KR20230016576A

KR20230016576A - 섬유화 질환의 예방 또는 치료용 신규 항체

Info

Publication number: KR20230016576A
Application number: KR1020220073962A
Authority: KR
Inventors: 윤호근; 박수연
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2021-07-26
Filing date: 2022-06-17
Publication date: 2023-02-02
Also published as: WO2023008858A1

Abstract

본 발명은 섬유화에 관여하는 트롬보스폰딘-2(Thrombospondin, TSP-2) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 섬유화 질환 발생 여부를 예측하거나, 해당 단백질의 활성을 억제함으로써 섬유화 질환을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 명확한 발병 기전이 알려져 있지 않아 효율적인 치료 방법이 부재했던 특발성 폐섬유증에 대한 신규한 진단 및 치료 타겟으로서 TSP-2를 새롭게 제시하고, 특발성 폐섬유증에 대한 유효한 진단, 예방 또한 치료에 사용될 수 있는 효과적인 항체를 제공한다. 아울러, 본 발명은 궁극적으로 병리학적 섬유화 기전에 대한 근원적인 억제 방법을 제공함으로써 다양한 조직에서의 섬유화를 효율적으로 차단하는 데에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

섬유화 질환의 예방 또는 치료용 신규 항체{Novel Antibody for Preventing or Treating Fibrotic Disease}

본 발명은 섬유화에 관여하는 트롬보스폰딘-2(Thrombospondin, TSP-2) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 섬유화 질환 발생 여부를 예측하거나, 해당 단백질의 활성을 억제함으로써 섬유화 질환을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.

특발성 폐섬유증(IPF)은 심각한 만성 간질성 폐질환으로, 전 세계에 수백만 명의 환자에게 영향을 미치는 치명적이고 진행성인 질환이다. 해당 질환은 환자의 폐에 흉터를 남기면서 폐를 딱딱하게 만들어 호흡 곤란 등의 중대한 증상을 초래하며, 증상이 대개 몇 년간에 걸쳐 천천히 진행하기 때문에, 일상 생활에 불편이 생길 정도로 증상이 심해지고 나서야 의사의 진료를 받는 경우가 많아서 더욱 위험한 질환이다. 또한, 종래에 특발성 폐섬유증은 치료가 매우 어려워 완치가 거의 불가능한 질환으로 알려져 있으며, 현재 해당 질병에 특이적으로 효과적인 약물이 전무하며, 말기 환자들의 경우에 제한적으로 폐 이식만이 이용되고 있는 실정이다. 이러한 이유로 본 질환의 치료제에 대한 업계의 요구가 높으나, 병인이 정확하게 알려져 있지 않아서 치료제 개발에 어려움이 많은 상황이다.

섬유증(Fibrosis)은 과도한 섬유질 결합 조직의 형성 및 침착을 주 특징으로 하는 회복 또는 반응성 과정으로, 여러 섬유화 질환(Fibrotic Disease) 및 만성 질환의 주요 병인으로 작용한다. 특히, 폐 섬유증은 정확한 기작은 알려져 있지 않으나, 세포 외 기질(Extracellular Matrix, ECM)의 과도한 침착 및 비정상적인 폐포 상피 세포의 손상으로 발생한다고 알려져 있다. 정상적인 상태에서 섬유아세포(fibroblast)는 상처 회복 및 결합 조직 생성에 중요한 역할을 수행하나, 조절되지 않은 지나친 섬유아세포의 발현으로 인하여 병소(foci)에 과도한 면역세포 및 ECM 단백질이 축적되는 경우 병리학적인 상태로 발전하게 되는 것이다. 이러한 개략적인 기작 외에, 폐섬유증의 예측인자 및 발병기전은 여전히 모호하기 때문에, 이에 대한 정확한 분자 및 생물학적 기작을 밝히는 것은 폐섬유증의 진단 또는 치료에 매우 중요한 요소라고 할 수 있다.

한편, ECM은 비-구조적(non-structural) 기질 단백질로, 섬유증에서 비정상적인 침착이 관찰된다. 이러한 ECM과 결합하는 30여 종의 세포외기질-부착 단백질이 현재 알려져 있는데, 트롬보스폰딘(Thrombospondin, TSP)도 그 중 하나이다. 이러한 세포외기질-부착 단백질은 세포와 세포외기질을 연결하는 역할을 하여 세포-기질 상호작용의 조절자로서 중요한 역할을 수행한다. 특히 TSP 패밀리에 속하는 TSP-2 단백질의 경우, 섬유아세포에 의하여 분비되며 기질(matrix)의 리모델링에 관여한다.

이에, 본 발명자들은 TSP 패밀리 중 특히 TSP-2와 폐 섬유증과의 연관성에 집중하여, TSP-2가 폐 섬유증의 발생에 기여함을 입증하고자 하였으며, 해당 연구를 통하여 TSP-2 단백질과 섬유화의 관계성을 입증하는 동시에 이를 섬유증의 치료 타겟으로 하여 TSP-2에 특이적인 단일클론 항체를 개발하고, 해당 항체의 항-섬유화 효과를 입증하고자 하였다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

특허문헌 1. 미국특허공개공보 제2017-0334978호

본 발명자들은 전 세계적으로 높은 유병률을 가지면서 폐 이식 등을 제외하고는 유효한 치료 방법이 전무한 난치성 질환인 특발성 폐섬유증(Idiopathic Pulmonary Fibrosis, IPF)의 발병 기전을 밝히는 동시에, 이에 대한 효율적인 치료 방법을 발굴하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 폐 섬유화의 발병 기전에서 TSP-2가 섬유아세포-매개 섬유화(섬유증)를 일으킨다는 사실을 최초로 규명하고 TSP-2가 치료 타겟이 될 수 있음을 확인하였을 뿐 아니라, 동시에 TSP-2를 특이적으로 인식 및 억제하는 신규한 단일클론 중화항체를 개발함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 TSP-2 단백질에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 이를 코딩하는 핵산분자를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 섬유화 질환(fibrotic disease)의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산분자; 상기 핵산분자를 포함하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터를 포함하는 숙주세포를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 이용한 시료 내 TSP-2 단백질의 존재여부를 확인하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 진단용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1의 서열로 이루어진 HCDR1, 서열번호 2의 서열로 이루어진 HCDR2 및 서열번호 3의 서열로 이루어진 HCDR3의 중쇄 CDR(complementarity determining region) 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역을 포함하는, TSP-2 (Thrombospondin-2) 단백질에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.

본 명세서에서 용어“항체(antibody)”는 TSP-2에 대한 항체로서, 이의 특정 에피토프를 특이적으로 인식하여 이에 결합하며, 완전한 항체 형태뿐만 아니라 항체 분자의 항원 결합 단편(항체 단편)을 포함한다.

완전한 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.

본 명세서에서 용어“항체의 항원 결합 단편”은 전체 항체 분자 내에서 항원-항체 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변영역 및 중쇄의 첫 번째 불변영역(C_H1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 C_H1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 PCT 국제 공개특허출원 WO 88/10649, WO 88/106630, WO 88/07085, WO 88/07086 및 WO 88/09344에 개시되어 있다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변영역과 단쇄의 가변영역이 공유결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수도 있다.

본 명세서에서 용어“중쇄”는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 V_H 및 3 개의 불변영역 도메인 C_H1, C_H2 및 C_H3을 포함하는 전체길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다.

본 명세서에서, 용어“CDR(complementarity determining region)”은 면역글로블린 중쇄 및 경쇄의 고가변 영역(hypervariable region)의 아미노산 서열을 의미한다(Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)). 중쇄(HCDR1, HCDR2 및 HCDR3) 및 경쇄(LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)에는 각각 3개의 CDR이 포함되어 있으며, 이들 CDR은 항체가 항원 또는 에피토프에 결합하는 데 있어서 주요한 접촉 잔기를 제공한다.

본 발명의 항체 또는 항체 단편의 범위에는 CDR 영역에 보존적 아미노산 치환을 갖는 변이체가 포함된다. 또한, 본 발명의 항체 또는 항체 단편은, 인산화된 PLCγ2를 특이적으로 인식할 수 있는 범위 내에서 첨부한 서열목록에 기재된 아미노산 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 보다 더 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 추가적인 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 갖으며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.

변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스(hydropathic index)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소루이신(+4.5); 발린(+4.2); 루이신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글라이신(-0.4); 쓰레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 타이로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘 (-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파르테이트(-3.5); 아스파라긴 (-3.5); 라이신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5).

단백질의 상호적인 생물학적 기능(interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 일특정예에서는 ± 2 이내, 다른 특정예에서는 ± 1 이내, 또 다른 특정예에서는 ± 0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.

한편, 유사한 친수성 값(hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 미국 특허 제4,554,101호에 개시된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌(+3.0); 라이신(+3.0); 아스팔테이트(+3.0± 1); 글루타메이트(+3.0±1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글라이신(0); 쓰레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5±1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 루이신(-1.8); 아이소루이신 (-1.8); 타이로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4). 친수성 값을 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 일특정예에서는 ± 2 이내, 다른 특정예에서는 ± 1 이내, 또 다른 특정예에서는 ± 0.5 이내의 친수성 값 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.

분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu 및 Asp/Gly 간의 교환이다.

상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 항체 또는 이를 코딩하는 핵산 분자는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인 하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인 된 서열을 분석한 경우에, 최소 61%의 상동성, 일특정예에 따르면 70%의 상동성, 다른 특정예에 따르면 80%의 상동성, 또 다른 특정예에 따르면 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. (1981) 2:482 Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. (1970) 48:443; Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. (1988) 24: 307-31; Higgins and Sharp, Gene (1988) 73:237-44; Higgins and Sharp, CABIOS (1989) 5:151-3; Corpet et al. Nuc. Acids Res. (1988) 16:10881-90; Huang et al. Comp. Appl. BioSci. (1992) 8:155-65 및 Pearson et al. Meth. Mol. Biol. (1994) 24:307-31에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul et al. J. Mol. Biol. (1990) 215:403-10)은 NBCI 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html에서 확인할 수 있다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 중쇄 가변영역은 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열번호 4의 서열로 이루어진 LCDR1, 서열번호 5의 서열로 이루어진 LCDR2 및 서열번호 6의 서열로 이루어진 LCDR3의 경쇄 CDR 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역을 추가적으로 포함한다.

본 명세서 용어“경쇄”는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 V_L 및 불변영역 도메인 C_L을 포함하는 전체길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 경쇄 가변영역은 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는다.

본 발명의 항체는 단일클론 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단쇄 Fvs(scFV), 단쇄항체, Fab 단편, F(ab')단편, 다이설파이드-결합 Fvs(sdFV) 및 항-이디오타입(항-Id) 항체, 그리고 상기 항체들의 에피토프-결합 단편 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 항체는 단일클론 항체이다.

본 명세서에서 용어“단일클론 항체”는, 실질적으로 동일한 항체 집단에서 수득한 단일 분자 조성의 항체분자를 의미하며, 단일클론 항체는 특정 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 항체는 중화 항체(Neutralizing Antibody)이다.

본 발명에서 용어 “중화 항체”는 단백질, 항원 또는 감염성 입자의 표면 구조 중 특히 생물학적 기능을 나타내는 구조에 특화된 형태를 가져 해당 구조에 특이적으로 결합이 가능한 항체로써, 결합을 통하여 타겟 단백질, 항원 또는 감염성 입자의 생물학적 기능을 억제하는 역할을 수행하는 항체를 의미한다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 항체는 키메라 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체이다.

보다 구체적으로는 본 발명의 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 Fab 단편, F(ab') 단편, F(ab')2 단편 또는 Fv 단편이며, 보다 더 구체적으로는 단쇄 Fvs(scFV) 항체이다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 항체는 다양한 형태의 항체로 제조될 수 있다. 예를 들어, 하기의 실시예에 기재된 바와 같이, 본 발명의 항체는 sFv 또는 Fab 항체로 제조될 수 있고, 또한 sFv 또는 Fab 항체에 얻은 경쇄 및 중쇄 가변영역을 이용하여 사람 유래의 불변영역과 재조합함으로써 완전한(whole) 형태의 항체를 제공할 수도 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 섬유화 질환(fibrotic disease)의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 용어“예방”은 질환 또는 질병을 보유하고 있다고 진단된 적은 없으나, 이러한 질환 또는 질병에 걸릴 가능성이 있는 대상체에서 질환 또는 질병의 발생을 억제하는 것을 의미한다.

본 명세서에서 용어“치료”는 (a) 질환, 질병 또는 증상의 발전의 억제; (b) 질환, 질병 또는 증상의 경감; 또는 (c) 질환, 질병 또는 증상을 제거하는 것을 의미한다. 본 발명의 조성물을 대상체에 투여하면 섬유화를 일으키는 TSP-2 단백질의 활성이 억제되면서 과도한 섬유화를 방지하여 섬유화 질환(fibrotic disease)로 인한 증상의 발전을 억제하거나, 이를 제거하거나 또는 경감시키는 역할을 한다. 따라서, 본 발명의 조성물은 그 자체로 이들 질환 치료의 조성물이 될 수도 있고, 혹은 다른 약리성분과 함께 투여되어 상기 질환에 대한 치료 보조제로 적용될 수도 있다. 이에, 본 명세서에서 용어“치료”또는“치료제”는“치료 보조”또는“치료 보조제”의 의미를 포함한다.

본 발명에서 용어“섬유화 질환(fibrotic disease)”는 병리학적인 조직의 섬유화(fibrosis) 진행을 수반하고, 이러한 섬유화를 직접 또는 간접적인 원인으로 하는 모든 병적 상태를 통칭한다. 또한 용어“섬유화 또는 섬유증(fibrosis)”는 염증이 있거나 손상된 조직 내부 및 주변 부위에 섬유질 결합조직(콜라겐 및 피브로넥틴과 같은 세포외기질의 구성요소)이 과도하게 축적되어 영구적인 흉터, 장기 기능 장애 및 궁극적으로는 사망을 초래할 수 있는 질환을 의미한다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 섬유화 질환은 폐섬유증(Pulmonary Fibrosis)이다.

본 발명에서 용어 “폐섬유증(pulmonary fibrosis)”은, 반복된 폐 또는 폐 조직의 손상 및 상처로 인하여 폐가 섬유화되는 질환을 의미하며, 호흡곤란; 마른기침; 피로감; 체중저하; 및 곤봉손발톱(nail clubbing)의 증상을 동반한다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 폐섬유증(Pulmonary Fibrosis)은 간질성폐질환(Interstitial Lung Disease, ILD) 및 특발성 폐섬유증(Idiopathic Pulmonary Fibrosis, IPF)으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 질환이다.

본 발명에서 용어 “간질성폐질환(interstitial lung disease, ILD)”는 폐의 간질(interstitium of lung)에 주로 침범하는 비종양성, 비감염성 호흡기 질환들의 총칭으로써, 폐섬유증의 원인이 되기도 한다.

본 발명에서 용어“특발성 폐 섬유증(idiopathic pulmonary fibrosis)”는 폐 조직이 두꺼워지고 경직되어 흉터 조직이 형성되는 것을 특징으로 하는 진행성 호흡기 질환을 의미하며, 폐 기능의 점진적이고 비가역적인 감소를 특징으로 하는 만성 흉터성 폐 질환의 일종으로써, 명확한 원인이 알려져 있지 않아서‘특발성’이라고 지칭된다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 중쇄 가변영역을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.

본 명세서에서 용어“핵산 분자”는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산 분자에서 기본 구성단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, (1990) 90:543-584). 본 발명의 중쇄 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산 분자의 서열은 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오타이드의 추가, 결실, 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다.

본 발명의 핵산 분자는 상기한 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인 된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 일 특정예에서는 최소 90%의 상동성, 다른 특정예에서는 최소 95%의 상동성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 중쇄 가변영역을 코딩하는 핵산분자는 서열번호 27의 아미노산 서열을 갖는다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산분자를 제공한다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 중쇄 가변영역을 코딩하는 핵산분자는 서열번호 32의 아미노산 서열을 갖는다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 중쇄 가변영역을 코딩하는 핵산 분자, 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산 분자 또는 상기 핵산분자 모두를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 명세서에서 용어 “벡터”는 숙주세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로 플라스미드 벡터; 코즈미드 벡터; 그리고 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터 같은 바이러스 벡터 등을 포함한다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 벡터에서 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산 분자 및 중쇄 가변영역을 코딩하는 핵산 분자는 프로모터와 작동적으로 결합(operatively linked)되어 있다. 본 명세서에서 용어“작동적으로 결합된”은 핵산 발현조절서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.

본 발명의 재조합 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있다.

본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ프로모터, pRλ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로모터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주세포로서 E. coli(예컨대, HB101, BL21, DH5α 등)가 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위(Yanofsky, C. J. Bacteriol. 158:1018-1024(1984)) 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터(pLλ프로모터, Herskowitz, I. and Hagen, D. Ann. Rev. Genet. 14:399-445(1980))가 조절부위로서 이용될 수 있다. 숙주세포로서 바실러스 균이 이용되는 경우, 바실러스 츄린겐시스의 독소단백질 유전자의 프로모터(Appl. Environ. Microbiol. 64:3932-3938(1998); Mol. Gen. Genet. 250:734-741(1996)) 또는 바실러스균에서 발현 가능한 어떠한 프로모터라도 조절부위로 이용될 수 있다.

한편, 본 발명의 재조합 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드(예: pCL, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지(예: λgt4·λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스(예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.

한편, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터, β-액틴 프로모터, 사람 헤로글로빈 프로모터 및 사람 근육 크레아틴 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, HSV의 tk 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, HIV의 LTR 프로모터, 몰로니 바이러스의 프로모터 엡스타인바 바이러스(EBV)의 프로모터 및 로우스 사코마 바이러스(RSV)의 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.

본 발명의 재조합 벡터는 그로부터 발현되는 항체의 정제를 용이하게 하기 위하여 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은, 예컨대 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA); 말토스 결합 단백질(NEB, USA); FLAG(IBI, USA); 6x His(hexahistidine; Quiagen, USA), Pre-S1, c-Myc와 같은 태그 서열; OmpA, PelB와 같은 선도서열 등이 있다. 또한, 본 발명의 벡터에 의해 발현되는 단백질이 항체이기 때문에 정제를 위한 추가적인 서열 없이도, 발현된 항체는 단백질 A 컬럼 등을 통하여 용이하게 정제할 수 있다.

한편, 본 발명의 재조합 벡터는 선택표지로서 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.

본 발명의 항체를 발현하는 벡터는, 경쇄와 중쇄가 하나의 벡터에서 동시에 발현되는 벡터 시스템이거나 또는 경쇄와 중쇄를 각각 별도의 벡터에서 발현시키는 시스템 모두 가능하다. 후자의 경우, 두 벡터는 동시 형질전환(co-transfomation) 및 표적 형질전환(targeted transformation)을 통하여 숙주세포로 도입된다. 동시 형질전환은 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 각각의 벡터 DNA를 동시에 숙주세포로 도입한 뒤 경쇄와 중쇄를 모두 발현하는 세포를 선별하는 방법이다. 표적 형질전환은 경쇄(또는 중쇄)를 포함하는 벡터로 형질전환 된 세포를 선별하고 경쇄를 발현하는 선별된 세포를 중쇄(또는 경쇄)를 포함하는 벡터로 다시 형질전환 하여 경쇄 및 중쇄 모두를 발현하는 세포를 최종적으로 선별하는 방법이다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 재조합 벡터를 포함하는 숙주세포를 제공한다. 일 구체예에서, 상기 숙주세포는 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환된 세포이다. 본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지되어 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas)(예를 들면, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스(Staphylococcus)(예를 들면, 스타필로코쿠스 카르노수스(Staphylocus carnosus))와 같은 원핵 숙주세포를 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다.

상기 벡터의 적합한 진핵세포 숙주세포는 아스페르길러스 속(Aspergillus species)과 같은 진균, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세르비시아(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스(Schizosaccharomyces) 및 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)와 같은 효모, 그 밖의 하등 진핵세포, 곤충-유래 세포와 같은 고등 진핵생물의 세포, 그리고 식물 또는 포유동물로부터 유래한 세포를 이용할 수 있다.

본 명세서에서 용어“형질전환”은 본 발명의 재조합 벡터를 이용하여 숙주 세포에 목적하는 유전자를 도입하는 것을 말하며, “형질감염”과 동일한 의미로 사용된다. 따라서, 숙주세포로의“형질전환”및/또는“형질감염”은 핵산을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기충격유전자전달법(electroporation), 원형질 융합, 인산칼슘(CaPO₄) 침전, 염화칼슘(CaCl₂) 침전, 실리콘 카바이드 섬유 이용한 교반, 아그로 박테리아 매개된 형질전환, PEG, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 포함되나, 이로 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 시료에 접촉시키는 단계를 포함하는 시료 내 TSP-2(Thrombospondin-2) 단백질을 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 항체 또는 그의 항원결합 단편은 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명의 항체는 생물학적 시료에 적용되어 TSP-2 (Thrombospondin-2) 단백질을 검출할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 용어, “생물학적 시료”란 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇨, 림프액, 척수액, 조직 부검 시료(뇌, 피부, 림프절, 척수 등), 세포 배양 상등액, 파열된 진핵세포 및 세균 발현계 등을 들 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 구체적으로는, 상기 시료는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇨, 림프액 또는 척수액이다.

생물학적 시료에서 TSP-2 (Thrombospondin-2) 단백질의 검출은, 비색법(colormetric method), 전기화학법(electrochemical method), 형광법(fluorimetric method), 발광법(luminometry), 입자계수법(particle counting method), 육안측정법(visual assessment) 또는 섬광계수법(scintillation counting method)을 이용한 항원-항체 복합체 형성의 검출을 통하여 수행할 수 있다. 본 명세서상의“검출”은 항원-항체 복합체를 검출하기 위한 것으로 여러 가지 표지체를 사용하여 실시할 수 있다. 표지체의 구체적인 예로는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자 또는 방사성 동위원소를 포함한다.

검출 표지체로서 사용되는 효소로는 아세틸콜린에스테라제, 알칼라인 포스파타제, β-D-갈락토시다제, 호스래디쉬 퍼옥시다제 및 β-라타마제 등을 포함하며, 형광물로는 플루오레세인, Eu³⁺, Eu³⁺킬레이트 또는 크립테이트 등을 포함하며, 리간드로는 바이오틴 유도체 등을 포함하며, 발광물로는 아크리디늄 에스테르 및 이소루미놀 유도체 등을 포함하며, 미소입자로는 콜로이드 금 및 착색된 라텍스 등을 포함하며, 방사성 동위원소로는 ⁵⁷Co, ³H, ¹²⁵I 및 ¹²⁵I-볼톤(Bonton) 헌터(Hunter) 시약 등을 포함한다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 항원-항체 복합체를 효소면역흡착법(ELISA) 을 이용하여 검출할 수 있다. 효소면역흡착법에는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 이차항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다. 본 발명의 항체는 검출 표지를 가질 수 있으며, 검출표지를 가지지 않을 경우는 본 발명의 항체를 포획할 수 있고 검출 표지를 가지는 또 다른 항체를 처리하여 확인할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 섬유화 질환(fibrotic disease)의 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 TSP-2 단백질을 항원-항체 반응을 이용한 면역분석(immunoassay) 방법에 따라 검출하여 섬유화 질환 발생 여부를 분석하는 데 이용될 수 있다. 이러한 면역분석은 종래에 개발된 다양한 면역분석 또는 면역염색 프로토콜에 따라 실시될 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 방법이 방사능면역분석 방법에 따라 실시되는 경우, 방사능동위원소(예컨대, C¹⁴, I¹²⁵, P³²및 S³⁵)로 표지된 항체가 이용될 수 있다. 본 발명에서 TSP-2 단백질을 특이적으로 인식하는 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이며, 바람직하게는 모노클로날 항체이다.

본 발명의 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519 (1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,567호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York (1999)에 상세하게 기재되어 있다.

상술한 면역분석 과정에 의한 최종적인 시그널의 강도를 분석함으로써, 종양의 전이 여부 또는 전이 가능성을 예측할 수 있다. 즉, 개체의 시료에서 TSP-2 단백질에 대한 시그널이 정상 시료 보다 강하게 나오는 경우에는 개체의 종야의 전이가 진행되었거나 향후 진행될 가능성이 높은 것으로 판단된다.

본 명세서에서 용어“진단”은 특정 질환에 대한 개체의 감수성(susceptibility)의 판정, 특정 질환을 현재 개체가 가지고 있는 지 여부의 판정, 및 특정 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)의 판정을 포함한다.

본 명세서에서 용어“진단용 조성물”은 대상체의 섬유화 질환 발생 여부를 판단하거나, 발생 가능성을 예측하기 위해 TSP-2 단백질 또는 이를 인코딩하는 유전자의 발현량 측정수단을 포함하는 통상적인(mixture) 또는 장비(device)를 의미하며, 이에“진단용 키트”로 표현될 수도 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 TSP-2 (Thrombospondin-2) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현량을 측정하는 제제를 유효성분으로 포함하는 섬유화 질환(fibrotic disease)의 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 TSP-2를 인코딩하는 유전자의 발현량을 측정하는 제제는 상기 유전자의 핵산 분자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브이다.

본 명세서에서 사용되는 용어“프라이머”는 핵산쇄(주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재, 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용하는 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 구체적으로는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드 단일쇄이다. 본 발명에서 이용되는 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있으며, 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다.

본 발명의 프라이머는 타겟 핵산에 어닐링 되어 주형-의존성 핵산 중합효소에 의해 타겟 핵산에 상보적인 서열을 형성하는 연장 프라이머(extension primer)일 수 있으며, 이는 고정화 프로브가 어닐링 되어 있는 위치까지 연장되어 프로브가 어닐링 되어 있는 부위를 차지한다.

본 발명에서 이용되는 연장 프라이머는 타겟 핵산, 예를 들어 TSP-2 단백질을 코딩하는 유전자의 특정 염기서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 용어“상보적”은 소정의 어닐링 또는 혼성화 조건하에서 프라이머 또는 프로브가 타겟 핵산 서열에 선택적으로 혼성화할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 실질적으로 상보적(substantially complementary)인 경우 및 완전히 상보적(perfectly complementary)인 경우를 모두 포괄하는 의미이며, 구체적으로는 완전히 상보적인 경우를 의미한다. 본 명세서에서 용어“실질적으로 상보적인 서열”은 완전히 일치되는 서열뿐만 아니라, 특정 서열에 어닐링하여 프라이머 역할을 할 수 있는 범위 내에서, 비교 대상의 서열과 부분적으로 불일치되는 서열도 포함되는 의미이다.

프라이머는, 중합제의 존재 하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍시킬 수 있을 정도로 충분히 길어야 한다. 프라이머의 적합한 길이는 다수의 요소, 예컨대, 온도, pH 및 프라이머의 소스(source)에 따라 결정되지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 혼성 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다. 이러한 프라이머의 설계는 타겟 뉴클레오티드 서열을 참조하여 당업자가 용이하게 실시할 수 있으며, 예컨대, 프라이머 디자인용 프로그램(예: PRIMER 3 프로그램)을 이용하여 할 수 있다.

본 명세서에서 용어“프로브”는 특정 뉴클레오타이드 서열에 혼성화될 수 있는 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하는 자연 또는 변형되는 모노머 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머를 의미한다. 구체적으로, 프로브는 혼성화에서의 최대 효율을 위하여 단일가닥이며, 더욱 구체적으로는 디옥시리보뉴클레오타이드이다. 본 발명에 이용되는 프로브로서, 상기 TSP-2 단백질을 코딩하는 유전자의 특정 염기서열에 완전하게(perfectly) 상보적인 서열이 이용될 수 있으나, 특이적 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로(substantially) 상보적인 서열이 이용될 수도 있다. 일반적으로, 혼성화에 의해 형성되는 듀플렉스(duplex)의 안정성은 말단의 서열의 일치에 의해 결정되는 경향이 있기 때문에, 타겟 서열의 3’-말단 또는 5’-말단에 상보적인 프로브를 사용하는 것이 바람직하다.

혼성화에 적합한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., et al., Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C.(1985)에 개시된 사항을 참조하여 결정할 수 있다.

본 발명은 단백질의 활성 또는 발현량을 측정하기 위하여 항체 대신 TSP-2 단백질에 특이적으로 결합하는 앱타머를 이용할 수도 있다. 본 명세서에서 용어“앱타머”는 특정 표적물질에 높은 친화력과 특이성으로 결합하는 단일 줄기의(single-stranded) 핵산(RNA 또는 DNA) 분자 또는 펩타이드 분자를 의미한다. 앱타머의 일반적인 내용은 Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine". J Mol Med. 78(8):426-30(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R . "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library". Proc Natl Acad Sci USA. 95(24):14272-7(1998)에 상세하게 개시되어 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 4의 서열로 이루어진 LCDR1, 서열번호 5의 서열로 이루어진 LCDR2 및 서열번호 6의 서열로 이루어진 LCDR3의 경쇄 CDR(complementarity determining region) 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역을 포함하는 TSP-2(Thrombospondin-2) 단백질에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 경쇄 CDR(LCDR); 경쇄 가변영역; 및 이를 포함하는 항체 또는 그의 항원결합 단편에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 TSP-2 (Thrombospondin-2)에 대한 억제제를 유효성분으로 포함하는 섬유화 질환(fibrotic disease)의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 항체를 이용한 섬유화질환의 예방 또는 치료용 조성물 및 예방 또는 치료의 의미에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 명세서에서 용어“억제제”는 타겟 유전자의 활성 또는 발현의 저하를 야기시키는 물질을 의미하며, 이에 의해 타겟 유전자의 활성 또는 발현이 탐지 불가능해지거나 무의미한 수준으로 존재하게 되는 경우 뿐 아니라, 타겟 유전자의 생물학적 기능이 유의하게 저하될 수 있을 정도로 활성 또는 발현을 저하시키는 물질을 의미한다.

타겟 유전자의 억제제는 예를 들어 당업계에 이미 그 서열이 공지된 상기 유전자의 발현을 유전자 수준에서 억제하는 shRNA, siRNA, miRNA, 리보자임(ribozyme), PNA(peptide nucleic acids) 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 타겟 유전자를 인식하는 가이드 RNA를 포함하는 CRISPR 시스템과, 단백질 수준에서 억제하는 항체 또는 앱타머 뿐 아니라, 이들의 활성을 억제하는 화합물, 펩타이드 및 천연물을 포함하나, 이에 제한되지 않고 당업계에 공지된 모든 유전자 및 단백질 수준의 억제수단이 사용될 수 있다.

TSP-2 단백질에 특이적으로 결합하여 이의 활성 또는 발현을 억제하는 항체 및 앱타머에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.

본 명세서에서 용어“shRNA(small hairpin RNA)”는 인 비보 상에서 스템-루프(stem-loop) 구조를 이루는 단일 가닥으로 50-70개로 구성된 뉴클레오타이드로서, RNA 간섭을 통해 타겟 유전자의 발현을 억제하기 위한 타이트한 헤어핀 구조를 만드는 RNA 서열을 의미한다. 통상적으로 5-10개의 뉴클레오타이드의 루프 부위 양쪽으로 상보적으로 19-29개의 뉴클레오타이드의 긴 RNA가 염기쌍을 이루어 이중가닥의 스템을 형성하며, 언제나 발현되도록 하기 위하여 U6 프로모터를 포함하는 벡터를 통해 세포 내로 형질도입되며 대개 딸세포로 전달되어 타겟 유전자의 발현억제가 유전되도록 한다.

본 명세서에서 용어“siRNA”는 특정 mRNA의 절단(cleavage)을 통하여 RNAi(RNA interference) 현상을 유도할 수 있는 짧은 이중사슬 RNA를 의미한다. 타겟 유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 가지는 안티센스 RNA 가닥으로 구성된다. 전체 길이는 10 내지 100 염기, 바람직하게는 15 내지 80 염기, 가장 바람직하게는 20 내지 70 염기이고, 타겟 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt)말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3 말단 돌출한 구조와 5 말단 쪽이 돌출한 구조 모두 가능하다.

본 명세서에서 용어“miRNA(microRNA)”는 세포내에서 발현되지 않는 올리고뉴클레오타이드로서 짧은 스템-루프 구조를 가지면서 타겟 유전자의 mRNA와 상보적인 결합을 통하여 타겟 유전자 발현을 억제하는 단일 가닥 RNA분자를 의미한다.

본 명세서에서 용어“리보자임(ribozyme)”은 RNA의 일종으로 특정한 RNA의 염기 서열을 인식하여 자체적으로 이를 절단하는 효소와 같은 기능을 가진 RNA 분자를 의미한다. 리보자임은 타겟 mRNA 가닥의 상보적인 염기서열로 특이성을 가지고 결합하는 영역과 타겟 RNA를 절단하는 영역으로 구성된다.

본 명세서에서 용어“PNA(Peptide nucleic acid)”는 핵산과 단백질의 성질을 모두 가지면서 DNA 또는 RNA와 상보적으로 결합이 가능한 분자를 의미한다. PNA는 자연계에서는 발견되지 않고 인공적으로 화학적인 방법으로 합성되며, 상보적인 염기 서열의 천연 핵산과 혼성화(hybridization)를 통해 이중가닥을 형성하여 타겟 유전자의 발현을 조절한다.

본 명세서에서 용어 “안티센스 올리고뉴클레오타이드”는 특정 mRNA의 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열로서 타겟 mRNA 내의 상보적 서열에 결합하여 이의 단백질로의 번역, 세포질내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해하는 핵산 분자를 의미한다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 효능을 증진시키기 위하여 하나 이상의 염기, 당 또는 골격(backbone)의 위치에서 변형될 수 있다(De Mesmaeker et al., Curr Opin Struct Biol., 5(3):343-55, 1995). 올리고뉴클레오타이드 골격은 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 메틸 포스포네이트, 단쇄 알킬, 시클로알킬, 단쇄 헤테로아토믹, 헤테로시클릭 당숄포네이 등으로 변형될 수 있다.

본 명세서에서 용어“gRNA(guideRNA)”는 타겟 유전자를 인식하여 핵산분해효소(nuclease)를 유도함으로써 인식된 분위를 특이적으로 절단하는 유전자 편집 시스템에 사용되는 RNA 분자를 의미한다. 이러한 유전자 편집 시스템에는 대표적으로 CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 시스템이 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 섬유화 질환의 예방 또는 치료용 조성물의 스크리닝 방법을 제공한다:

(a) TSP-2 (Thrombospondin-2) 단백질 또는 이를 발현하는 세포를 포함하는 생물학적 시료에 시험물질을 접촉시키는 단계; 및

(b) 상기 생물학적 시료 내 TSP-2 단백질 또는 이를 인코딩하는 유전자의 발현량을 측정하는 단계,

상기 생물학적 시료 내 상기 단백질 또는 이를 인코딩하는 유전자의 발현량이 감소하는 경우, 상기 시험물질은 섬유화 질환의 예방 또는 치료용 조성물로 판정한다.

본 발명에서 사용되는 TSP-2 단백질 및 이의 발현 조절을 통해 예방 또는 치료할 수 있는 질환에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명에서 용어“생물학적 시료”는 인간을 포함한 포유동물로부터 얻어지는, 상술한 단백질을 발현하는 세포를 포함하고 있는 모든 시료로서, 조직, 기관, 세포 또는 세포 배양액을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 보다 구체적으로는, 상기 생물학적 시료는 폐 유래의 조직, 세포 또는 이의 배양액일 수 있다.

본 발명의 스크리닝 방법을 언급하면서 사용되는 용어 “시험물질”은 본 발명의 단백질 또는 유전자를 발현하는 세포를 포함하는 시료에 첨가되어 이들 단백질 또는 유전자의 활성 또는 발현량에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시험물질은 화합물, 뉴클레오타이드, 펩타이드 및 천연 추출물을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 시험물질을 처리한 생물학적 시료에서 상기 단백질 또는 유전자의 발현량 또는 활성을 측정하는 단계는 당업계에 공지된 다양한 발현량 및 활성 측정방법에 의해 수행될 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 섬유화에 관여하는 트롬보스폰딘-2(Thrombospondin, TSP-2) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 섬유화 질환 발생 여부를 예측하거나, 해당 단백질의 활성을 억제함으로써 섬유화 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

(b) 본 발명은 명확한 발병 기전이 알려져 있지 않아 효율적인 치료 방법이 부재했던 특발성 폐섬유증에 대한 신규한 진단 및 치료 타겟으로서 TSP-2를 새롭게 제시하고, 특발성 폐섬유증에 대한 유효한 진단, 예방 또한 치료에 사용될 수 있는 효과적인 항체를 제공한다.

(c) 아울러, 본 발명은 궁극적으로 병리학적 섬유화 기전에 대한 근원적인 억제 방법을 제공함으로써 다양한 조직에서의 섬유화를 효율적으로 차단하는 데에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1a는 건강한 지원자(n=35) 및 IPF 환자(n=49)의 총 폐 조직에서 TSP-2의 FPKM(백만당 전사체 염기의 킬로 단위) 매핑 판독을 공개적으로 사용 가능한 데이터베이스인 GSE124685를 사용하여 비교한 결과를 도시한 그림이다. 도 1b는 공개적으로 이용 가능한 데이터베이스인 GSE110147를 사용하여 TSP-2의 RMA(Robust Multi-array Average) 배경 보정(background correction) 및 데이터 정규화를 수행한 결과를 도시한 그림이다.
도 2는 정량적 샌드위치 효소 면역분석(Quantitative Sandwich Enzyme Immunoassay)를 통하여 건강한 대조군과 간질성 폐질환(ILD)환자에서 TSP-2의 혈청 수준을 대조군 결과를 도시한 그림이다.
도 3a는 블레오마이신을 통한 마우스 폐 섬유증 모델에 대한 실험 계획을 도시한 그림이다. 도 3b는 농축된 기관지 폐포 세척액(BALF)에서 블레오마이신으로 인하여 증가된 TSP-2를 웨스턴 블롯으로 확인한 결과를 도시한 그림이다. 도 3c는 BAL 액 총 세포 계수 결과, 마우스 폐 섬유증 모델에서 염증세포가 증가된 것을 도시한 그림이다. 도 3d는 마우스 폐 조직에서 TSP-2에 대한 qRT-PCR의 결과를 도시한 그림이다. 도 3e는 상피 Ccsp-TGF-β1-TG 마우스를 생성하기 위한 독시사이클린 투여 계획을 도시한 그림이다. 도 3f는 농축된 기관지 폐포 세척액(BALF)에서 독시사이클린으로 인하여 증가된 TSP-2을 면역블롯으로 확인한 결과를 도시한 그림이다. 도 3g는 BAL 액 총 세포 계수 결과, 독시사이클린으로 인하여 염증세포가 증가한 것을 도시한 그림이다. 도 3h는 독시사이클린 투여로 TSP-2 발현이 마우스 폐 조직에서 증가한 것을 도시한 그림이다.
도 4a는 MLg 및 C22 세포주에서 Smad4의 넉다운(Knockdown)결과, TGF-β에 의해 유도되는 TSP-2 발현을 나타내는 mRNA가 감소된 것을 도시한 그래프이다. 도 4b는 MLg 및 C22 세포주에서 Smad4의 넉다운(Knockdown)결과, TGF-β에 의해 유도되는 TSP-2의 단백질 양이 감소된 것을 면역 블롯으로 확인한 결과를 도시한 그림이다.
도 5a는 TGF-β₁의 선택적 억제제가 TGF-β₁에 의해 유도되는 TSP-2 발현을 양-의존적(dose dependent manner)로 억제함을 도시한 그래프이다. 도 5b는 TGF-β₁의 선택적 억제제가 TGF-β₁에 의해 유도되는 TSP-2 발현을 용량-의존적 방식(dose dependent manner)으로 억제함을 웨스턴 블롯으로 확인한 결과를 도시한 그림이다.
도 6a는 4kb 크기의 TSP-2 유전자 프로모터 내의 Smad-결합 요소를 표시한 개략도이다. 도 6b는 프로모터 부분 결실에 따른 프로모터의 활성을 루시퍼레이즈 리포터 분석으로 조사한 결과를 나타낸 그림이다. 도 6c는 TGF-β₁이 없는 경우, 프로모터 부분 결실에 따른 프로모터의 활성을 루시퍼레이즈 리포터 분석으로 조사한 결과를 나타낸 그림이다. 도 6d는 TGF-β1이 있는 경우 #6 Smad-결합 부위 결실을 사용하여 루시퍼레이즈 리포터 분석을 수행한 결과를 도시한 그림이다.
도 7a는 자가분비(Autocrine) 및 측분비(Paracrine) 실험을 도시한 개략도이다. 도 7b는 TSP-2의 녹다운 효율을 알아보기 위하여 수행한, 폐 세포에서 TSP-2 유전자의 발현에 대한 qRT-PCR 분석 결과를 도시한 그림이다. 도 7c는 TSP-2의 녹다운 효율을 알아보기 위하여 수행한, 폐 세포에서 TSP-2 유전자의 발현에 대한 웨스턴 블롯 결과를 도시한 그림이다. 도 7d는 TGF-β1-유도 섬유아세포(자가분비) 활성화를 알아보기 위하여 섬유아세포 계수를 측정한 결과를 도시한 그림이다. 도 7e는 섬유화 마커(표적 유전자)들의 TGF-β1 투여에 의한 상향조절 여부 및 TSP-2 녹다운에 의한 하향조절 여부를 알아보기 위한 qRT-PCR 결과를 도시한 그림이다.
도 8a는 폐 상피 세포(Lung Epithelial Cell)에서 TSP-2의 녹다운 효율을 알아보기 위하여 수행한, TSP-2 유전자의 발현에 대한 qRT-PCR 분석 결과를 도시한 그림이다. 도 8b는 폐 상피 세포(Lung Epithelial Cell)에서 TSP-2의 녹다운 효율을 알아보기 위하여 수행한, TSP-2 유전자의 발현에 대한 웨스턴 블롯 결과를 도시한 그림이다. 도 8c는 TGF-β1-유도 섬유아세포(측분비) 활성화를 알아보기 위하여 섬유아세포 계수를 측정한 결과를 도시한 그림이다. 도 8d는 폐 상피 세포에서 섬유화 마커(표적 유전자)들의 TGF-β₁ 투여에 의한 상향조절 여부 및 TSP-2 녹다운에 의한 하향조절 여부를 알아보기 위한 qRT-PCR 결과를 도시한 그림이다.
도 9a는 TSP-2의 표적 억제는 용량 의존적 방식으로 TGF-β1 유도 섬유아세포 활성화를 감소시킴을 섬유아세포의 세포수로 나타낸 그래프이다. 도 9b는 TSP-2에 특이적인 단일 중화 항체에 의한 TSP-2의 표적 억제에 의하여 TGF-β₁으로 유도된 섬유화 마커(표적 유전자)들의 발현이 감소됨을 도시한 qRT-PCR 결과 그래프이다.
도 10a는 상피 세포(C22)에서 TSP-2의 표적 억제는 용량 의존적 방식으로 TGF-β₁ 유도 섬유아세포 활성화를 감소시킴을 섬유아세포의 세포수로 나타낸 그림이다. 도 10b는 상피 세포(C22)에서 TSP-2에 특이적인 단일 중화 항체에 의한 TSP-2의 표적 억제에 의하여 TGF-β₁으로 유도된 섬유화 마커(표적 유전자)들의 발현이 감소됨을 도시한 qRT-PCR 결과 그래프이다. 도 10c는 상피 세포(RLE-6TN)에서 TSP-2의 표적 억제는 용량 의존적 방식으로 TGF-β₁ 유도 섬유아세포 활성화를 감소시킴을 섬유아세포의 세포수로 나타낸 그림이다. 도 10d는 상피 세포(RLE-6TN)에서 TSP-2에 특이적인 단일 중화 항체에 의한 TSP-2의 표적 억제에 의하여 TGF-β₁으로 유도된 섬유화 마커(표적 유전자)들의 발현이 감소됨을 도시한 qRT-PCR 결과 그래프이다.
도 11a는 TSP-2에 대한 단일클론항체를 제작하기 위하여 시행한 7개 클론에 대한 닷-블롯(Dot-Blot) 결과를 도시한 그림이다. 도 11b는 7개 클론의 항체 친화도(Affinity)를 알아보기 위하여 시행한 폐섬유아세포에서의 웨스턴 블롯 결과를 도시한 그림이다. 도 11c는 #2 및 #4 클론 항체의 섬유아세포 증식 저해능을 비교한 그래프이다. 도 11d는 최종 제작 항체와 시판항체의 TGF-β처리 후 섬유아세포 증식 억제능을 비교한 그래프이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험방법 및 분석방법

환자 샘플

인간 혈청 샘플은 세브란스 병원(서울, 한국)에서 얻었다. 총 8개의 ILD 환자 샘플과 정상 조직을 가진 총 4개의 대조군 샘플을 연구에 포함시켰다. 환자는 미국 흉부 학회 및 유럽 호흡기 학회의 기준을 충족했으며, ILD 진단은 병력, 신체 검사, 폐 기능 연구, 흉부 고해상도 컴퓨터 단층 촬영으로 입증하였고, 비디오-보조 흉강경 폐 생검 또는 이식편 외식(transplant explants)으로 확증하였다. 본 연구는 세브란스병원 기관심사위원회의 승인받아 수행하였다.

효소-연결 면역흡착측정법 (ELISA)

혈청 분리 튜브를 사용하여 혈청을 분리하고 제조업체의 지침에 따라 Human Thrombospondin-2 quantikine ELISA 키트(R&D Systems Inc., USA)를 사용하여 TSP-2의 혈청 수준(말기 ILD 환자 제외)을 측정하였다.

동물 연구

모든 동물 실험은 연세대학교 의과대학 동물연구소 동물관리위원회(인증번호 IACUC-2018-0087)의 승인을 받았고, 프로토콜은 연세대학교 의과대학 동물실험윤리위원회의 승인을 받았다. 모든 마우스는 C57BL/6 유전적 배경의 마우스를 사용하였고, 12h-낮/12h-밤 주기로 수용하였다.

마우스들을 Zoletil(30 mg/kg) 및 Rompun(10 mg/kg)을 복강내 주사하여 마취하였다. 마우스에 PBS(비히클 대조군) 또는 4mg/kg 블레오마이신(Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA)을 기관내 주사하였다. 각 그룹에 평균 8마리의 마우스를 사용했으며, 마우스는 블레오마이신 및 기관지 세척액(Bronchial Lavage, BAL)을 투여받은 후 14일째에 희생시키고 폐조직을 채취하였다. TGF-β1-TG 마우스는 연세대학교 손명현 교수의 연구실에서 제공받았다. TGF-β1 발현을 유도하기 위해 성체 형질전환 마우스(8-12주령)를 4주 동안 2% 자당(Sucrose)과 0.5 mg/mL 독시사이클린(Doxycycline)을 함유한 식수와 함께 4주 동안 수용하였다. 독시사이클린을 함유하는 물은 일주일에 세 번 교체하였다.

폐의 채취 및 고정

마우스는 졸레틸/룸푼으로 마취하였으며, 복부와 흉곽을 절개하여 심장과 폐를 노출시켰다. 10mL PBS를 사용하여 폐동맥을 통해 폐를 관류하였다. 마우스 폐의 좌엽을 제거하고 실온에서 48시간 동안 포름알데히드(4% w/v)에 고정하고 파라핀에 포매하였다. 파라핀 블록 절편의 구획화는 서울의 연세대 의과대학 조직학 코어에서 수행하였다.

메이슨 삼색 염색법(Masson’s Trichrome Staining)

메이슨 삼색 염색법으로 콜라겐 생성을 확인하기 위해 절편을 탈파라핀화하고 물로 수화하였다. 절편을 전자레인지를 사용하여 Bouin’s 용액(#HT10132, Merck, Darmstadt, Germany)에 1분 동안 염색한 다음, 실온에서 15분 동안 방치하였다. 흐르는 수돗물로 씻은 후 절편을 헤마톡실린에 10분간 담그고, 다시 흐르는 수돗물로 헹구고 비브리히 스칼렛(Biebrich scarlet)으로 5분간 염색하였다. 그 후, 절편을 15분 동안 인텅스텐(phosphotungstic) / 인몰리브덴산(phosphomolybdic)으로 염색하고 아닐린 블루로 5분 동안 바로 옮긴 후, 탈수하고 커버슬립을 덮었다.

세포 배양 및 시약

마우스 섬유아세포주 MLg 및 쥐 폐포 2형 세포주 RLE-6TN은 한국세포주은행(서울, 한국)에서 구입하였다. MLg와 RLE-6TN은 10%(v/v) 태아 소 혈청과 1% 항생제/항진균 용액(Corning, Manassas, VA, USA)이 첨가된 둘베코수정이글배지(Dulbecco’s modified Eagles’s medium)에서 37℃, 5% CO₂에서 배양하였다. 불멸화 마우스 폐 클럽 세포주(Immortalized Mouse Cell Line), C22(Sigma-Aldrich)는 2% 소 태아 혈청, 페니실린[100U/ml], 스트렙토마이신[100 μg/ml], 2mM 글루타민, 엔도텔린-1[0.25㎍/ml], 인터페론-γ[0.01㎍/ml], 인슐린[10㎍/ml], 트랜스페린[5㎍/ml], 내피세포 성장 보충 [7.5 μg/ml], 표피 성장 인자 [0.025 μg/ml], 히드로코르티손 [0.36 μg/ml] 및 T3 [0.02 μg/ml] 이 보충된 허용 조건의 둘베코수정이글배지(Corning, Manassas, VA, USA)에서 5% CO₂에서 33℃로 실험 전까지 유지하였고, 그런 다음 T 대항원(Large T-antigen)을 비활성화하기 위해 37 ℃에서 비허용 조건(인터페론-γ 없음)으로 옮겼다. 블레오마이신은 Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA)에서 구입하였고, TGF-β1은 ProSpec (East Brunswick, NJ, USA)에서 구입하였다. 일시적 형질감염(Transient transfection)은 Lipofectamine 2000, Lipofectamine 3000 및 Lipofectamine RNAiMAX(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 수행하였다.

국부 돌연변이 실험(Site-directed Mutagenesis)

High-Fidelity DNA Polymerases & Master Mixes(Thermo science, Waltham, Massachusetts, USA)를 사용하여 다양한 결실 구조가 생성하였고, PCR 반응을 위해 10pM 프라이머를 혼합하였다. 국부 돌연변이 실험에서 사용된 PCT 사이클링 조건은 다음과 같다: 98℃에서 2분간 초기 변성, 98℃에서 30초 변성, 65℃에서 30초 동안 어닐링 및 72℃에서 45초 동안 연장 반응을 수행하였다. 그리고 최종 extension은 72℃에서 5분간 진행하였다. 증폭된 혼합물을 DpnⅠ(Aglient Technologies, Santa clara, CA, USA)로 37℃에서 1시간 30분 동안 처리하였고, PCR 산물을 사용하여 수용성 E.coli(Real Biotech Corporation, Banqiao, Taiwan)를 형질전환하였다. 모든 생성물들은 DNA 시퀀싱을 통해 확인하였다.

루시퍼레이즈 리포터 분석 (Luciferase reporter assay)

마우스 TSP-2 유전자 프로모터 구조체을 만들기 위해 TSP-2 유전자의 특정 영역(-1700 ~ +300 뉴클레오티드)을 야생형 C57BL/6 마우스 조직(QIAGEN, DNA mini kit)에서 얻은 유전체DNA를 증폭시킴으로써 준비하였다. 증폭된 생성물을 정제하고 Nhe-IHF 및 XhoI 제한 효소로 절단하고 pGL3-Control 벡터(Promega)에 클로닝하였다. 이 TSP-2 리포터 유전자를 결실 구조체(deletion construct)의 주형으로 사용하였다. 루시퍼라제 리포터 분석을 수행하기 위해 리포펙타민 3000(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 24웰 플레이트에서 웰당 1㎍의 TSP-2 리포터 유전자로 세포를 일시적 형질감염시켰다. 24시간 동안 인큐베이션한 후, 세포를 추가 24시간 동안 무혈청 배지에서 20ng/mL의 TGF-β1으로 처리하였다. 세포를 수확하고 용해하여 루시퍼라제 분석 시스템(Promega)을 사용하여 루시퍼라제 활성을 분석하였다. 발광성은 MicroLumatPlus LB96V Microplate Luminometer(Berthold)로 측정하였다.

안정적인 형질감염 세포주의 구축

TSP-2의 안정적인 녹다운을 위한 세포주를 생성하기 위해 이 연구에 사용된 렌티바이러스 벡터(shTSP-2)를 Sigma-Aldrich, U.S.A.에서 구입하였다. 보조 플라스미드 리포솜(pxPAX.2 및 pMD2.G) 및 렌티바이러스 벡터는 Lipofectamine 2000이라는 형질감염 시약(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 이용하여 293FT cell에 형질감염하여 렌티바이러스를 생산하였다. 형질감염 48시간 후, 상층액을 수집하고 원심분리하여 세포 파편(cell debris)를 제거하였다. 원심분리된 상층액은 0.45 μm 폴리비닐리덴 디플루오라이드 필터를 사용하여 여과하였다. C22, RLE-6TN 및 MLg 세포를 10㎍/ml 폴리브렌과 혼합된 바이러스 현탁액으로 감염시켰다. 감염 48시간 후, 안정적으로 형질도입된 양성 세포주를 스크리닝하기 위해 2㎍/ml의 퓨로마이신을 첨가하였다.

웨스턴 블롯 분석

세포는 용해 완충액(20mM Tris-Cl, 150mM NaCl, 1% Triton X-100, 1.5% MgCl2, 1mM EDTA, 1mM Na2VO4, 1mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드(PMSF) 및 프로테아제 억제제 칵테일, pH 7.5)에서 용해하였다. 용해물을 간단히 볼텍싱하고 초음파 처리한 후, 4℃에서 20분 동안 12,000 x g에서 원심분리하여 부산물을 제거하였다. 상층액을 수집하고 새로운 튜브로 옮겼다. 단백질 농도는 660 nm 단백질 분석 시약(Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)으로 결정하였다. 동일한 양의 단백질 추출물을 SDS-폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동한 다음 니트로셀룰로오스 전달막(Whatman, Dassel, Germany)으로 옮겼다. 멤브레인은 0.1%(v/v) Tween 20(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 5%(w/v) 무지방 DifcoTM 탈지유(BD Biosciences, Sparks, MD, USA) 및 3% BSA(Affymetrix, Santa clara OH, USA)를 포함하는 PBS를 통해 차단되었고, 1차 항체를 첨가하였다. 실험에는 다음과 같은 항체를 사용하였다: Cell Signaling(Danvers, MA, USA)에서 구입한 항-TSP-2(Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, USA), 항-Smad3, 항-p-Smad3 및 항- Smad4(Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, USA), 항-β-액틴(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). 그런 다음 멤브레인을 1x PBST로 세척하고 적절한 이차 항-토끼 또는 항-마우스 양고추냉이 퍼옥시다제 결합 항체(Thermo Scientific, Rockford IL, USA)와 함께 1시간 동안 인큐베이션한 다음, LAS-3000 시스템 (Fujifilm, Stamford, CT, USA)과 함께 enhanced chemiluminescence detection reagent (Thermo Scientific)을 통해 시각화하였다.

RNA 분리 및 정량적 실시간 연쇄 반응(qRT-PCR)

제조사의 프로토콜(Takara, Kyoto, Japan)에 따라 TRIzol 시약을 사용하여 총 RNA를 추출하였다. 500㎕의 Trizol을 세포 배양 접시(6웰)에 첨가하고 세포를 튜브에 수집하였다. 100 μl의 클로로포름을 샘플에 첨가하고 샘플을 볼텍싱하였다. 샘플을 실온에서 3분 동안 인큐베이션하고 4℃에서 15분 동안 12,000 x g에서 원심분리하였다. 250 ul의 상청액을 수집하고 새로운 튜브로 옮겼다. 250㎕의 이소프로판올을 샘플에 첨가하고 샘플을 4℃에서 10분 동안 12,000 xg에서 원심분리하였다. 상층액을 제거하고 500㎕의 75% 에탄올을 샘플에 첨가하였다. 그 후 샘플을 4℃에서 5분 동안 13,000 x g에서 원심분리하였다. 상층액을 제거하고 펠렛을 실온에서 건조하였다. DEPC 30㎕를 건조된 펠렛에 첨가하였다. RNA의 농도는 Nanodrop1000(Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)으로 측정하였다. RNA 분리 후 1 μg의 total RNA를 사용하고 제조사의 프로토콜에 따라 CellScript(CellSafe, Seoul, Korea)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. qRT-PCR 분석은 ABI PRISM 7000 Sequence Detection System 기기 및 소프트웨어(Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 일부 수정된 제조업체의 프로토콜에 따라 수행하였다. 간단히 요약하면, 적절한 양의 역전사 반응 혼합물을 SYBR 그린 PCR 마스터 믹스(Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 특정 프라이머로 증폭하였다. qRT-PCR에 대한 PCR 프라이머 서열은 표 1에 나열하였다.

유전자의 발현 수준은 5점 연속 표준 곡선을 생성하여 결정하였다. cDNA의 농도는 α-Tubulin를 통하여 정규화하였다. 모든 반응은 삼중으로 수행하였으며, 상대 발현 수준 및 SD 값은 비교 방법(comparative method)을 사용하여 계산하였다.

mouse Thbs2 forward primer : GACCAAACCTACGCTGGTGGA (서열번호 33)

mouse Thbs2 reverse primer : AGCACATTGCTGGAGCTGGA (서열번호 34)

mouse α-SMA forward primer : GTGACTCACAACGTGCCTATC (서열번호 35)

mouse α-SMA reverse primer : CTCGGCAGTAGTCACGAAGG (서열번호 36)

mouse FN forward primer : AAGACCATACCTGCCGAATG (서열번호 37)

mouse FN reverse primer : GAACATGACCGATTTGGACC (서열번호 38)

mouse col1a1 forward primer : ATGGATTCCCGTTCGAGTACG (서열번호 39)

mouse col1a1 reverse primer : TCAGCTGGATAGCGACATCG (서열번호 40)

mouse col1a2 forward primer : TGCAGTAACTTCGTGCCTAGC (서열번호 41)

mouse col1a2 reverse primer : ACGTGGTCCTCTGTCTCCA (서열번호 42)

mouse col3a1 forward primer : CTAAAATTCTGCCACCCCGAA (서열번호 43)

mouse col3a1 reverse primer : AGGATCAACCCAGTATTCTCCACTC (서열번호 44)

mouse Snail forward primer : TCTGAAGATGCACATCCGAAGCCA (서열번호 45)

mouse Snail reverse primer : AGGAGAATGGCTTCTCACCAGTGT (서열번호 46)

mouse Smad4 forward primer : CAGCCATAGTGAAGGACTGTTGC (서열번호 47)

mouse Smad4 reverse primer : CCTACTTCCAGTCCAGGTGGTA (서열번호 48)

rat Thbs2 forward primer : CAAGGACATGCAGTTTGGGC (서열번호 49)

rat Thbs2 reverse primer : GAAGACCAGGGTGACCAGTG (서열번호 50)

rat α-SMA forward primer : TTCATTGGAATGGAGTCGGCG (서열번호 51)

rat α-SMA reverse primer : CTGTCAGCAATGCCTGGGTA (서열번호 52)

배지 농도

60-mm 세포 배양 접시에서 배양된 C22, RLE-6TN 또는 MLg 세포의 배지를 수확하고 0.45 μm 필터(Sartorius, Stonehouse, UK)를 통과시킨 후, 조절 배지(conditioned medium)로 사용하였다. 추가적으로, 배양 배지를 VIVASPIN6 컬럼(Sartorius)에 적용하고 10,000 x g에서 2시간 동안 원심분리한 후, 단백질 분석을 사용하여 농축된 단백질을 계산한 다음 항체를 사용하여 면역블롯팅하였다. 주변분비(paracrine)의 경우, 섬유화 유발 분비인자(Matricellular proteins)를 분비하는 C22 또는 RLE-6TN의 조건 배지를 MLg로 옮겼다.

통계 분석

결과는 Prism 소프트웨어 버전 5(GraphPad Software, San Diego, CA, USA)로 시각화 및 분석하였다. 2개 이상의 샘플 그룹을 비교할 때, 통계적 유의성을 위해 일원 분산 분석(one-way ANOVA)을 이용하였다. 데이터 값은 평균±표준편차(SD)로 나타내었다. 두 그룹의 통계적 유의성을 결정하는 데 스튜던트 t-검정를 사용하였으며, P < 0.05의 값은 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.

항체 제작

TSP-2의 1,172개의 아미노산 중, a.a 928-930 (RGD 도메인)을 포함하는 펩타이드를 이용하여 항체를 제작하였다. 대조군으로는 a.a 173-295를 인식하는 산타크루즈(Santacruz) 시판 항체(sc-136238, mouse mono)를 사용하였다.

TSP-2 아미노산 서열 (NCBI Reference Sequence: NP_003238.2 , thrombospondin-2 precursor [Homo sapiens]) :

MVWRLVLLALWVWPSTQAGHQDKDTTFDLFSISNINRKTIGAKQFRGPDPGVPAYRFVRFDYIPPVNADD

LSKITKIMRQKEGFFLTAQLKQDGKSRGTLLALEGPGLSQRQFEIVSNGPADTLDLTYWIDGTRHVVSLE

DVGLADSQWKNVTVQVAGETYSLHVGCDLIDSFALDEPFYEHLQAEKSRMYVAKGSARESHFRGLLQNVH

LVFENSVEDILSKKGCQQGQGAEINAISENTETLRLGPHVTTEYVGPSSERRPEVCERSCEELGNMVQEL

SGLHVLVNQLSENLKRVSNDNQFLWELIGGPPKTRNMSACWQDGRFFAENETWVVDSCTTCTCKKFKTIC

HQITCPPATCASPSFVEGECCPSCLHSVDGEEGWSPWAEWTQCSVTCGSGTQQRGRSCDVTSNTCLGPSI

QTRACSLSKCDTRIRQDGGWSHWSPWSSCSVTCGVGNITRIRLCNSPVPQMGGKNCKGSGRETKACQGAP

CPIDGRWSPWSPWSACTVTCAGGIRERTRVCNSPEPQYGGKACVGDVQERQMCNKRSCPVDGCLSNPCFP

GAQCSSFPDGSWSCGSCPVGFLGNGTHCEDLDECALVPDICFSTSKVPRCVNTQPGFHCLPCPPRYRGNQ

PVGVGLEAAKTEKQVCEPENPCKDKTHNCHKHAECIYLGHFSDPMYKCECQTGYAGDGLICGEDSDLDGW

PNLNLVCATNATYHCIKDNCPHLPNSGQEDFDKDGIGDACDDDDDNDGVTDEKDNCQLLFNPRQADYDKD

EVGDRCDNCPYVHNPAQIDTDNNGEGDACSVDIDGDDVFNERDNCPYVYNTDQRDTDGDGVGDHCDNCPL

VHNPDQTDVDNDLVGDQCDNNEDIDDDGHQNNQDNCPYISNANQADHDRDGQGDACDPDDDNDGVPDDRD

NCRLVFNPDQEDLDGDGRGDICKDDFDNDNIPDIDDVCPENNAISETDFRNFQMVPLDPKGTTQIDPNWV

IRHQGKELVQTANSDPGIAVGFDEFGSVDFSGTFYVNTDRDDDYAGFVFGYQSSSRFYVVMWKQVTQTYW

EDQPTRAYGYSGVSLKVVNSTTGTGEHLRNALWHTGNTPGQVRTLWHDPRNIGWKDYTAYRWHLTHRPKT

GYIRVLVHEGKQVMADSGPIYDQTYAGGRLGLFVFSQEMVYFSDLKYECRDI (서열번호 53)

닷 블롯(Dot-blot)을 통하여 TSP-2에 대한 제작 항체의 후보군으로 7개의 클론을 확보하였고, 해당 클론들로 폐섬유아세포에서 웨스턴 블롯 테스트을 수행하여, 항체 친화도를 기반으로 2개의 클론으로 후보군을 좁혔다. 그 후, 해당 2개의 항체의 섬유아세포 증식 저해능을 비교하여, 최종적으로 1개의 항체를 선별하였다. 그 후, 제작된 항체와 시판항체의 TGF-β처리 후 섬유아세포 증식 억제능력을 세포 수 계수(Cell Counting)방법을 통하여 비교하였다.

실험결과

TSP-2의 발현이 IPF 환자의 폐 및 폐 섬유증 마우스 모델에서 증가되었다.

섬유화 유발 분비인자(Matricellular proteins)는 섬유증의 예측 바이오마커 및 ECM 합성의 조절자로 기능하며, 따라서 유망한 잠재적 치료 타겟이므로, 섬유화 유발 분비인자의 TSP들 중 TSP-2와 폐 질환의 병리학적 관련성을 조사하기 위하여 IPF 환자의 폐 조직, 간질성 폐 질환 환자의 혈청 및 폐 섬유증의 마우스 모델에서 TSP-2의 발현을 측정하였다.

NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 유전자 발현 옴니버스(GEO)에 따르면, TSP-1 및 TSP-3이 아닌 TSP-2가 대조군에 비해 IPF 환자의 샘플에서 유의하게 상승한 것으로 나타났다(도 1a 및 1b). 또한 건강한 피험자와 ILD 환자의 TSP-2 수치를 조사하였고, ILD 환자에서 인간 TSP-2의 혈청 수준은 TSP-2 ELISA 키트를 통해 평가하였다. 그 결과, 혈청 TSP-2의 수준은 ILD 환자에서 상향 조절됨을 확인하였다.

다음으로, 폐 섬유증 마우스 모델에서 TSP-2 발현을 조사하기 위해 블레오마이신 유도 폐 섬유증 모델 및 Ccsp-TGF 1-TG 마우스를 사용하였다. Bleomycin(BLM)은 마우스에서 폐 섬유증의 급성 유도에 널리 사용되며, Bleomycin에 의하여 강력한 섬유화 사이토카인인 TGF-β1의 수준이 증가하고 이는 IPF38에서 중요한 역할을 수행한다. TGF-β는 상피-중간엽 전이(EMT)의 주요 유도제이며 폐를 포함한 많은 조직에서 섬유증의 주요 매개체이다.

도 3a에 나타낸 바와 같이, 블레오마이신 유도 폐 섬유증 모델에서 실험을 진행하였고 콜라겐 축적을 관찰할 수 있었다. 분비된 TSP-2 단백질의 발현을 조사하기 위해 마우스 폐 섬유증 모델에서 농축된 기관지 폐포 세척액(BALF)을 조사하였다. 상향 조절된 TSP-2 발현은 웨스턴 블롯 분석을 통하여 확인할 수 있었고(도 3b), BAL 액체 총 세포 계산를 통하여 마우스 폐 섬유증 모델에서 BAL 액 총 세포 수의 증가를 확인할 수 있었다(도 3c). 또한, 마우스 폐 조직에서 마우스 폐 섬유증 모델의 TSP-2 발현도 상승하였다(도 3d). 따라서, TSP-2 수준은 블레오마이신 주사 후 마우스의 폐에서 유의하게 증가함을 확인하였다(도 3a 내지 3d).

TGF-β 구동 폐 섬유증에서 TSP-2 발현의 유도를 추가로 확인하기 위해, TGF-β1(Ccsp-TGF 1-TG 마우스)의 유도성 과발현이 있는 형질전환 마우스 모델에서 TSP-2 발현의 변화를 평가하였다. 독시사이클린(Dox)의 투여는 폐 섬유증을 유도하는데(도 3e), Dox 투여 30일 후, TSP-2는 야생형 마우스의 폐와 비교하여 Ccsp-TGF 1-TG 마우스의 폐에서 유의하게 증가하였다. BALF를 농축하고 면역블롯을 사용하여 TSP-2의 발현 증가를 관찰할 수 있었다(도 3f). 또한, 많은 염증 세포와 콜라겐 축적으로 인해 BAL 액의 총 세포 수가 증가하였고(도 3g), 마우스 폐 조직에서 TSP-2 발현도 상향 조절되었다(도 3h). 상기 결과를 통하여, TSP-2 발현이 IPF 환자 및 폐 섬유증의 마우스 모델에서 상승한다는 것을 입증할 수 있었다.

TGF-β 매개 SMAD 의존적 신호전달을 통하여 TSP-2 유전자의 전사가 활성화된다.

TSP-2는 TGF-β28을 활성화시키는 것으로 나타났으므로, TGF-β1 처리 후 MLg(마우스 섬유아세포), C22(마우스 클럽 세포)에서 TSP-2의 mRNA 수준을 평가하였다. qRT-PCR 및 Western blot 분석 결과에 의하여 TGF-β1 처리에 의해 TSP-2의 수준이 증가됨을 관찰할 수 있었다.

TGF-β-유도된 TSP-2 발현이 표준 TGF-β 신호전달에 의해 매개되는지 여부를 조사하기 위해, TSP-2 발현에 대한 Smad4 녹다운의 효과를 조사하였다. MLg 및 C22 세포주에서 Smad4의 녹다운은 TGF-β-유도된 TSP-2 발현에서의 mRNA 수준을 없앴다(도 4a). 또한, TGF-β-유도된 TSP-2 발현의 단백질 수준도 감소하였다(도 4b). 이러한 결과를 통하여 TSP-2 유전자의 전사 활성화에 Smad 의존적 표준 TGF-β 신호전달이 필요함을 알 수 있었다. 다음으로, 선택적 TGF-β1 억제제인 LY2157299를 이용하여 TGF-β 억제가 TSP-2의 발현에 미치는 영향을 시험하였다. 그 결과, LY2157299는 용량 의존적 방식으로 TGF-β1 유도 TSP-2 발현을 억제함을 알 수 있었다(도 5a, 5b). 상기 결과를 종합하여, TSP-2 발현이 TGF-β 신호전달에 의해 조절된다는 것을 입증할 수 있었다.

TSP-2의 프로모터 영역의 전사 인자를 분석하기 위해 PROMO 3.0.2 도구를 사용하여 검색하였다. 특히, Smad가 TGF-β1 처리에 대한 반응으로 TSP-2의 전사를 직접 조절하는지 여부를 추가로 조사하기 위해 TSP-2 유전자 프로모터의 Smad 결합 모티프 CAGAC 또는 GTCTG를 검색하였다. 도 6a는 TSP-2 프로모터의 여러 Smad 결합 요소를 개략적으로 도시한 것이다. 프로모터 활성은 2kb (-1700 ~ 300 bp) 프로모터와 비교하여 TSP-2 유전자의 구조체(-30 ~ 300 bp) 프로모터에서 유의하게 감소하였다(도 6b). 전사 시작 부위의 업스트림에 초점을 맞추기 위해 TSP-2 유전자의 1.6kb, 400 및 350 염기쌍 크기의 프로모터를 사용하여 루시퍼라제 리포터 유전자 분석을 추가로 수행하였다. 400 및 350 염기쌍 크기의 프로모터에서 유사하게 루시페라제 활성이 증가했기 때문에(도 6c) #6 Smad 결합 요소가 중요할 것으로 예상하였다. #6(-43에서 -39) Smad 결합 요소가 결실된 TSP-2 유전자 프로모터에서 대조군과 비교하여 루시페라제 활성의 상당한 감소를 관찰할 수 있었다. 또한, #6이 결실된 돌연변이 프로모터의 루시페라제 활성은 TGF-β1 처리에 의해 영향을 받지 않았다(도 6d). 이러한 결과를 통하여 #6 Smad-결합 요소가 TSP-2 유전자의 전사 조절에 필수적임을 입증할 수 있었다. 따라서, Smad가 TSP-2 프로모터에 결합하고 TGF-β 신호전달에 반응하여 TSP-2 유전자 전사를 활성화한다는 것을 입증할 수 있었다.

TSP-2의 녹다운은 TGF-β1 유도 섬유아세포 활성화를 억제한다.

TGF-β는 여러 조직에서 섬유증의 주요 매개체이고 TSP-2는 TGF-β 신호전달에 의해 조절되기 때문에, TGF-β가 상피 세포 및 섬유아세포 모두에서 TSP-2의 분비를 증가시키고, 그 후 자가분비 또는 측분비 방식을 통해 섬유아세포에서 ECM의 침착을 촉진시키는 것으로 가정하였다. 따라서, 폐 상피 세포(C22 및 RLE-6TN) 또는 폐 섬유아세포(MLg)에서 TSP-2 발현을 차단한 후 TGF-β에 의해 유도된 섬유아세포 증식 및 섬유아세포에서 표적 유전자 발현을 평가하였다.

TSP-2의 녹다운 효율을 확인하기 위해 MLg, C22, RLE-6TN(쥐 AT2 세포)에서 qRT-PCR(도 7b, 8a) 및 웨스턴 블롯 분석(도 7c, 8b)을 수행하였다. 섬유아세포 활성화에 대한 TSP-2 녹다운의 자가분비 및 측분비(도 7a) 효과를 조사하였다. 측분비 신호의 경우, 상피 세포에서 TSP-2의 녹다운 후의 조절 배지를 섬유아세포로 이동시켰고, 섬유아세포의 세포 증식을 측정하였다(도 7a). TGF-β1 처리와 함께 배양된 조건 배지는 섬유아세포 증식을 증가시켰으나, TSP-2의 녹다운은 자가분비 및 측분비 방식 모두에서 TGF-β1 유도 섬유아세포 활성화를 감소시켰다(도 7d, 8c). 따라서 TGF-β1에 의한 섬유아세포 증식에는 TSP-2가 필요함을 알 수 있었다.

다음으로, 섬유아세포에서 섬유화 표적 유전자 발현에 대한 TSP-2의 넉다운 효과를 조사하였다. 예상대로 TGF-β1 처리는 Collagen1a1(Col1a1), Collagen1a2(Col1a2), Collagen3a1(Col3a1), Fibronectin(FN), α-Smooth Muscle Actin(α-SMA)과 같은 섬유화 표적 유전자를 유의하게 증가시켰고, 반면 TSP-2의 녹다운은 표적 유전자의 TGF-β1-유도된 상향조절을 실질적으로 억제하였다(도 7e). 또한, 상피 세포에서 TSP-2의 녹다운은 섬유아세포에서 섬유화 표적 유전자의 유도를 없앴다(도 8d). 이러한 결과를 통해 TSP-2의 녹다운에 의하여 자가분비 또는 측분비 방식을 통해 TGF-β 유도 섬유아세포 활성화를 억제되며, 따라서 TSP-2는 TGF-β로 유도된 섬유아세포 활성화를 조절함을 알 수 있었다.

TSP-2 단클론 중화항체로 TSP-2를 차단하는 경우 섬유아세포 활성화가 억제된다.

TSP-2의 발현을 억제하면 섬유아세포 활성화가 억제되는 것으로 관찰되어 TSP-2의 기능을 효과적으로 억제할 수 있는 TSP-2에 대한 단클론항체(mAb)의 유효성을 조사하였다. 섬유아세포 활성화에 대한 TSP-2 차단의 자가분비 및 측분비 효과를 실험하였다. 먼저, TSP-2 단일클론항체의 차단 작용을 확인하기 위해 TGF-β1 유도 섬유아세포 활성화가 섬유아세포 증식에 미치는 억제 효과를 평가하였다. 그 다음 TSP-2 단일클론항체의 처리가 넉다운 결과와 유사하게 섬유화 마커의 표적 유전자를 억제하는지 여부를 조사하였다. 다음으로, TSP-2 단일클론항체의 처리가 넉다운 결과와 유사하게 섬유화 마커의 표적 유전자를 억제하는지 여부를 조사하였다.

섬유아세포에 TGF-β1(20ng/ml)과 농도에 따라 TSP-2 단일클론항체를 처리한 후, TGF-β1에 의해 유도된 섬유아세포 증식을 세포 계수로 분석하였다. CTGF 모노클로날 항체 처리는 항체 차단 실험의 양성 대조군을 위하여 사용되었고, 항-TSP-2 단일클론 항체가 있는 조건 배지의 TGF-β1-유도 섬유아세포 증식은 용량 의존적 방식으로 유의하게 감소되었다(도 9a). 또한, TSP-2 모노클로날 중화 항체를 통하여 TSP-2의 표적화 억제를 통하여 용량 의존적 방식으로 섬유아세포에서 TGF-β1 유도 섬유화 표적 유전자 발현을 감소실 수 있음을 확인하였다(도 9b).

측분비 신호전달에 대해서는, 상피세포에 TSP-2 단일클론항체와 TGF-β1(20 ng/ml) 처리하고, 조건배지를 섬유아세포로 이동시킨 후 섬유아세포의 세포 증식을 측정하였다. 항-TSP-2 모노클로날 항체를 갖는 조절 배지의 TGF-β1-유도된 섬유아세포 증식은 용량 의존적 방식으로 감소하였다(도 10a). 또한, 항-TSP-2 단일클론 항체에 의한 TSP-2의 표적 억제는 용량 의존적 방식으로 섬유아세포에서 TGF-β1-유도 섬유화 표적 유전자 발현을 효율적으로 억제하였다(도 10b). 따라서, 이러한 결과를 통하여 항-TSP-2 mAb가 분비된 TSP-2 단백질에 결합하고 자가분비 및 측분비 방식으로 TSP-2를 중화함으로써 TGF-β1 유도 섬유아세포 활성화를 억제함을 입증할 수 있었다.

최종 제작 항체의 CDR 서열을 확보하였다.

상기 항체 제작 및 선별과정을 통하여, 기존 시판항체(sc-136238)보다 섬유아세포 저해능이 우월한 제작항체를 선별할 수 있었다. 7개의 클론(#1 내지 #7)을 확보하기 위하여 닷 블롯을 사용하였고(도 11a), 폐섬유아세포에서 웨스턴 블롯을 기반으로 2개의 후보를 선정하였으며(도 11b), 최종적으로 2개의 후보(#2, #4)의 섬유아세포증식 저해능을 비교하여 최종 제작 항체(#4)를 선별하였다(도 11c).

또한, 해당 제작항체의 CDR 서열을 분석하였으며, 분석결과는 다음과 같다.

아미노산 서열

HCDR1 : GYSFTGYY (서열번호 1)

HCDR2 : VNPNNGGI (서열번호 2)

HCDR3 : ARDGAY (서열번호 3)

LCDR1 : QSLLDSDGKTY (서열번호 4)

LCDR2 : LVS (서열번호 5)

LCDR3 : WQGTHFPFT (서열번호 6)

HFR1 : EVQLQQSGPDLVKPGASVKISCKAS (서열번호 7)

HFR2 : MHWVKQSHEKSLEWIGR (서열번호 8)

HFR3 : SYNQKFRGKAILTVDRSSNTAYMELRSLTSEDSAVYYC (서열번호 9)

HFR4 : WGQGTLVTVSA (서열번호 10)

중쇄 가변영역 :

EVQLQQSGPDLVKPGASVKISCKASGYSFTGYYMHWVKQSHEKSLEWIGRVNPNNGGISYNQKFRGKAILTVDRSSNTAYMELRSLTSEDSAVYYCARDGAYWGQGTLVTVSA (서열번호 11)

LFR1 : DVVMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSS (서열번호 12)

LFR2 : LNWLLQRPGQSPKRLIY (서열번호 13)

LFR3 : KLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYYYC (서열번호 14)

LFR4 : FGSGTKLEIK (서열번호 15)

경쇄 가변영역 :

DVVMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYYYCWQGTHFPFTFGSGTKLEIK (서열번호 16)

핵산 서열

HCDR1 : GGTTACTCATTCACTGGCTACTAC (서열번호 17)

HCDR2 : GTTAATCCTAACAATGGTGGTATA (서열번호 18)

HCDR3 : GCAAGAGATGGTGCTTAC (서열번호 19)

LCDR1 : CAGAGCCTCTTAGATAGTGATGGAAAGACATAT (서열번호 20)

LCDR2 : CTGGTGTCT (서열번호 21)

LCDR3 : TGGCAAGGTACACATTTTCCATTCACG (서열번호 22)

HFR1 :

GAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGACCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTTCT (서열번호 23)

HFR2 : ATGCACTGGGTGAAACAGAGCCATGAAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGACGT (서열번호 24)

HFR3 :

AGCTACAACCAGAAGTTCAGGGGCAAGGCCATATTAACTGTAGACAGGTCATCCAATACAGCCTACATGGAGCTCCGCAGTCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGT (서열번호 25)

HFR4 : TGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA (서열번호 26)

중쇄 가변영역 :

GAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGACCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGGCTACTACATGCACTGGGTGAAACAGAGCCATGAAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGACGTGTTAATCCTAACAATGGTGGTATAAGCTACAACCAGAAGTTCAGGGGCAAGGCCATATTAACTGTAGACAGGTCATCCAATACAGCCTACATGGAGCTCCGCAGTCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGAGATGGTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA (서열번호 27)

LFR1 :

GATGTTGTGATGACCCAGACTCCACTCACTTTGTCGGTTACCATTGGACAACCAGCCTCCATCTCTTGCAAGTCAAGT (서열번호 28)

LFR2 : TTGAATTGGTTGTTACAGAGGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCGGCTAATCTAT (서열번호 29)

LFR3 :

AAATTGGACTCTGGAGTCCCTGACAGGTTCACTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATTTGGGAATTTATTATTATTGC (서열번호 30)

LFR4 : TTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAA (서열번호 31)

경쇄 가변영역 :

GATGTTGTGATGACCCAGACTCCACTCACTTTGTCGGTTACCATTGGACAACCAGCCTCCATCTCTTGCAAGTCAAGTCAGAGCCTCTTAGATAGTGATGGAAAGACATATTTGAATTGGTTGTTACAGAGGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCGGCTAATCTATCTGGTGTCTAAATTGGACTCTGGAGTCCCTGACAGGTTCACTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATTTGGGAATTTATTATTATTGCTGGCAAGGTACACATTTTCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAA (서열번호 32)

제작된 항체와 기존 시판항체의 TGF-β처리 후 섬유아세포 증식 억제능을 비교한 결과, 제작항체의 억제능이 시판항체보다 뛰어남을 확인할 수 있었다(도 11d).

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Yonsei University Industry Academic Cooperation Foundation <120> Novel Antibody for Preventing or Treating Fibrotic Disease <130> PDPB214360k01 <150> KR 10-2021-0097971 <151> 2021-07-26 <160> 53 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-TSP2 antibody HCDR1 <400> 1 Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Tyr 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-TSP2 antibody HCDR2 <400> 2 Val Asn Pro Asn Asn Gly Gly Ile 1 5 <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-TSP2 antibody HCDR3 <400> 3 Ala Arg Asp Gly Ala Tyr 1 5 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-TSP2 antibody LCDR1 <400> 4 Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr 1 5 10 <210> 5 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-TSP2 antibody LCDR2 <400> 5 Leu Val Ser 1 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-TSP2 antibody LCDR3 <400> 6 Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Phe Thr 1 5 <210> 7 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-TSP2 antibody HFR1 <400> 7 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser 20 25 <210> 8 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-TSP2 antibody HFR2 <400> 8 Met His Trp Val Lys Gln Ser His Glu Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly 1 5 10 15 Arg <210> 9 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-TSP2 antibody HFR3 <400> 9 Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Arg Gly Lys Ala Ile Leu Thr Val Asp Arg 1 5 10 15 Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp 20 25 30 Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 35 <210> 10 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-TSP2 antibody HFR4 <400> 10 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 1 5 10 <210> 11 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-TSP2 antibody VH region <400> 11 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Glu Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Val Asn Pro Asn Asn Gly Gly Ile Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Arg Gly Lys Ala Ile Leu Thr Val Asp Arg Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Gly Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 100 105 110 Ala <210> 12 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-TSP2 antibody LFR1 <400> 12 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser 20 25 <210> 13 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-TSP2 antibody LFR2 <400> 13 Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Lys Arg Leu Ile 1 5 10 15 Tyr <210> 14 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-TSP2 antibody LFR3 <400> 14 Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly 1 5 10 15 Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly 20 25 30 Ile Tyr Tyr Tyr Cys 35 <210> 15 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-TSP2 antibody LFR4 <400> 15 Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 16 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-TSP2 antibody VL region <400> 16 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Tyr Cys Trp Gln 85 90 95 Gly Thr His Phe Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-TSP2 antibody HCDR1 DNA <400> 17 ggttactcat tcactggcta ctac 24 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-TSP2 antibody HCDR2 DNA <400> 18 gttaatccta acaatggtgg tata 24 <210> 19 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-TSP2 antibody HCDR3 DNA <400> 19 gcaagagatg gtgcttac 18 <210> 20 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-TSP2 antibody LCDR1 DNA <400> 20 cagagcctct tagatagtga tggaaagaca tat 33 <210> 21 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-TSP2 antibody LCDR2 DNA <400> 21 ctggtgtct 9 <210> 22 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-TSP2 antibody LCDR3 DNA <400> 22 tggcaaggta cacattttcc attcacg 27 <210> 23 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-TSP2 antibody HFR1 DNA <400> 23 gaggtccagc tgcagcagtc tggacctgac ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60 tcctgcaagg cttct 75 <210> 24 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-TSP2 antibody HFR2 DNA <400> 24 atgcactggg tgaaacagag ccatgaaaag agccttgagt ggattggacg t 51 <210> 25 <211> 114 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-TSP2 antibody HFR3 DNA <400> 25 agctacaacc agaagttcag gggcaaggcc atattaactg tagacaggtc atccaataca 60 gcctacatgg agctccgcag tctgacatct gaggactctg cggtctatta ctgt 114 <210> 26 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-TSP2 antibody HFR4 DNA <400> 26 tggggccaag ggactctggt cactgtctct gca 33 <210> 27 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-TSP2 antibody VH region DNA <400> 27 gaggtccagc tgcagcagtc tggacctgac ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60 tcctgcaagg cttctggtta ctcattcact ggctactaca tgcactgggt gaaacagagc 120 catgaaaaga gccttgagtg gattggacgt gttaatccta acaatggtgg tataagctac 180 aaccagaagt tcaggggcaa ggccatatta actgtagaca ggtcatccaa tacagcctac 240 atggagctcc gcagtctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagagatggt 300 gcttactggg gccaagggac tctggtcact gtctctgca 339 <210> 28 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-TSP2 antibody LFR1 DNA <400> 28 gatgttgtga tgacccagac tccactcact ttgtcggtta ccattggaca accagcctcc 60 atctcttgca agtcaagt 78 <210> 29 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-TSP2 antibody LFR2 DNA <400> 29 ttgaattggt tgttacagag gccaggccag tctccaaagc ggctaatcta t 51 <210> 30 <211> 111 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-TSP2 antibody LFR3 DNA <400> 30 aaattggact ctggagtccc tgacaggttc actggcagtg gatcagggac agatttcaca 60 ctgaaaatca gcagagtgga ggctgaggat ttgggaattt attattattg c 111 <210> 31 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-TSP2 antibody LFR4 DNA <400> 31 ttcggctcgg ggacaaagtt ggaaataaaa 30 <210> 32 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-TSP2 antibody VL region DNA <400> 32 gatgttgtga tgacccagac tccactcact ttgtcggtta ccattggaca accagcctcc 60 atctcttgca agtcaagtca gagcctctta gatagtgatg gaaagacata tttgaattgg 120 ttgttacaga ggccaggcca gtctccaaag cggctaatct atctggtgtc taaattggac 180 tctggagtcc ctgacaggtt cactggcagt ggatcaggga cagatttcac actgaaaatc 240 agcagagtgg aggctgagga tttgggaatt tattattatt gctggcaagg tacacatttt 300 ccattcacgt tcggctcggg gacaaagttg gaaataaaa 339 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Thbs2 forward primer <400> 33 gaccaaacct acgctggtgg a 21 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Thbs2 reverse primer <400> 34 agcacattgc tggagctgga 20 <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse alpha-SMA forward primer <400> 35 gtgactcaca acgtgcctat c 21 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse alpha-SMA reverse primer <400> 36 ctcggcagta gtcacgaagg 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse FN forward primer <400> 37 aagaccatac ctgccgaatg 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse FN reverse primer <400> 38 gaacatgacc gatttggacc 20 <210> 39 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse col1a1 forward primer <400> 39 atggattccc gttcgagtac g 21 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse col1a1 reverse primer <400> 40 tcagctggat agcgacatcg 20 <210> 41 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse col1a2 forward primer <400> 41 tgcagtaact tcgtgcctag c 21 <210> 42 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse col1a2 reverse primer <400> 42 acgtggtcct ctgtctcca 19 <210> 43 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse col3a1 forward primer <400> 43 ctaaaattct gccaccccga a 21 <210> 44 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse col3a1 reverse primer <400> 44 aggatcaacc cagtattctc cactc 25 <210> 45 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Snail forward primer <400> 45 tctgaagatg cacatccgaa gcca 24 <210> 46 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Snail reverse primer <400> 46 aggagaatgg cttctcacca gtgt 24 <210> 47 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Smad4 forward primer <400> 47 cagccatagt gaaggactgt tgc 23 <210> 48 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Smad4 reverse primer <400> 48 cctacttcca gtccaggtgg ta 22 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rat Thbs2 forward primer <400> 49 caaggacatg cagtttgggc 20 <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rat Thbs2 reverse primer <400> 50 gaagaccagg gtgaccagtg 20 <210> 51 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rat alpha-SMA forward primer <400> 51 ttcattggaa tggagtcggc g 21 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rat alpha-SMA reverse primer <400> 52 ctgtcagcaa tgcctgggta 20 <210> 53 <211> 1172 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 53 Met Val Trp Arg Leu Val Leu Leu Ala Leu Trp Val Trp Pro Ser Thr 1 5 10 15 Gln Ala Gly His Gln Asp Lys Asp Thr Thr Phe Asp Leu Phe Ser Ile 20 25 30 Ser Asn Ile Asn Arg Lys Thr Ile Gly Ala Lys Gln Phe Arg Gly Pro 35 40 45 Asp Pro Gly Val Pro Ala Tyr Arg Phe Val Arg Phe Asp Tyr Ile Pro 50 55 60 Pro Val Asn Ala Asp Asp Leu Ser Lys Ile Thr Lys Ile Met Arg Gln 65 70 75 80 Lys Glu Gly Phe Phe Leu Thr Ala Gln Leu Lys Gln Asp Gly Lys Ser 85 90 95 Arg Gly Thr Leu Leu Ala Leu Glu Gly Pro Gly Leu Ser Gln Arg Gln 100 105 110 Phe Glu Ile Val Ser Asn Gly Pro Ala Asp Thr Leu Asp Leu Thr Tyr 115 120 125 Trp Ile Asp Gly Thr Arg His Val Val Ser Leu Glu Asp Val Gly Leu 130 135 140 Ala Asp Ser Gln Trp Lys Asn Val Thr Val Gln Val Ala Gly Glu Thr 145 150 155 160 Tyr Ser Leu His Val Gly Cys Asp Leu Ile Asp Ser Phe Ala Leu Asp 165 170 175 Glu Pro Phe Tyr Glu His Leu Gln Ala Glu Lys Ser Arg Met Tyr Val 180 185 190 Ala Lys Gly Ser Ala Arg Glu Ser His Phe Arg Gly Leu Leu Gln Asn 195 200 205 Val His Leu Val Phe Glu Asn Ser Val Glu Asp Ile Leu Ser Lys Lys 210 215 220 Gly Cys Gln Gln Gly Gln Gly Ala Glu Ile Asn Ala Ile Ser Glu Asn 225 230 235 240 Thr Glu Thr Leu Arg Leu Gly Pro His Val Thr Thr Glu Tyr Val Gly 245 250 255 Pro Ser Ser Glu Arg Arg Pro Glu Val Cys Glu Arg Ser Cys Glu Glu 260 265 270 Leu Gly Asn Met Val Gln Glu Leu Ser Gly Leu His Val Leu Val Asn 275 280 285 Gln Leu Ser Glu Asn Leu Lys Arg Val Ser Asn Asp Asn Gln Phe Leu 290 295 300 Trp Glu Leu Ile Gly Gly Pro Pro Lys Thr Arg Asn Met Ser Ala Cys 305 310 315 320 Trp Gln Asp Gly Arg Phe Phe Ala Glu Asn Glu Thr Trp Val Val Asp 325 330 335 Ser Cys Thr Thr Cys Thr Cys Lys Lys Phe Lys Thr Ile Cys His Gln 340 345 350 Ile Thr Cys Pro Pro Ala Thr Cys Ala Ser Pro Ser Phe Val Glu Gly 355 360 365 Glu Cys Cys Pro Ser Cys Leu His Ser Val Asp Gly Glu Glu Gly Trp 370 375 380 Ser Pro Trp Ala Glu Trp Thr Gln Cys Ser Val Thr Cys Gly Ser Gly 385 390 395 400 Thr Gln Gln Arg Gly Arg Ser Cys Asp Val Thr Ser Asn Thr Cys Leu 405 410 415 Gly Pro Ser Ile Gln Thr Arg Ala Cys Ser Leu Ser Lys Cys Asp Thr 420 425 430 Arg Ile Arg Gln Asp Gly Gly Trp Ser His Trp Ser Pro Trp Ser Ser 435 440 445 Cys Ser Val Thr Cys Gly Val Gly Asn Ile Thr Arg Ile Arg Leu Cys 450 455 460 Asn Ser Pro Val Pro Gln Met Gly Gly Lys Asn Cys Lys Gly Ser Gly 465 470 475 480 Arg Glu Thr Lys Ala Cys Gln Gly Ala Pro Cys Pro Ile Asp Gly Arg 485 490 495 Trp Ser Pro Trp Ser Pro Trp Ser Ala Cys Thr Val Thr Cys Ala Gly 500 505 510 Gly Ile Arg Glu Arg Thr Arg Val Cys Asn Ser Pro Glu Pro Gln Tyr 515 520 525 Gly Gly Lys Ala Cys Val Gly Asp Val Gln Glu Arg Gln Met Cys Asn 530 535 540 Lys Arg Ser Cys Pro Val Asp Gly Cys Leu Ser Asn Pro Cys Phe Pro 545 550 555 560 Gly Ala Gln Cys Ser Ser Phe Pro Asp Gly Ser Trp Ser Cys Gly Ser 565 570 575 Cys Pro Val Gly Phe Leu Gly Asn Gly Thr His Cys Glu Asp Leu Asp 580 585 590 Glu Cys Ala Leu Val Pro Asp Ile Cys Phe Ser Thr Ser Lys Val Pro 595 600 605 Arg Cys Val Asn Thr Gln Pro Gly Phe His Cys Leu Pro Cys Pro Pro 610 615 620 Arg Tyr Arg Gly Asn Gln Pro Val Gly Val Gly Leu Glu Ala Ala Lys 625 630 635 640 Thr Glu Lys Gln Val Cys Glu Pro Glu Asn Pro Cys Lys Asp Lys Thr 645 650 655 His Asn Cys His Lys His Ala Glu Cys Ile Tyr Leu Gly His Phe Ser 660 665 670 Asp Pro Met Tyr Lys Cys Glu Cys Gln Thr Gly Tyr Ala Gly Asp Gly 675 680 685 Leu Ile Cys Gly Glu Asp Ser Asp Leu Asp Gly Trp Pro Asn Leu Asn 690 695 700 Leu Val Cys Ala Thr Asn Ala Thr Tyr His Cys Ile Lys Asp Asn Cys 705 710 715 720 Pro His Leu Pro Asn Ser Gly Gln Glu Asp Phe Asp Lys Asp Gly Ile 725 730 735 Gly Asp Ala Cys Asp Asp Asp Asp Asp Asn Asp Gly Val Thr Asp Glu 740 745 750 Lys Asp Asn Cys Gln Leu Leu Phe Asn Pro Arg Gln Ala Asp Tyr Asp 755 760 765 Lys Asp Glu Val Gly Asp Arg Cys Asp Asn Cys Pro Tyr Val His Asn 770 775 780 Pro Ala Gln Ile Asp Thr Asp Asn Asn Gly Glu Gly Asp Ala Cys Ser 785 790 795 800 Val Asp Ile Asp Gly Asp Asp Val Phe Asn Glu Arg Asp Asn Cys Pro 805 810 815 Tyr Val Tyr Asn Thr Asp Gln Arg Asp Thr Asp Gly Asp Gly Val Gly 820 825 830 Asp His Cys Asp Asn Cys Pro Leu Val His Asn Pro Asp Gln Thr Asp 835 840 845 Val Asp Asn Asp Leu Val Gly Asp Gln Cys Asp Asn Asn Glu Asp Ile 850 855 860 Asp Asp Asp Gly His Gln Asn Asn Gln Asp Asn Cys Pro Tyr Ile Ser 865 870 875 880 Asn Ala Asn Gln Ala Asp His Asp Arg Asp Gly Gln Gly Asp Ala Cys 885 890 895 Asp Pro Asp Asp Asp Asn Asp Gly Val Pro Asp Asp Arg Asp Asn Cys 900 905 910 Arg Leu Val Phe Asn Pro Asp Gln Glu Asp Leu Asp Gly Asp Gly Arg 915 920 925 Gly Asp Ile Cys Lys Asp Asp Phe Asp Asn Asp Asn Ile Pro Asp Ile 930 935 940 Asp Asp Val Cys Pro Glu Asn Asn Ala Ile Ser Glu Thr Asp Phe Arg 945 950 955 960 Asn Phe Gln Met Val Pro Leu Asp Pro Lys Gly Thr Thr Gln Ile Asp 965 970 975 Pro Asn Trp Val Ile Arg His Gln Gly Lys Glu Leu Val Gln Thr Ala 980 985 990 Asn Ser Asp Pro Gly Ile Ala Val Gly Phe Asp Glu Phe Gly Ser Val 995 1000 1005 Asp Phe Ser Gly Thr Phe Tyr Val Asn Thr Asp Arg Asp Asp Asp Tyr 1010 1015 1020 Ala Gly Phe Val Phe Gly Tyr Gln Ser Ser Ser Arg Phe Tyr Val Val 1025 1030 1035 1040 Met Trp Lys Gln Val Thr Gln Thr Tyr Trp Glu Asp Gln Pro Thr Arg 1045 1050 1055 Ala Tyr Gly Tyr Ser Gly Val Ser Leu Lys Val Val Asn Ser Thr Thr 1060 1065 1070 Gly Thr Gly Glu His Leu Arg Asn Ala Leu Trp His Thr Gly Asn Thr 1075 1080 1085 Pro Gly Gln Val Arg Thr Leu Trp His Asp Pro Arg Asn Ile Gly Trp 1090 1095 1100 Lys Asp Tyr Thr Ala Tyr Arg Trp His Leu Thr His Arg Pro Lys Thr 1105 1110 1115 1120 Gly Tyr Ile Arg Val Leu Val His Glu Gly Lys Gln Val Met Ala Asp 1125 1130 1135 Ser Gly Pro Ile Tyr Asp Gln Thr Tyr Ala Gly Gly Arg Leu Gly Leu 1140 1145 1150 Phe Val Phe Ser Gln Glu Met Val Tyr Phe Ser Asp Leu Lys Tyr Glu 1155 1160 1165 Cys Arg Asp Ile 1170

Claims

서열번호 1의 서열로 이루어진 HCDR1, 서열번호 2의 서열로 이루어진 HCDR2 및 서열번호 3의 서열로 이루어진 HCDR3의 중쇄 CDR(complementarity determining region) 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역을 포함하는, TSP-2 (Thrombospondin-2) 단백질에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
제 1 항에 있어서, 상기 중쇄 가변영역은 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
제 1 항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열번호 4의 서열로 이루어진 LCDR1, 서열번호 5의 서열로 이루어진 LCDR2 및 서열번호 6의 서열로 이루어진 LCDR3의 경쇄 CDR 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
제 3 항에 있어서, 상기 경쇄 가변영역은 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
제 1 항에 있어서, 상기 항원 결합 단편은 Fab 단편, F(ab') 단편, F(ab')2 단편 또는 Fv 단편인 것을 특징으로 하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
제 1 항에 있어서, 상기 항체는 단일클론 항체인 것을 특징으로 하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
제 1 항에 있어서, 상기 항체는 중화 항체(Neutralizing Antibody)인 것을 특징으로 하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
제 1 항에 있어서, 상기 항체는 키메라 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체인 것을 특징으로 하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 섬유화 질환(fibrotic disease)의 예방 또는 치료용 조성물.
제 9 항에 있어서, 상기 섬유화 질환은 폐섬유증(Pulmonary Fibrosis)인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 10 항에 있어서, 상기 폐섬유증(Pulmonary Fibrosis)은 간질성폐질환(Interstitial Lung Disease, ILD) 및 특발성 폐섬유증(Idiopathic Pulmonary Fibrosis, IPF)으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 질환인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산 분자.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 섬유화 질환(fibrotic disease)의 진단용 조성물.
TSP-2 (Thrombospondin-2) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현량을 측정하는 제제를 유효성분으로 포함하는 섬유화 질환(fibrotic disease)의 진단용 조성물.
서열번호 4의 서열로 이루어진 LCDR1, 서열번호 5의 서열로 이루어진 LCDR2 및 서열번호 6의 서열로 이루어진 LCDR3의 경쇄 CDR(complementarity determining region) 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역을 포함하는 TSP-2(Thrombospondin-2) 단백질에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
TSP-2 (Thrombospondin-2)에 대한 억제제를 유효성분으로 포함하는 섬유화 질환(fibrotic disease)의 예방 또는 치료용 조성물.
다음의 단계를 포함하는 섬유화 질환의 예방 또는 치료용 조성물의 스크리닝 방법:
(a) TSP-2 (Thrombospondin-2) 단백질 또는 이를 발현하는 세포를 포함하는 생물학적 시료에 시험물질을 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 생물학적 시료 내 TSP-2 단백질 또는 이들을 인코딩하는 유전자의 발현량을 측정하는 단계,
상기 생물학적 시료 내 상기 단백질 또는 상기 유전자의 발현량이 감소하는 경우, 상기 시험물질은 섬유화 질환의 예방 또는 치료용 조성물로 판정한다.