来说：可以开发结合测定法例如ELISA，其中将包含脱亚胺基组蛋白H2A或H4的N-端上的瓜氨酸化表位的肽固定在固相支持物上。可以将本文公开的单克隆抗体标记，并且可以通过常规分析容易地确定对它们与固定化抗原的结合的干扰。这些以及其他更加精心设计的方法对于专业技术人员来说是已知的，并且可以在普通实验室背景中常规地进行。

具体来说，可以容易地开发使用固定在固相支持物上的符合SEQ ID NO：1或SEQID NO：2的任一抗原性肽的测定法。可以将选自RhmAb2.102、RhmAb2.108、RhmAb2.109、RhmAb2.110、RhmAb2.111、RhmAb2.112、MQ22.101、MQ22.102和MQ22.101b/d的单克隆抗体标记，并在测试抗体存在和不存在的情况下与所述固定化的抗原相接触。如果所述测试抗体干扰结合，即降低使用任何标记的抗体获得的信号，则可以得出结论，所述测试抗体竞争所述标记的抗体的结合。这种竞争抗体然后将适合用于本发明的方法中，只要它不与具有相同序列但其中瓜氨酸残基被精氨酸残基替换的肽反应即可。

符合本发明的用途的抗体基本上可以通过两种方式产生。首先，它们可以源自于本文中提出的抗体及其序列。所述抗体的反应性甚至可以通过定点突变、链穿梭、有性PCR或通过本领域技术人员已知的其他抗体衍生和优化手段来提高。或者，抗体可以通过淘选来获得，所述淘选使用本文中描述的任何特异性反应的表位，特别是脱亚胺基组蛋白2A、包含符合SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的序列的肽和其他特定反应性肽。

本领域技术人员可以使用本文中描述的序列来克隆或产生cDNA或基因组序列，例如在下面的实施例中所描述的。这些序列在适合的真核表达载体例如pcDNA3(InVitrogen)或其衍生载体中的克隆，以及随后用适合的含有轻链和重链的载体的组合转染哺乳动物细胞(如CHO细胞)，将导致所需抗体的表达和分泌。

小鼠单克隆抗体MQ22.101可以被它们相应的被保藏的杂交瘤细胞系(DSMZ编号ACC 3031)直接表达和分泌。

专业技术人员也可以通过使用抗体序列的特异性结合结构域制造本文中描述的特异性结合分子的类似物并将它们在不同背景例如多肽如融合蛋白中表达。这在本领域中是公知的。

在本文件及其权利要求书中，动词“包含”及其变化形式以其非限制性意义使用，意味着在所述词语后面的条目被包括，但不排除没有具体提到的条目。此外，对没有具体数目的要素的指称，不排除存在超过一个所述要素的可能性，除非上下文明确要求存在一个并且仅有一个所述要素。因此，没有具体数目的指称物通常意味着“至少一个”指称物。

不希望受到理论限制，我们假设MQ22.101及其人类对应物靶向嗜中性粒细胞细胞外阱(Neutrophil Extracellular Trap)(NET)中的脱亚胺基组蛋白，并因此能够通过抑制炎性嗜中性粒细胞的活化以及因此抑制其流入来阻断炎性过程。Chrysanthopoulou等(JPathol 233,294-307,2014)已显示，NET不仅参与炎症，而且通过它们对成纤维细胞分化的影响而参与随之而来的纤维化，从而变成符合本发明的抗体疗法的有吸引力的靶。符合本发明的抗体疗法没有严重副作用，因为它不干扰免疫系统或其他通用看家(householding)途径。

实施例

实施例1：用于纤维化的实验动物模型

雌性C57BL/6小鼠(6-8周龄)购自The Jackson Laboratory。所有小鼠被维持在无病原体条件下，并提供随意取用的食物和水。在第0日，当小鼠为8-10周龄(体重19-21g)时，通过博来霉素口咽滴注(0.045单位/小鼠)诱导肺损伤。对照动物接受PBS气管内滴注。在第0、2和5日，博来霉素处理组接受含有1mg MQ22.101或1mg对照抗体MQ20.101(无关的同种型匹配的对照抗体)的腹膜内注射液。从第0日开始直至第14日期间，每隔一日评估所有动物的体重(图1)。

在博来霉素或PBS滴注后2和3周，在异氟烷麻醉下通过颈椎脱位杀死小鼠，并收集肺和支气管肺泡灌洗(BAL)液。将肺固定，石蜡包埋，并对切片进行Masson染色，以便评估炎症/纤维化的量(图2)。测量BAL中的蛋白质含量以及总的和差异细胞计数(嗜中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞)。测量蛋白质含量，并通过用BAL液进行细胞离心涂片，对细胞染色，并在它们的形态的基础上计数和鉴定不同细胞类型，来评估总的和差异细胞计数(图3)。

实施例2：验证实验

在具有略微改变的实验设置的分开且独立的实验中，验证在实施例1中获得的结果。

雄性C57BL/6N小鼠(收到时19-21克)购自Charles River。所有小鼠被维持在无病原体条件下，并提供随意取用的食物和水。在第0日，当小鼠为8-10周龄(体重19-21g)时，通过博来霉素鼻内激惹诱导肺损伤。将硫酸博来霉素溶解在0.9％NaCl溶液中(10mg/25ml)以便达到0.4mg/mL的博来霉素浓度，然后分成1ml的等分试样，储存在-20℃下。用于激惹的博来霉素溶液剂量为50μl/小鼠。对照动物接受PBS的鼻内激惹。在博来霉素诱导的肺纤维化动物模型中，吡非尼酮已被用作确立的肺纤维化治疗。每天早晨，通过将适合量的吡非尼酮溶解在0.5％羧甲基纤维素钠盐中，制备用于每日给药的吡非尼酮。给药体积为10mL/kg体重。吡非尼酮每日两次经口给药，两次给药之间间隔7.5h。在周末，小鼠在早晨接受总的每日剂量。

治疗：在第0、2和5日，博来霉素处理组接受含有1mg小鼠抗体MQ22.101、1mg小鼠抗体MQ20.101(无关的同种型匹配对照抗体)或PBS的腹膜内注射液。两个另外的博来霉素处理组在第2和5日接受1mg人源化MQ22.101(MQ22.101b/d)或1mg人MQR2.101(人对照抗体)。MQR2.101是对照抗体。从第0日至第13日，每日给药吡非尼酮。在博来霉素或PBS滴注后两周，将小鼠用过量的盐酸氯胺酮(Narketan)和盐酸甲苯噻嗪(Rompun)安乐死。将肺用10％的缓冲的福尔马林固定，用于组织病理学分析(Madtes评分：表3和4)。

对于组织病理学评估来说，将整个肺包埋在石蜡中并按照Mallory进行染色。使用Madtes评分方法评估肺的组织学变化(Madtes DK等，Am J Respir Cell Mol Biol 20:924-934,1999)。Madtes评分系统将纤维化和炎症参数考虑在内(表3和4；图4)。对10个低倍率视野(LPF，即50x放大倍数)进行检查，对于炎症来说按照炎症评分流程(参见表3)，对于纤维化来说按照纤维化评分流程(参见表4)。筛选覆盖左和右肺叶的视野：左肺(4xLPF)和右肺(颅侧叶2xLPF，尾侧叶2xLPF，中叶1xLPF和副叶1xLPF)。对于每只动物来说，最终评分被计算为10个LPF的中值。

表3：炎症评分

表4：纤维化评分流程

总Madtes分值＝炎症+纤维化分值

实施例3：ACPA的产生

如以前在WO 2011/070172中所述，通过在DBA/J1小鼠中用符合SEQ ID NO：1和SEQID NO 2的肽对小鼠进行免疫接种，产生针对包含脱亚胺基组蛋白H2A或H4的N-端上的瓜氨酸化表位的肽的抗体。

简单来说：在免疫接种过程开始后第125日，获取血清样品并分析瓜氨酸特异性抗原的应答。这通过将在使用符合SEQ ID NO：1的肽作为抗原的ELISA中获得的信号与使用符合SEQ ID NO：3的肽作为抗原的ELISA进行比较来进行。所有小鼠在试验的时间点处显示出特异性的抗原特异性血清滴度。

为了产生杂交瘤细胞系，在最后一次加强后剖开脾脏，从脾脏收获脾细胞，并按照标准程序与小鼠骨髓瘤细胞系(NS-1)融合。杂交瘤上清液中的抗体特异性在含有瓜氨酸的抗原以及非瓜氨酸化等同物上筛选。

这产生了生产MQ22.101的杂交瘤克隆(DSMZ登记号ACC3031)。随后对重链和轻链的测序分别符合SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12。

实施例4：ACPA的表位作图

通过在4℃下温育过夜，将96孔ELISA板用中性亲和素(0.1μg/孔)包被。将孔用PBS-Tween20(PBS-T)清洗5次，并通过与PBS-T+1％牛血清白蛋白(BSA)在室温(RT)下温育1小时进行封闭。在用PBS-T进一步清洗5次后，将孔在RT下与组蛋白H2A来源的含有瓜氨酸和生物素的符合SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的肽(0.3μg/孔)温育1小时。所有使用的肽含有游离的N-端NH2基团。在用PBS-T另外清洗5次后，将孔在RT下与MQ22.101或MQ22.101b/d在PBS-T+1％BSA中的连续稀释液温育1小时，所述抗体始于10μg/孔的浓度。将孔用PBS-T清洗5次，并在RT下与兔抗人HRP抗体(1:2000)温育1小时，然后用PBS-T清洗5次并用PBS清洗3次。将孔与TMB底物温育5min，然后用2M H₂SO₄终止反应。在450nm处测量光密度，并将其作为所使用的抗体的亲和性的度量。

MQ22.101和MQ22.101b/d结合于组蛋白H2A的N-端的瓜氨酸化的肽(SEQ ID NO：1)，但是不结合于含有精氨酸的肽(SEQ ID NO：3)。MQ22.101和MQ22.101b与组蛋白H4的N-端的瓜氨酸化的肽(SEQ ID NO：2)的结合显示出类似结果。

实施例5：使用含有瓜氨酸的肽的疫苗接种在体内产生保护性免疫应答.

在C57BL/6N小鼠(收到时19-21克)中引发针对SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的含有瓜氨酸残基的合成组蛋白肽(表1)的免疫应答。在免疫接种过程开始后第57至80日之间，获取血清样品并分析含瓜氨酸肽特异性抗原应答。显示出与符合SEQ ID NO 1和/或SEQ IDNO：2的含瓜氨酸肽反应，但不与符合SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的含精氨酸肽反应的特异性抗原血清滴度的小鼠，被用于如实施例1中所解释的通过博来霉素的口咽滴注来诱导肺损伤。从第0日开始直至第21日，每隔一日评估所有动物的体重。

在博来霉素或PBS滴注后2和3周，在异氟烷麻醉下通过颈椎脱位杀死小鼠，并收集肺和支气管肺泡灌洗(BAL)液。将肺固定，石蜡包埋，并对切片进行Masson染色以便评估炎症/纤维化的量。测量BAL中的蛋白质含量以及总的和差异细胞计数(嗜中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞)。测量蛋白质含量，并通过用BAL液进行细胞离心涂片，对细胞染色，并在它们的形态的基础上计数和鉴定不同细胞类型，来评估总的和差异细胞计数。

这些小鼠的临床参数的结果，即使不与用ACPA抗体MQ22.101被动免疫的小鼠的结果一致，也是可比的。

实施例6：用于ACPA的检测测定法

使用固定在固相支持物上的符合SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的抗原性蛋白，可以容易地开发用于辨别具有治疗性质的抗体的测定法。例如，可以将MQ22.101(或任何其他具有治疗性质的ACPA)标记，并在测试抗体存在和不存在的情况下与所述固定化的抗原相接触。如果所述测试抗体干扰结合，即降低使用标记的MQ22.101获得的信号，则可以得出结论，所述测试抗体竞争标记的MQ22.101的结合。这种竞争抗体然后将适合用于本发明的方法中，只要它不与具有相同序列但其中瓜氨酸残基被精氨酸残基替换的肽(SEQ ID NO：3和SEQ ID NO 4)反应即可。

实施例7：MQ22.101b/d的制造

通过RT-PCR从杂交瘤MQ22.101获得可变重链(VH)和可变轻链(VL)片段，并将其克隆到含有人IgG1和人κ恒定结构域的表达载体中。随后通过CDR嫁接将VH和VL结构域人源化并建立种系。表2示出了来自于MQ22.101b/d的VH CDR1、-2和-3多肽(SEQ ID NO：5、6和7)以及VL CDR1、-2和-3多肽(SEQ ID NO：8、9和10)。

附图说明

图1：

使用博来霉素诱导的肺纤维化模型来检测MQ22.101对体重减轻的影响。在第0日，小鼠接受PBS(菱形)或博来霉素(0.045单位/小鼠)(三角形和正方形)的口咽滴注。在第0、2和5日，将小鼠用1mg MQ22.101(三角形)、1mg对照抗体MQ20.101(正方形)或PBS(菱形)腹膜内治疗。从第0日开始直至第14日，每隔一日对动物称重。

图2：

使用博来霉素诱导的肺纤维化模型来检测MQ22.101对肺炎症/纤维化的预防的影响。在图2a和2b中示出的实验中使用的小鼠在第0日接受PBS口咽滴注，而在图2c-f中示出的实验中使用的小鼠接受博来霉素口咽滴注(0.045单位/小鼠)。在第0、2和5日，来自于图2c-d的小鼠用1mg MQ22.101腹膜内处理，来自于图2e-f的小鼠用1mg对照抗体MQ20.101腹膜内处理。在14(图2a、2c和2e)或21日(图2b、2d和2f)后，将小鼠处死，将肺固定，石蜡包埋，并对切片进行Masson染色，以便评估炎症/纤维化的量。

图3：

从每个实验组的2只小鼠获得BAL液，以便测量蛋白质(图3a)和细胞含量(图3b-e)。为了收集BAL液，将插管插入到以前准备好的气管中，然后将肺用3倍体积的PBS(总体积1mL)灌洗。测量蛋白质含量，并通过用BAL液进行细胞离心涂片，对细胞染色，并在它们的形态的基础上计数和鉴定不同细胞类型，来评估总的和差异细胞计数。

图4：

使用博来霉素诱导的肺纤维化模型来检测MQ22.101和MQ22.101b/d对肺中的炎症和纤维化的影响。在第0日，小鼠接受博来霉素口咽滴注。在第0、2和5日，博来霉素处理组接受含有1mg小鼠抗体MQ22.101、1mg小鼠抗体MQ20.101(无关的同种型匹配对照抗体)或PBS的腹膜内注射液。两个另外的博来霉素处理组在第2和5日接受1mg人源化MQ22.101(MQ22.101b/d)或1mg人抗体MQR2.101(人对照抗体)。MQR2.101是对照抗体。从第0日至第13日，每日给药吡非尼酮。在博来霉素或PBS滴注后两周，将小鼠用过量的盐酸氯胺酮(Narketan)和盐酸甲苯噻嗪(Rompun)安乐死。将肺称重并用10％的缓冲的福尔马林固定，用于组织病理学分析。Madtes评分按照表3和4进行。分值：0-10。

*针对介质p<0,05，Mann-Whitney检验。

序列表

<110> 莫蒂克斯特私人有限公司

<120> 特发性肺纤维化的治疗方法

<130> 287 WO

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> Xaa

<222> (3)..(3)

<223> Xaa is citrulline

<400> 1

Ser Gly Xaa Gly Lys Gln Gly Gly Lys Ala Arg Ala

1 5 10

<210> 2

<211> 23

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> Xaa

<222> (3)..(3)

<223> Xaa is citrullin

<220>

<221> Xaa

<222> (3)..(3)

<223> Xaa is citrulline

<400> 2

Ser Gly Xaa Gly Lys Gly Gly Lys Gly Leu Gly Lys Gly Gly Ala Lys

1 5 10 15

Arg His Arg Lys Val Leu Arg

20

<210> 3

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

Ser Gly Arg Gly Lys Gln Gly Gly Lys Ala Arg Ala

1 5 10

<210> 4

<211> 23

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

Ser Gly Arg Gly Lys Gly Gly Lys Gly Leu Gly Lys Gly Gly Ala Lys

1 5 10 15

Arg His Arg Lys Val Leu Arg

20

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5

Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

1 5

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 6

Ile Asn Thr Tyr Ser Gly Glu Ala

1 5

<210> 7

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 7

Leu Arg Gly Tyr Thr Tyr Gln Ser Phe Asp Glu Gly Gly Asp Tyr

1 5 10 15

<210> 8

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 8

Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr

1 5 10

<210> 9

<211> 3

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 9

Leu Val Ser

1

<210> 10

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 10

Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Tyr Thr

1 5

<210> 11

<211> 367

<212> DNA

<213> mus musculus

<400> 11

cggatccagt tggtgcagtc tggacctgaa ctgaagaagc ctggtgaggc agtcaagatc 60

tcctgtaagg cttctggata taccttcaca aactatggta tgcactggat gaaacagact 120

ccaggaaagg attttaggtg gatgggctgg ataaacacct acagtggaga ggcaacatat 180

gttgatgact tcaagggacg cttcgccttc tctttgggaa cctctgccag cactgcctat 240

ttgcagatca acaacctcaa gaatgacgac acggctacat atttctgttt aagaggctat 300

acttaccaaa gtttcgacga agggggcgac tactggggcc agggcaccgc tctcacagtc 360

tcctcag 367

<210> 12

<211> 338

<212> DNA

<213> mus musculus

<400> 12

gatgttgtga tgacccagac tccactcact ttgtcggtta ccactggaca accagcctcc 60

atctcttgca agtcaagtca gagcctcttg gatagtgatg gaaagacata tttgaattgg 120

ttgtttcaga ggccaggcca gtctccaaag cgcctaatat atctggtgtc taaactggac 180

tctggagtcc ctgacaggtt cactggcagt ggatcaggga cagatttcac actgaaaatc 240

agcagagtgg aggctgagga tttgggaatt tattattgct ggcaaggtac acattttccg 300

tacacgttcg gaggggggac caatttggaa ataaaacg 338

Claims (6)

1.一种与脱亚胺基组蛋白H2A或H4的N-端上的瓜氨酸化表位特异性反应的抗体在制备用于预防或治疗特发性肺纤维化的药物中的用途，其中所述瓜氨酸化表位位于由SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：2的序列组成的肽上。

2.权利要求1的用途，其中所述抗体是单克隆抗体。

3.权利要求1或2的用途，其中所述抗体包含由SEQ ID NO：5的序列组成的重链CDR1结构域、由SEQ ID NO：6的序列组成的重链CDR2结构域、由SEQ ID NO：7的序列组成的重链CDR3结构域、由SEQ ID NO：8的序列组成的轻链CDR1结构域、由SEQ ID NO：9的序列组成的轻链CDR2结构域、由SEQ ID NO：10的序列组成的轻链CDR3结构域。

4.权利要求1或2的用途，其中所述抗体包含以保藏号ACC 3031保藏在DSMZ的杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体RmmAb 22.101中所包含的重链和轻链。

5.权利要求1或2的用途，其中所述抗体与单克隆抗体RmmAb22.101竞争与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO：2的肽的结合。

6.一种包含含有脱亚胺基组蛋白H2A或H4的N-端的肽的组合物在制备用于预防或治疗特发性肺纤维化的药物中的用途，其中所述N-端包含瓜氨酸化表位，并且其中所述瓜氨酸化表位位于由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的序列组成的肽上。

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