JP2014503063A - 治療または癌を検出するための抗cxcl16抗体および抗cxcr6抗体の使用 - Google Patents
治療または癌を検出するための抗cxcl16抗体および抗cxcr6抗体の使用 Download PDFInfo
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Abstract
Description
本願は、2010年12月14日に出願された米国特許出願第12/967,273号の一部継続出願である、2011年9月15日に出願された米国特許出願第13/233,769号からの優先権を主張する。前述の全ての出願の全文を参照文献として本願に援用する。
本願で用いられる以下の用語は以下の意味を有する:
CXCL16はCXCR6ケモカイン受容体のリガンドである。ケモカインも受容体も、癌の転移および浸潤の調節において1つの役割を果たすと見られる。CXCL16もCXCR6も、卵巣癌、肺癌、乳癌、前立腺癌、骨癌および膵臓癌を含めた複数の癌腫組織の種類において、正常組織と比較して局所的にアップレギュレートされる。
本願の1つの態様は抗CXCL16抗体および/または抗CXCR6抗体を用いて癌を治療または予防するための方法に関する。方法は、そのような治療を必要とする対象に、抗CXCL16抗体、または抗CXCR6抗体、またはその組み合わせの治療的に有効な量を投与することを含む。1つの実施形態においては、癌は黒色腫または癌腫である。癌腫の例は細葉細胞癌、腺様嚢胞癌、腺癌、腺扁平上皮癌、副腎皮質腺腫、副腎皮質癌、退形成癌、アプドーマ、基底細胞癌、カルチノイド、癌肉腫、明細胞癌、円柱腫、嚢胞腺癌、管癌、ガストリン産生腫瘍、巨細胞癌、神経膠腫、グルカゴン産生腫瘍、ヒュルトレ細胞癌、インスリノーマ、大細胞癌、小葉癌、髄芽腫、髄様癌、粘液性嚢胞腺腫、粘膜表皮癌、神経外胚葉性腫瘍、膨大細胞腫、乳頭状汗腺腫、乳頭腫、多形細胞癌、肺芽腫、肉腫様癌、漿液性嚢腺腫、印環細胞癌、小細胞癌、ソマトスタチン産生腫瘍、紡錘細胞癌、扁平上皮癌、胸腺腫、疣状癌、および内皮、外胚葉または上皮細胞に由来する器官または身体の内面または外面を被覆する組織を含むがこれに限定されない。これらの器官および組織は:骨、乳房、中枢神経系、子宮頸部、結腸、子宮内膜、食道、ファローピウス管、消化管、腎臓、肺、リンパ系、乳腺、口腔、卵巣、膵臓、下垂体、前立腺、直腸、生殖管、気道、胃、汗腺、胸腺、甲状腺、子宮、膣を含むが、これに限定されない。
レトロウイルスは、任意の種類、サブファミリー、属および親和性を含めた、レトロウイルス科に属する動物ウイルスである。遺伝子療法のためにレトロウイルスベクターを用いるための方法の例は、その教示を参照文献として本願に援用する、米国特許第4,868,116号および第4,980,286号;PTC国際出願第90/02806号および第89/07136号;およびMulligan(Science 260:926-932 (1993);に記載されている。
組換えアデノウイルスは、気道上皮、肝細胞、血管内皮、CNS実質、および数多くの他の組織部位への直接的インビボ送達後に、高効率ウイルス転移を達成することが示されている。組換えアデノウイルスは特異的な細胞表面受容体と結合することにより遺伝子形質導入を達成し、ウイルスはその後野生種または複製欠損アデノウイルスと同じ様式で受容体を介したエンドサイトーシスにより内部移行する。
他の種類のウイルスベクターはアデノ随伴ウイルス(AAV)に基づいている。この欠損パルボウイルスは、多くの細胞型に感染することができかつヒトに対して非病原性であるので、好ましいベクターである。AAV型ベクターは約4から5kbを輸送することが可能であり、かつ野生種AAVは19番染色体に安定的に挿入されることが知られている。この部位特異的組み込み特性を含むベクターが好ましい。この種のベクターの特に好ましい実施形態は、カリフォルニア州サンフランシスコのAvigenにより生成されるP4.1 Cベクターであり、これは単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼウイルス遺伝子、HSV−tk、および/または緑色蛍光タンパク質GFPをコードする遺伝子などのマーカー遺伝子を含むことができる。
大型ヒトヘルペスウイルスを用いた分子遺伝学実験により、それによってヘルペスウイルスへの感染を許容する細胞に大きな異種DNAフラグメントをクローニングし、増殖させ、かつ確立することのできる手段が提供されている(Sun他、Nature genetics 8: 33-41, 1994;CotterおよびRobertson, Curr Opin Mol Ther 5: 633-644, 1999)。これらの大型DNAウイルス(単純ヘルペスウイルス(HSV)およびエプスタインバーウイルス(EBV)は、>150kbのヒト異種DNAフラグメントを特定の細胞に送達する可能性を有する。EBV組換え体は、感染B細胞において大きなDNA片をエピソームDNAとして維持することができる。ヒトゲノムインサートを330kbまで担持する個々のクローンは遺伝学的に安定と見られる。これらのエピソームの維持は、EBV感染中に構成的に発現する特異的なEBV核タンパク質であるEBNA1を必要とする。さらに、これらのベクターは、一時的にインビトロで大量のタンパク質を生成することのできるトランスフェクションを目的として使用することができる。ヘルペスウイルスアンプリコン系も、>220kbのDNA片をパッケージ化してDNAをエピソームとして安定的に維持できる細胞を感染させるために使用されている。他の有用な系は、たとえば複製および宿主制限非複製ワクシニアウイルスベクターを含む。
エクジソン系は、ショウジョウバエに認められる脱皮誘導系に基づいているが、修飾して哺乳類細胞における発現の誘導を可能としている。系は、ショウジョウバエステロイドホルモンエクジソンの類似体ムリステロンAを用いて、ヘテロ二量体核酸受容体を介した目的の遺伝子の発現を活性化する。発現レベルは、哺乳類細胞の生理学に影響することなく、基礎レベルを200倍上回ると報告されている。
プロゲステロン受容体は、通常は刺激されて特異的なDNA配列と結合し、かつそのホルモンリガンドとの相互作用を経て転写を活性化する。逆に、プロゲステロン拮抗物質ミフェプリストン(RU486)は、ホルモン誘導性核輸送およびその後のDNA結合を遮断することができる。刺激されてRU486との相互作用を経て結合することのできるプロゲステロン受容体の変異型が生成されている。特異的で調節可能な転写因子を生成するために、プロゲステロン受容体のRU486結合ドメインは、酵母転写因子GAL4のDNA結合ドメインおよびHSVタンパク質VP16のトランス活性化ドメインと融合されている。キメラ因子はRU486の非存在下で不活性である。しかし、ホルモンの付加はキメラタンパク質の立体構造変化を誘導し、さらにこの変化はGAL−4結合部位との結合およびGAL−4結合部位を含むプロモーターからの転写の活性化を可能とする。
FK506およびラパマイシンなどの免疫抑制剤は、特異的細胞タンパク質と結合しかつその二量体化を促進することにより作用する。たとえば、ラパマイシンのFK506結合タンパク質(FKBP)との結合によりもう1つのラパマイシン結合タンパク質FRAPとのヘテロ二量体化がもたらされ、これは薬剤の除去により逆転することができる。薬剤の添加により2つのタンパク質を接合する能力により、転写を含む数多くの生物学的プロセスの調節が増強される。キメラDNA結合ドメインはFKBPと融合されており、これにより融合タンパク質の特異的DNA結合配列との結合が可能となる。転写活性化ドメインもFRAPと融合されている。これら2つの融合タンパク質が同じ細胞において共発現する場合、ラパマイシンの添加に媒介されたヘテロ二量体化により完全に機能的な転写因子を形成することができる。二量体化キメラ転写因子は、その後合成DNA結合配列のコピーを含む合成プロモーター配列と結合することができる。この系は、アデノウイルスおよびAAVベクターに成功裏に組み込まれている。
本願の他の態様は、CXCL16またはCXCR6の発現または活性を阻害する物質を用いることにより癌を治療または予防するための方法に関する。他の実施形態においては、方法は、(1)CXCL16および/またはCXCR6の発現を阻害するか、または(2)CXCL16とCXCR6の相互作用を阻害するか、または(3)CXCL16および/またはCXCR6の生物学的活性を阻害する物質を発現する有効量の発現ベクターを、そのような治療を必要とする対象に投与することを含む。1つの実施形態においては、CXCL16およびCXCR6の生物学的活性はCXCL16とCXCR6の相互作用を含む。
本願の他の態様は、対象におけるCXCL16および/またはCXCR6の発現が上昇した癌細胞の遊走または転移の予防または阻害のための方法に関する。
本願の他の態様は、化学療法の効果を増強するための方法に関する。1つの実施形態においては、方法は、癌に対する化学療法を受けている対象に、抗CXCL16抗体、または抗CXCR6抗体、またはその組み合わせの有効量を投与することを含む。
本願の他の態様は、癌を治療または予防するための組成物およびキットに関する。1つの実施形態においては、組成物は(1)抗CXCL16抗体、抗CXCR6抗体、またはその組み合わせ、および(2)医薬品として許容できる担体を含む。他の実施形態においては、組成物は(1)抗CXCL16抗体、抗CXCR6抗体、またはその組み合わせについてのコード配列を担持する発現ベクター、および(2)医薬品として許容できる担体を含む。他の実施形態においては、組成物は、(1)CXCL16またはCXCR6の発現、またはCXCL16またはCXCR6の生物学的活性、またはCXCL16とCXCR6の相互作用を阻害する物質についてのコード配列を担持する発現ベクター、および(2)医薬品として許容できる担体を含む。
CXCL16はCXCR6ケモカイン受容体のリガンドである。ケモカインも受容体も、癌の転移および浸潤の調節において1つの役割を果たすと見られる。CXCL16もCXCR6も、卵巣癌、肺癌、乳癌、前立腺癌、骨癌および膵臓癌を含めた複数の癌腫組織の種類において、正常組織と比較して局所的にアップレギュレートされる。CXCL16レベルは、それらの癌を有する患者の血清においても上昇する。さらに、可溶性CXCL16ケモカインは、癌細胞のインビボおよびインビトロ増殖および遊走を促進する。
癌を検出するための本方法は、患者由来の生物学的サンプル中の1つまたはそれ以上の癌マーカーの発現レベルを参照サンプルのそれと比較することにより、癌患者の予後を評価するために施用しうる。1つの実施形態においては、方法は、患者に由来する生物学的サンプル中の1つまたはそれ以上の癌マーカーの発現レベルを判定することを含み、生物学的サンプル中の1つまたはそれ以上の癌マーカーの発現の対照値、たとえば対照中のレベルに対してより高いレベルが対象の予後が不良であることを示す一方で、生物学的サンプル中の1つまたはそれ以上の癌マーカーの発現の対照のそれに対してより低いかまたは同様のレベルは対象の予後が良好であることを示すことを特徴とする。不良である予後は、癌が侵襲型または浸潤型であり、急速に進行する可能性がありかつ/または転移する可能性があることを示し、1つまたはそれ以上の癌マーカーがCXCL16またはCXCR6またはCXCL16およびCXCR6の両者を含むことを特徴とする。他の実施形態においては、1つまたはそれ以上の癌マーカーは(1)CXCL16またはCXCR6またはCXCL16およびCXCR6の両者、および(2)1つまたはそれ以上の他の癌マーカーの両者を含む。
一定の実施形態においては、1つまたはそれ以上の癌マーカーのレベルを用いて癌の治療の経過をモニタリングする。この方法においては、被験生物学的サンプルは癌に対する治療を受けている対象から提供される。好ましくは、治療前、治療中または治療後の様々な時点において対象より複数の被験生物学的サンプルを採取する。次に、治療後サンプル中の癌マーカーの発現レベルを治療前サンプルの中の癌マーカーのレベル、または、その代わりに参照サンプル(例:正常対照レベル)と比較してもよい。たとえば、治療後マーカーレベルが治療前マーカーレベルより低い場合、治療が有効であると結論づけることができる。同様に、治療後マーカーレベルが正常対照マーカーレベルと同様、または同じである場合も、治療が有効であると結論づけることができる。
本願で用いる用語「癌マーカー」は、単独の、または他のポリペプチドまたはポリヌクレオチドと複合したその発現レベルが癌または癌の予後と相関するポリペプチドまたはポリヌクレオチドを意味するか、または記述する。相関は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの発現上昇または発現減少のいずれかと関連することができる。たとえば、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの発現が癌を示してもよく、またはポリペプチドまたはポリヌクレオチドの発現の欠落が癌患者の予後の不良と相関してもよい。
癌マーカーの発現は、転写レベル(すなわちmRNAの量)または翻訳レベル(すなわちタンパク質の量)で判定することができる。一定の実施形態においては、癌マーカーの発現は定量的RT−PCR、ノーザンブロットまたは当業者に既知の他の方法によってmRNAレベルで判定される。他の実施形態においては、癌マーカーの発現はELISA、ウェスタンブロット、または抗CXCL16および抗CXCR6抗体などの抗癌マーカー抗体を用いた他の種類の免疫検出法によってタンパク質レベルで判定される。
一定の実施形態においては、癌マーカーは、典型的には抗体コーティングした分析プレートまたはウェルを用いて遂行される酵素免疫測定法(ELISA)を用いて検出される。一般的に使用されるELISA測定は、サンドイッチイムノアッセイまたは競合結合イムノアッセイのいずれかを用いる。
他の一定の実施形態においては、癌マーカーは抗体コーティングされたマイクロビーズを用いて検出される。一定の実施形態においては、マイクロビーズは磁気ビーズである。他の実施形態においては、ビーズは蛍光色素で内部的にカラーコードが付与され、またビーズの表面は、被験サンプル中の癌マーカーに結合することのできる抗癌マーカー抗体(例:抗CXCL16または抗CXCR6抗体)でタグ付けされる。癌マーカーの方は、蛍光タグで直接標識されるか、または蛍光タグと複合体化された抗マーカー抗体を用いて間接的に標識される。したがって、一方はビーズ、もう一方は蛍光タグからの2つの色の発生源がある。代替的に、ビーズには種々のサイズによって内部的にコード付与することもできる。
一部の実施形態においては、液状生体サンプル中の癌マーカーは検査スティックを用いて検出される。検査スティックは、典型的には液状物不浸透性ハウジングおよび1つまたはそれ以上の検出ゾーンを有する液状物浸透性「スティック」を含む。1つの実施形態においては、アーチ検出ゾーンは生体サンプル中の癌マーカーと結合する乾燥結合試薬を含む。他の実施形態においては、乾燥結合試薬は標識結合試薬である。他の実施形態においては、検査スティックは、測定検査が成功裏に遂行されていること、すなわち検査装置中に試薬が存在すること、および試薬が検査の実行中には可動化されかつ流路に沿って運ばれることを示す対照ゾーンをさらに含みうる。対照ゾーンは、装置内の試薬が免疫化学的相互作用を実施可能であることを示し、装置の化学的完全性を確認することもできる。一定の温度範囲内の乾燥条件下での装置の保管および輸送を考慮する場合、これは重要である。対照ゾーンは、典型的には検出ゾーンよりも下流に位置し、かつたとえば標識結合試薬に対する固定された結合試薬を含みうる。標識結合試薬は、対照ゾーンおよび検出ゾーンより上流に可動的な形態で存在しうる。標識結合試薬は、癌マーカーに対する標識結合試薬と同一であっても異なっていてもよい。
他の実施形態においては、癌マーカーはその表面上に固定された癌マーカー特異性抗体を含むタンパク質マイクロアレイによって検出される。マイクロアレイは、マイクロアレイ上の抗体が被験サンプルの癌マーカーを捕捉し、かつ捕捉されたマーカーが、捕捉されたマーカーと特異的に結合する標識二次抗体によって検出される「サンドイッチ」測定法で用いることができる。好ましい実施形態においては、二次抗体はビオチニル化または酵素標識される。検出は、その後のストレプトアビジン−蛍光体複合体(蛍光検出用)または酵素基質(比色検出用)とのインキュベーションにより達成される。
他の実施形態においては、癌マーカーは埋め込み式バイオセンサーを用いて検出される。バイオセンサーは、生物学的相互作用の結果として電子的信号を生成する電子装置である。1つの実施形態においては、バイオセンサーは、典型的には結合ペアのもう一方の構成要素である、癌マーカーと結合する抗体、受容体、核酸、またはその他の結合ペアの構成要素を用いる。バイオセンサーは血液サンプルと共に用いられて、自動化イムノアッセイシステムにおいて典型的に必要とされるサンプル調製および/または分離段階を必要とせずに癌マーカーの存在を判定する。
他の実施形態においては、癌マーカーはMALDI/TOF(飛行時間)、SELDI/TOF、液体クロマトグラフィー−質量分析(LC−MS)、ガスクロマトグラフィー−質量分析(GC−MS)、高速液体クロマトグラフィー−質量分析(HPLC−MS)、キャピラリー電気泳動−質量分析、核磁気共鳴分析、またはタンデム質量分析(例:MS/MS、MS/MS/MS、ESI−MS/MSなど)などの質量分析(MS)を用いて検出される。
本願においては、CXCL16の血中濃度などの癌マーカーの標準発現レベルは、統計的に決定することができる。たとえば、健常者のCXCL16の血中濃度を測定してCXCL16の標準血中濃度を統計的に決定することができる。統計的に十分な母集団を集めることができる場合、平均値から標準偏差(S.D.)の2から3倍の範囲の数値がしばしば標準値として用いられる。したがって、平均値±2×S.D.または平均値±3×S.D.に対応する数値を標準値として用いうる。記載された通りに設定した標準値は、理論的にはそれぞれ健常者の90%および99.7%を含む。
PPV=(真陽性)/(真陽性+偽陽性)。
NPV=(真陰性)/(真陰性および偽陰性)。
本願の他の態様は、癌を検出するための、または癌の進行をモニタリングするためのキットに関する。1つの実施形態においては、キットは、生物学的サンプル中のCXCL16および/またはCXCR6の発現を判定するための試薬、および試薬を使用する方法についての指示を含み、試薬が抗CXCL16抗体、抗CXCR6抗体または両者を含むことを特徴とする。
図1A〜Dは前立腺組織におけるCXCR6およびCXCL16発現の典型的な例を示す。非腫瘍性(n=8)および腺癌(n=16)由来の前立腺組織を(A)アイソタイプ対照、(B)抗CXCR6、または(C)抗CXCL16抗体で染色した。茶色(DAB)およびマゼンタ色の染色はそれぞれCXCR6およびCXCL16陽性を示す。図1Dは、Aperio ImageScope v.6.25ソフトウェアを用いて定量した、非腫瘍対照組織に対する前立腺癌組織の相対的CXCR6およびCXCL16免疫強度比を描出する。アスタリクス(*)は、非腫瘍組織と癌性組織の間の有意差(p<0.01)を示す。
(プライマー設計)
NIH−NCBI遺伝子バンクデータベースよりCXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR5a、CXCR5b、CXCR6、CXCR7、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CCL10、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL24、CCL25、CCL25−1、CCL25−2、CCL27、CCL28、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10、CCR11、XCL1、XCL2、XCR1、CX3CR1、またはCX3CL1についてのメッセンジャーRNA配列を取得した。プライマーはBeaconJ 2.0コンピュータプログラムを用いて設計した。コンピュータプログラム:Primer PremierJおよびMIT Primer 3を用いてプライマーの熱力学分析を実施した。生成したプライマーセットをヒトゲノム全体と比較して特異性を確認した。
癌細胞株(ATCC、メリーランド州ロックヴィル)を、非必須アミノ酸L−グルタミン酸、およびピルビン酸ナトリウムを添加した10%ウシ胎児血清を含有するRMPI−1640(完全培地)中で培養した。臨床切除組織より原発性腫瘍および正常ペアマッチング組織(Clinomics Biosciences、メリーランド州フレデリックおよびUAB Tissue Procurement、アラバマ州バーミンガム)を採取した。メーカーのプロトコルに従ってTriReagent(Molecular Research Center、オハイオ州シンシナティ)を用い、106個の細胞からメッセンジャーRNA(mRNA)を分離した。RNアーゼ非含有DNアーゼ(インビトロジェン、カリフォルニア州サンディエゴ)10U/Flを用いて37℃で15分間処理することで、これらのサンプルより潜在的なゲノムDNA汚染を除去した。その後、RNAを沈殿させ、RNA Secure(Ambion、テキサス州オースチン)に再懸濁した。メーカーのプロトコルにしたがってTaqman7逆転写試薬(アプライドバイオシステムズ、カリフォルニア州フォスターシティ)を用い、総RNA約2μgを逆転写することによりcDNAを生成した。その後、メーカーのプロトコルにしたがってSYBR7 Green PCRマスターミックス試薬(アプライドバイオシステムズ)を用い、cDNAをCXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR5a、CXCR5b、CXCR6、CXCR7、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CCL10、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL24、CCL25、CCL25−1、CCL25−2、CCL27、CCL28、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10、CCR11、XCL1、XCL2、XCR1、CX3CR1、またはCX3CL1に対する特異的ヒトcDNAプライマーにより増幅した。これらの標的のmRNAのコピーレベルを、BioRad Incyclerおよびソフトウェア(カリフォルニア州ハーキュリーズ)を用いたリアルタイムPCR分析により評価した。
(抗血清の調製)
CXCR1、CXCR2、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL12、CXCR5a、CXCR5b、CXCL13、CXCR6、CXCL16、CCL16、CCL25、CCL25−1、CCL25−2、CX3CR1、およびCX3CL1から15アミノ酸ペプチドを合成し(シグマジェノシス、テキサス州ザ/ウッドランド)、さらにその後の抗血清調製またはモノクローナル抗体生成のための免疫用に、鶏卵リゾチーム(Pierce、イリノイ州ロックフォード)と複合体化して抗原を生成した。発色性リムルスアメーバ様細胞溶解物測定(Cape Cod社、ミシシッピー州ファルマス)によりケモカインペプチド複合体のエンドトキシンレベルを定量したところ<5EU/mgであることが示された。初回免疫用に、抗原100μgを免疫原としてフロイントの完全アジュバントRibi Adjuvantシステム(RAS)と共に最終体積1.0mLで用いた。この混合物の100mL分取をウサギの背部の2部位に皮下投与し、また各後脚の筋肉に400mLずつ筋肉内投与した。3から4週間後、ウサギに、フロイントの不完全アジュバントに加えて抗原100μgを投与してその後3回免疫した。抗−CXCR1、−CXCR2、−CXCL1、−CXCL2、−CXCL3、−CXCL5、−CXCL6 −CXCL7、−CXCL8、−CXCL12、−CXCR5a、−CXCR5b、−CXCL13、−CXCR6、−CXCL16、−CCL16、−CCL25、−CCL25−1、−CCL25−2、−CX3CR1、および−CX3CL1抗体価が1:1,000,000に達したときに抗血清を採取した。続いて、正常または抗血清を熱不活化しさらにPBSで1:50希釈した。
CXCR1、CXCR2、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL12、CXCR5a、CXCR5b、CXCL13、CXCR6、CXCL16、CCL16、CCL25、CCL25−1、CCL25−2、CX3CR1、およびCX3CL1から15アミノ酸ペプチドを合成し(シグマジェノシス)、さらにその後の抗血清調製またはモノクローナル抗体生成のための免疫用に、鶏卵リゾチーム(Pierce)と複合体化して「抗原」を生成した。発色性リムルスアメーバ様細胞溶解物測定(Cape Cod社、ミシシッピー州ファルマス)によりケモカインペプチド複合体のエンドトキシンレベルを定量したところ<5EU/mgであることが示された。初回免疫用に、抗原100μgを免疫原としてフロイントの完全アジュバントRibi Adjuvantシステム(RAS)と共に最終体積200μLで用いた。その後、この混合物の100μL分取をラット、マウス、または免疫グロブリンヒト化マウスの背部の2部位に投与した。2週間後、動物にはフロイントの不完全アジュバントに加えて抗原100μgを投与してその後3回免疫した。血清を採取し、かつ抗−CXCR1、−CXCR2、−CXCL1、−CXCL2、−CXCL3、−CXCL5、−CXCL6 −CXCL7、−CXCL8、−CXCL12、−CXCR5a、−CXCR5b、−CXCL13、−CXCR6、−CXCL16、−CCL16、−CCL25、−CCL25−1、−CCL25−2、−CX3CR1、および−CX3CL1抗体価が1:2,000,000に達したとき、宿主を屠殺しかつ脾細胞を分離してハイブリドーマを生成した。簡潔に述べると、免疫した宿主の脾臓またはリンパ節に由来するB細胞を不死骨髄腫細胞株(例:YB2/0など)と融合させた。次に、選択培養条件(すなわちHAT添加培地)およびハイブリドーマクローニングの限定希釈法後にハイブリドーマを分離した。ELISAを用いて所望の特異性を有する抗体を産生する細胞を選択した。正常ラットまたはマウスに由来するハイブリドーマを、一般的に用いられる分子生物学的技術を用いてヒト化した。高親和性および増殖性ハイブリドーマをクローニングした後、腹水または培養上清から抗体を分離し、力価1:2,000,000に調節しさらにPBSで1:50希釈した。
T、B,およびNK細胞を欠く免疫不全ヌードNIH−IIIマウス(週齢8から12週、チャールズリバーラボラトリー、マサチューセッツ州ウィルミントン)に1×106個の癌細胞を皮下に与えて腫瘍を確立した。対応して、用時切除したかまたは液体窒素で凍結した腫瘍組織1gを、腸脂肪組織に外科的に移植して腫瘍を生成した。一旦異種移植腫瘍の増殖がサイズ5mmに達したならば、NIH−IIIマウスに抗血清またはモノクローナル抗体のいずれかの200μL腹腔内注射を3日毎に実施し、さらに腫瘍増殖の進行または退縮についてモニタリングした。
SigmaStat2000(イリノイ州シカゴ)ソフトウェアを用いて、データの統計的有意性を分析および確認した。その後、2因子不対検定を用いたスチューデントのt−検定でデータを分析した。この分析においては、投与サンプルを非投与サンプルと比較した。有意水準はp<0.05に設定した。
腺腫、癌腫、白血病、リンパ腫、黒色腫、および/または骨髄腫細胞株をCXCR1、CXCR2、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6 CXCL7、CXCL8、CXCR4、CXCL12、CXCR5a、CXCR5b、CXCL13、CXCR6、CXCL16、CCL16、CCR9、CCL25、CCL25−1、CCL25−2、CX3CR1、またはCX3CL1に対して特異的な抗体の存在するまたは存在しない完全培地内で増殖させた。CXCR1および/またはCXCR2を発現する癌細胞株の増殖は、CXCR1、CXCR2、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7、またはCXCL8に対する抗体によって阻害された。同様に、CXCR4を発現する癌細胞株の増殖はCXCR4またはCXCL12に対する抗体によって阻害された。CXCR5aまたはCXCR5aを発現する癌細胞株の増殖はCXCR5a、CXCR5b、またはCXCL13に対する抗体によって阻害された。CXCR6を発現する癌細胞株の増殖はCXCR6またはCXCL16に対する抗体によって阻害された。CCR9を発現する癌細胞株の増殖はCCR9、CCL25、CCL25−1、またはCCL25−2に対する抗体によって阻害された。CX3CR1を発現する癌細胞株の増殖はCX3CR1またはCXC3L1に対する抗体によって阻害された。興味深いことに、可溶性リガンドCXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL12、CXCL13、CXCL16、CCL16、CCL25、CCL25−1、CCL25−2、またはCX3CL1に対する抗体は、膜受容体に向けられたものの増殖阻害において、より効果的である。
微小血管内膜細胞(Cell Systems、ワシントン州カークランド)を供給者のプロトコルにしたがって増殖させ、さらにCXCR1、CXCR2、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCR4、CXCL12、CXCR5a、CXCR5b、CXCL13、CXCR6、CXCL16、CCL16、CCR9、CCL25、CCL25−1、CCL25−2、CX3CR1、またはCX3CL1に特異的な抗体の存在下または非存在下で、血管新生についてのインビトロ測定(BD−Biocoat、カリフォルニア州ハーキュリーズ)において微細血管細静脈を形成させた。血管新生は、CXCR1、CXCR2、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCR4、CXCL12、CXCR6またはCXCL16に対する抗体によって阻害された。
癌細胞株または原発性腫瘍組織をNIH−IIIマウスに養子移入し、さらに目的の異種移植腫瘍を形成させた。CXCR1、CXCR2、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCR4、CXCL12、CXCR5a、CXCR5b、CXCL13、CXCR6、CXCL16、CCL16、CCR9、CCL25、CCL25−1、CCL25−2; CX3CR1、またはCX3CLlに対する抗体は、腫瘍サイズの進行および退縮に識別的に影響した。一定の場合において、CXCR1、CXCR2、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCR4、CXCL12、CXCR6またはCXCL16に向けられた抗体は、効果的に腫瘍増殖の退縮にも進行の阻害にもつながった。CXCR4、CXCL12、CXCR5a、CXCR5b、CXCL13、CCL16、CCR9、CCL25、CCL25−1、CCL25−2、CX3CR1、またはCX3CL1に向けられた抗体は、腫瘍サイズの進行の阻害において効果的である。
LNCaP(ホルモン反応性、野生型p53発現)、PC3(ホルモン抵抗性、p53完全欠損)、およびDU145(ホルモン抵抗性、p53変異)細胞株を、CXCL16を添加または無添加で、かつドキソルビシン(1μM/2μM/4μM)、エトポシド(20μM/40μM)、エストラムスチン(4μM/10μM)、またはドセタキセル(10nM/20nM/40nM)を添加または無添加で4、8、12、および24時間増殖させる。細胞生存、プロアポトーシスおよび抗アポトーシスシグナル(Akt、Src、CamKII、FAK、FKHR、FOXO、CREB、NF−κB、Myc、Fos、Jun Apaf1、Bax、Bcl2、BclXL、BaK、Bad、Bik、Bim、TP53、カスパーゼ−3、−6、−8、−9、サバイビン、ビトロネクチン、β−カテニン)、および薬剤耐性または代謝を担う分子(Twist−1、Snail−1、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ−π(GST−π)、p53、トポイソメラーゼI、IIα、IIβ、およびABC薬物輸送体)の発現および活性化を、リアルタイムPCRおよびウェスタンブロッティングで評価する。簡潔に述べると、細胞処理後にリアルタイムPCRを用いて遺伝子発現の変化を試験する。シグナリング分子の活性化も、リン酸特異的抗体(すなわちウェスタンブロット分析)によって試験する。活性化シグナリング分子の役割をさらに確認するため、CXCL16処理後に、化学的阻害物質またはsiRNAを用いて候補分子の発現または活性を阻害し、また標的遺伝子をリアルタイムPCRおよびウェスタンブロット分析で分析する。その後、化学療法剤に対する処理細胞の反応をVybrantアポトーシス測定(Molecular probes)キットで評価する。
Trizol(登録商標)(インビトロジェン)法で総RNAを分離し、紫外線分光測定によって定量する。電気泳動法によりRNAの品質を分析する。iScript(登録商標)cDNA合成キット(BioRad)をメーカーの記載する通りに用いてcDNA合成を完遂する。IQ(登録商標)SYBRグリーンスーパーミックス(BioRad)をメーカーの記載する通りに用い、さらにFAK、FKHR、FOXO、Apaf1、Bax、Bcl2、BclXL、BaK、Bad、Bid、XIAP、Bik、Bim、TP53、チトクロームC、カスパーゼ−3、−6、−8、−9、サバイビン、ラミン、CamKII、ビトロネクチン、β−カテニン、カドヘリン、Twist−1、Snail−1、CREB、NF−κB、Myc、Fos、Jun、β−アクチンおよびGAPDHに対して設計された特異的プライマーを用いてリアルタイムPCRを実施する。結果をΔΔCt法によって算出し、非処理群に対するmRNA変化が何倍かを定量する。
細胞を回収し、溶解緩衝液に再懸濁して総タンパク質を抽出する。溶解緩衝液は、50mM Tris−HCl、pH7.4、150mM NaCl、1%Triton X−100、1%デオキシコール酸、0.1%SDS、5mM EDTAを含有し、プロテアーゼ阻害剤、1mMフッ化フェニルメチルスルフォニル、1mMベンズアミジン、10μg/mL大豆トリプシン阻害剤、50μg/mLロイペプチン、1μg/mLペプスタチンおよび20μg/mLアプロチニンを添加する。細胞溶解液を氷上で30分間保存し、4℃で20分間遠心分離し(14000×g)、さらに上清をmRNAレベルの有意なモジュレーションを示す遺伝子のウェスタンブロット分析に用いる。同様に、蛍光体特異性抗体を用いてAkt1/2/3、mTOR、FAK、FKHR、FOXO、およびGSK−3βのリン酸化のレベルの変化を試験する。さらに、特異抗体を用いて開裂後のカスパーゼおよびPARPの活性化を評価する。ECLプラス試薬(Pharmecia)によるX線フィルム上でのタンパク質バンドの化学発光検出後に得られた結果を、Image J画像分析ソフトウェア(NIH)を用いてβアクチンおよび/またはGAPDHに対して正規化する。
細胞を採取し、さらにPBSで洗浄し、さらに220mMマンニトール、68mMショ糖、50mM PIPES−KOH、pH7.4、50mM KCl、5mM EGTA、2mM MgCl2、1mM DTT、およびプロテアーゼ阻害剤を含有する抽出緩衝液に再懸濁する。氷上で30分間インキュベートした後、Glass−Teflonホモジナイザーを用いて細胞をホモジナイズし、さらにホモジネートを14,000gで15分間遠心分離する。サイトゾルの抽出物を、抗チトクロームCモノクローナル抗体(PharMingen)を用いたウェスタンブロット分析に用いる。
前立腺癌細胞株を、LipofectAMINE2000(インビトロジェン)を用いて遺伝子特異性および非特異性対照siRNA(Dharmacon)によってトランスフェクトする。至適な遺伝子ノックダウン時間およびsiRNA濃度をウェスタンブロット分析で確認し、またCXCL16、対照抗体、および/または抗CXCR6抗体を用いて、または用いずに薬剤処理した後の細胞の生存についてさらに評価する。生存、アポトーシス、および壊死細胞の変化の検出は以下のように評価する:細胞の生存は、FACScanフローサイトメーターおよびCellQuest(登録商標)ソフトウェア(BD Pharmingen)を用い、Vybrant apoptosisによってメーカー(Molecular probe)の記載通りに試験する。遺伝子ノックダウン後の下流遺伝子発現の変化は、リアルタイムPCRおよびウェスタンブロッティングを用いて試験する。
LNCaP、PC3、およびDU145細胞を、CXCL16、対照抗体、および/または抗−CXCR6抗体を添加または無添加で、ドキソルビシン、エストラムスチン、エトポシド、またはドセタキセルと共にまたはこれを加えずに、前述の通りに4、8、12または16時間増殖させる。処理後、ABC輸送体およびTwist−1のmRNA発現の変化を、ABCおよびTwist−1 cDNAに向けられた特異的プライマーを用いて、上述の通りにリアルタイムPCRで定量する。mRNA発現の有意な変化を示す遺伝子をウェスタンブロット分析でさらに試験する。処理細胞に由来する核抽出物をクロマチン免疫沈降(ChIP)測定によって評価し、CXCL16結合によって誘導される転写因子がABC輸送体およびTwist−1のプロモーター領域と結合するか判定する。
実施例4の結果は、調節される遺伝子、さらにはCXCR6−CXCL16相互作用によって活性化される転写因子をモジュレートしうる遺伝子についての情報を提供する。これらの結果に基づき、標的転写因子および遺伝子を選択する。特異的PCRプライマーを、転写因子の結合部位を含むこれらの遺伝子のプロモーター領域に対して設計する。PCRプライマーを用いて、転写因子と共に沈殿するDNAを増幅する。20mM酪酸塩の存在下で細胞をトリプシン処理により回収する。50,000個の細胞をPBS/酪酸500μLに再懸濁する。1%ホルムアルデヒドを用いてタンパク質とDNAを室温で8分間架橋し、さらに125mMグリシンを5分間用いて架橋を停止する。細胞をソフト減速条件のスイングアウトローターで4℃、470gで10分間遠心分離し、氷冷PBS/酪酸0.5mL中でボルテックス振盪したのち遠心分離して2回洗う。溶解緩衝液(50mM Tris−HCl、pH8、10mM EDTA、1%SDS、プロテアーゼ阻害剤カクテル(シグマアルドリッチ)、1mM PMSF、20mM酪酸塩を添加し、ボルテックスで振盪し、またその後遠心分離することにより細胞を溶解する。この手順は、500bpのクロマチンフラグメントを生成することが知られている。超音波処理した溶解物を、プロテアーゼ阻害剤カクテル、1mM PMSFおよび20mM酪酸塩を含有するRIPA緩衝液(RIPA ChIP緩衝液)で8倍希釈する。RIPA ChIP緩衝液(330μL)をペレットに添加し、ボルテックスで混合する。ChIP材料の免疫沈降および洗浄は、特異的転写因子に向けられた抗体の使用によって実現される。抗体ビーズ複合体を収容するチューブにクロマチンを分取する。投入サンプルを、フェノール−クロロホルムイソアミルアルコール分離用チューブに入れる。免疫沈降材料を3回洗い、TE中にある間に新しいチューブに移す。1%SDSでのDNA溶離、架橋の逆転およびプロテイナーゼK消化は、68℃で2時間1段階で実施する。アクリルアミド担体(シグマアルドリッチ)の存在下でフェノール−クロロホルムイソアミルアルコール、およびエタノール沈降によりDNAを抽出し、TEに溶解する。3〜4つの独立したChIPから免疫沈降したDNAをリアルタイムPCRで分析する。リアルタイムPCRデータは、3回の独立した再現ChIP分析において、投入DNAに対する沈殿(抗体結合)DNAの百分率(±SD)で表示する。
雄性ヌードマウスを、ルシフェラーゼ発現アンドロゲン反応性(LNCaP−Luc)および非反応性(PC3−Luc)細胞で皮下攻撃する。インビボ撮像システムを用いて腫瘍の発達を非侵襲的に測定する。測定可能な腫瘍の確立後、マウスを投与群(A、B、C、DおよびE)と対照群(F、G、H、I、JおよびK)に分ける。「A」群にはCXCL16中和抗体(12.5mg/kg/日)を1日おきに投与し、対照(F群)にはアイソタイプ対照抗体を投与する(12.5mg/kg/日)。「B」、「C」、「D」および「E」群にはCXCL16中和抗体(12.5mg/kg/日)を、それぞれドキソルビシン腹腔内注射(1から3日目、その後15日目から17日目に5mg/kg/日投与)、エトポシド静脈内注射(10mg/kg/日;1、5、9、14、19および24日目)、エストラムスチン静脈内注射(1〜5日目および26〜31日目に4mg/kg/日投与)、またはドセタキセル腹腔内注射(8mg/kg/日で週2回4週間)と共に投与する。これらの投与群の対照(それぞれ「G」、「H」、「I」および「J」)には、これらの薬剤を同様の濃度および注射プロトコルを用いてアイソタイプ対照抗体(12.5mg/kg/日)と共に投与する。「K」群にはPBSを投与し、プラセボとなる。投与および対照の腫瘍進行および退縮をインビボ撮像で非侵襲的に評価する。投与群および非投与群から腫瘍を切除し、免疫組織化学検査によって細胞生存および薬剤抵抗性タンパク質の変化について評価する。
サンプルサイズ(または検定力)の算出は予備試験の設計および提案された実験の要件を判定することにとって重要である。我々の結果を解釈するためには、有意性検定および統計分析も重要である。従来のα値、すなわちp=0.01を用いて本試験の統計的有意性を評価する。公表された(67)研究に基づいて提案された実験は、各群最小10匹のマウスを必要とするであろう。データは平均±SEMで表示され、かつ正規分布サンプルについては両側対(または非対)スチューデントt−検定を、または正規分布しないサンプルについてはノンパラメトリック検定として非対マンホイットニーU検定により比較する。結果は、SYSTAT(Systat software社)統計プログラムを用いて分析する。一因子および二因子分散ANOVA分析を用いて、それぞれ群およびサブグループを評価する。したがって、結果はp値が<0.05である場合に統計的に有意とみなす。
週齢6から8週間の雄性ヌードマウスにPCa細胞を皮下注射する。簡潔に述べると、5x106個のルシフェラーゼ発現PC3細胞を無菌PBS100μLに再懸濁し、イソフルラン麻酔下でヌードマウスの側腹部に注射する。ルシフェラーゼ発現LNCaP細胞(5x106個)を50%Matrigel(ベクトンディッキンソン)と混合し、イソフルラン麻酔下でヌードマウスの側腹部に注射する。
腫瘍担持ヌードマウスに、撮像の15分前に25×5/8”ゲージ針を用いた腹腔内注射によりD−ルシフェリン(Xenogen)150mg/kgを投与する。マウスはIVIS100インビボ撮像システムを用いて撮像し、結果を光子/秒/cm2/srで表示する。腫瘍体積はノギスを用いて測定し、式(長径)×(短径)2×0.5で算出する。
(細胞生存、アポトーシスおよび薬剤耐性遺伝子発現分析)
Claims (31)
- 対象における癌の存在を検出するための方法であって:
前記対象から採取した生物学的サンプル中の1つまたはそれ以上の癌マーカーの発現のレベルを検出すること;および
前記生物学的サンプル中の前記1つまたはそれ以上の癌マーカーの前記発現のレベルを前記1つまたはそれ以上の癌マーカーの発現の正常レベルと比較することを含み、
前記生物学的サンプル中の前記1つまたはそれ以上の癌マーカーの発現の正常より高いレベルが前記対象における癌の存在を示すことを特徴とし、
前記1つまたはそれ以上の癌マーカーの前記発現の正常レベルが事前に決定された数値であるかまたは前記生物学的サンプルと同じ起源または種類の既知の正常非癌性細胞の対照サンプルから得られることを特徴とし、かつ
前記癌が黒色腫、癌腫、リンパ腫、白血病、肉腫または胚細胞腫瘍であることを特徴とし、かつ
前記1つまたはそれ以上の癌マーカーがCXCL16またはCXCR6またはCXCL16およびCXCR6の両者を含むことを特徴とする前記方法。 - 請求項1に記載の前記方法であって、前記1つまたはそれ以上の癌マーカーがCXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR5a、CXCR5b、CXCR7、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CCL10、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL24、CCL25、CCL25−1、CCL25−2、CCL27、CCL28、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10、CCR11、XCL1、XCL2、XCR1、CX3CR1、CX3CL1、RNA結合モチーフ3(「RBM3」)、癌胎児性抗原(CEA)、前立腺特異抗原(PSA)、クロムグラニンA(CGA)、デヒドロエピアンドロステロン(DHEA)、神経特異的エノラーゼ(NSE)、前立腺酸性ホスファターゼ(PAP)、プロラクチン、B7−H3、セプラーゼポリペプチド、抗p53、オステオポンチン、フェリチン、リゾフォスファチジルコリン、キネシンファミリー構成要素4A(KIF4A)、神経ペントラキシンI(NPTX1)および線維芽細胞増殖因子受容体1癌遺伝子パートナー(FGFR1OP)タンパク質からなる群から選択されることを特徴とする前記方法。
- 請求項1に記載の前記方法であって、前記癌が黒色腫であることを特徴とし、かつ前記1つまたはそれ以上の癌マーカーがCCL25、CCL27、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL12、CXCL13、CX3CL1、CCR9、CCR10、CXCR1、CXCR2、CXCR4、CXCR5およびCX3CR1からなる群から選択される1つまたはそれ以上の癌マーカーをさらに含むことを特徴とする前記方法。
- 請求項1に記載の前記方法であって、前記の癌が癌腫であることを特徴としかつ前記1つまたはそれ以上の癌マーカーがCCL1、CCL2、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CCL25、CXCL12、CXCL13、CCR2、CCR7、CCR8、CCR9、CXCR4、CXCR5およびCX3CR1からなる群から選択される1つまたはそれ以上の癌マーカーをさらに含むことを特徴とする前記方法。
- 請求項4に記載の前記方法であって、前記癌腫が乳癌であることを特徴としかつ前記1つまたはそれ以上の癌マーカーがCCL1、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CCL25、CXCL12、CXCL13、CCR7、CCR8、CCR9、CXCR4、CXCR5、CX3CR1、RNA結合モチーフ3(「RBM3」)、癌胎児性抗原(CEA)。RNA結合モチーフ3(「RBM3」)および/または癌胎児性抗原(CEA)をさらに含むことを特徴とする前記方法。
- 請求項4に記載の前記方法であって、前記癌腫が前立腺癌であることを特徴としかつ前記1つまたはそれ以上の癌マーカーが前立腺特異抗原(PSA)、CEA、クロムグラニンA(CGA)、デヒドロエピアンドロステロン(DHEA)、神経特異的エノラーゼ(NSE)、前立腺酸性ホスファターゼ(PAP)、プロラクチンおよび/またはB7−H3をさらに含むことを特徴とする前記方法。
- 請求項4に記載の前記方法であって、前記癌腫がコロンレクタル癌であることを特徴としかつ前記癌マーカーがCXCL13、CXCR5、CCL1、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CCL25、CXCL12、CCR7、CCR8、CCR9、CXCR4、CX3CR1、セプラーゼポリペプチド、抗p53、オステオポンチンおよびフェリチンをさらに含むことを特徴とする前記方法。
- 請求項4に記載の前記方法であって、前記癌腫が卵巣癌であることを特徴としかつ前記1つまたはそれ以上の癌マーカーがCXCL13、CXCR5、CXCL16、CXCR6、CCL1、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CCL25、CXCL12、CCR7、CCR8、CCR9、CXCR4、CX3CR1、癌抗原125(CA−125)、HE−4、OVX−1マクロファージコロニー刺激因子(M−CSF)および/またはリゾフォスファチジルコリンをさらに含むことを特徴とする前記方法。
- 請求項4に記載の前記方法であって、前記癌腫が肺癌であることを特徴としかつ前記1つまたはそれ以上の癌マーカーがCXCL13、CXCR5、CCL1、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CCL25、CXCL12、CCR7、CCR8、CCR9、CXCR4、CX3CR1、キネシンファミリー構成要素4A(KIF4A)、神経ペントラキシンI(NPTX1)、線維芽細胞増殖因子受容体1癌遺伝子パートナー(FGFR1OP)タンパク質およびCEAをさらに含むことを特徴とする前記方法。
- 請求項4に記載の前記方法であって、前記癌腫が膵臓癌または胃癌であることを特徴としかつ前記1つまたはそれ以上の癌マーカーがCXCL13、CXCR5、CCL1、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CCL25、CXCL12、CCR7、CCR8、CCR9、CXCR4、CX3CR1およびCEAをさらに含むことを特徴とする前記方法。
- 請求項1に記載の前記方法であって、前記癌がリンパ腫、白血病、肉腫、または胚細胞腫瘍であることを特徴とする前記方法。
- 請求項1に記載の前記方法であって、前記生物学的サンプルが血漿、唾液または尿サンプルであることを特徴とする前記方法。
- 癌を有する対象の予後を評価するための方法であって:
前記対象に由来する生物学的サンプル中の1つまたはそれ以上の癌マーカーの発現レベルを判定すること、および
前記生物学的サンプル中の前記1つまたはそれ以上の癌マーカーの前記発現のレベルを前記1つまたはそれ以上の癌マーカーの発現の対照レベルと比較することを含み、
前記生物学的サンプル中の前記1つまたはそれ以上の癌マーカーの発現の前記対照レベルに対してより高いレベルが前記対象の前記予後が不良であることを示すことを特徴とし、
前記生物学的サンプル中の前記1つまたはそれ以上の癌マーカーの発現の前記対照レベルに対してより低いかまたは同様のレベルが前記対象の前記予後が良好であることを示すことを特徴とし、
不良である予後が前記癌が侵襲型または浸潤型であることを示すことを特徴とし、
前記癌が黒色腫、癌腫、リンパ腫、白血病、肉腫または胚細胞腫瘍であることを特徴とし、かつ
前記1つまたはそれ以上の癌マーカーがCXCL16またはCXCR6またはCXCL16およびCXCR6の両者を含むことを特徴とする前記方法。 - 対象における癌治療の経過をモニタリングするための方法であって:
前記治療中または治療後に前記対象から採取した1つまたはそれ以上の生物学的サンプル中の1つまたはそれ以上の癌マーカーの発現レベルを判定すること、および
前記1つまたはそれ以上の生物学的サンプル中の前記1つまたはそれ以上の癌マーカーの前記発現のレベルを前記1つまたはそれ以上の癌マーカーの発現の対照レベルと比較することを含み、
前記1つまたはそれ以上の癌マーカーの前記対照レベルが前記対象における前記1つまたはそれ以上の癌マーカーの治療前レベルまたは事前に定められた参照レベルであることを特徴とし、
前記1つまたはそれ以上の生物学的サンプル中の前記1つまたはそれ以上の癌マーカーが前記対照レベルと同様であるかまたはこれより低い場合に前記治療が有効であると考えられることを特徴とし、
前記癌が黒色腫、癌腫、リンパ腫、白血病、肉腫または胚細胞腫瘍であることを特徴とし、かつ
前記1つまたはそれ以上の癌マーカーがCXCL16またはCXCR6またはCXCL16およびCXCR6の両者を含むことを特徴とする前記方法。 - 癌を検出するかまたは癌の進行をモニタリングするためのキットであって:
生物学的サンプル中のCXCL16および/またはCXCR6の発現を判定するための試薬;および前記試薬を用いる方法の指示を含み、
前記試薬が抗CXCL16抗体、抗CXCR6抗体、またはその両者を含むことを特徴としかつ前記癌が癌腫、黒色腫、リンパ腫、白血病、肉腫または胚細胞腫瘍であることを特徴とする前記キット。 - 対象における癌を治療するための方法であって:
抗CXCL16抗体、または抗CXCR6抗体、またはその組み合わせの治療的に有効な量を前記対象に投与することを含み、
前記癌が黒色腫、リンパ腫、白血病、肉腫、芽腫、または癌腫であることを特徴とし、かつ前記抗CXCL16抗体、または前記抗CXCR6抗体、または前記抗CXCL16抗体と前記抗CXCR6抗体の組み合わせが1ng/kg体重/日から約100mg/kg体重/日の用量範囲で与えられることを特徴とする前記方法。 - 請求項16に記載の前記方法であって、前記癌が黒色腫または卵巣癌、膣癌、子宮頸癌、子宮体癌、前立腺癌、肛門癌、直腸癌、結腸癌、胃癌、膵臓癌、インスリノーマ、腺癌、線扁平上皮癌、神経内分泌腫瘍、乳癌、肺癌、食道癌、口腔癌、脳癌、髄芽腫、神経外胚葉性腫瘍、神経膠腫、下垂体癌および骨癌からなる群から選択される癌腫であることを特徴とする前記方法。
- 請求項16に記載の前記方法であって、前記抗CXCL16抗体、または抗CXCR6抗体、またはその組み合わせが癌性組織内に直接投与されるか、または化学療法剤と共に投与されることを特徴とする前記方法。
- 請求項16に記載の前記方法であって、前記癌が癌腫でありかつ前記抗CXCL16抗体、または前記抗CXCR6抗体、またはその組み合わせがCCL1、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CCL25、CXCL12、CXCL13、CCR7、CCR8、CCR9、CXCR4、CXCR5およびCX3CR1からなる群から選択される他の抗ケモカインまたは抗ケモカイン受容体抗体と共に投与されることを特徴とする前記方法。
- 請求項16に記載の前記方法であって、前記癌が黒色腫でありかつ前記抗CXCL16抗体、または前記抗CXCR6抗体、またはその組み合わせがCCL25、CCL27、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL12、CXCL13、CX3CL1、CCR9、CCR10、CXCR1、CXCR2、CXCR4、CXCR5およびCX3CR1からなる群から選択される他の抗ケモカインまたは抗ケモカイン受容体抗体と共に投与されることを特徴とする前記方法。
- 請求項16に記載の前記方法であって:
前記対象に由来する組織中のCXCL16および/またはCXCR6発現のレベルを判定すること、および、CXCL16および/またはCXCR6の上昇レベルが検出される場合、前記抗CXCL16抗体、前記抗CXCR6抗体、またはその組み合わせの治療的に有効な量を前記対象に投与することを含む前記方法。 - 請求項16に記載の前記方法であって、前記対象が癌細胞中のCXCL16および/またはCXCR6発現上昇をもたらす癌と診断されることを特徴とする前記方法。
- 請求項16に記載の前記方法であって、前記抗CXCL16抗体、または前記抗CXCR6抗体、または前記抗CXCL16抗体と前記CXCR6抗体の組み合わせが1ng/kg体重/日から約100ng/kg体重/日、10ng/kg体重/日から約1μg/kg体重/日、100ng/kg体重/日から約10μg/kg体重/日、1μg/kg体重/日から約100μg/kg体重/日、10μg/kg体重/日から約1mg/kg体重/日、または100μg/kg体重/日から約10mg/kg体重/日の用量範囲で与えられることを特徴とする前記方法。
- 対象におけるCXCL16および/またはCXCR6の発現が上昇した癌細胞の遊走または転移の予防または阻害のための方法であって:
抗CXCL16抗体、または抗CXCR6抗体、またはその組み合わせの治療的に有効な量を前記対象に投与することを含み、
前記抗CXCL16抗体、または前記抗CXCR6抗体、または前記抗CXCL16抗体と前記抗CXCR6抗体の組み合わせが1ng/kg体重/日から約100mg/kg体重/日の用量範囲で与えられることを特徴とする前記方法。 - 化学療法の効果を増強するための方法であって:
抗CXCL16抗体、または抗CXCR6抗体、またはその組み合わせの有効量を、癌に対する化学療法を受けている対象に投与することを含む前記方法。 - 請求項25に記載の前記方法であって、前記対象が黒色腫または癌腫のための化学療法を受けていることを特徴とする前記方法。
- 医薬組成物であって:
(1)CXCL16および/またはCXCR6の発現を阻害する、または(2)CXCL16とCXCR6の相互作用を阻害する、または(3)CXCL16および/またはCXCR6の生物学的活性を阻害する物質を発現することのできる発現ベクター;および
医薬品として許容できる担体を含む前記医薬組成物。 - 請求項29に記載の前記医薬組成物であって、前記物質が抗CXCL16抗体または抗CXCR6抗体であることを特徴とする前記医薬組成物。
- 対象における癌を治療するための方法であって:
有効量のCXCL16および/またはCXCR6免疫原で前記対象を免疫してCXCL16および/またはCXCR6の生物学的活性を阻害する抗体を誘導することを含み、
前記癌が黒色腫、リンパ腫、白血病、肉腫、芽腫、または癌腫であることを特徴とする前記方法。 - 対象におけるCXCL16および/またはCXCR6の発現が上昇した癌細胞の遊走または転移の予防または阻害のための方法であって:
有効量のCXCL16および/またはCXCR6免疫原で前記対象を免疫してCXCL16および/またはCXCR6の生物学的活性を阻害する抗体を誘導することを含み、
前記癌が黒色腫、リンパ腫、白血病、肉腫、芽腫、または癌腫であることを特徴とする前記方法。 - 化学療法の効果を増強するための方法であって:
癌に対する化学療法を受けている対象に有効量のCXCL16および/またはCXCR6免疫原を投与してCXCL16および/またはCXCR6の生物学的活性を阻害する抗体を誘導することを含む前記方法。
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