ITTO20120858A1 - Chemiochina per il trattamento terapeutico del medulloblastoma - Google Patents
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Description
Descrizione dell’invenzione industriale dal titolo: “Chemiochina per il trattamento terapeutico del medulloblastomaâ€
DESCRIZIONE
La presente invenzione rientra nel campo dei trattamenti terapeutici del medulloblastoma.
Dopo la nascita, i precursori dei granuli del cervelletto (GCPs) proliferano intensamente entro lo strato granulare esterno (EGL), alla superficie del cervelletto in corso di sviluppo. La proliferazione dei GCPs à ̈ innescata dalla proteina Sonic Hedgehog (Shh), secreta dai neuroni di Purkinje. Una prolungata attività mitotica dei GCPs ne incrementa i rischi di trasformazione. Il medulloblastoma, che à ̈ il più comune tumore cerebrale nei bambini, origina infatti dai GCPs.
Il medulloblastoma à ̈ un tumore estremamente difficile da trattare, in quanto particolarmente refrattario ai trattamenti chirurgici e farmacologici ad oggi disponibili.
Attualmente il medulloblastoma viene trattato mediante rimozione chirurgica della massa tumorale, che tuttavia non à ̈ curativa. L’aggiunta di radioterapia sul sistema nervoso centrale a dosi elevate può incrementare il tasso di guarigione, specie se seguita da chemioterapia. Gli effetti collaterali riportati dal paziente sono però in taluni casi così gravi da compromettere l’aspirazione ad una qualità di vita soddisfacente. In particolare, la radioterapia ha un impatto fortemente negativo sulla capacità cognitiva del paziente pediatrico in età compresa tra i due ed i sette anni, poiché le radiazioni possono comportare la parziale distruzione della riserva di precursori neuronali presenti nel cervello non ancora completamente formato.
Vi à ̈ dunque una drammatica necessità di nuovi trattamenti terapeutici del medulloblastoma che non presentino gli inconvenienti sopra menzionati.
Tale necessità à ̈ stata ora soddisfatta dai presenti inventori, i quali hanno trovato che la chemiochina CXCL3 (“C-X-C motif chemokine 3†) à ̈ in grado di contrastare la prima fase della tumorigenesi nel medulloblastoma.
La chemiochina CXCL3 rappresenta quindi un nuovo agente terapeutico per il trattamento del medulloblastoma.
Come sarà descritto in dettaglio nella parte sperimentale che segue, i presenti inventori sono arrivati ad identificare la chemiochina CXCL3 come nuovo agente terapeutico per il medulloblastoma, grazie alla creazione di un nuovo modello animale che à ̈ stato generato incrociando topi eterozigoti Patched1 (Ptc<+/->) con topi privati del gene Tis21 (Tis21<-/->), il che ha consentito di ottenere topi doppio knockout Ptc<+/->/Tis21<-/->.
I topi eterozigoti Patched1 (Ptc<+/->) sono un noto un modello murino di medulloblastoma (Wetmore, C. et al. Cancer Res., 60:2239-2246, 2000; Goodrich, L. V. et al. Science (Wash. DC), 277:1109-1113, 1997) che rappresenta adeguatamente il medulloblastoma umano ma che sviluppa il tumore con bassa frequenza.
E’ noto che mutazioni ereditate o sporadiche del gene Patched1 umano, che codifica per il recettore di Shh e agisce da inibitore della pathway di Shh in assenza del ligando, oppure la mancanza di un allele Patched1 in modelli murini, portano allo sviluppo del medulloblastoma. Ciò indica che una sovra-attivazione del pathway Shh à ̈ importante nell’eziologia del tumore. La proliferazione di GCPs guidata da Shh nell’EGL à ̈ massima una settimana dopo la nascita, ma dopo tre settimane i GCPs sono ormai differenziati e sono migrati dall’EGL verso l’interno del cervelletto, negli strati molecolare e granulare (ML; IGL), che rappresentano la loro destinazione finale. In contrasto, a quell’età l’EGL dei topi eterozigoti per Patched1 (Ptc1<+/->) presenta dei cluster di GCPs che sono ancora altamente proliferanti e che, essendo diversi dai GCPs normali per il profilo di espressione e per la perdita dell’allele Patched1 wild-type, possono essere considerati un intermedio preneoplastico fra i GCPs e le cellule di medulloblastoma. I GCPs preneoplastici possono ancora differenziare, eccetto una piccola frazione di cellule che continua a dividersi. Infatti, entro un periodo di 3 a 6 mesi, nel 15-25% dei topi eterozigoti per Patched1, i GCPs si sviluppano in lesioni più grandi e poi nel tumore.
Tis21, anche noto come PC3 o BTG2 (rispettivamente in topo, ratto ed essere umano) à ̈ un cofattore trascrizionale che agisce nei GCPs del cervelletto e nei progenitori neurali di diverse aree del cervello, quali l’ippocampo e la zona subventricolare, inducendoli ad uscire dallo stato proliferativo e a differenziarsi. Tis21 inibisce il ciclo cellulare nei progenitori neurali attraverso la repressione diretta del promotore della ciclina D1, ed attiva geni proneurali attraverso la repressione diretta del promotore di Id3, un inibitore dei geni proneurali bHLH. L’espressione di questo gene à ̈ stata osservata essere sotto-regolata nel medulloblastoma umano.
Come menzionato in precedenza, i presenti inventori hanno incrociato topi Ptc1<+/->con i topi Tis21<-/->ed hanno ottenuto un nuovo modello murino di medulloblastoma (doppi knockout Ptc<+/->/Tis21<-/->), che presenta numerose caratteristiche vantaggiose rispetto ai modelli noti di medulloblastoma. I doppi knockout Ptc<+/->/Tis21<-/->sviluppano infatti il medulloblastoma con frequenza molto più elevata rispetto ai topi Ptc<+/->(80% circa) e presentano inoltre un’elevata frequenza di lesioni iperplastiche dell’EGL, formate da GCPs preneoplastici. La delezione del gene Tis21 nei doppi knockout Ptc<+/->/Tis21<-/->non influisce sulla proliferazione dei GCPs ma ne inibisce il differenziamento e soprattutto la migrazione fuori dall’EGL, una caratteristica che non à ̈ presente in nessun’altro modello animale di medulloblastoma. Come spiegato in maggiore dettaglio nel seguito, tale difetto di migrazione rappresenta una fase importante della formazione del medulloblastoma, poiché i GCPs, rimanendo più a lungo nella nicchia proliferativa dell’EGL, diventano più proni alla trasformazione.
I presenti inventori hanno condotto studi comparativi di espressione genica confrontando l’espressione su scala genomica di GCPs isolati dai topi Ptc<+/->con l’espressione su scala genomica di GCPs isolati dai topi doppi knockout Ptc<+/->/Tis21<-/->. Gli inventori hanno così osservato che l’espressione della chemiochina Cxcl3 à ̈ significativamente ridotta nei topi doppi knockout Ptc<+/->/Tis21<-/->. In fettine di cervelletto ex vivo, gli inventori hanno altresì verificato che l’aggiunta di Cxcl3 à ̈ in grado di contrastare il difetto di migrazione dei GCPs e di ridurre l’area delle lesioni, favorendo la migrazione dei GCPs preneoplastici residenti nelle lesioni. Pertanto, il processo di trasformazione neoplastica dei GCPs può essere contrastato dall’azione di Cxcl3, che favorisce la migrazione dei GCPs preneoplastici e riduce le dimensioni delle lesioni, che rappresentano la prima fase della tumorigenesi.
Forma quindi oggetto della presente invenzione la chemiochina Cxcl3 per l’impiego nel trattamento terapeutico del medulloblastoma.
La chemiochina Cxcl3 umana à ̈ una proteina di 107 aminoacidi (UniProt Primary accession number: P19876), la cui sequenza aminoacidica à ̈ di per sé nota ed à ̈ riportata nel sequence listing come SEQ ID NO:1 (Homo sapiens chemokine (C-X-C motif) ligand 3 (CXCL3), mRNA, NCBI Reference Sequence: NM_002090.2).
MAHATLSAAP SNPRLLRVAL LLLLLVAASR RAAGASVVTE LRCQCLQTLQ GIHLKNIQSV NVRSPGPHCA QTEVIATLKN GKKA-CLNPAS PMVQKIIEKI LNKGSTN (SEQ ID NO:1).
Tale chemiochina à ̈ ad esempio somministrata al paziente sotto forma di proteina ricombinante. Forme ricombinanti della chemiochina Cxcl3 sono descritte nello stato della tecnica e sono disponibili in commercio, per cui la loro scelta e il loro impiego rientrano nelle capacità del tecnico medio del settore.
In una forma di realizzazione alternativa della presente invenzione, al paziente à ̈ somministrato un vettore di espressione comprendente una sequenza nucleotidica codificante per la chemiochina Cxcl3.
La sequenza nucleotidica codificante per la chemiochina Cxcl3 umana à ̈ di per sé nota ed à ̈ riportata nel sequence listing come SEQ ID NO:2. (Homo sapiens chemokine (C-X-C motif) ligand 3 (CXCL3), mRNA, NCBI Reference Sequence: NM_002090.2 in carattere sottolineato sono i codoni di inzio della proteina e di stop).
1 gctccgggaa tttccctggc ccggccgctc cgggctttcc agtctcaacc atgcataaaa 61 agggttcgcc gatcttgggg agccacacag cccgggtcgc aggcacctcc ccgccagctc 121 tcccgcttct cgcacagctt cccgacgcgt ctgctgagcc ccatggccca cgccacgctc 181 tccgccgccc ccagcaatcc ccggctcctg cgggtggcgc tgctgctcct gctcctggtg 241 gccgccagcc ggcgcgcagc aggagcgtcc gtggtcactg aactgcgctg ccagtgcttg 301 cagacactgc agggaattca cctcaagaac atccaaagtg tgaatgtaag gtcccccgga 361 ccccactgcg cccaaaccga agtcatagcc acactcaaga atgggaagaa agcttgtctc 421 aaccccgcat cccccatggt tcagaaaatc atcgaaaaga tactgaacaa ggggagcacc 481 aactgacagg agagaagtaa gaagcttatc agcgtatcat tgacacttcc tgcagggtgg 541 tccctgccct taccagagct gaaaatgaaa aagagaacag cagctttcta gggacagctg 601 gaaaggactt aatgtgtttg actatttctt acgagggttc tacttattta tgtatttatt 661 tttgaaagct tgtattttaa tattttacat gctgttattt aaagatgtga gtgtgtttca 721 tcaaacatag ctcagtcctg attatttaat tggaatatga tgggttttaa atgtgtcatt 781 aaactaatat ttagtgggag accataatgt gtcagccacc ttgataaatg acagggtggg 841 gaactggagg gtggggggat tgaaatgcaa gcaattagtg gatcactgtt agggtaaggg 901 aatgtatgta cacatctatt ttttatactt tttttttaaa aaaagaatgt cagttgttat 961 ttattcaaat tatctcacat tatgtgttca acatttttat gctgaagttt cccttagaca 1021 ttttatgtct tgcttgtagg gcataatgcc ttgtttaatg tccattctgc agcgtttctc 1081 tttcccttgg aaaagagaat ttatcattac tgttacattt gtacaaatga catgataata 1141 aaagttttat gaaaaaaaaa aaaaaa
Vettori di espressione idonei per l’impiego in terapia genica sono noti e descritti nello stato della tecnica, per cui la loro scelta e il loro impiego rientrano nelle capacità del tecnico medio del settore. A titolo di esempio non limitativo si cita il vettore adenoassociated virus (AAV) la cui trascrizione à ̈ promossa una promotore citomegalovirus di pollo/beta actin (CBA) che à ̈ stato dimostrato trasdurre con efficienza un certo numero di aree cerebrali e che à ̈ ideale per la scarsa reazione immunitaria associata (Klein RL, Hamby ME, Gong Y, Hirko AC, Wang S, Hughes JA, King MA, Meyer EM.
2002. Dose and promoter effects of adeno-associated viral vector for green fluorescent protein expression in the rat brain. Exp Neurol. 176:66-74).
Forma altresì oggetto della presente invenzione una composizione farmaceutica comprendente la chemiochina Cxcl3, preferibilmente ricombinante, o un vettore di espressione comprendente una sequenza nucleotidica codificante per la chemiochina Cxcl3, in combinazione con veicoli, eccipienti e/o diluenti farmaceuticamente accettabili.
La composizione farmaceutica della presente invenzione può essere formulata in qualsivoglia forma di dosaggio idonea ad esempio per la somministrazione per via orale, sublinguale, buccale, rettale, intranasale, inalatoria, sottocutanea, intradermica, transcutanea, intravenosa, intraarteriosa, intramuscolare, intraperitoneale, intratecale o intracerebroventricolare. E’ tuttavia prevedibile che la via di somministrazione più idonea possa rivelarsi quella per via intratecale assistita da procedura stereotassica. Naturalmente la scelta dei veicoli, eccipienti e/o diluenti idonei à ̈ effettuata in dipendenza della forma di somministrazione desiderata e tale scelta rientra nelle capacità del tecnico medio del settore. Anche la scelta della dose di principio attivo e del regime di dosaggio rientrano nelle capacità del tecnico medio del settore, e la loro selezione dipende da svariati fattori quali ad esempio l’età del paziente e il grado di progressione della malattia.
La parte sperimentale che segue à ̈ fornita a scopo puramente illustrativo e non limitativo della portata dell’invenzione come definita dalle annesse rivendicazioni.
PARTE SPERIMENTALE
Materiali e Metodi
Linee murine e genotipizzazione
I topi Tis21 knockout sono stati generati come descritto in precedenza (Park, S. et al. Mol. Cell. Biol. 24:10256-10262, 2004) nel ceppo C57BL/6 (B6) sostituendo l’esone II del gene Tis21 con la cassetta per la resistenza alla neomicina. I topi eterozigoti per Patched 1 (Ptc<+/->) sono stati generati in background CD1 distruggendo gli esoni 6 e 7. Gli embrioni Ptc<-/->morivano prima di E14. Incrociando i topi eterozigoti per Patched1 con i topi Tis21<-/->sono stati ottenuti topi doppi mutanti Patched1/Tis21 che sono stati sottoposti a interbreeding per ottenere i genotipi studiati. La progenie à ̈ stata resa isogenica prima di iniziare qualsiasi analisi, mediante ulteriore interbreeding per sei o più generazioni.
I topi Math1-proteina fluorescente verde (Math1-GFP) esprimono la GFP sotto il controllo dell’enhancer Math1.
Tutte le procedure animali sono state realizzate secondo le linee guida del Comitato Etico Europeo (Direttiva 86/609/CEE).
Quantificazione dei tumori e delle lesioni e analisi istologica
I topi sono stati osservati giornalmente per i sintomi del medulloblastoma per un periodo di 12 mesi. Alla comparsa dei sintomi di medulloblastoma (formazione di una protuberanza sulla testa, postura incurvata, rotazione in circolo del corpo in senso orario o antiorario, severa perdita di peso, paralisi, arruffamento della pelliccia o inattività ) i topi sono stati sacrificati e sottoposti ad autopsia. Il tumore cerebellare à ̈ stato congelato velocemente in azoto liquido per gli studi sull’mRNA oppure à ̈ stato fissato in 4% paraformaldeide per immersione overnight e poi crioprotetto prima del sezionamento in 30% saccarosio in PBS-DEPC. I campioni sono poi stati inclusi in Tissue Teck OCT (Sakura Finetek, Torrance, CA, Stati Uniti d’America), sezionati serialmente e colorati con ematossilina/eosina per confermare mediante analisi istologica che il tessuto cerebrale sottoposto a necroscopia fosse medulloblastoma. Le lesioni sono state identificate mediante visualizzazione dei GCPs GFP<+>proliferanti in topi Ptc<+/->/Tis21<-/->/Math1-GFP<+>asintomatici.
Trattamento dei topi con Bromodeossiuridina (BrdU) I GCPs in entrata nella fase S sono stati visualizzati 1 ora dopo un’iniezione di BrdU (95 mg/kg i.p.) secondo protocolli esistenti.
Immunoistochimica; preparazione dei campioni, marcatura con BrdU, anticorpi e analisi delle immagini L’istologia e l’immunocolorazione delle sezioni, colorante per marcatura multipla e incorporazione di BrdU usando metodi fluorescenti, sono state effettuate come descritto precedentemente (Farioli-Vecchioli S. et al. FASEB J. 21:2215-2225, 2007; Canzoniere D. et al. J. Neurosci. 24:3355-3369, 2004). Le immagini delle sezioni immunocolorate sono state ottenute mediante microscopia confocale a scansione laser usando un microscopio TCS SO5 (Leica Microsystem) e sono state analizzate con il software I.A.S. (Delta Sistemi, Roma, Italia). Quantificazione del numero di cellule in EGL e lesioni
La quantificazione delle cellule proliferanti, delle cellule in fase di differenziamento o delle cellule apoptotiche nell’EGL à ̈ stata effettuata su cinque sezioni sagittali mediane non adiacenti nel punto centrale del quinto, settimo e nono folium di ciascuna sezione, analizzando cinque sezioni per topo e tre topi per ciascun genotipo. Il numero di cellule nell’EGL à ̈ stato espresso come rapporto percentuale delle cellule proliferanti (BrdU<+>), in fase di differenziamento (NeuroD1<+>o NeuN<+>) o in apoptosi (Caspasi-3<+>) rispetto al numero totale di cellule (marcate con Hoechst 33258; 1 mg/ml in PBS), contate per l’intera lunghezza dell’EGL in ciascun campo fotomicrografico, da immagini digitali.
Le cellule BrdU<+>, NeuroD1<+>, NeuN<+>o Caspasi-3<+>nelle lesioni sono state contate nell’intera area della lesione, definita dalla presenza di cellule GFP<+>, su almeno cinque sezioni sagittali mediane non adiacenti per lesione. Gli inventori hanno esaminato tutte le lesioni presenti in ciascun topo analizzato. Nella tabella 1 sottostante sono riportanti il numero di topi analizzati per ciascun genotipo e il tempo.
Tabella 1
Genotipo n (2 settimane) n (6 settimane) n (12 settimane) Ptc1<+/->/Tis21<+/+>/Math1-GFP 10 19 8 Ptc1<+/->/Tis21<-/->/Math1-GFP 13 17 10
Saggi di migrazione cellulare, area degli strati, area delle lesioni e volumi
In esperimenti di migrazione dall’EGL, il numero di cellule marcate con BrdU per millimetro quadrato in ciascuno strato definito, cioà ̈ EGL, strato molecolare (ML) o strato granulare interno (IGL), à ̈ stato contato in cinque sezioni sagittali mediane non adiacenti nel punto centrale del quinto, settimo e nono folium. Sono stati analizzati tre topi per ciascun genotipo. In modo simile, in esperimenti di migrazione dalle lesioni à ̈ stato contato il numero di cellule marcate con BrdU per millimetro quadrato di ciascuno strato definito vicino alla lesione (cioà ̈ ML e IGL), in tre sezioni sagittali non adiacenti per lesione.
Le misurazioni planimetriche di EGL, ML o IGL e dell’area della lesione sono state effettuate per l’intera lunghezza dello strato o per l’intera estensione della lesione in ciascun campo fotomicrografico (5 x). L’area à ̈ stata ottenuta tracciando il contorno dell’intero strato o lesione su una fotografia digitale scattata e misurata utilizzando il software I.A.S. (Delta Sistemi).
Il volume di ciascuna lesione à ̈ stato calcolato moltiplicando l’area media della lesione per lo spessore della sezione e per il numero di sezioni in cui la lesione à ̈ stata osservata.
Isolamento di progenitori dei granuli del cervelletto (da EGL e lesioni)
I GCPs sono stati isolati da cervelletti di topi P7 seguendo una procedura descritta (Wechsler-Reya, R. J. et al. Neuron 22: 103-114, 1999).
Coltura di fettine organotipiche (marcatura con BrdU, infezione retrovirale e immunocolorazione) Le fettine sono state ottenute e coltivate secondo i metodi di Stoppini L. et al J. Neuroshee. Methods 37: 173-182, 1991 e Polleux F. et al Science 282: 1904-1906, 1998.
Le fettine sono state coltivate per 120 ore in presenza di 100 ng/ml di Cxcl3 (R&D Systems) o di veicolo (PBS, 0,1% BSA) da solo ed il terreno à ̈ stato sostituito ogni 48 ore. Per marcare e successivamente tracciare le cellule migranti dall’EGL, le colture sono state marcate con il metodo della marcatura intermittente con BrdU (10 µg/ml; Sigma) aggiunta al t0 per 18 ore. In esperimenti di infezione retrovirale con la sequenza di cDNA di Tis21, le fettine organotipiche sono state infettate aggiungendo direttamente sulla fettina il volume di stock virale (retrovirus pCAG-Tomato-Tis21) corrispondente a 1,4 x 10<6>TU, sottoposte a marcatura intermittente il giorno successivo con 10 µg/ml di BrdU per 6 ore e coltivate per altre 72 ore. Per ciascun animale, metà delle fettine cerebellari à ̈ stata utilizzata come controllo ed esse sono state infettate con il virus pCAG-Tomato vuoto e l’altra metà con il pCAG-Tomato-Tis21. Alla fine di ciascun esperimento, le fettine sono state fissate in 4% paraformaldeide e immunocolorate.
Costrutti di DNA e produzione di retrovirus
Il vettore retrovirale pCAG-IRES-tdTomato, gentilmente fornito dal Dr. Mu-ming Poo, à ̈ stato usato per esprimere il cDNA di Tis21 (cioà ̈ la sequenza murina) solo nei GCPs in corso di divisione. L’intera cornice di lettura aperta del cDNA di Tis21 à ̈ stata clonata nei siti XhoI-5’/SmaI-3’ di pCAG-IRES-tdTomato, ottenendo il costrutto pCAG-IRES-tdTomato-Tis21. Il costrutto à ̈ stato verificato mediante sequenziamento del DNA.
I retrovirus sono stati propagati come descritto precedentemente (Farioli-Vecchioli S. et al PLoS Biol 6 (10), e 246, 2008).
Estrazione dell’RNA, real-time RT-PCR
L’RNA totale, estratto da GCPs e sottoposto a trascrizione inversa, à ̈ stato analizzato mediante amplificazione real-time RT-PCR, utilizzando il saggio 5-nucleasi fluorogenico basato sulla sonda TaqMan in campioni in duplicato ed un sistema 7900HT (Applied Biosystems, Foster City, CA, Stati Uniti d’America). I valori di espressione relativi dell’mRNA, ottenuti con il metodo comparativo ciclo-soglia, sono stati normalizzati rispetto ai controlli endogeni proteina legante TATA e GAPDH. Analisi microarray
L’analisi di espressione su scala genomica di GCPs isolati da EGL di topi P7 à ̈ stata effettuata con Whole Mouse Genome Microarrays (Agilent Technologies, Stati Uniti d’America).
Statistica
I confronti individuali fra gruppi delle frequenze delle lesioni e dei volumi di cellule proliferanti, in fase di differenziamento e migranti e dei valori real-time PCR sono stati effettuati utilizzando il test t di Student. I confronti fra gruppi dell’incidenza di medulloblastoma e delle percentuali di medulloblastoma sono stati effettuati con il test Chi-quadro. Nell’analisi microarray i dati grezzi corrispondenti ai valori di intensità del segnale sono stati limitati ad 1, trasformati in log2, normalizzati al cinquantesimo percentile e normalizzati alla linea basale formata dalla mediana di tutti i campioni. I geni con un valore p corretto < 0,05 (ANOVA ad una via seguito dal test di Benjamini and Hochberg False Discovery Rate e dal test Tukey’s Post Hoc) sono stati considerati differenzialmente espressi.
Risultati
L’ablazione di Tis21 facilita la tumorigenesi Per testare se la tumorigenicità dei precursori dei granuli del cervelletto preneoplastici (pGCPs) sia influenzata dall’ablazione di Tis21, gli inventori hanno analizzato la frequenza di medulloblastomi sviluppati nel corso di un anno di vita in topi eterozigoti per Patched1 (Ptc<+/->), che tendono a sviluppare spontaneamente il medulloblastoma, incrociati con topi knockout per Tis21. Gli inventori hanno osservato che mentre i topi Ptc<+/->/Tis21<+/+>sviluppano il medulloblastoma con una frequenza del 25,3%, i doppi mutanti, Ptc<+/->/Tis21<+/->oppure Ptc<+/->/Tis21<-/->, mostrano un’incidenza significativamente maggiore di medulloblastoma, cioà ̈ rispettivamente l’80% (p = 0,000) e il 75,9% (p = 0,000) (tabella 2). Inaspettatamente, tuttavia, la latenza tumorale media à ̈ significativamente più lunga nei doppi mutanti che nei topi Ptc<+/->/Tis21<+/+>(tabella 2). Nei topi Ptc<+/->/Tis21<+/+>non si sviluppano tumori (tabella 2). Pertanto, l’ablazione di uno o due alleli di Tis21 sembra favorire fortemente la tumorigenesi nei pGCPs Ptc<+/->.
Tabella 2: Analisi statistica dell’incidenza e della latenza del medulloblastoma<a>
<Genotipo>Ptc<+/+>/ Ptc<+/+>/ Ptc<+/->/ Ptc<+/->/ Ptc<+/->/
Tis21<+/+>Tis21<-/->Tis21<+/+>Tis21<+/->Tis21<-/->Medulloblasto- 0 (0,0) 0 (0,0) 18 (25,35) 41*(75,93) 60*(80,00) ma (%)
Latenza me- -- -- 20,09±1,7 25,46±1,5<†>25.57±1.3<†>dia (settimane)
N° topi 40 42 71 54 75 analizzati
<a>I 5 genotipi si riferiscono alla progenie di incroci fra topi eterozigoti per Patched1 e knockout per Tis21; tutti i genotipi murini sono nello stesso background genetico, essendo stati incrociati tra di loro per almeno 6 generazioni
<*>p < 0,0001 vs gruppo Ptc<+/->/Tis21<+/+>(test Chi quadro).<†>p < 0,05 vs gruppo Ptc<+/->/Tis21<+/+>(test t di Student).
Per studiare quest’effetto Tis21 dipendente, i presenti inventori hanno analizzato parametri cellulari chiave dei pGCPs residenti all’interno delle lesioni, cioà ̈ la proliferazione, il differenziamento, la vitalità e la migrazione.
I topi eterozigoti per Patched1 a P14 presentano delle lesioni caratterizzate da regioni dell’EGL più spesse espanse come formazioni nodulari all’interno dei lobuli cerebellari contenenti pGCPs con GCP altamente proliferanti. Queste lesioni sono definite resti di EGL iperplastici o iperplasie focali se comprendono più di 30 pGCPs, oppure iperplasie diffuse quando includono più di 5000 cellule. Le iperplasie focali sono frequenti a P14, ma a partire da P21 iniziano a scomparire e ad essere sostituite da iperplasie diffuse più grandi, il che indica che si verifica una selezione dei pGCPs in cellule tumorali.
Così, gli inventori hanno analizzato le lesioni iperplastiche precoci a P14, quando i GCPs normali nell’EGL sono spessi due o tre strati, avendo quasi completato la migrazione all’interno dell’IGL, mentre i cluster rimanenti di GCPs possono essere considerati preneoplastici. Gli inventori hanno anche analizzato lesioni a 6 e 12 settimane, quando l’EGL à ̈ scomparso e il cervelletto esterno contiene foci di pGCPs ectopici.
Per identificare i GCPs preneoplastici nelle lesioni iperplastiche diffuse e focali, i topi doppi mutanti Ptc<+/->/Tis21<-/->sono stati incrociati con topi transgenici Math1-GFP (Lumpkin E.A. Gene expr. patterns 3: 389-395, 2003), che portano un transgene GFP sotto il controllo di Math1, un fattore di trascrizione espresso nei GCPs proliferanti, normali, preneoplastici e tumorali. Gli inventori hanno verificato che la progenie dei doppi mutanti Ptc<+/->/Tis21<-/->incrociata con topi Math1-GFP presentava una frequenza e dei volumi delle lesioni e dei parametri proliferativi dei GCPs preneoplastici equivalenti a quelli dei doppi mutanti non incrociati con Math1-GFP, come determinato mediante marcatura con BrdU.
Gli inventori hanno osservato che la percentuale di topi doppi mutanti (Ptc<+/->/Tis21<-/->/Math1-GFP) con lesioni iperplastiche diffuse o focali era significativamente maggiore di quella dei topi eterozigoti per Patched1 (Ptc<+/->/Tis21<+/+>/Math1-GFP) a 2 e 12 settimane dopo la nascita. Inoltre, la percentuale di topi doppi mutanti con lesioni (circa l’80%) rimaneva stabile per l’intero periodo analizzato, mentre quella dei topi Ptc<+/->/Tis21<+/+>/Math1-GFP diminuiva rapidamente dal 60% al 20% entro 12 settimane dopo la nascita (figura 2A; Ptc<+/->/Tis21<-/->/Math1-GFP vs Ptc<+/->/Tis21<+/+>/Math1-GFP; p = 0,02 e p = 0,03 in topi di 2 e 12 settimane, rispettivamente). In modo simile, il numero di lesioni iperplastiche per topo era significativamente maggiore nei doppi mutanti che negli eterozigoti per Patched1 a 2 e 6 settimane di età , anche se questo numero diminuiva progressivamente diventando uguale, a 12 settimane, a quello osservato nei topi eterozigoti per Patched1 (figura 2B; Ptc<+/->/Tis21<-/->/Math1-GFP vs Ptc<+/->/Tis21<+/+>/Math1-GFP; p = 0,006 e p = 0,02 in topi di 2 e 6 settimane, rispettivamente). È interessante notare che la percentuale di topi con lesioni a 12 settimane corrispondeva esattamente in tutti i genotipi alla percentuale di topi che sviluppavano il medulloblastoma (figura 2A; tabella 2). Ciò indica che le lesioni presenti a 12 settimane dopo la nascita sono irreversibili. In tutti i genotipi, gli inventori hanno osservato un progressivo incremento dei volumi delle lesioni in età successive, con un incremento significativo nei doppi mutanti rispetto ai topi eterozigoti per Patched1 a 2 settimane (figura 2C; Ptc<+/->/Tis21<-/->/Math1-GFP vs Ptc<+/->/Tis21<+/+>/Math1-GFP; p = 0,007; il numero di topi analizzati in figura 2A-C à ̈ mostrato in tabella 2).
Nell’insieme, questi risultati suggeriscono che nei topi doppi mutanti Ptc<+/->/Tis21<-/->i pGCPs sono più tendenti a raggrupparsi in lesioni e ad espandersi in tumori, anche se con una latenza più lunga che nei topi eterozigoti per Patched1.
Gli inventori ritengono che la maggiore incidenza di tumori osservati nei doppi mutanti possa dipendere dalla maggiore frequenza e persistenza delle lesioni. Per comprendere meglio questo aspetto, gli inventori hanno analizzato i pGCPs all’interno delle lesioni, la cui area à ̈ stata visualizzata tramite la presenza di cellule GFP<+>, misurando il loro tasso di proliferazione mediante incorporazione di BrdU con marcatura intermittente di 1 ora, e il loro differenziamento, mediante marcatura dei pGCPs con i marcatori neurali NeuroD1 e NeuN. NeuroD1 marca i GCPs postmitotici appena differenziati dell’EGL interno ed à ̈ richiesto per il loro differenziamento, mentre NeuN marca i neuroni granulari differenziati postmitotici. Non sono state osservate differenze significative fra i topi Ptc<+/->/Tis21<-/->/Math1-GFP e i topi Ptc<+/->/Tis21<+/+>/Math1-GFP per ciò che concerne il numero di cellule Brdu<+>, NeuroD1<+>o NeuN<+>presenti nell’area delle lesioni GFP<+>, a 2, 6 o 12 settimane di età . Al contrario, à ̈ stato osservato un significativo incremento dell’apoptosi (cellule caspasi-3<+>per area della lesione) in topi Ptc<+/->/Tis21<-/->/Math1-GFP vs Ptc<+/->/Tis21<+/+>/Math1-GFP a 6 settimane (figura 3; p = 0,01). Poi, gli inventori hanno misurato il numero e l’area dei pGCPs migrati al di fuori delle lesioni marcando i pGCPs proliferanti in topi di 2 e 6 settimane di età (P14 e P42) con una marcatura intermittente con BrdU e seguendo la loro migrazione nello strato molecolare (ML) e nello strato granulare interno (IGL) nell’arco delle successive 42 ore o dei successivi 5 giorni. Un numero minore di pGCPs migranti dalle lesioni verso lo strato molecolare era rilevabile nei topi Ptc<+/->/Tis21<-/->/Math1-GFP di 2 e 6 settimane di età già 42 ore dopo la marcatura intermittente con BrdU. Questo decremento diventa significativo 5 giorni dopo la marcatura intermittente con BrdU, con una riduzione evidente (più del 40%) di pGCPs migrati sia nello strato molecolare sia nello strato granulare interno a 2 o 6 settimane di età (figura 3C-E; topi Ptc<+/->/Tis21<-/->/Math1-GFP vs topi Ptc<+/->/Tis21<+/+>/Math1-GFP, ML:p = 0,002 a 2 settimane, p = 0,044 a 6 settimane di età ; IGL: p = 0,002 a 2 settimane, p = 0,02 a 6 settimane di età ). Nell’insieme, questi dati indicano che l’ablazione di Tis21 impedisce la migrazione di pGCPs fuori dalle lesioni e suggerisce che questo difetto, ritardando la scomparsa delle lesioni dall’area proliferativa alla superficie del cervelletto, favorisca la loro conversione in medulloblastoma.
L’ablazione di Tis21 inibisce il differenziamento e la migrazione dei GCPs
Avendo analizzato i pGCPs dentro le lesioni, gli inventori hanno voluto definire se l’ablazione genetica di Tis21, da sola (topi Ptc<+/+>/Tis21<-/->) o in combinazione con quella dell’allele Patched1 (topi Ptc<+/->/Tis21<-/->), influisca sulla proliferazione e il differenziamento dei GCPs in aree dell’EGL prive di lesioni a P7 e P14, ossia in stadi rispettivamente precedenti o corrispondenti all’iniziale formazione di lesioni focali.
A P7 – il momento della maggiore espansione dei GCPs – o a P14, la percentuale di GCPs proliferanti, identificata mediante incorporazione di BrdU tramite marcatura intermittente di 1 ora, aumenta significativamente solo nei topi eterozigoti per Patched1, o con gli alleli Tis21 wild-type o Tis21-null (Ptc<+/->/Tis21<+/+>o Ptc<+/->/Tis21<-/->vs Ptc<+/+>/Tis21<+/+>, p = 0,01 o p = 0,04 a P7 e p = 0,005 o p = 0,007 a P14, rispettivamente; Ptc<+/->/Tis21<-/->vs Ptc<+/->/Tis21<+/+>, p = 0,53 a P7 e p = 0,34 a P14).
Ciò indica che l’assenza di Tis21 non influisce sul tasso di proliferazione dei GCPs, mentre l’assenza di un allele di Patched1, come atteso, favorisce la loro divisione.
Successivamente, gli inventori hanno analizzato il differenziamento dei GCPs nell’EGL. A P7, l’ablazione di Tis21, da solo o in combinazione con un allele di Patched1, oppure l’ablazione sia di Tis21 sia di Patched1, riduceva significativamente nella stessa misura (circa il 25%) la percentuale di GCPs positivi per NeuroD1 (figura 4A; Ptc<+/+>/Tis21<-/->vs Ptc<+/+>/Tis21<+/+>; p = 0,000; Ptc<+/->/Tis21<+/+>o Ptc<+/->/Tis21<-/->vs Ptc<+/+>/Tis21<+/+>, p = 0,000 e p = 0,001). Dall’altro lato, l’ablazione di Tis21 da solo, o di un allele di Patched1, induceva un significativo e similare decremento di GCPs positivi per il marcatore di differenziamento tardivo NeuN a P14, in confronto ai corrispondenti controlli Tis21 wild-type (figura 4B; Ptc<+/+>/Tis21<-/->vs Ptc<+/+>/Tis21<+/+>, e Ptc<+/->/Tis21<-/->vs Ptc<+/->/Tis21<+/+>, p = 0,003 e p = 0,002, rispettivamente). Inoltre, nei doppi mutanti Ptc<+/->/Tis21<-/->la percentuale di GCPs completamente differenziati (NeuN-positivi a P14) era ulteriormente ridotta, indicando che l’assenza di Tis21 sinergizza con la mutazione di Patched1 nell’inibire il differenziamento terminale.
Nell’insieme, l’ablazione di Tis21 può di per sé ostacolare il differenziamento sia precoce sia terminale dei GCPs.
Successivamente, gli inventori hanno misurato la migrazione dei GCPs dall’EGL, marcandoli a P7 con una marcatura intermittente con BrdU e analizzando la loro migrazione dopo 42 ore o dopo 5 giorni. Come mostrato in figura 5A nei topi wild-type 42 ore dopo la marcatura, fino al 50% dei GCPs marcati con BrdU era migrata nell’ML e nell’IGL. In contrasto, nei topi Tis21-null (Ptc<+/+>/Tis21<-/->o Ptc<+/->/Tis21<-/->) un numero significativamente minore di GCPs marcati con BrdU era migrata nell’ML e nell’IGL dopo 42 ore (figura 5A; Ptc<+/+>/Tis21<-/->vs Ptc<+/+>/Tis21<+/+>, p < 0,002; o Ptc<+/->/Tis21<-/->vs Ptc<+/->/Tis21<+/+>, p < 0,0001; sia in ML sia in IGL). Coerentemente con la ridotta migrazione fuori dall’EGL, à ̈ stato osservato un incremento dei GCPs marcati con BrdU nell’EGL di topi Tis21<-/->, Patched1 wild-type o eterozigoti (figura 5A; Ptc<+/+>/Tis21<-/->vs Ptc<+/+>/Tis21<+/+>, p = 0,0000; o Ptc<+/->/Tis21<-/->vs Ptc<+/->/Tis21<+/+>, p = 0,0000). La ridotta migrazione dei GCPs nell’ML e nell’IGL era specificamente associata con l’ablazione di Tis21, poiché i topi Patched1 eterozigoti /Tis21 wild-type, confrontati con i topi Patched1 wild-type/Tis21 wild-type, non mostravano alcun decremento della migrazione dei GCPs (Ptc<+/->/Tis21<+/+>vs Ptc<+/+>/Tis21<+/+>nell’ML, p = 0,92) o addirittura mostravano un incremento della migrazione (nell’IGL). Dall’altro lato, 5 giorni dopo la marcatura (a P12) la maggior parte dei GCPs marcati con BrdU era migrata fuori dall’EGL in tutti i gruppi, per raggiungere la sua destinazione finale, ossia l’IGL (figura 5B). Tuttavia, un numero significativamente minore di GCPs migrati nell’ML era ancora rivelabile nei topi doppi mutanti Patched1 eterozigoti /Tis21-null (figura 5B; Ptc<+/->/Tis21<-/->vs Ptc<+/->/Tis21<+/+>, p = 0,003 nell’ML), suggerendo che il difetto di migrazione persista di più se la mutazione di Tis21 era associata a quella di Patched1. In aggiunta, gli inventori non hanno trovato alcun difetto nei topi Tis21-null, sia Patched1 wild-type sia eterozigoti, per ciò che concerne l’organizzazione della glia radiale di Bergmann, rivelata mediante GFAP, che guida la migrazione dei granuli.
Gli inventori hanno anche valutato la sopravvivenza dei GCPs nell’EGL a P7 e P14, e non hanno trovato cambiamenti significativi nella percentuale di GCPs che andavano incontro ad apoptosi nei quattro genotipi studiati, come rivelato mediante positività alla caspasi-3.
Nell’insieme, i cambiamento più evidente osservato nei topi Tis21-null, Patched1 wild-type o eterozigoti, era un difetto di migrazione dei GCPs, preneoplastici e normali, dalle lesioni e dall’EGL verso gli strati interni adiacenti. Il difetto di migrazione dei GCPs Tis21-null dall’EGL veniva contrastato con ritardo nei topi eterozigoti per Patched1,ed appariva permanente nelle lesioni, suggerendo che l’ablazione di Tis21 cooperi con la mutazione di Patched1 in maniera tempo-dipendente. Dall’altro lato, il difetto di differenziamento dei GCPs Tis21-null nell’EGL sembrava meno pronunciato rispetto al difetto di migrazione, e non era rivelabile nelle lesioni, suggerendo che il difetto di migrazione dei GCPs fuori dall’EGL e fuori dalle lesioni possa essere un evento di primaria importanza nell’incremento della tumorigenesi osservato nei topi Ptc<+/->/Tis21<-/->(figura 1).
Poi, per seguire il processo di migrazione dei GCPs Tis21-null nel corso del tempo e per interferire con esso, gli inventori hanno voluto analizzare colture di fettine organotipiche di cervelletto.
In effetti, una migrazione difettiva fuori dall’EGL à ̈ stata osservata in GCPs positivi per BrdU di fettine organotipiche ottenute da topi Tis21-null, o Patched1 wild-type o eterozigoti, in confronto a topi Tis21 wild-type (figura 6A; Ptc<+/+>/Tis21<-/->vs Ptc<+/+>/Tis21<+/+>, o Ptc<+/->/Tis21<-/->vs Ptc<+/->/Tis21<+/+>, p = 0,0000). In aggiunta, quando le fettine organotipiche di cervelletto da topi Tis21-null, o Patched1 wild-type o eterozigoti, sono state infettate con un retrovirus esprimente Tis21 e la proteina fluorescente Tomato red, la migrazione difettiva dei GCPs veniva contrastata in modo significativo (figura 6B,C; Tomato-Tis21<+>vs Tomatovuoto<+>in topi Ptc<+/+>/Tis21<-/->, p = 0,02; Tomato-Tis21<+>vs Tomato-vuoto<+>in topi Ptc<+/->/Tis21<-/->, p = 0,003). Ciò indica che il difetto di migrazione associato con la perdita di Tis21 à ̈ specifico e reversibile, cioà ̈ non à ̈ causato da difetti dello sviluppo.
Espressione genica specifica per i Tis21 knockout/medulloblastoma
Per iniziare a studiare i meccanismi molecolari alla base di questo fenotipo complesso, gli inventori hanno analizzato, mediante real time PCR, i livelli di espressione di tre pathway principali associati con la migrazione, che notoriamente regolano la migrazione dei neuroni del cervelletto, in particolare BDNF e il suo recettore TrkB, astrotactina1/astrotactina2, e neuregulina e il suo recettore Erb4.
Non sono stati rilevati cambiamenti significativi di questi mRNA in GCPs isolati da topi P7, o doppi mutanti o Patched1 wild-type/Tis21-null, in confronto con i rispettivi controlli Tis21 wildtype. Pertanto, gli inventori hanno effettuato un’analisi dell’mRNA su scala genomica mediante microarray in GCPs isolati dall’EGL di topi P7. E’ stata confrontata l’espressione dei geni nei topi Tis21-null e nei topi Tis21 wild-type, in un background Patched1 wild-type (Ptc<+/+>/Tis21<-/->vs Ptc<+/+>/Tis21<+/+>) o in un background Patched1 eterozigote (Ptc<+/->/Tis21<-/->vs Ptc<+/->/Tis21<+/+>). Gli inventori hanno formulato l’ipotesi che i geni la cui espressione era significativamente modificata solo nel primo confronto possano essere correlati con fenotipi cerebellari Tis21 knockout non tumorespecifici, mentre i geni modificati nel secondo confronto (o in entrambi i confronti) possano essere coinvolti specificamente nell’incremento Tis21 knockout-dipendente della formazione di medulloblastoma. In questo modo sono stati identificati 344 geni espressi differenzialmente, 179 dei quali erano Tis21 knockout-specifici e 165 medulloblastomaspecifici.
Tra di essi gli inventori hanno identificato alcuni geni che presentano un’espressione significativamente diversa nei topi doppi mutanti rispetto ai topi eterozigoti per Patched1, in accordo con i risultati del microarray; fra di essi, il gene per la chemiochina Cxcl3 à ̈ quello con il maggior decremento (circa il 45%; Ptc<+/->/Tis21<-/->vs Ptc<+/->/Tis21<+/+>p = 0,003). E’ da notare il fatto che in pGCPs isolati tramite FACS come cellule GFP<+>da lesioni diffuse in topi doppi mutanti di 6 settimane di età , l’espressione di Cxcl3 era quasi scomparsa (decremento del 95%, p = 0,000; figura 7), mentre gli altri geni non differivano.
Cxcl3 contrasta il difetto di migrazione dei GCPs e riduce l’area delle lesioni
Per studiare le implicazioni funzionali della sotto-regolazione di Cxcl3, gli inventori hanno testato la capacità di Cxcl3 di contrastare il difetto di migrazione dei GCPs Tis21-null. A questo scopo, fettine organotipiche di cervelletto di topi Tis21-null a P7, o Patched1 wild-type o eterozigoti, sono state trattate per 5 giorni con proteina Cxcl3 ricombinante, ed à ̈ stato osservato che Cxcl3 neutralizza in modo significativo il difetto di migrazione dei GCPs dall’EGL, come indicato dalla percentuale di GCPs BrdU<+>GCPs migrati fuori dall’EGL (figura 8A; con Cxcl3 vs senza: in topi Ptc<+/+>/Tis21<-/->, p = 0,001, o in topi Ptc<+/->/Tis21<-/->, p = 0,000). In particolare, nei topi doppi mutanti Cxcl3 induce almeno l’80% dei GCPs a migrare fuori dall’EGL, raggiungendo il livello basale di migrazione osservato nei topi wild-type. E’ rilevante che a P30, 5 giorni di trattamento con Cxcl3 riducano significativamente l’area delle lesioni nelle fettine (figura 8B; Cxcl3 giorno 0 vs giorno 5, in topi Ptc<+/->/Tis21<-/->/Math1-GFP, p = 0,003) e, in maniera corrispondente, contrasti significativamente il difetto di migrazione dei pGCPs (marcati con Brdu<+>) fuori dalle lesioni (figura 8C; con Cxcl3 vs senza, in topi Ptc<+/->/Tis21<-/->/Math1-GFP, p = 0,000). Ciò indica che l’aggiunta di Cxcl3 esogena può eliminare il difetto di migrazione Tis21-dipendente dei GCPs anche nello stadio preneoplastico con lesioni e, di conseguenza, ridurre l’area delle lesioni.
Discussione
Gli inventori hanno generato un nuovo modello murino di medulloblastoma che ha consentito loro di identificare nuovi meccanismi alla base della plasticità e della trasformazione neoplastica dei GCPs. In questo modello, l’ablazione di Tis21 incrementa in modo notevole l’incidenza di medulloblastomi spontanei in topi eterozigoti per Patched 1 (dal 25% all’80%). All’origine di tale incremento vi à ̈ la maggiore frequenza con cui i GCPs Tis21-null diventano preneoplastici nei primi periodi di vita postnatale e si raggruppano in cluster nell’EGL, a formare lesioni iperplastiche focali e diffuse che si svilupperanno dopo le 12 settimane di età in medulloblastomi. L’alterazione più evidente osservata nei GCPs privi di Tis21 à ̈ un notevole ritardo della loro migrazione, dall’EGL e dalle lesioni, verso gli strati molecolare e granulare interno adiacenti. Questo effetto à ̈ peculiare della mutazione Tis21-null, dato che l’eterozigosi di Patched1 di per sé non influenza la migrazione dei GCPs, ed à ̈ accompagnato da un ritardo nel differenziamento dei GCPs, mentre non si osserva alcun cambiamento nel loro tasso di proliferazione nell’EGL né nelle lesioni. Chiaramente, il gene Tis21 à ̈ necessario per la migrazione e per il differenziamento terminale dei GCPs. E’ stato mostrato che i GCPs proliferano quando sono esposti al microambiente della nicchia proliferativa dell’EGL, ed escono dal ciclo cellulare quando migrano fuori da questo microambiente. Lo stimolo proliferativo presente nell’EGL à ̈ Shh, un forte mitogeno prodotto dalle cellule di Purkinje. Il ritardo nella loro migrazione fuori dall’EGL, rivelabile nei GCPs Tis21-null, sia Patched1 eterozigoti sia wild-type, causa un prolungamento della loro permanenza nell’EGL e quindi della loro esposizione all’azione proliferativa di Shh. Ciò può dare come risultato la maggiore frequenza di lesioni e la maggiore incidenza di medulloblastomi che sono state osservate nel genotipo doppio mutante (Ptc<+/->/Tis21<-/->). Sembra che nei topi doppi mutanti Ptc<+/->/Tis21<-/->la tumorigenesi segua due fasi: i) a 2 settimane, quando l’EGL à ̈ ancora presente, cioà ̈ dalle fasi postnatali iniziali la percentuale di topi doppi mutanti con lesioni e il numero di lesioni per cervelletto aumentano in maniera significativa rispetto ai topi Patched1 eterozigoti/Tis21 wild-type (Ptc<+/->/Tis21<+/+>); ii) il numero maggiore di topi doppi mutanti con lesioni persiste fino a 12 settimane di età , mentre a questa età la percentuale di topi Patched1 eterozigoti/Tis21 wild-type (Ptc<+/->/Tis21<+/+>) con lesioni diminuisce; peraltro, la percentuale di topi con lesioni a 12 settimane di età concorda perfettamente con quella di topi che sviluppano medulloblastoma. Nell’insieme, ciò suggerisce che l’ablazione di Tis21 in topi Patched1 eterozigoti, causando una protratta esposizione fin dal primo periodo postnatale dei GCPs in fase di divisione nell’area dell’EGL all’effetto trasformante esercitato da Shh, possa favorire la loro trasformazione preneoplastica ed un ulteriore incremento di tumorigenesi dopo le 12-15 settimane di età , a cui segue il raggiungimento di un plateau nella curva che rappresenta l’incidenza del medulloblastoma. Ciò può anche spiegare la latenza media più lunga dell’insorgenza di medulloblastoma nei topi doppi mutanti. Tuttavia gli inventori non possono escludere che un componente di questa latenza media più lunga possa essere una ridotta diffusione dei GCPs tumorali, e quindi una ridotta espansione del tumore.
I dati ottenuti dagli inventori indicano che nei topi Tis21-null non si verifica alcun cambiamento nell’espressione di geni facenti parte di noti pathway che regolano la migrazione dei neuroni cerebellari, quali BDNF/TrkB, astrotactina1/astrotactina2 e neuregulina/Erb4. Tuttavia, con un’analisi di espressione effettuata su scala genomica di GCPs isolati da topi a P7, à ̈ stato osservato che nei topi doppi mutanti molti altri geni coinvolti nella migrazione o nel differenziamento cellulare presentano un decremento dell’espressione del mRNA.
In particolare, gli inventori hanno notato che Cxcl3 mostra un forte decremento di espressione nei GCPs e ancora più forte nelle lesioni dei topi doppi mutanti Patched1 eterozigoti/Tis21-null, in confronto con i topi Patched1 eterozigoti/Tis21 wildtype. Poiché Cxcl3 riduce l’area delle lesioni inducendo la migrazione di pGCPs fuori dalle lesioni, à ̈ possibile ipotizzare che questa azione di Cxcl3 favorente la migrazione possa indurre i pGCP ad uscire dal programma neoplastico.
Nell’insieme, ciò suffraga l’ipotesi avanzata dai presenti inventori, secondo la quale un difetto di migrazione à ̈ la causa dell’incremento della tumorigenesi del medulloblastoma a seguito di ablazione di Tis21.
Inoltre, la chemiochina Cxcl3 appare un promettente nuovo bersaglio per la terapia del medulloblastoma, essendo in grado di contrastare questo complesso fenotipo difettivo Tis21-dipendente.
Claims (10)
- RIVENDICAZIONI 1. Chemiochina Cxcl3 per l’impiego nel trattamento terapeutico del medulloblastoma.
- 2. Chemiochina Cxcl3 secondo la rivendicazione 1, che à ̈ una proteina ricombinante.
- 3. Chemiochina Cxcl3 secondo la rivendicazione 1 o 2, che consiste della sequenza aminoacidica SEQ ID NO.1.
- 4. Chemiochina Cxcl3 secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 3, per l’impiego nel trattamento terapeutico del medulloblastoma in un paziente umano.
- 5. Vettore di espressione comprendente una sequenza nucleotidica codificante per una chemiochina Cxcl3 secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 4.
- 6. Vettore di espressione secondo la rivendicazione 5, comprendente una sequenza promotore e una sequenza segnale di poliadenilazione.
- 7. Vettore di espressione secondo la rivendicazione 6, in cui la sequenza nucleotidica codificante à ̈ SEQ ID NO.2.
- 8. Composizione farmaceutica per l’impiego nel trattamento terapeutico del medulloblastoma, comprendente una chemiochina Cxcl3 secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 3 e/o un vettore di espressione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 5 a 7, ed un veicolo, eccipiente(i) e/o diluente farmaceuticamente accettabile.
- 9. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 8, che à ̈ in una forma idonea alla somministrazione per via orale, sublinguale, buccale, rettale, intranasale, inalatoria, sottocutanea, intradermica, transcutanea, intravenosa, intraarteriosa, intramuscolare, intraperitoneale, intratecale o intracerebroventricolare.
- 10. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 8 o 9, in cui il paziente à ̈ umano.
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| EP (1) | EP2903633B1 (it) |
| IT (1) | ITTO20120858A1 (it) |
| WO (1) | WO2014053999A1 (it) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20120064089A1 (en) * | 2002-11-15 | 2012-03-15 | Morehouse School Of Medicine | Anti-cxcl16 and anti-cxcr6 antibodies for the prevention and treatment of cancer and cancer cell migration |
-
2012
- 2012-10-02 IT IT000858A patent/ITTO20120858A1/it unknown
-
2013
- 2013-10-02 EP EP13779637.1A patent/EP2903633B1/en active Active
- 2013-10-02 WO PCT/IB2013/059057 patent/WO2014053999A1/en active Application Filing
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20120064089A1 (en) * | 2002-11-15 | 2012-03-15 | Morehouse School Of Medicine | Anti-cxcl16 and anti-cxcr6 antibodies for the prevention and treatment of cancer and cancer cell migration |
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP2903633A1 (en) | 2015-08-12 |
| EP2903633B1 (en) | 2018-01-31 |
| WO2014053999A1 (en) | 2014-04-10 |
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