JP7250307B2 - 子宮癌の発症、転移又は再発の予測方法 - Google Patents
子宮癌の発症、転移又は再発の予測方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP7250307B2 JP7250307B2 JP2018207653A JP2018207653A JP7250307B2 JP 7250307 B2 JP7250307 B2 JP 7250307B2 JP 2018207653 A JP2018207653 A JP 2018207653A JP 2018207653 A JP2018207653 A JP 2018207653A JP 7250307 B2 JP7250307 B2 JP 7250307B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- foxp4
- expression
- protein
- cancer
- cells
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Description
2.生物学的サンプルが、被験体から採取された全血、血漿、血清、又は子宮組織である、上記1記載の方法。
3.子宮頸癌の発症を予測するための、上記1又は2記載の方法。
4.子宮体癌の転移及び/又は再発を予測するための、上記1又は2記載の方法。
5.FOXP4タンパク質に特異的に結合する抗体を用いてFOXP4タンパク質の発現を検出する、上記1~4のいずれか記載の方法。
6.ウェスタンブロット法、免疫組織学的検出法、免疫沈降法、又はELISA法によってFOXP4タンパク質の発現を検出する、上記5記載の方法。
7.被験体由来のサンプル中のFOXP4発現を、正常の対照サンプルにおけるFOXP4発現又は基準値と比較して子宮癌の発症、転移又は再発の可能性があると判定するステップを含む、上記1~6のいずれか記載の方法。
8.FOXP4タンパク質に特異的に結合する抗体を含有する、被験体における子宮癌の発症、転移又は再発の検査薬。
9.子宮頸癌の発症の検出のための、上記8記載の検査薬。
10.子宮体癌の転移及び/又は再発の検出のための、上記8記載の検査薬。
11.FOXP4タンパク質の発現を抑制し得る核酸又はFOXP4タンパク質に特異的に結合する抗体を含有する、子宮癌の発症、転移又は再発抑制のための医薬。
別の実施形態において、本発明の方法は、子宮体癌の転移及び/又は再発を予測するための方法であり得る。
本発明はまた、FOXP4タンパク質に特異的に結合する抗体を含有する、被験体における子宮癌の発症、転移又は再発の検査薬を提供する。
本発明の検査薬は、被験体に由来する生物学的サンプルと接触させ、サンプル中の上記抗体と結合する抗原、すなわちFOXP4タンパク質の発現の有無及び/又は発現量を検出することができる。例えば上記抗体、又は上記抗体に対する二次抗体を蛍光試薬や発色試薬等で標識し、蛍光又は発色を検出することで確認することができる。
上記の通り、本発明者等は、被験体におけるFOXP4タンパク質の発現が、子宮癌の発症、転移及び再発と深く関わっており、FOXP4タンパク質またはそのmRNAの発現を抑制することで、癌細胞の増殖を抑制することができることも見出している。更に、本発明者等は、FOXP4タンパク質又はmRNAの発現抑制により、癌細胞の分化を誘導することができることも見出している。
本発明の医薬の有効成分は、例えばFOXP4タンパク質の発現を阻害するsiRNAもしくはshRNA、又はFOXP4タンパク質に対する抗体である。
金沢大学病院で子宮頸部円錐切除及び子宮摘出術を施行した57例の患者から、子宮頸部の病変組織試料を採取した。軽度子宮頸部異形成(CIN1)は8例、中等度子宮頸部異形成(CIN2)は12例、高度子宮頸部異形成(CIN3)は19例、子宮頸癌(SCC)は13例であった。一方で子宮筋腫及び腺筋症による子宮摘出術を受けた患者から、5つの正常な子宮頸部組織を得た。
(i)切片をキシレン中で脱パラフィンし、エタノール中で再水和させ、続いて0.01Mクエン酸緩衝液、pH6.0中で抗原賦活化を行った。
(ii)スライドを3%過酸化水素に10分間浸漬して内因性ペルオキシダーゼ活性を遮断し、次いで0.05mol / Lリン酸緩衝食塩水(PBS)、pH7.4中で洗浄した。
(iii)1.5μg/ mLの濃度の一次抗体、抗ヒトFOXP4ポリクローナルウサギ抗体(Sigma-Aldrich、St. Louis、MO、USA)またはウサギ抗p16(クローンDCS-50、Progen Biotechnik GmbH 、ハイデルベルク、ドイツ)を加湿チャンバー内で4℃で一晩インキュベートした。対照染色は、一次抗体を正常ウサギ血清溶液で置換して行った。
(iv)洗浄後、切片を室温でFOXP4用ビオチン標識ヤギ抗ウサギIgGと共に30分間インキュベートした。
(v)その後、それらを室温でアビジン-ビオチン複合体で処理した。ペルオキシダーゼ活性の部位をジアミノベンジジン(Liquid DAB + Substrate Chromogen System、Dako、Carpinteria、USA)で可視化し、切片をヘマトキシリンで対比染色した。
実施例1で取得した正常な子宮頸部組織試料を更に検討したところ、子宮頸部腺上皮細胞の核領域においてもFOXP4の中程度の発現が観察された(図2A)。またFOXP4はSCJ領域で円柱上皮から扁平上皮に分化(化生)するときに発現してくる予備細胞の核領域に発現していた(図2B)。この予備細胞は最近子宮頸癌の幹細胞の候補として注目されている[Sato M等、Oncotarget. 2017; 8: 40935-40945]。またFOXP4は、予備細胞から新たに重層化する未熟な扁平細胞上にも発現が継続していた(図2C)。対照的に、SCJ領域においてもすでに成熟した扁平上皮細胞層ではFOXP4の発現は消失していた。
実施例1で取得した臨床試料におけるFOXP4の特異的タンパク質発現を確認するために、抗FOXP4抗体を用いてウェスタンブロット分析を行った。
臨床試料中のFOXP4のタンパク質発現レベルを分析するために、RIPAバッファーでタンパク質溶解物を抽出した。各溶解物を7.5%SDS-PAGEゲル上で電気泳動し、次いでニトロセルロース膜に移した。移した膜をFOXP4に対する一次抗体(1:2,500、Sigma-Aldrich、St. Louis、MO、USA)と共に4℃で一晩インキュベートした。次いでHRP結合抗体を、翌日室温で1時間適用した。ECL TMウェスタンブロッティング検出試薬(GE Healthcare、Buckinghamshire、UK)を用いて増強化学発光系で可視化した。
実施例1で取得した臨床サンプルから、RNeasyミニキット(Qiagen、Hilden、Germany)を使用して全RNAを抽出し、PrimeScriptTM RT-PCR Kit(Takara Bio Inc.、Shiga、Japan)を用いてRNAをcDNAに逆転写した。
HPRT1フォワードプライマー:GCCCTGGCGTCGTGATTAGT (配列番号1)
HPRT1リバースプライマー:CGAGCAAGACGTTCAGTCCTGTC(配列番号2)
Foxp4フォワードプライマー:GTTCACCAGGATGTTCGCCT (配列番号3)
Foxp4リバースプライマー:CTCCGCTTCTGATACTCCCG (配列番号4)
PCRサイクル条件は、95℃で30秒間、95℃で5秒間の36サイクルと、60℃で20秒間のアニーリング及び伸長ステップとした。
CIN病変の予測因子としてのFOXP4発現の可能性を調べるために、HPV感染によるE7の高発現を反映することが報告されているp16 [Boyer SN等、Cancer Res. 1996; 56: 4620-4624;Dyson N等、Science. 1989; 243: 934-937] の発現との関係を評価した。
子宮頸癌細胞株として、ヒト子宮頸部扁平上皮癌細胞株(C33A及びSiHa)を、10%FCS (Sigma-Aldrich、St.Louis、MO)、100μg/ mLストレプトマイシン及び100IU / mLペニシリンを添加したDMEMで37℃、5%CO2下で培養した。
上記の結果から、FOXP4タンパク質の発現又はFOXP4タンパク質をコードするmRNAの発現を抑制することにより、癌細胞の増殖抑制効果がもたらされることが示された。
実施例6で用いた細胞の浸潤能を、8μm孔のポリエチレン膜にマトリゲルコートした細胞培養インサートからなるBiocoat Matrigel浸潤チャンバー(CORNING、Bedford、MA、USA)を用いて、また遊走能はマトリゲルコート無しのインサートチャンバーを用いて分析した。細胞(1.0×105細胞/ウェル)をインサートチャンバーに播種して48時間後にフィルターの下側の侵入した細胞を固定し、DIFF-quick染色で視覚化し、細胞数を倒立顕微鏡下に同定した。遊走及び浸潤能のデータ解析は、ANOVAとそれに続くDunnett法を用いて実施し、P <0.05をもって有意差ありとした。
上記の結果は、FOXP4タンパク質の発現又はFOXP4タンパク質をコードするmRNAの発現を抑制することにより、癌細胞の増殖だけでなく、遊走及び浸潤も抑制され、従って癌転移抑制効果につながることが示された。
Foxp4を発現している子宮頸部異形成細胞株であるW12細胞を以下の条件で培養し、Foxp4のノックダウンを目的に5種類のFoxp4-shRNA(配列番号6~10)とコントロールのNC-shRNA(配列番号11)を導入した。
培養条件:37℃ 5% CO2
培地:DMEM/F-12とF-12を1:1
添加物:5%FBS、ヒドロコルチゾン0.4μg/mL、インスリン5μg/mL、コレラトキシン8.4ng/mL、アデニン24μg/mL、EGF 10ng/mL、ペニシリン 100U/mL、ストレプトマイシン 100mg/mL
セレクション用培地:上記培地にピューロマイシン1μg/mLを添加
Day0:上記培地にW12をまく
Day1:W12に種々のFoxp4-shRNA及びNC-shRNAをMOI=10で添加し、37℃ 5%CO2環境下で20時間培養
Day2:培地交換し、24時間培養
Day3:ピューロマシン1μg/mlを添加した培地に交換(セレクション)し、その後もピューロマシン1μg/mlを添加した培地で培養継続
Day5:Foxp4-sh4の細胞で島状変化・重層化を観察
Day7:RNA抽出し、qPCR
K1フォワードプライマー:ATTTCTGAGCTGAATCGTGTGATC(配列番号12)
K1リバースプライマー:CTTGGCATCCTTGAGGGCATT(配列番号13)
K10フォワードプライマー:TGATGTGAATGTGGAAATGAATGC(配列番号14)
K10リバースプライマー:GTAGTCAGTTCCTTGCTCTTTTCA(配列番号15)
インボルクリンフォワードプライマー:GGGTGGTTATTTATGTTTGGGTGG(配列番号16)
インボルクリンリバースプライマー:GCCAGGTCCAAGACATTCAAC(配列番号17)
Foxp4、K1、K10、インボルクリンの発現レベルは、2DD Ct法を用いてHPRT1の発現に対する相対量として計算した。
金沢大学病院で子宮内膜癌の初期治療として子宮全摘術を受け、手術標本にて組織型が類内膜癌と病理組織診断された154例の子宮体部類内膜癌患者を対象とし、各症例における代表的な腫瘍組織に対して実施例1と同様にしてFOXP4の免疫組織学的発現を解析した。手術標本は20%ホルマリンで固定後にパラフィン包埋し、4μmに薄切した組織についてHE染色にて病理組織学的診断を行った。FOXP4免疫染色の判定基準は、腫瘍細胞の核の染色領域が50%未満であるものを低発現、50%以上のものを高発現と規定し、解析を行った。
尚、腫瘍組織の使用は対象患者から文書で同意が得られており、また、すべての研究プロトコルは、金沢大学医学倫理委員会の承認を得ておこなった。
子宮体部類内膜癌におけるFOXP4発現のHE染色の結果を図7及び図8に、FOXP4発現と予後の関係を図9及び以下の表1に示す。
Claims (9)
- 被験体の子宮組織由来の生物学的サンプル中のフォークヘッドボックスタンパク質P4(FOXP4)の発現を検出することを特徴とする、被験体における子宮癌の発症、転移又は再発を予測するための方法。
- 子宮頸癌の発症を予測するための、請求項1記載の方法。
- 子宮体癌の転移及び/又は再発を予測するための、請求項1記載の方法。
- FOXP4タンパク質に特異的に結合する抗体を用いてFOXP4タンパク質の発現を検出する、請求項1~3のいずれか1項記載の方法。
- ウェスタンブロット法、免疫組織学的検出法、免疫沈降法、又はELISA法によってFOXP4タンパク質の発現を検出する、請求項4記載の方法。
- 被験体由来のサンプル中のFOXP4発現を、正常の対照サンプルにおけるFOXP4発現又は基準値と比較するステップを含む、請求項1~5のいずれか1項記載の方法。
- FOXP4タンパク質に特異的に結合する抗体を含有する、被験体における子宮癌の発症、転移又は再発の検査薬。
- 子宮頸癌の発症の検出のための、請求項7記載の検査薬。
- 子宮体癌の転移及び/又は再発の検出のための、請求項7記載の検査薬。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2018207653A JP7250307B2 (ja) | 2018-11-02 | 2018-11-02 | 子宮癌の発症、転移又は再発の予測方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2018207653A JP7250307B2 (ja) | 2018-11-02 | 2018-11-02 | 子宮癌の発症、転移又は再発の予測方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2020071205A JP2020071205A (ja) | 2020-05-07 |
JP7250307B2 true JP7250307B2 (ja) | 2023-04-03 |
Family
ID=70547626
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2018207653A Active JP7250307B2 (ja) | 2018-11-02 | 2018-11-02 | 子宮癌の発症、転移又は再発の予測方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP7250307B2 (ja) |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20110028344A1 (en) | 2008-04-11 | 2011-02-03 | Expression Pathology, Inc. | Biomarkers for endometrial disease |
JP2012157283A (ja) | 2011-01-31 | 2012-08-23 | Institute Of Physical & Chemical Research | 一塩基多型に基づく前立腺癌の検査方法 |
WO2018025971A1 (ja) | 2016-08-04 | 2018-02-08 | 静岡県 | がんの発症リスクの有無を判定する方法 |
-
2018
- 2018-11-02 JP JP2018207653A patent/JP7250307B2/ja active Active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20110028344A1 (en) | 2008-04-11 | 2011-02-03 | Expression Pathology, Inc. | Biomarkers for endometrial disease |
JP2012157283A (ja) | 2011-01-31 | 2012-08-23 | Institute Of Physical & Chemical Research | 一塩基多型に基づく前立腺癌の検査方法 |
WO2018025971A1 (ja) | 2016-08-04 | 2018-02-08 | 静岡県 | がんの発症リスクの有無を判定する方法 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
TAKATA, R. et al.,Genome-wide association study identifies five new susceptibility loci for prostate cancer in the Japanese population,nature genetics,2010年08月01日,Vol.42, No.9,pp.751-754 |
ZHAO, M. et al.,Negative immune factors might predominate local tumor immune status and promote carcinogenesis in cervical carcinoma,Virology Journal,2017年01月13日,Vol.14, No.5,pp.1-6 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2020071205A (ja) | 2020-05-07 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6636067B2 (ja) | c−MAFを用いた前立腺がん転移の診断、予後診断および処置のための方法 | |
US20200040097A1 (en) | Antibody and antigen recognizing tumor-initiating cells and use thereof | |
US9316654B2 (en) | TAZ/WWTR1 for diagnosis and treatment of cancer | |
EP3008210B1 (en) | Methods for detecting prostate cancer | |
JP2014503063A (ja) | 治療または癌を検出するための抗cxcl16抗体および抗cxcr6抗体の使用 | |
Sana et al. | CD133 expression and identification of CD133/nestin positive cells in rhabdomyosarcomas and rhabdomyosarcoma cell lines | |
McKinnon et al. | Glucose transporter expression in eutopic endometrial tissue and ectopic endometriotic lesions | |
Gao et al. | TCF12 overexpression as a poor prognostic factor in ovarian cancer | |
Wang et al. | Targeting MEX3A attenuates metastasis of breast cancer via β-catenin signaling pathway inhibition | |
KR101875935B1 (ko) | Her2 저해제 내성 바이오마커 | |
Chen et al. | Human telomerase reverse transcriptase recruits the β-catenin/TCF-4 complex to transactivate chemokine (CC motif) ligand 2 expression in colorectal cancer | |
KR20110046987A (ko) | 암의 진단 및 치료를 위한 eIF3m의 용도 | |
WO2011129427A9 (ja) | 癌の診断剤および治療剤 | |
JP7250307B2 (ja) | 子宮癌の発症、転移又は再発の予測方法 | |
Ruan et al. | Phosphatase of regenerating liver-3: a novel and promising marker in human endometriosis | |
US10000558B2 (en) | Use of annexin A3 as a diagnostic and prognostic biomarker and therapeutic target for treating hepatocellular carcinoma | |
KR101943157B1 (ko) | 유방암 예후 예측용 바이오마커 | |
KR102055350B1 (ko) | 대장암의 항암제 내성 진단용 바이오마커 및 이의 용도 | |
EP1627916B1 (en) | Anti-BAMBI antibodies or RNA for diagnosis and therapy of colon or liver cancer | |
US20210164982A1 (en) | Pharmaceutical use of actinin-4 involved in induction of cervical cancer | |
WO2014034798A1 (ja) | 癌の検出方法、診断薬および診断キット並びに癌治療用医薬組成物 | |
JP2009095343A (ja) | 前立腺癌の検出方法及び前立腺癌の術後再発の可能性の判定方法並びに前立腺癌の治療及び/若しくは予防剤 | |
KR101796091B1 (ko) | 카복실 말단 조절 단백질을 포함하는 두경부암 진단용 바이오 마커 조성물 | |
WO2017012944A1 (en) | Method for individualized cancer therapy | |
Yu et al. | Increase of ASH1L Expression Promotes Hepatocellular Carcinoma Development and Affects the Prognosis of Liver Transplantation Patients |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20211021 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20220922 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20220927 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20221128 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20230214 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20230314 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7250307 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |