KR102061352B1 - 아넥신 1 항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 도 2a에 도시된 아미노산 서열을 갖는 인간 Anx-A1 단백질에 대해 유도된 특이적 결합 분자를 제공한다. 본 발명은 또한 T 세포 매개된 질환의 치료에서 이러한 특이적 결합 분자의 용도에 관한 것이다.

Description

아넥신 1 항체{ANNEXIN 1 ANTIBODY}
본 발명은 아넥신-A1에 결합하는 특이적 결합 분자, 특히 항체 및 이의 단편, 및 이러한 특이적 결합 분자를 생산하는 하이브리도마 세포주에 관한 것이다. 이러한 특이적 결합 분자는 T 세포 매개된 질환의 치료에 유용하다.
글루코코르티코이드(GC)는 선천 및 적응 면역 반응 둘 다를 동시에 차단하는 능력 때문에 다양한 만성 자가면역 질환의 치료에 빈번히 사용된다. 본 발명자들 및 다른 연구 그룹에 의한 지난 10년간의 연구에 의해 선천 면역 반응에 대한 GC의 염증 효과 중 일부가 아넥신-1(Anx-A1)으로 지칭되는 단백질에 의해 매개되는 것으로 밝혀졌다. 이 단백질은 호중구, 마크로파지 및 내피 세포를 포함하는 다수의 세포 유형에 대해 항상성 조절을 발휘하는 것으로 판명되었다. 그러나, 항상 무시되어 왔던 한 가지 양태는 적응 면역 반응에서의 Anx-A1의 역할이다. 이는 Anx-A1이 GC의 약물학적 효과의 2차 메신저 중의 하나로서 제안되었음을 고려하면 놀라운 것이다.
본 발명자들은 Anx-A1이 T 세포 수용체(TCR) 신호전달의 강도를 조절함으로써 T 세포에서 항상성 역할을 하고 있음을 이미 밝혀냈다[참조: D'Acquisto et al., Blood 109: 1095-1102, 2007].
추가로, 본 발명자들은 고도의 Anx-A1이 T 세포 활성화의 역치를 저하시키고 Th1 세포로의 분화를 조장하는 반면, Anx-A1 결핍 마우스는 T 세포 활성화 손상 및 Th2 세포로의 분화 증가를 나타냄을 밝혀냈다[참조: D'Acquisto et al., Eur. J. Immunol. 37: 3131-3142, 2007].
국제공개공보 제WO 2005/027965호는 아폽토틱(apoptotic) 호중구가 항염증 시그날을 수지상 세포로 전달하고 당해 과정을 간섭하는 항체를 확인하는 메카니즘의 발견을 기술하고 있다.
발명의 요약
본 발명자들은 임의의 세포독성 부작용 없이 T 세포 활성화의 특이적 억제와 관련하여 우수한 특성을 갖는 모노클로날 항체를 동정했다. 당해 항체는 T 세포 매개된 질환, 예를 들면, 류마티스성 관절염 또는 다발성 경화증의 치료에 유용하다.
따라서, 본 발명은 도 2a에 도시된 아미노산 서열을 갖는 인간 Anx-A1 단백질에 대해 유도된 특이적 결합 분자를 제공한다.
정의
본원에 사용된 바와 같이 "특이적 결합 분자"는 서로에 대해 결합 특이성을 갖는 분자 쌍의 구성원이다. 특이적 결합 쌍의 구성원은 자연적으로 유도되거나 전체적 또는 부분적으로 합성에 의해 생산될 수 있다. 분자 쌍의 하나의 구성원은 이의 표면 상에 소정 크기를 갖고, 이는 분자 쌍의 다른 구성원에 특이적으로 결합하여 이의 특정한 공간적 및 극성 조직에 상보성인 돌출부 또는 공강(cavity)일 수 있다. 따라서, 당해 쌍의 구성원은 서로 특이적으로 결합하는 특성을 갖는다. 특이적 결합 쌍의 유형 예는 항원-항체, 비오틴-아비딘, 호르몬-호르몬 수용체, 수용체-리간드, 효소-기질이다. 본 발명은 일반적으로 항원-항체 유형의 반응에 관한 것이다. 본 발명의 특이적 결합 분자는 다른 분자보다도 Anx-A1에 대해 보다 큰 친화성으로 결합하는데, 즉, 이는 Anx-A1에 특이적으로 결합한다. Anx-A1에 결합하는 특이적 결합 분자는 항-Anx-A1 항체 및 압타머(aptamer)를 포함한다. 본 발명의 특이적 결합 분자는 통상 항체이다. 본 발명의 항-Anx-A1 항체는 T 세포의 활성화를 차단함으로써 작용하고, 따라서, 투여되는 경우, 비정상 T 세포 활성화에 의해 통상 유발되는 T 세포 매개된 질환의 치료에 사용될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "항체"는 면역글로불린 분자, 및 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 부분, 즉, 자연적으로 생산되거나 부분적 또는 전체적으로 합성에 의해 생산되든지, 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 함유하는 분자를 지칭한다. 당해 용어는 또한, 항체 결합 도메인이거나 당해 도메인과 상동성인 결합 도메인을 갖는 임의의 폴리펩티드 또는 단백질을 포괄한다. 이들은 자연 공급원으로부터 유래되거나 부분적 또는 전체적으로 합성에 의해 생산될 수 있다. 항체는 2개의 동일한 중쇄, 및 중쇄보다 작은 2개의 동일한 경쇄(light chain)를 함유하는 폴리펩티드이다. 포유동물에는 2종류의 경쇄가 있으며, 이들은 람다(λ) 및 카파(κ)로 불리운다. 각각의 중쇄 및 각각의 경쇄는 가변 영역 및 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 가변 영역은 VH 영역으로 지칭되고, 경쇄 가변 영역은 VL 영역으로 지칭된다. 카파 경쇄의 경우, VL 영역은 또한 VK 영역으로 지칭될 수 있다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 각각 3개의 상보성 결정 영역(CDR), CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 이들은 각각 VLCDR1, VLCDR2, VLCDR3, VHCDR1, VHCDR2 및 VHCDR3으로 지칭된다. 항체의 예는 면역글로불린 이소형(예: IgG, IgE, IgM, IgD 및 IgA) 및 이들의 이소형 하부류; Fab, F(ab')2, Fv, scFv, dAb, Fd 등의 항원 결합 도메인을 포함하는 단편; 및 디아바디이다. 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날일 수 있다. 모노클로날 항체는 본원에서 "mAb"로서 언급될 수 있다.
아넥신은 칼슘- 및 인지질-결합 세포 단백질의 그룹이고, 또한 리포코르틴으로 공지되어 있다. 아넥신 계열은 아넥신 A1, 아넥신 A2 및 아넥신 A5를 포함하여 13개 구성원을 갖는다. 아넥신 A1은 또한 아넥신-1로서 공지되어 있고, 본원에서 "Anx-A1"로서 지칭된다. 아넥신-1(Anx-A1)은 37-kDa 단백질이고, 글루코코르티코이드 작용의 매개인자로서 본래 기재되었다. 지난 수년에 걸친 증거에 의해 Anx-A1은 T 세포 수용체(TCR) 신호전달의 강도를 조절함으로써 적응 면역계, 특히 T 세포에서 항상성 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. Anx-A1은 생체내에서 선천 면역계의 세포에서 염증의 내인성 하향-조절인자로서 작용한다. 도 1a는 Anx-A1의 3차원 구조를 나타내는 리본 다이어그램이다.
Anx-A1을 인코딩하는 8개 인간 뉴클레오티드 서열이 있다. 이들 중에서, 4개만이 해독되어 있고, 따라서 ANXA1-002, ANXA1-003, ANXA1-004 및 ANXA1-006으로 지정된 Anx-A1의 4개 이소형이 존재한다. 이들 서열은 엔젬블(Ensembl) 웹사이트(www.ensembl.org)에서 이용가능하고, OTTHUMT00000052664(ANXA1-002), OTTHUMT00000052665(ANXA1-003), OTTHUMT00000052666(ANXA1-004) 및 OTTHUMT00000052668(ANXA1-006)로서 지정되어 있다. 인간 아넥신-1(Anx-A1)의 한 이소형에 대한 아미노산 및 뉴클레오티드 서열은 도 2a에 도시되어 있다. 이소형 ANXA1-002, ANXA1-004 및 ANXA1-006의 아미노산 서열은 도 2b, 2c 및 2d에 각각 도시되어 있다. 도 2로부터 알 수 있는 바와 같이, 이소형 ANXA1-002, ANXA1-004 및 ANXA1-006은 ANXA1-003의 짧은 스플라이싱 변이체 또는 소수의 아미노산 변화를 갖는 ANXA1-003의 변이체이다.
다수의 연구들은 Ac.2-26으로 명명된 Anx-A1의 N-말단 펩티드가 전체 단백질의 생활성 대리인자로서 작용함을 밝혔다[참조: Lim et al., Proc Natl Acad Sci USA 95, 14535-9, 1998].
도 1b는 아넥신 반복체 및 이러한 생활성 서열의 위치의 개략도이다. 펩티드 Ac.2-26은 도 2에 도시된 Anx-A1의 전장 아미노산 서열 중의 아미노산 잔기 2-26의 서열을 갖는 아세틸화 펩티드이다. 펩티드 Ac.2-26의 서열은 도 1c에 도시되어 있고, 다음과 같다:
CH3CO-AMVSEFLKQAWFIENEEQEYVQTVK
Anx-A1 및 이의 N-말단 유도 생활성 펩티드는 포르밀 펩티드 수용체(FPR) 계열의 구성원을 통해 이들의 생물학적 효과를 매개한다. Anx-A1은 이러한 계열의 한 구성원, 즉 포르밀 펩티드 수용체 유사-1(FPRL-1)의 직접 결합 및 활성화에 의해 호중구 분출 및 선천 면역성에 대한 이의 길항(counterregulatory) 작용을 나타낸다. 본 발명자들은 hrAnx-A1의 존재하에 T 세포의 자극이 FPRL-1의 자극에 의해 T 세포 활성화를 증가시킴을 이미 밝혀냈다[참조: D'Acquisto et al., Blood 109: 1095-1102, 2007].
본 발명의 특이적 결합 분자는 아넥신-1(Anx-A1)에 결합한다. 특이적 결합 분자가 결합하는 Anx-A1은 도 2a에 도시된 폴리펩티드 서열을 갖는 인간 Anx-A1이다.
제1 양태에서, 본 발명은 도 2a에 도시된 아미노산 서열을 갖는 인간 Anx-A1 단백질에 대해 유도된 특이적 결합 분자를 제공한다.
본 발명의 이러한 양태는 또한, 본 발명의 제1 양태의 특이적 결합 분자의 상보성 결정 영역(CDR) VLCDR1, VLCDR2, VLCDR3, VHCDR1, VHCDR2 및 VHCDR3 또는 개개의 각 CDR과 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 특이적 결합 분자로 연장한다. 특이적 결합 분자는 통상 항체이다.
한 가지 양태에서, 특이적 결합 분자는, VLCDRl이 KASENVVTYVS이고, VLCDR2가 GASNRYT이고, VLCDR3이 GQGYSYPYT이고, VHCDRl이 GYTFTNYWIG이고, VHCDR2가 DIYPGGDYTNYNEKFKG이고, VHCDR3이 WGLGYYFDY인, 개개 아미노산 서열을 각각 갖는 상보성 결정 영역(CDR) VLCDR1, VLCDR2, VLCDR3, VHCDR1, VHCDR2 및 VHCDR3 또는 이와 적어도 70% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
CDR은 보존된 서열 정의[참조: Kabat et al in "Sequences of Proteins of Immunological Interest", Nat'l. Inst. Health, Bethesda, MD(1998)] 및 구조 정의[참조: Chothia and Lesk J. Mol Biol. 196:901-17(1987)]의 조합에 따라 지정된다. 나중에 이들 정의는 또한 문헌[참조: Carter et al, Proc Natl' Acad Sci USA. 89:4285-9(1992)]에 기재되어 있다.
본 발명은 또한 상기 언급된 펩티드 서열의 변이체로 연장한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "변이체"는 유사한 아미노산 서열을 갖고/갖거나 동일한 기능을 보유하는 단백질과 관련된다. 예를 들면, 용어 "변이체"는 하나 이상의 아미노산 부가, 결실, 치환 등을 포함하는 단백질 또는 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명의 변이체의 예는, 하나 이상의 다른 아미노산을 갖는 하나 이상의 아미노산의 치환과는 별도로, 상기 정의된 펩티드를 포함하는 융합 단백질 등의 단백질이다. 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 다양한 아미노산이 유사한 특성을 가짐을 인지한다. 소정 물질의 하나 이상의 이러한 아미노산은 당해 물질의 목적하는 활성을 제거하지 않고서 하나 이상의 기타 이러한 아미노산으로 종종 치환될 수 있다.
따라서, 아미노산 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신은 종종 서로 치환될 수 있다(지방족 측쇄를 갖는 아미노산). 이들 가능한 치환 중에서, 글리신 및 알라닌을 서로간의 치환에 사용하고(이들은 비교적 짧은 측쇄를 갖기 때문에), 발린, 류신 및 이소류신을 서로간의 치환에 사용하는 것(이들은 소수성의 보다 긴 지방족 측쇄를 갖기 때문에)이 바람직하다. 서로간에 빈번히 치환될 수 있는 다른 아미노산은 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판(방향족 측쇄를 갖는 아미노산); 리신, 아르기닌 및 히스티딘(염기성 측쇄를 갖는 아미노산); 아스파르테이트 및 글루타메이트(산성 측쇄를 갖는 아미노산); 아스파라긴 및 글루타민(아미드 측쇄를 갖는 아미노산); 및 시스테인 및 메티오닌(황 함유 측쇄를 갖는 아미노산)을 포함한다.
이러한 성질의 치환은 "보존적" 또는 "반-보존적" 아미노산 치환으로 종종 지칭된다. 따라서, 본 발명은, 상기한 아미노산 서열을 갖지만 CFR의 아미노산 서열이 상기 서열과 적어도 70% 동일성을 갖도록 CDR 중에 하나 이상의 보존적 치환을 갖는 CDR을 포함하는 특이적 결합 분자로 연장한다. 예를 들면, 개개 CDR은 상기 기재된 CDR의 아미노산 서열과 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 보존적 치환(CDR에 따라)을 가질 수 있다. 예를 들면, 상기한 VLCDR1의 아미노산 서열에는 1, 2 또는 3개의 보존적 치환이 존재할 수 있고, 상기한 VLCDR2의 아미노산 서열에는 1 또는 2개의 보존적 치환이 존재할 수 있고, 상기한 VLCDR3의 아미노산 서열에는 1 또는 2개의 보존적 치환이 존재할 수 있고, 상기한 VHCDR1의 아미노산 서열에는 1, 2 또는 3개의 보존적 치환이 존재할 수 있고, 상기한 VHCDR2의 아미노산 서열에는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 보존적 치환이 존재할 수 있고, 상기한 VHCDR3의 아미노산 서열에는 1, 2 또는 3개의 보본적 치환이 존재할 수 있고, 당해 서열은 상기한 CDR 서열에 대해 적어도 70% 동일성을 보유할 것이다.
3문자 및 1문자 코드를 사용하여 아미노산을 다음과 같이 지칭할 수 있다: 글리신(G 또는 Gly), 알라닌(A 또는 Ala), 발린(V 또는 Val), 류신(L 또는 Leu), 이소류신(I 또는 Ile), 프롤린(P 또는 Pro), 페닐알라닌(F 또는 Phe), 티로신(Y 또는 Tyr), 트립토판(W 또는 Trp), 리신(K 또는 Lys), 아르기닌(R 또는 Arg), 히스티딘(H 또는 His), 아스파르트산(D 또는 Asp), 글루탐산(E 또는 Glu), 아스파라긴(N 또는 Asn), 글루타민(Q 또는 Gln), 시스테인(C 또는 Cys), 메티오닌(M 또는 Met), 세린(S 또는 Ser) 및 트레오닌(T 또는 Thr). 잔기가 아스파르트산 또는 아스파라긴인 경우, 약어 Asx 또는 B를 사용할 수 있다. 잔기가 글루탐산 또는 글루타민인 경우, 약어 Glx 또는 Z를 사용할 수 있다. 달리 명시되지 않는 한, 아스파르트산에 대한 언급은 아스파르테이트를 포함하고, 글루탐산에 대한 언급은 글루타메이트를 포함한다.
아미노산 결실 또는 삽입이 또한 상기 언급된 융합 단백질 등의 단백질의 아미노산 서열에 대해 이루어질 수 있다. 따라서, 예를 들면, 폴리펩티드 활성에 대해 실질적인 영향을 미치지 않거나 이러한 활성을 적어도 제거하지 않은 아미노산이 결실될 수 있다. 이러한 결실은 활성을 여전히 유지하면서 폴리펩티드의 전장 및 분자량을 감소시킬 수 있기 때문에 유리할 수 있다. 이는 특정한 목적에 요구되는 폴리펩티드의 양을 감소시킬 수 있고, 예를 들면, 복용량 수준을 감소시킬 수 있다.
상기 융합 단백질의 서열에 대한 아미노산 삽입이 또한 이루어질 수 있다. 이는 본 발명의 물질의 특성을 변화시키기 위해 수행될 수 있다(예를 들면, 융합 단백질과 관련하여 상기 설명한 바와 같이 동정, 정제 또는 발현을 보조하기 위해).
상기 제공된 서열에 대한 아미노산 변화는 임의의 적합한 기술, 예를 들면, 부위 지시된 돌연변이유발 또는 고체상 합성을 사용하여 이루어질 수 있다.
본 발명의 범위 내의 아미노산 치환 또는 결실은 자연 발생 또는 비자연 발생 아미노산을 사용하여 이루어질 수 있음을 이해해야 한다. 자연 또는 합성 아미노산이 사용되거나 사용되지 않든지, L-아미노산만이 존재하는 것이 바람직하다.
당해 기술분야에 공지된 "동일성"은, 서열을 비교하여 결정된, 2개 이상의 폴리펩티드 서열 또는 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 관계이다. 당해 기술분야에서, 동일성은 또한, 이 경우가 그러한 바와 같이, 이러한 서열의 스트링 사이의 합치에 의해 결정되는, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 서열 관련성 정도를 의미한다. 2개 폴리펩티드 또는 2개 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 동일성을 결정하는 방법이 다수 존재하지만, 동일성을 결정하는데 통상 사용된 방법은 컴퓨터 프로그램으로 편성된다. 2개 서열 사이의 동일성을 결정하기 위한 바람직한 컴퓨터 프로그램은, 이로써 한정되는 것은 아니지만, GCG 프로그램 팩키지[참조: Devereux, et al., Nucleic Acids Research, 12, 387(1984), BLASTP, BLASTN, 및 FASTA(Atschul et al., J. Molec. Biol. 215, 403(1990)]를 포함한다.
아미노산 서열을 비교하기 위해 CLUSTAL 프로그램과 같은 프로그램을 사용할 수 있다. 이 프로그램은 아미노산 서열을 비교하고, 적절한 어느 서열에 공간을 삽입하여 최적 정렬을 찾는다. 최적 정렬을 위해 아미노산 동일성 또는 유사성(아미노산 유형의 동일성 + 보존)을 계산할 수 있다. BLASTx와 같은 프로그램은 유사한 서열의 최장 연장을 정렬하고 소정 값을 적합성에 대해 지정한다. 따라서, 각각 상이한 스코어를 갖는 몇몇 유사성 영역이 발견되는 소정 비교를 수득할 수 있다. 두 유형의 모두의 동일성 분석이 본 발명에서 고려된다.
2개 아미노산 서열 또는 2개 핵산 서열의 동일성(%)은 최적 비교 목적을 위해 당해 서열을 정렬시키고(예를 들면, 당해 서열과의 최상의 정렬을 위해 갭을 첫번째 서열에 도입할 수 있다) 상응하는 위치에서 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드를 비교함으로써 결정된다. "최상의 정렬"은 최고 동일성 퍼센트(%)를 제공하는 2개 서열의 정렬이다. 동일성 퍼센트(%)는 비교되는 서열에서 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드 수에 의해 결정된다(즉, 동일성(%) = 동일한 위치 수/전체 위치 수 ×100).
2개 서열 사이의 동일성 퍼센트(%)의 측정은 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 공지된 수학적 알고리즘을 사용하여 달성할 수 있다. 2개 서열을 비교하는 수학적 알고리즘의 예는 문헌[참조: Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, 이의 변형으로서 Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877]의 알고리즘이다. 알츠출 등[참조: Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410]의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램은 이러한 알고리즘을 도입했다. BLAST 뉴클레오티드 탐색을 NBLAST 프로그램(스코어 = 100, 단어 길이(wordlength) = 12)로 수행하여 본 발명의 핵산 분자에 상동성인 뉴클레오티드 서열을 수득할 수 있다. BLAST 단백질 탐색을 XBLAST 프로그램(스코어 = 50, 단어 길이 = 3)으로 수행하여 본 발명의 단백질 분자에 상동성인 아미노산 서열을 수득할 수 있다. 비교 목적으로 갭이 있는 정렬을 수득하기 위해, 갭이 있는 BLAST를 문헌[참조: Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402]에 기재된 바와 같이 사용할 수 있다. 또는, PSI-Blast를 사용하여, 분자 사이의 거리 관계(Id.)를 검색하는 반복 탐색을 실시할 수 있다. BLAST, 갭이 있는 BLAST 및 PSI-Blast 프로그램을 사용하는 경우, 각 프로그램(예: XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미터를 사용할 수 있다.[참조: http://www.ncbi.nlm.nih.gov]. 서열 비교에 사용된 수학적 알고리즘의 또 다른 예는 문헌[참조: Myers and Miller, CABIOS (1989)]의 알고리즘이다. CGC 서열 정렬 소프트웨어 팩키지인 ALIGN 프로그램(버젼 2.0)은 이러한 알고리즘을 도입했다. 당해 기술분야에 공지된 서열 분석용 기타 알고리즘은 문헌[참조: Torellis and Robotti (1994) Comput. Appl. Biosci., 10 :3-5]에 기재된 바와 같은 ADVANCE 및 ADAM 및 문헌[참조: Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-8]에 기재된 바와 같은 FASTA를 포함한다. FASTA에서, ktup은 민감성 및 탐색 속도를 설정하는 조절 옵션이다.
통상적으로, 본 발명의 특이적 결합 분자의 CDR의 아미노산 서열은, 상기된 CDR의 아미노산 서열에 대해 아미노산 수준에서 HGMP(Human Genome Mapping Project)에 의해 제공된 BLAST 컴퓨터 프로그램[참조: Atschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403-410(1990)]의 디폴트 파라미터를 사용하여 적어도 70% 동일성을 갖는다. 보다 전형적으로, CDR 서열은 상기 제시된 서열에 대해 아미노산 수준에서 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는다. 전형적으로, 본 발명의 특이적 결합 분자의 CDR 서열 각각은 상기한 CDR의 아미노산 서열에 대해 이러한 수준의 동일성을 갖는다. 또는, 본 발명의 특이적 결합 분자의 임의의 1, 2, 3, 4 또는 5개는 상기한 CDR의 아미노산 서열에 대해 이러한 수준의 동일성을 갖는다.
본 발명의 특이적 결합 분자는 전형적으로 항체, 보다 전형적으로 모노클로날 항체이다. 한 가지 양태에서, 본 발명의 모노클로날 항체는 인간화된 것이다.
본 발명의 모노클로날 항체는 항체의 아미노산 서열을 변형시킴으로써 인간화될 수 있다. 본 발명의 특이적 결합 분자의 면역원성을 감소시키는 방법은, 예를 들면, 부위 지시된 돌연변이유발 또는 기타 통상 사용된 분자 생물학 기술[참조: Roguska et all Protein Eng. 9 895-904(1996)]에 의해 적합한 항체 골격 스캐폴드 상으로의 CDR 그래프팅 또는 가변 표면 잔기 리모델링을 포함할 수 있다.
적용가능한 기타 방법은 분자 내에서 잠재적 T-세포 에피토프의 동정 및, 예를 들면, 부위 지시된 돌연변이유발에 의한 이들의 후속적 제거(탈면역화)를 포함한다. 특이적 결합 분자의 인간화는 당해 분자가 치료제로서 사용되어야 하는 경우에 바람직할 수 있다. CDR 영역 또는 주변 골격의 인간화는 필요에 따라 수행할 수 있다.
본래 항체의 특이성을 보유하는 기타 항체 또는 키메라 분자를 생산하기 위해 모노클로날 및 기타 항체를 취하고 재조합 DNA 기술의 기술을 사용할 수 있다. 이러한 기술은 항체의 면역글로불린 가변 영역 또는 상보성 결정 영역(CDR)을 인코딩하는 DNA를 상이한 면역글로불린의 불변 영역 또는 불변 영역 + 골격 영역에 도입하는 것을 수반할 수 있다[참조: EP-A-184187, GB 2188638A 또는 EP-A-239400]. 항체를 생산하는 하이브리도마 또는 기타 세포는 유전자 돌연변이 또는 기타 변화로 처리할 수 있고, 이는 생산된 항체의 결합 특이성을 변경하거나 변경하지 않을 수 있다.
항체는 여러가지 방법으로 변형시킬 수 있기 때문에, 용어 "항체"는 요구된 특이성을 갖는 결합 도메인을 갖는 임의의 특이적 결합 구성원 또는 물질을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 따라서, 이 용어는, 자연적이든지 또는 전체 또는 부분적으로 합성적이든지, 면역글로불린 결합 도메인을 포함하는 임의의 폴리펩티드를 포함하여, 항체 단편, 유도체, 항체의 기능적 등가물 및 동족체, 인간화된 항체를 포함한다. 따라서, 또 다른 폴리펩티드와 융합된 면역글로불린 결합 도메인 또는 등가물을 포함하는 키메라 분자가 포함된다. 키메라 항체의 클로닝 및 발현은 유럽 특허 출원 제0120694호 및 유럽 특허 출원 제0125023호에 기재되어 있다. 인간화된 항체는 비인간(예: 쥐) 항체의 가변 영역과 인간 항체의 불변 영역을 갖는 변형된 항체일 수 있다. 인간화된 항체를 제조하는 방법은, 예를 들면, 미국 특허 제5225539호에 기재되어 있다.
본 발명의 특이적 결합 분자는 항체의 단편일 수 있다. 전체 항체의 단편은 결합 항원의 기능을 수행할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 결합 단편의 예는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fab 단편; (ii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iii) 단일 항체의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (iv) Vh 도메인으로 이루어진 dAb 단편[참조: Ward, E.S. et al., Nature 341:544-546(1998)]; (v) 분리된 CDR 영역; (vi) F(ab')2 단편, 2개의 연결된 Fab 단편을 포함하는 이가 단편; (vii) 단일쇄 Fv 분자(scFv)(여기서, Vh 도메인 및 VL 도메인은, 2개 도메인을 결합시켜 항원 결합 부위를 형성하는 펩티드 링커에 의해 연결된다)[참조: Bird et al., Science 242:423-426 (1998); Huston et al., PNAS USA 85:5879-5883)]; (viii) 이특이적 단일쇄 Fv 다이머(PCT/US92/09965) 및 (ix) "디아바디", 유전자 융합에 의해 작제된 다가 또는 다중특이적 단편[참조: WO94/13804; P. Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448(1993)]. 전형적으로, 당해 단편은 Fab, F(ab')2 또는 Fv 단편 또는 scFv 분자이다.
디아바디(diabody)는 폴리펩티드의 다량체이고, 여기서 각 폴리펩티드는 면역글로불린 경쇄의 결합 영역을 포함하는 제1 도메인 및 면역글로불린 중쇄의 결합 영역을 포함하는 제2 도메인을 포함하고, 2개 도메인은 연결(예: 펩티드 링커에 의해)되어 있지만, 서로 결합되어 항원 결합 부위를 형성할 수는 없다: 항원 결합 부위는 다량체 내의 한 폴리펩티드의 제1 도메인과 다량체 내의 또 다른 폴리펩티드의 제2 도메인과의 결합에 의해 형성된다(WO94/13804).
이특이적 항체가 사용되어야 하는 경우, 이들은 다양한 방식[참조: Bollinger & Winter, Current Opinion Biotechnol. 4:446-449(1993)]으로 제조, 예를 들면, 화학적으로 또는 하이브리드 하이브리도마로부터 제조될 수 있거나 상술한 임의의 이특이적 항체 단편일 수 있는 통상의 이특이적 항체일 수 있다. 완전 항체보다 scFv 다이머 또는 디아바디를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 디아바디 및 scFv는 가변 도메인만을 사용하여 잠재적으로 항-유전자형 반응의 효과를 감소시킴으로써 Fc 영역 없이 작제할 수 있다. 다른 형태의 이특이적 항체는 문헌[참조: Traunecker et al., EMBO Journal 10:3655-3659(1991)]에 기재된 단일쇄 "야누신(Janusin)"을 포함한다.
또한, 이특이적 완전 항체와는 대조적으로, 이특이적 디아바디가 유용할 수 있는데, 이는 이들이 용이하게 작제되고 이. 콜라이(E. coli)에서 발현될 수 있기 때문이다. 적절한 결합 특이성을 갖는 디아바디(및 항체 단편 등의 다수의 기타 폴리펩티드)는 라이브러리로부터 파지 디스플레이(WO94/13804)를 사용하여 용이하게 선택될 수 있다. 예를 들면, 항원 X에 대해 유도된 특이성을 갖는 디아바디의 하나의 암(arm)이 일정하게 유지되어야 하는 경우, 다른 암이 변화되고 적절한 특이성의 항체가 선택되는 라이브러리가 제조될 수 있다.
모노클로날 항체 VJ-4B6은 부다페스트 조약하에 유럽 세포 배양 보관 기관(European Collection of Cell Cultures(ECACC), Health Protection Agency, Centre for Emergency Preparedness and Response, Porton Down, Salisbury, SP4 0JG, United Kingdom)에 2010년 6월 3일자로 기탁되어 수탁번호 10060301로 지정된 하이브리도마 세포주 VJ-4B6-E5-B10-D4에 의해 분비된다.
기탁은 풀비오 다퀴스토(Fulvio D'Acquisto, Queen Mary and Westfield College, Centre for Biochemical Pharmacology, Charterhouse Square, London EC1M 6BQ)에 의해 이루어졌다. 기탁자는 출원인에게 본원에서 기탁 재료를 인용하는 것에 권한을 부여하였고, 유럽 특허 조약 Rule 31(1)(d)에 따라 기탁된 재료가 공중에게 이용가능해지는 것에 대한 그의 무조건적 및 취소불가능한 동의를 제공했다.
하이브리도마 세포주 VJ-4B6-E5-B10-D4는 아넥신-A1에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체 VJ-4B6을 생산한다. 본 발명의 모노클로날 항체 VJ-4B6은 IgG2b 이소형의 것이다.
항체 VJ-4B6은 도 2a에 도시된 아미노산 서열을 갖는 전장 인간 Anx-A1 단백질에 대해 유도되었다.
항체 VJ-4B6의 경쇄 가변 영역의 DNA 및 아미노산 서열은 도 11에 도시되어 있다. 도 12는 CDR 주석과 함께 VJ-4B6의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 나타낸다. 도 12는 또한 VJ-4B6의 경쇄 불변 영역의 제1 몇몇 아미노산을 나타낸다.
항체 VJ-4B6의 중쇄 가변 영역의 DNA 및 아미노산 서열은 도 13에 도시되어 있다. 도 14는 CDR 주석과 함께 VJ-4B6의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 나타낸다. 도 14는 또한 VJ-4B6의 중쇄 불변 영역의 제1 몇몇 아미노산을 나타낸다.
항체 VJ-4B6의 CDR은 다음과 같다:
VLCDR1은 KASENVVTYVS이고,
VLCDR2는 GASNRYT이고,
VLCDR3은 GQGYSYPYT이고,
VHCDR1은 GYTFTNYWIG이고,
VHCDR2는 DIYPGGDYTNYNEKFKG이고,
VHCDR3은 WGLGYYFDY이다.
본 발명은 본원에 기재된 항체 VJ-4B6의 CDR을 갖는 특이적 결합 분자, 및 또한 본원에 기재된 항체 VJ-4B6의 하나 이상의 CDR과 적어도 70% 동일성을 갖는 CDR을 갖는 특이적 결합 분자로 연장한다.
본 발명은 또한 항체 VJ-4B6의 경쇄 가변 영역, 중쇄 가변 영역, 또는 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역 둘 다를 갖는 특이적 결합 분자로 연장한다.
특정한 양태에서, 본 발명은 따라서 도 11 및/또는 도 13에 도시된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 본 발명의 제1 양태에 따르는 특이적 결합 분자를 제공한다.
본 발명의 이러한 양태는 또한, 도 11에 도시된 아미노산 서열의 경쇄 가변 영역 및/또는 도 13에 도시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 함유하는 특정 항체 단편으로 연장한다. 예를 들면, 이러한 양태는 Fab, F(ab')2 또는 Fv 단편 및 scFv 분자로 연장한다.
본 발명은 또한 도 12 및/또는 도 14에 도시된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 본 발명의 제1 양태에 따르는 특이적 결합 분자를 포함한다.
특정한 양태에서, 본 발명은 2010년 6월 3일에 유럽 세포 배양 보관 기관(ECACC)에 수탁번호 10060301로 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생산된 본 발명의 제1 양태에 따르는 특이적 결합 분자를 제공한다.
제2 양태에서, 본 발명은 도 2a에 도시된 아미노산 서열을 갖는 인간 Anx-A1 단백질에 대해 유도된 특이적 결합 분자를 생산하는 하이브리도마 세포주를 제공한다.
특정한 양태에서, 본 발명은 2010년 6월 3일에 유럽 세포 배양 보관 기관(ECACC)에 수탁번호 10060301로 기탁된 본 발명의 제2 양태에 따르는 하이브리도마 세포주를 제공한다.
제3 양태에서, 본 발명은 본 발명의 특이적 결합 분자를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 이러한 양태에 따르는 조성물은 임의의 통상의 경로로 사용하기 위해 제형화될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 본 발명의 특이적 결합 분자 이외에 통상 약학으로 허용가능한 담체, 부형제, 희석제, 보조제, 비히클, 완충제 또는 안정화제를 포함할 것이다. 이러한 담체는, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 염수, 완충 염수, 덱스트로즈, 리포좀, 물, 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜, 에탄올 및 이들의 배합물을 포함한다. 이러한 약학적 조성물은 이를 환자에게 투여하는 목적하는 방법에 따라 임의의 적합한 형태로 존재할 수 있다.
이는 단위 용량 형태로 제공될 수 있고, 일반적으로 밀봉 용기로 제공될 것이며, 키트의 일부로서 제공될 수 있다. 이러한 키트는 통상(필수적인 것은 아니지만) 사용 지침을 포함할 것이다. 이는 복수의 상기 단위 용량 형태를 포함할 수 있다.
약학적 조성물은 임의의 적절한 경로, 예를 들면, 경구(구강 또는 설하 포함), 직장내, 비내, 국소(구강, 설하 또는 경피 포함), 질내 또는 비경구(피하, 근육내, 정맥내 또는 경피 포함) 경로에 의한 투여로 적용될 수 있다. 이러한 조성물은 약학 분야에 공지된 임의의 방법, 예를 들면, 활성 성분을 멸균 조건하에 담체(들) 또는 부형제(들)와 혼합함으로써 제조할 수 있다.
경구 투여에 적용된 약학적 조성물은 캡슐 또는 정제 등의 분리 단위로서; 산제 또는 과립으로서; 용액, 시럽 또는 현탁액(수성 또는 비수성 액체 중; 또는 식용 폼(foam) 또는 휩(whips)으로서; 또는 에멀젼으로서)으로 제공할 수 있다.
정제 또는 경질 젤라틴 캡슐제에 적합한 부형제는 락토즈, 옥수수 전분 또는 이의 유도체, 스테아르산 또는 이의 유도체를 포함한다.
연질 젤라틴 캡슐제에서 사용하기에 적합한 부형제는, 예를 들면, 식물유, 왁스, 지방, 반고체 또는 액체 폴리올 등을 포함한다.
액제 및 시럽제를 제조하기 위해, 사용될 수 있는 부형제는, 예를 들면, 물, 폴리올 및 당을 포함한다. 현탁제를 제조하기 위해, 오일(예: 식물유)를 사용하여 수중유 또는 유중수 현탁제를 제공할 수 있다.
경피 투여에 적당한 약학적 조성물은 장기간에 걸쳐 수용자의 표피와 친밀한 접촉 상태로 유지하도록 의도된 분리 패치로서 제공할 수 있다. 예를 들면, 활성 성분은 문헌[참조: Pharmaceutical Research, 3(6):318 (1986)]에 일반적으로 기재된 바와 같이 이온삼투요법에 의해 패치로부터 전달될 수 있다.
국소 투여에 적당한 약학적 조성물은 연고, 크림, 현탁제, 로션, 분말, 용액, 페이스트, 겔, 스프레이, 에어로졸 또는 오일로서 제형화될 수 있다. 눈 또는 기타 외부 조직, 예를 들면, 입 및 피부 감염의 경우, 당해 조성물은 바람직하게는 국소 연고 또는 크림으로서 적용된다. 연고로 제형화되는 경우, 활성 성분은 파라핀 또는 수혼화성 연고 기재와 함께 사용될 수 있다. 또는, 활성 성분은 수중유 크림 기재 또는 유중수 기재와 함께 크림으로 제형화될 수 있다. 눈에의 국소 투여에 적당한 약학적 조성물은 점안약을 포함하고, 여기서 활성 성분은 적합한 담체, 특히 수성 용매에 용해되거나 현탁된다. 입 속의 국소 투여에 적당한 약학적 조성물은 로젠지, 방향제 및 구강 세척제를 포함한다.
직장 투여에 적당한 약학적 조성물은 좌제 또는 관장제로서 제공할 수 있다.
담체가 고체인 비내 투여에 적당한 약학적 조성물은 입자 크기가, 예를 들면, 20 내지 500μ 범위인 조악한 분말을 포함하고, 이는 코가 들이마시는 방식, 즉 코에 인접하여 유지된 분말 용기로부터 비강 통로를 통한 신속한 흡입에 의해 투여된다. 비내 분무제 또는 비내 점액제로서 투여하기 위한, 담체가 액체인 적합한 조성물은 활성 성분의 수성 또는 유성 용액을 포함한다.
흡입에 의한 투여에 적당한 약학적 조성물은 미립자 분진 또는 미스트를 포함하고, 이는 다양한 형태의 계량 용량의 가압 에어로졸, 분무기 또는 취입기에 의해 생성될 수 있다.
질내 투여에 적당한 약학적 조성물은 페서리, 탐폰, 크림, 겔, 페이스트, 폼 또는 분무 제형으로서 제공될 수 있다.
비경구 투여에 적당한 약학적 조성물은 당해 제형을 의도된 수용자의 혈액과 실질적으로 등장성으로 되게 하는 항산화제, 완충제, 세균발육저지제 및 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 주사액; 및 현탁화제 및 증점제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액을 포함한다. 주사가능한 용액에 사용될 수 있는 부형제는, 예를 들면, 물, 알콜, 폴리올, 글리세린 및 식물유를 포함한다. 당해 조성물은 단위 용량 또는 복수 용량 용기, 예를 들면, 밀봉된 앰플 및 바이알로 제공될 수 있고, 사용 직전에 운반된 멸균 액체, 예를 들면, 주사용수의 첨가만을 필요로 하는 동결 건조된(동결건조) 조건하에 저장될 수 있다. 즉시 주사액 및 현탁액은 멸균 분말, 과립 및 정제로부터 제조할 수 있다.
약학적 조성물은 방부제, 가용화제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 감미제, 착색제, 방향제, 염(본 발명의 물질은 자체로 약학으로 허용가능한 염 형태로 제공될 수 있다), 완충제, 피복제 또는 산화방지제를 함유할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 본 발명의 분자 이외에 하나 이상의 기타 치료학적 활성제를 또한 함유할 수 있다.
일부 양태에서, 활성 약물 농축물 제형은 약학으로 허용가능한 긴장제(tonicity agent), 완충제 및 약학으로 허용가능한 계면활성제를 포함할 수 있다.
또는, 당해 제형은, 임의로 약 6.0 내지 7.0, 예를 들면, 대략 6.5로 조정된 pH를 갖는, 활성 성분과 인산나트륨, 일염기성, 인산나트륨 이염기성, 염화나트륨, 폴리솔베이트 80 또는 폴리솔베이트 20(진탕 유도된 응집의 위험을 최소화하기 위한 계면활성제) 및 물(USP/Ph.Eur)을 포함할 수 있다.
활성 약물 농축물은 동결건조되거나 동결건조되지 않을 수 있다.
다른 제형은 완충제로서 나트륨 아세테이트 삼수화물, 긴장성 개질제로서 염화나트륨, pH 조절을 위한 아세트산, 및 주사용수를 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물의 용량은 치료되는 질환 또는 질병, 치료되는 개인의 연령 및 증상 등에 따라 광범위하게 달라질 수 있고, 주치의가 사용되는 적절한 용량을 최종적으로 결정할 것이다.
이러한 투약은 적절한 경우 빈번히 반복될 수 있다. 부작용이 발생하는 경우, 투약량 및/또는 투약 빈도는 통상의 임상적 실시에 따라 감소시킬 수 있다.
포유동물, 특히 인간에게 투여하기 위해, 활성제의 1일 용량은 1㎍/체중 kg 내지 10mg/체중 kg, 전형적으로 대략 10㎍/체중 kg 내지 1mg/체중 kg 일 것이다. 임의의 경우의 주치의는, 개인의 연령, 체중, 성별 및 반응을 포함하는 요인들에 좌우될 수 있는, 개인에게 가장 적합할 수 있는 실제 용량을 결정할 것이다. 상기 용량은 평균 경우의 예이다. 물론, 보다 높거나 낮은 용량이 유용한 경우도 있고, 이는 본 발명의 범위 내에 포함된다.
본 발명의 특이적 결합 분자는 의약, 예를 들면, T 세포 매개된 질환의 치료에 사용될 수 있다.
제4 양태에서, 본 발명은 따라서 의약에서 사용하기 위한 본 발명의 특이적 결합 분자를 제공한다.
제5 양태에서, 본 발명의 T 세포 매개된 질환의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 특이적 결합 분자를 제공한다. 본 발명의 이러한 양태는 따라서 또한, 본 발명의 특이적 결합 분자를 대상체에게 투여함을 포함하는, 대상체, 통상 이를 필요로 하는 대상체에서 T 세포 매개된 질환을 치료하는 방법을 포함한다. 따라서, 본 발명은 또한 T 세포 매개된 질환의 치료에 사용하기 위한 의약의 제조에서 본 발명의 특이적 결합 분자의 용도 또는 달리는 T 세포 매개된 질환을 치료하기 위한 의약의 제조에서 본 발명의 특이적 결합 분자의 용도로 연장한다. 치료 방법은 인간 또는 동물 대상체에게 이루어질 수 있고, 본 발명은 인간 및/또는 가축 의약에서의 용도로 동등하게 연장한다. 본 발명의 특이적 결합 분자는 바람직하게는 "치료학적 유효량"으로 개인에게 투여과고, 이러한 양은 개인에게 잇점을 나타내기에 충분하다. 본원에 사용된 바와 같이, "치료"는 인간 또는 비인간 동물, 바람직하게는 포유동물에게 유익할 수 있는 임의의 섭생을 포함한다. 당해 치료는 존재하는 증상과 관련할 수 있거나 예방적(예방적 치료)일 수 있다.
본 발명의 이러한 양태에서, 본 발명은 T 세포에 의해 매개되는 다양한 범위의 질환의 치료에 사용될 수 있다. 본 문맥에서, "T 세포 매개된 질환"은 T 세포가 질환 또는 상태의 발병 또는 발생에서 중요한 역활을 하는 임의의 질환 또는 상태를 의미한다. T 세포 매개된 질환은 통상적으로 비정상 T 세포 활성화에 의해 유발된다. 따라서, 이러한 질환은 Anx-A1의 활성을 차단하여 T 세포의 활성화를 방지함으로써 치료될 수 있고, 이는 본원에서 입증된 바와 같이 모노클로날 항체 VJ-4B6에 의해 수행될 수 있다. 전형적으로, 본 발명에서 치료된 T 세포 매개된 질환은 Th1 세포가 중요한 역할을 하는 질환이다.
T 세포 매개된 질환은, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 이식편 대 숙주 질환, 이식편 거부, 아테롬성 동맥경화증, HIV 및/또는 AIDS, 건선, 유산 및 일부 자가면역 질환을 포함한다. 본 발명에 따라 치료될 수 있는 자가면역 질환은 류마티스성 관절염(RA), 다발성 경화증(MS), 전신 홍반성 낭창(SLE), 애디슨(Addison) 질환, 그레이브(Grave) 질환, 경피증, 다발성근염, 당뇨병 및 특히 일부 형태의 진성당뇨병(예: 연소자형 당뇨병), 자가면역 포도막염, 궤양성 대장염, 심상성 천포창, 염증성 장 질환, 자가면역 갑상선염, 포도막염, 베쳇트 질환 및 소그렌 증후군을 포함한다. T 세포 매개된 질환은 전형적으로 류마티스성 관절염, 다발성 경화증, 및 전신 홍반성 낭창(SLE), 아테롬성 동맥경화증, HIV, AIDS 또는 건선이다. 보다 전형적으로, T 세포 매개된 질환은 류마티스성 관절염 또는 다발성 경화증이다.
본원에 정의된 바와 같은 T 세포 매개된 질환은 또한 유산을 포함한다. 본원에 정의된 바와 같이, 치료는 예방적(예방적 치료)일 수 있다. 따라서, 본 발명의 특이적 결합 분자를 사용하여 유산을 예방할 수 있다. 비조절된 Th1 반응은 유산과 관련되는 것으로 공지되어 있고, Th2 반응의 증가는 임신을 조장한다.
T 세포 매개된 질환은 전형적으로 류마티스성 관절염이다. 류마티스성 관절염(RA)에서, T 세포는 활막에서 항원 제시 세포를 인지하고 이와 상호작용하는 것으로 생각된다. 활성화되면, 이들 세포는 사이토킨 및 작동체 분자를 생성하고, 사이토킨의 이러한 순차 확장된 생성은 "사이토킨 캐스케이트"를 구성하고, 이는 마크로파지의 활성화 및 염증 과정의 유도를 유발하여 연골 및 골의 분해 및 흡수를 유도한다. 시간이 경과함에 따라, 골 침식, 연골의 파괴 및 관절 통합성의 완전한 소실이 발생할 수 있다. 결국, 복합 기관 시스템이 영향을 받을 수 있다.
다른 양태에서, T 세포 매개된 질환은 다발성 경화증(MS)이다.
다른 양태에서, T 세포 매개된 질환은 아테롬성 동맥경화증이다. 염증은 관상 동맥 질환 및 아테롬성 동맥경화증의 기타 징후에서 중요한 역할을 한다. 면역 세포는 초기 아테롬성 동맥경화증 병변을 지배하고, 이들의 작동체 분자는 당해 병변의 진행을 촉진시키며, 염증의 활성화는 급성 관상 증후군을 유도할 수 있다. 적응 면역성은 아테롬성 동맥경화증과 고도로 관련되어 있는데, 이는 대사 위험 인자와 상호작용하여 동맥 트리 내의 병변을 개시, 전파 및 활성화시키는 것으로 밝혀졌기 때문이다.
다른 양태에서, T 세포 매개된 질환은 전신 홍반성 낭창(SLE)이다.
Th1 세포의 분화를 조장하는 Anx-A1의 능력과 관련하여, 본 발명은 또한, 예를 들면, 세포내 병원체에 대한 비조절된 보호적 세포(Th1) 반응을 제한하기 위해 및 Th1 분화를 억제하고 Th2 분화를 조장함으로써 세포외 감염(Th2 반응)을 치료하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 제2 및 후속 양태에 대한 바람직한 특징은 제1 양태에 대한 것을 준용한다.
한 가지 양태에서, 본 발명은 도 2a에 도시된 아미노산 서열을 갖는 전장 인간 Anx-A1 단백질에 대해 유도된 특이적 결합 분자를 제공한다.
이러한 특이적 결합 분자의 한 가지 예는 2010년 6월 3일에 유럽 세포 배양 보관 기관(ECACC)에 수탁번호 10060301로 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생산된 모노클로날 항체 VJ-4B6이다.
한 가지 양태에서, 본 발명은 하기 아미노산 서열을 갖는 모노클로날 항체 VJ-4B6의 CDR을 갖는 특이적 결합 분자를 제공한다:
VLCDRl가 KASENVVTYVS이고,
VLCDR2가 GASNRYT이고,
VLCDR3이 GQGYSYPYT이고,
VHCDRl이 GYTFTNYWIG이고,
VHCDR2가 DIYPGGDYTNYNEKFKG이고,
VHCDR3이 WGLGYYFDY이다.
한 가지 양태에서, 본 발명은 각각 도 11 및 도 13에 도시된 모노클로날 항체 VJ-4B6의 VH 및/또는 VL 영역을 갖는 특이적 결합 분자를 제공한다.
한 가지 양태에서, 본 발명은 2010년 6월 3일에 유럽 세포 배양 보관 기관(ECACC)에 수탁번호 10060301로 기탁된 하이브리도마 세포주 VJ-4B6-E5-B10-D4를 제공한다.
모노클로날 항체 VJ-4B6는 도 3a에 기재된 방법으로 생산된다. 요약하면, 도 2a에 도시된 서열을 갖는 전장 인간 Anx-A1을 인코딩하는 cDNA를 발현 벡터 내로 클로닝시키고, 세포 표면 발현을 확인했다. 이어서, 금 입자에 흡수된 벡터 DNA의 몇몇 피내 적용물을 마우스에게 투여했다. 마우스 세포는 면역화 벡터를 흡수했고, 면역 반응을 자극하는 cDNA 코딩된 단백질을 발현시켰다. 이어서, 마우스 림프구를 쥐 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마를 생성했다. 이어서, 특이성 시험을 수행하고, 하이브리도마를 클로닝하고, 모노클로날 항체를 생산했다.
이렇게 모노클로날 항체 VJ-4B6를 생산하는데 사용된 방법은 세포 표면 상에서 전체 분자를 발현시키는 Anx-A1 cDNA 형질감염된 세포를 사용하고, 따라서 당해 단백질은 생체내에서 발견될 수 있는 것과 동일한 형태, 즉 제4 천연 구조로 존재한다. 항체를 생산하는 이러한 방법은, 마우스를 Anx-A1 펩티드 또는 변성된 전장 단백질로 면역화시킴으로써 생성되어 왔던, Anx-A1에 대한 다른 상업적으로 이용가능한 항체의 생산과 상이하다.
본 발명의 항체는 류마티스성 관절염 및 다발성 경화증 등의 T 세포 매개된 질환의 치료에 특히 유용하다.
본 발명은 이제 하기 실시예를 참조로 하여 추가로 기재될 것이며, 하기 실시예는 단지 설명을 목적으로 제공된다. 실시예에서, 참조는 도면 번호에 대해 이루어진다.
도 1a는 4개 아넥신 반복체 및 N-말단 도메인을 나타내는 아넥신-1 구조의 리본 다이아그램이다. 도 1b는 아넥신 반복체 및 생활성 서열, 아넥신-1 펩티드 Ac.2-26의 위치의 개략도이다. 도 1c는, Anx-A1의 아세틸화 N-말단 펩티드 단편인 펩티드 Ac.2-26의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 2a는 (i) 아미노산 서열 및 (ii) 인간 아넥신-1(Anx-A1), 이소형 ANXA1-003의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 도 2b는 인간 아넥신-1(Anx-A1), 이소형 ANXA1-002의 아미노산 서열을 나타낸다. 도 2c는 인간 아넥신-1(Anx-A1), 이소형 ANXA1-004의 아미노산 서열을 나타낸다. 도 2d는 인간 아넥신-1(Anx-A1), 이소형 ANXA1-006의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 3은 VJ-4B6의 생성을 나타낸다. (A)는 VJ-4B6의 분리 및 생산에 사용된 방법의 개략도이다. (B)는 VJ-4B6을 사용하여 아넥신-1 cDNA(녹색 라인; 우측 피크) 또는 무관한 대조군 cDNA(적색 라인; 좌측 피크)로 안정하게 형질감염된 세포주의 염색을 나타낸다.
도 4는 VJ-4B6의 확인을 나타낸다. (A)는 VJ-4B6(50ng/ml)를 사용하여 투과된 인간 말초혈 단핵 세포(Peripheral Blood Mononuclear Cell; PBMS) 또는 다형태 단핵 세포(Polymorph Mononuclear Cell; PMN)의 염색을 나타낸다. (B)는 VJ-4B6(50ng/ml)를 사용하여 투과된 쥐 비장세포 또는 복막 거주 마크로파지의 염색을 나타낸다. 모든 시험에서, 세포는 4% 파라포름알데히드로 고정시킨 다음, FACS 완충제 중의 0.02% 사포닌으로 투과시켰다. 세포를 밤새 4℃에서 비오티닐화 VJ-4B6과 함께 배양한 다음, 스트렙트아비딘-FITC 접합된 항체(희석 1:200)을 사용하여 1시간 동안 염색시켰다. 모든 그래프에서, 좌측 피크는 대조군을 나타내고, 우측 피크는 VJ-4B6을 나타낸다. 제시된 데이타는 단일 시험의 것이고, 유사한 결과를 갖는 다른 2개 실험을 나타낸다.
도 5는 VJ-4B6이 항-CD3-유도된 T 세포 증식을 억제시킴을 나타낸다. AnxA1+/+(A) 및 AnxA1-/-(B) 마우스의 비장 및 림프절로부터의 T 세포를 지시된 농도의 VJ-4B6의 존재하에 플레이트 결합된 항-CD3(1㎍/ml)로 자극시켰다. 18 내지 20시간 후, 세포를 12시간 동안 3H-티미딘(1μCi)으로 펄스한 다음, 세포 수거기에 의해 처리하여 3H-티미딘 도입의 수준을 측정했다. 도시된 데이타는 단일 실험의 것이고, 유사한 결과를 갖는 다른 2개 실험을 나타낸다.
도 6은 VJ-4B6이 항-CD3/CD28-유도된 T 세포 증식을 억제시킴을 나타낸다. AnxA1+/+(A) 및 AnxA1-/-(B) 마우스의 비장 및 림프절로부터의 T 세포를 지시된 농도의 VJ-4B6의 존재하에 플레이트 결합된 항-CD3(1㎍/ml) 및 항-CD28(1㎍/ml)로 자극시켰다. 18 내지 20시간 후, 세포를 12시간 동안 3H-티미딘(1μCi)으로 펄스한 다음, 세포 수거기에 의해 처리하여 3H-티미딘 도입의 수준을 측정했다. 도시된 데이타는 단일 실험의 것이고, 유사한 결과를 갖는 다른 2개 실험을 나타낸다.
도 7은 VJ-4B6이 항-CD3-유도된 IL-2 생산을 억제시킴을 나타낸다. AnxA1+/+(A) 및 AnxA1-/-(B) 마우스의 비장 및 림프절로부터의 T 세포를 지시된 농도의 VJ-4B6의 존재하에 플레이트 결합된 항-CD3(1㎍/ml)로 자극시켰다. 20 내지 24시간 후, 세포 상청액을 수집하고, ELISA에 의해 IL-2의 수준에 대해 분석했다. 도시된 데이타는 단일 실험의 것이고, 유사한 결과를 갖는 다른 2개 실험을 나타낸다.
도 8은 VJ-4B6이 항-CD3/CD28-유도된 IL-2 생산을 억제시킴을 나타낸다. AnxA1+/+(A) 및 AnxA1-/-(B) 마우스의 비장 및 림프절로부터의 T 세포를 지시된 농도의 VJ-4B6의 존재하에 플레이트-결합된 항-CD3(1㎍/ml) 및 항-CD28(1㎍/ml)로 자극시켰다. 20 내지 24시간 후, 세포 상청액을 수집하고, ELISA에 의해 IL-2의 수준에 대해 분석했다. 도시된 데이타는 단일 실험의 것이고, 유사한 결과를 갖는 다른 2개 실험을 나타낸다.
도 9는 VJ-4B6이 항-CD3-유도된 CD25/CD69 상향조절을 억제시킴을 나타낸다. AnxA1+/+(A) 및 AnxA1-/-(B) 마우스의 비장 및 림프절로부터의 T 세포를 지시된 농도의 VJ-4B6의 존재하에 플레이트 결합된 항-CD3(1㎍/ml)로 자극시켰다. 18 내지 20시간 후, 세포를 수집하고, 항-CD25 FITC + 항-CD69 PE로 염색시켰다. 샘플을 FACScalibur로 취득하고, FlowJo 소프트웨어로 분석했다. 도시된 데이타는 단일 실험의 것이고, 유사한 결과를 갖는 다른 2개 실험을 나타낸다.
도 10은 VJ-4B6이 항-CD3/CD28-유도된 CD25/CD69 상향조절을 억제시킴을 나타낸다. AnxA1+/+(A) 및 AnxA1-/-(B) 마우스의 비장 및 림프절로부터의 T 세포를 지시된 농도의 VJ-4B6의 존재하에 플레이트 결합된 항-CD3(1㎍/ml) 및 항-CD28(1㎍/ml)로 자극시켰다. 18 내지 20시간 후, 세포를 수집하고, 항-CD25 FITC + 항-CD69 PE로 염색시켰다. 샘플을 FACScalibur로 취득하고, FlowJo 소프트웨어로 분석했다. 도시된 데이타는 단일 실험의 것이고, 유사한 결과를 갖는 다른 2개 실험을 나타낸다.
도 11은 VJ-4B6의 경쇄 가변 영역의 DNA 및 아미노산 서열을 나타낸다.
도 12는 CDR 주석과 함께 VJ-4B6의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 나타낸다. CDR1, CDR2, CDR3 및 불변 영역의 개시는 강조되어 있다. 카바트(kabat)에 따라 넘버링 및 CDR.
도 13은 VJ-4B6의 중쇄 가변 영역의 DNA 및 아미노산 서열을 나타낸다.
도 14는 CDR 주석과 함께 VJ-4B6의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 나타낸다. CDR1, CDR2, CDR3 및 불변 영역의 개시는 강조되어 있다. 카바트에 따라 넘버링 및 CDR. 중쇄 가변 영역에서, 잔기 26 내지 29는, 카바트에 의해 정의된 과가변 영역의 일부는 아니지만, 초티아(Chothia and Lesk, 1987)에 의해 정의된 CDR 루프의 일부이다. 삽입체 52, 52A, 82, 82A, 82b, 82c, 100 및 100a에서의 위치는 52A, 82Abc, 100a로서 지시되어 있다.
도 15는 VJ-4B6이 EAE의 발달을 억제시킴을 나타낸다. C57BL/6 마우스를 CFA 중의 MOG35-55로 면역화시키고, 22일 동안 EAE의 징후에 대해 매일 모니터링했다. 면역화후 6일에서, 마우스에게 6일마다 100ng의 IgG(A) 또는 5(B), 50(C), 100ng(D)의 VJ-4B6(PBS 100㎕ 중)의 복강내 주사를 제공했다. 결과는 평균 ± SEM(n=6/그룹)이다. *p < 0.05, ***p < 0.001.
도 16은 VJ-4B6이 EAE의 발달과 관련된 체중 소실을 감소시킴을 나타낸다. C57BL/6 마우스를 CFA 중의 MOG35 -55로 면역화시키고, 22일 동안 체중 증가/소실에 대해 매일 모니터링했다. 면역화후 6일에서, 마우스에게 6일마다 100ng의 IgG(A) 또는 5(B), 50(C), 100ng(D)의 VJ-4B6(PBS 100㎕ 중)의 복강내 주사를 제공했다. 결과는 평균 ± SEM(n=6/그룹)이다. *p < 0.05, ***p < 0.001.
도 17은 VJ-4B6이 CIA의 발달을 감소시킴을 나타낸다. DBA/1 마우스를 CFA 중의 소 유형 II 콜라겐으로 면역화시켰다. 1차 면역화후 21일에서, 마우스를 완전 CFA중의 200㎍ 유형 II로 부스팅시키고, 20일 동안 질환의 징후에 대해 매일 모니터링했다. 부스팅한 날에 마우스에게 6일마다 100ng의 VJ-4B6(PBS 100㎕ 중)의 복강내 주사를 제공했다. 결과는 평균 ± SEM(n=6/그룹)이다. ***p < 0.001.
실시예 1 - VJ -4B6은 아넥신 -1 함유 T 세포에서 T 세포 활성화를 특이적으로 억제시킨다.
재료 및 방법
마우스(도 4b, 5, 6, 7, 8, 9 및 10에서 사용된 마우스)
Balb/C 마우스는 B&K Universal(Grimston, England)로부터 입수했다. Anx-A1-/- 마우스는 본 발명자의 실험실에서 태어났고, B&K Universal에서 병원체 비함유 조건하에 생육시켰다. 이들 연구에 사용된 모든 마우스는 6 내지 8주령이었다. 동물 작업은 영국 홈 오피스 규정(Guideance on the Operation of Animals, Scientific Procedures Act 1986) 및 유럽 연합(EU) 지침의 규정에 따라 수행했다.
쥐 T 세포 추출(도 4B, 5, 6, 7, 8, 9 및 10에 사용된 세포)
비장 및 림프절(겨드랑이, 서혜부 및 장)을 6 내지 8주령 마우스로부터 제거하고, 상기한 바와 같은 시린지 플런저를 사용하여 50㎛ 세포 여과기(BD)를 통해 조직의 온화한 해응집(disaggregation)에 의해 제조했다. 세포 현탁액을 피콜 위에 적층하여 단핵 세포를 수득한 다음, 수집하여 RPMI 매질(Gibco)로 세정했다.
T 세포 증식 분석(도 5 및 6의 데이타)
정제된 림프절 T 세포(105 세포/ml)를 96웰 플레이트에서 플레이트-결합된 항-CD3(클론 145-2c11; eBioscience) 또는 항-CD3 + 항-CD28(클론 37.51; eBioscience)에 의해 자극시켰다. 18 내지 20시간 후, 배양물을 12시간 동안 1μCi의 [3H]-티미딘(Amersham Pharmacia Biotech)로 펄스하고, 도입된 방사능을 자동화 신틸레이션 계수기(Packard)로 측정했다.
IL-2 생산(도 7 및 8의 데이타)
정제된 림프절 T 세포(105 세포/ml)를 96웰 플레이트에서 플레이트-결합된 항-CD3(클론 145-2c11; eBioscience) 또는 항-CD3 + 항-CD28(클론 37.51; eBioscience)에 의해 자극시켰다. 20 내지 24시간 후, 배양 상청액을 수집하고, 제조업자의 지시에 따라 마우스 IL-2 ELISA 키트(eBioscience)를 사용하여 IL-2 함량에 대해 분석했다.
유세포 분석(도 9 및 10)
세포를 FACS 완충제(1% FCS 및 0.02% NaN2를 함유하는 PBS)에 재현탁시켰다. 림프구를 100㎕ FACS 완충제에서 1×106/ml로 염색시키고, CellQuestTM 소프트웨어(Becton Dickinson)로 FACScalibur 상에서 획득했다. 사용된 항체는 항-CD25 FITC(클론 PC61, eBioscience) 및 PE-접합된 항-CD69(클론 H1.2F3)이었다. 세포는 항-CD16/32를 함유하는 FACS 완충제에서 30분 동안 4℃에서 예비 인큐베이션시켜 비특이적 결합을 방지한 다음, 적절한 농도의 접합된 항체로 30분 동안 4℃에서 표지시켰다. 표지 후, 세포를 세정하고, 분석했다. 전방 및 측면 산란은 적혈구 및 사멸 세포를 배제하도록 설정하고, 적어도 2×104 림프구를 샘플당 분석했다. 모든 실험에서, 염색된 세포를 FACScalubur 유세포 분석기로 획득하고, FlowJo 소프트웨어를 사용하여 분석했다.
유세포 분석에 의한 VJ-4B6의 확인(도 4)
인간 PBMC 및 PMN 또는 쥐 비장세포 및 복막 마크로파지를 먼저 4% 파라포름알데히드를 함유하는 FACS 완충제에 10분 동안 및 이어서 4% 파라포름알데히드 및 0.02% 사포닌을 함유하는 FACS 완충제에 15분 동안 재현탁시켰다. 세포는 4℃에서 12시간 동안 50ng/ml의 비오티닐화 VJ-4B6과 함께 인큐베이션시켰다. 이어서, 세포를 실온에서 1시간 동안 스트렙트아비딘-FITC(희석 1:200; eBioscience)와 함께 인큐베이션시켰다. 표지화 후, 세포를 세정하고 분석했다. 전방 및 측면 산란은 적혈구 및 사멸 세포를 배제하도록 설정하고, 적어도 2×104 림프구를 샘플당 분석했다. 모든 실험에서, 염색된 세포는 FACScalibur 유세포 분석기로 획득했고, FlowJo 소프트웨어를 사용하여 분석했다.
인간 복막 혈액 백혈구(도 4A에 사용된 세포)
혈액 공여체는 20세 내지 35세의 건강한 남성 및 여성이었고, 이들은 HIV, 간염 B 바이러스 및 간염 C 바이러스에 대해 음성인 것으로 시험되었다. 추가의 배제 기준은 지난 4주간의 명백한 감염, 고열, 알러지 증상, 비정상 혈구 계수, 간 효소의 증가 또는 임의 종류의 약물 치료였다. 새로운 정맥 혈액을 건강한 지원자로부터 수집하고, 즉시 3.2% 나트륨 시트레이트(1:10 희석)을 함유하는 튜브로 옮겼다. 이어서, 세포는 밀도 구배 방법을 사용하여 분리했다: 3ml의 피콜 히스토파크-10771을 3ml의 피콜 히스토파크-11911(둘 다 Sigma사)의 상부에 적층하여 분리된 층을 생성하고, 6ml의 혈액(RPMI 매질과 1:1 희석됨)을 히스토파크의 상부에 적층했다. 실온에서 30분 동안 1500 RPM으로 원심분리한 후, 멸균 파스테르 피펫을 사용하여 PBMC 및 PMN을 이들의 적절한 층으로부터 흡입하고, RPMI로 3회 세척했다.
통계학적 분석
모든 통계학적 분석은 프리즘 소프트웨어(GraphPad 소프트웨어)로 수행했다. 모든 값은 평균 ± SE로 나타낸다. 통계학적 분석은 적절한 경우 스튜던트 t 시험 또는 일원(oen-way) ANOVA로 평가했다. P < 0.05의 가능성을 유의적인 것으로 간주했다.
결과
신규 항-AnxA1 항체는 도 3a의 개략도에 나타낸 바와 같이 유전자 면역화에 의해 생성했다(Genovac GmbH, Germany). 몇몇 면역화된 마우스로부터의 혈청을 시험했고, 3개는 AnxA1 cDNA로 형질감염시킨 IgG 인지 세포에 대해 포지티브 결과를 제공했다. 이들 마우스로부터의 비장세포를 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마 세포를 생성했다. 3개 하이브리도마 세포 클론 중의 단지 하나가 성공적으로 서브클로닝되었고, 증식되었다. 이들 하이브리도마 세포를 VJ-4B6-E5-B10-D4로서 명명했다. 당해 하이브리도마 세포로부터의 정제된 IgG2b 분획은 AnxA1 cDNA로 형질감염된 세포를 인지했지만(도 3b, 녹색 라인; 우측 피크), 무관한 cDNA로 형질감염된 세포를 인지하지 못했다(도 3b, 적색 라인; 좌측 피크).
VJ-4B6의 특이성을 확인하기 위해, 상이한 수준의 단백질을 발현시키는 것으로 공지된 투과된 인간 및 쥐 세포에서 AnxA1의 발현을 FACS에 의해 분석했다. 도 4a에 도시된 바와 같이, 인간 PMN은 인간 PBMC와 비교하여 VJ-4B6 염색에 대해 매우 포지티브였다(도 4a, 우측 피크, 각각 우측 및 좌측 패널). 이는 PMN이 PBMC와 비교하여 현저히 보다 높은 수준의 AnxA1을 발현시킨다는 이전 관찰(D'Acquisto et al, 미공개 결과)와 일치한다. 유사하게는, VJ-4B6를 사용한 쥐 마크로파지의 염색은 비장세포와 비교하여 AnxA1의 보다 높은 발현 수준을 나타냈다(도 4b, 우측 피크, 각각 우측 및 좌측 패널). 집합적으로, 이들 결과는 VJ-4B6가 인간 및 쥐 AnxA1 둘 다를 인지함을 나타낸다.
이어서, T 세포 활성화에 대한 VJ-4B6의 효과 및 특이성을 시험했다. 이를 위해, 먼저 항-CD3-유도된 세포 증식에 대한 VJ-4B6의 효과(3H-티미딘 도입의 평균으로)를 AnxA1+/+ 또는 AnxA1-/- 마우스로부터의 T 세포를 사용하여 측정했다. 도 5는 항-CD3으로 자극한 후에 AnxA1+/+ 및 AnxA1-/- T 세포 둘 다에서 3H-티미딘의 도입 증가를 나타낸다(각각 도 5a 및 5b). 자극된 배양물에 대한 VJ-4B6의 첨가는 AnxA1+/+ T 세포에서 3H-티미딘 도입의 농도-의존적 억제를 유발했지만, AnxA1-/- T 세포에서는 유발하지 않았다. 유사한 결과는 항-CD3 + 항-CD28로 자극시킨 T 세포에 의해 수득되었다(각각 도 6a 및 6b).
이들 결과를 추가로 확인하기 위해, T 세포 활성화의 다른 전형적 마커에 대한 VJ-4B6의 효과, 즉 인터류킨-2(IL-2) 생산 및 CD25/CD69 상향조절을 시험했다. 항-CD3 단독 또는 항-CD3 + 항-CD28로 자극된 T 세포는 대량의 IL-2를 생산했다(각각 도 7 및 8). VJ-4B6의 첨가는 AnxA1+/+ T 세포에서 IL-2 생산을 유의적으로 및 농도 의존적 방식으로 억제시켰지만, AnxA1-/- T 세포에서는 억제시키지 않았다. 유사한 결과를 CD25/CD69 상향조절에 대해 수득하였다. 항-CD3 단독 또는 항-CD3 + 항-CD28에 의한 T 세포의 활성화는 CD25/CD69 이중 포지티브 T 세포의 상당한 비율 증가를 유도했다(좌측으로부터 두번째 패널, 각각 도 9 및 도 10). VJ-4B6의 존재하의 자극은 AnxA1+/+ T 세포에서 CD25/CD69 유도(및 발현)을 유의적으로 및 농도 의존적 방식으로 억제시켰지만, AnxA1-/- T 세포에서는 억제시키지 않았다.
이들 결과는 함께 VJ-4B6이, 항-CD3 또는 항-CD3 + 항-CD28에 의해 유발된 신호전달에 의해 유도된, T 세포 증식, IL-2 생산 및 CD25/CD69 상향조절을 억제시킴을 나타낸다. 또한, 이러한 효과는, 이의 효과가 AnxA1-/- T 세포에서 소실되기 때문에, 구체적으로는 VJ-4B6에 의한 AnxA1의 중화에 기인하는 것이다. 이는 활성화된 T 세포가, 적절한 T 세포 활성화에 또한 요구될 수 있는 내인성 AnxA1을 방출한다는 본 발명자의 선행 관찰과 일치한다[참조: D'Acquisto et al., 109: 1095-1102, 2007; D'Acquisto et al., Eur. J. Immunol. 37:3131-3142, 2007].
요약하면, 이들 데이타는 VJ-4B6이 농도 의존적 방식으로 CD25 및 CD69(T 세포 활성화의 마커)의 항-CD3-유도된 상향조절을 억제시킴으로 나타낸다. 유사한 억제 효과가 IL-2 생산 및 T 세포 증식에 대해 관찰되었다. 가장 중요하게는, 이러한 효과는 아넥신-1-결핍 T 세포에서 관찰되지 않았으며, 이는 당해 억제가 특이적이고 당해 항체가 어떠한 세포독성 부작용을 유발하지 않음을 증명한다.
실시예 2 - VJ -4B6의 서열분석
본 실시예의 목적은 하이브리도마 세포로부터의 항체 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 클로닝하고 상보성 결정 영역(CDR)의 DNA 서열 및 위치 및 기타 특징을 결정하기 위한 것이다.
항체 가변 영역의 클로닝 및 서열분석
전체 RNA는 Qiagen RNeasy 미니 키트(Cat No: 74104)를 사용하여 하이브리도마 세포의 1개 바이알로부터 제조했다. RNA는 50㎕ 물로 용출시키고, 1.2% 아가로즈 겔 상에서 검사했다.
VH 및 VK(가변 카파 경쇄) cDNA는 IgG 및 카파 불변 영역 프라이머와 함께 역전사효소를 사용하여 제조했다. 제1 스트랜드 cDNA는 시그날 서열 프라이머의 거대 세트를 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. 증폭된 DNA를 겔 정제하고, 벡터 pGem® T Easy(Promega) 내로 클로닝시켰다. 수득된 VH 및 VK 클론을 예상된 크기의 삽입체에 대해 스크리닝했다. 선택된 클론의 DNA 서열은 자동화 DNA 서열분석에 의해 양 방향에서 결정했다. 당해 서열 중의 상보성 결정 영역(CDR)의 위치는 다른 항체 서열을 기준으로 결정했다[참조: Kabat EA et al., 1991].
결과
VJ-4B6 경쇄
단일 VK 서열이 동정되었다. VJ-4B6 VK에 대한 DNA 서열 및 추정된 아미노산 서열은 도 11에 도시되어 있다. CDR 주석과 함께 추정된 단백질 서열은 도 12에 도시되어 있다. 2개의 개개 증폭 단계로부터의 9개 클론(7개 독립적)은 동일한 V 영역 서열을 제공했다. 하이브리도마 융합 파트너로부터 유도되는 비-생산적 비정상 VK 서열은 또한 다수의 클론에 존재했고, 당해 서열 속에 결실을 갖는 1개 클론이 존재했다.
VJ-4B6 중쇄
단일 VH 서열이 동정되었다. VJ-4B6 VH에 대한 DNA 서열 및 추정된 아미노산 서열은 도 13에 도시되어 있다. 동일한 V 영역 서열은 9개 독립적 클론에서 발견되었다. 2개 클론은 단일 염기쌍 변화를 가졌고, 1개 클론은 단일 염기쌍 결실 및 단일 염기쌍 변화를 가졌으며, 1개 클론은 2개의 단일 염기쌍 변화를 가졌다. 5개의 단일 염기쌍 변화 각각은 하나의 클론에서만 발생했다. 나머지 5개 클론은 동일한 서열을 가졌다. CDR 주석과 함께 추정된 단백질 서열은 도 14에 도시되어 있다.
참조
Chothia C and Lesk AM. Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins. J Mol Biol. 196: 901-17, 1987.
Kabat EA, Wu TT, Perry HM, Gottesman KS, Foeller C. Sequences of proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, 1991
실시예 3 - 생체내에서 VJ -4B6의 면역억제 효과
생체내에서 VJ-4B6의 면역억제 효과를 시험하기 위해, 본 발명자들은 자가면역 질환의 2개 전형적 모델을 선택했다: MOG33-35-유도된 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE; 다발성 경화증의 마우스 모델) 및 콜라겐-유도된 관절염(CIA; 류마티스성 관절염의 마우스 모델).
방법
실험적 자가면역 뇌척수염. 마우스를, 300㎍ 열-사멸시킨 엠. 투베르쿨로시스(M. tuberculosis) H37Ra를 함유하는 동일 용적으로 CFA와 조합된 PBS 중의 300㎍의 MOG35 -55로 이루어진 300㎕ 에멀젼으로 0일에 피하 면역화시켰다. 에멀젼을 양 옆구리에 주사한 다음, 0일 및 2일에 100㎕ 염수 중의 비. 퍼투시스(B. pertussis) 독소(500ng/100㎕)를 복막내 주사했다. 마우스를 EAE 징후 및 체중 소실에 대해 매일 관찰했다. 질환 중증도는 6점 척도로 채점했다: 0 = 질환 없음; 1 = 부분적 이완 꼬리; 2 = 완전 이완 꼬리; 3 = 손상된 즉시 반사; 4 = 부분 뒷다리 마비; 5 = 완전 뒷다리 마비; 6 = 빈사 또는 사멸 동물
콜라겐 유도된 관절염. 6 내지 8마리의 수컷 DBA/1 마우스(8 내지 12주령)에게 완전 프로인트 보조제(CFA; Hooke labs)에서 유화시킨 200㎍ 콜라겐 유형 II를 꼬리 기부에 피내 주사했다. 1차 면역화후 21일에서, 마우스를 IFA(Hooke Labs) 중의 200㎍ 유형 II로 부스팅(s.c.)시켰다. 마우스는 2개 임상적 파라미터를 사용하여 관절염 개시 징후에 대해 모니터링했다: 발 팽창 및 임상 스코어. 발 팽창은 부종측정기로 발병된 뒷발의 두께를 측정함으로써 평가했다. 임상적 관절염은 제조업자에 의해 권장된 바와 같이 평가했다(http://hookelabs.com/protocols/ciaInductionDBA1/ciaInduction_DBA1.html). 각각의 팔다리를 등급화하여, 동물당 12개의 최대 가능한 스코어를 제공했다.
결과
수컷 C57/BL6 마우스를 문헌[참조: Paschalidis et al., J Neuroinflammation. 2009; 6:33]에 이미 기재된 바와 같이 MOG33 -35/CFA로 면역화시켰다. 마우스에게 MOG33 -35/CFA로 면역화시킨후 6일에 개시하여 6일마다 VJ-4B6(5, 50 및 100ng/100㎕), IgG 대조군(100ng/㎕) 또는 PBS 비히클(대조군)의 복강내(i.p.) 투여를 제공했다. 도 15에 도시된 바와 같이, 5, 50 및 100ng의 VJ-4B6으로 처리된 마우스는 대조군 마우스와 비교하여 질환 징후에 대해 통계학적으로 유의적인 용량 의존적 감소를 나타낸 반면(각각 도 15b, c 및 d), IgG 대조군의 투여는 어떠한 효과도 갖지 않았다(도 15a). 각 처리에 대한 곡선하 면적(AUC) 및 억제율 대 대조군(27.29 AUC)는 다음과 같다: IgG 100ng, 24.17 AUC, 11.4%; VJ-4B6 5ng, 15.04 AUC, 44.8%; VJ-4B6 50ng, 5.87 AUC, 78.5%; VJ-4B6 100ng, 7.04 AUC, 74.2%.
EAE의 동물 모델에 대한 연구는 당해 질환의 급성 상(phase)이, 아마도 식욕감퇴 및 유체 흡수 결핍에 기인하여, 체중 소실과 동시에 일어남을 입증했다. 처리된 마우스의 체중 측정은 임상 스코어의 중증도와 상관하였고, 대조군과 비교하여 VJ-4B6-처리된 마우스에서는 용량 의존적으로 감소된 체중 소실(18일 이후부터)을 나타냈지만, IgG-처리된 마우스에서는 나타내지 않았다(도 16).
생체내에서 면역억제제로서 VJ-4B6의 치료 가능성을 확인하기 위해, 본 발명자들은 CIA 모델에서 이의 효과를 시험했다. 수컷 DBA/1 마우스를 상기한 CFA 중의 소 유형 II 콜라겐으로 면역화시켰다[참조: D'Acquisto et al., Blood. 2007; 109(3): 1095-102]. 마우스에게, 콜라겐으로 부스팅후 0일에서 개시하여 6일마다 VJ-4B6(100ng/100㎕) 또는 PBS 비히클(대조군)의 복강내 주사를 제공했다. EAE에 대해 수득된 데이타와 일치하게, VJ-4B6의 투여는 대조군 마우스(AUC83.50)와 비교하여 질환 징후 발달을 유의적으로 감소시켰다(AUC 26.75; 67.9%)(도 17).
European Collection of Cell Cultures(ECACC) 10060301 20100603
<110> QUEEN MARY & WESTFIELD COLLEGE <120> ANNEXIN 1 ANTIBODY <130> IPA121131 <150> GB 1009675.8 <151> 2010-06-09 <150> GB 1011943.6 <151> 2010-07-15 <160> 20 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> ACETYLATION <222> (1)..(1) <400> 1 Ala Met Val Ser Glu Phe Leu Lys Gln Ala Trp Phe Ile Glu Asn Glu 1 5 10 15 Glu Gln Glu Tyr Val Gln Thr Val Lys 20 25 <210> 2 <211> 11 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> VLCDR1 <400> 2 Lys Ala Ser Glu Asn Val Val Thr Tyr Val Ser 1 5 10 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> VLCDR2 <400> 3 Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> VLCDR3 <400> 4 Gly Gln Gly Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr 1 5 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> VHCDR1 <400> 5 Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Trp Ile Gly 1 5 10 <210> 6 <211> 17 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> VHCDR2 <400> 6 Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> VHCDR3 <400> 7 Trp Gly Leu Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr 1 5 <210> 8 <211> 346 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Met Ala Met Val Ser Glu Phe Leu Lys Gln Ala Trp Phe Ile Glu Asn 1 5 10 15 Glu Glu Gln Glu Tyr Val Gln Thr Val Lys Ser Ser Lys Gly Gly Pro 20 25 30 Gly Ser Ala Val Ser Pro Tyr Pro Thr Phe Asn Pro Ser Ser Asp Val 35 40 45 Ala Ala Leu His Lys Ala Ile Met Val Lys Gly Val Asp Glu Ala Thr 50 55 60 Ile Ile Asp Ile Leu Thr Lys Arg Asn Asn Ala Gln Arg Gln Gln Ile 65 70 75 80 Lys Ala Ala Tyr Leu Gln Glu Thr Gly Lys Pro Leu Asp Glu Thr Leu 85 90 95 Lys Lys Ala Leu Thr Gly His Leu Glu Glu Val Val Leu Ala Leu Leu 100 105 110 Lys Thr Pro Ala Gln Phe Asp Ala Asp Glu Leu Arg Ala Ala Met Lys 115 120 125 Gly Leu Gly Thr Asp Glu Asp Thr Leu Ile Glu Ile Leu Ala Ser Arg 130 135 140 Thr Asn Lys Glu Ile Arg Asp Ile Asn Arg Val Tyr Arg Glu Glu Leu 145 150 155 160 Lys Arg Asp Leu Ala Lys Asp Ile Thr Ser Asp Thr Ser Gly Asp Phe 165 170 175 Arg Asn Ala Leu Leu Ser Leu Ala Lys Gly Asp Arg Ser Glu Asp Phe 180 185 190 Gly Val Asn Glu Asp Leu Ala Asp Ser Asp Ala Arg Ala Leu Tyr Glu 195 200 205 Ala Gly Glu Arg Arg Lys Gly Thr Asp Val Asn Val Phe Asn Thr Ile 210 215 220 Leu Thr Thr Arg Ser Tyr Pro Gln Leu Arg Arg Val Phe Gln Lys Tyr 225 230 235 240 Thr Lys Tyr Ser Lys His Asp Met Asn Lys Val Leu Asp Leu Glu Leu 245 250 255 Lys Gly Asp Ile Glu Lys Cys Leu Thr Ala Ile Val Lys Cys Ala Thr 260 265 270 Ser Lys Pro Ala Phe Phe Ala Glu Lys Leu His Gln Ala Met Lys Gly 275 280 285 Val Gly Thr Arg His Lys Ala Leu Ile Arg Ile Met Val Ser Arg Ser 290 295 300 Glu Ile Asp Met Asn Asp Ile Lys Ala Phe Tyr Gln Lys Met Tyr Gly 305 310 315 320 Ile Ser Leu Cys Gln Ala Ile Leu Asp Glu Thr Lys Gly Asp Tyr Glu 325 330 335 Lys Ile Leu Val Ala Leu Cys Gly Gly Asn 340 345 <210> 9 <211> 1041 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 atggcaatgg tatcagaatt cctcaagcag gcctggttta ttgaaaatga agagcaggaa 60 tatgttcaaa ctgtgaagtc atccaaaggt ggtcccggat cagcggtgag cccctatcct 120 accttcaatc catcctcgga tgtcgctgcc ttgcataagg ccataatggt taaaggtgtg 180 gatgaagcaa ccatcattga cattctaact aagcgaaaca atgcacagcg tcaacagatc 240 aaagcagcat atctccagga aacaggaaag cccctggatg aaacactgaa gaaagccctt 300 acaggtcacc ttgaggaggt tgttttggct ctgctaaaaa ctccagcgca atttgatgct 360 gatgaacttc gtgctgccat gaagggcctt ggaactgatg aagatactct aattgagatt 420 ttggcatcaa gaactaacaa agaaatcaga gacattaaca gggtctacag agaggaactg 480 aagagagatc tggccaaaga cataacctca gacacatctg gagattttcg gaacgctttg 540 ctttctcttg ctaagggtga ccgatctgag gactttggtg tgaatgaaga cttggctgat 600 tcagatgcca gggccttgta tgaagcagga gaaaggagaa aggggacaga cgtaaacgtg 660 ttcaatacca tccttaccac cagaagctat ccacaacttc gcagagtgtt tcagaaatac 720 accaagtaca gtaagcatga catgaacaaa gttctggacc tggagttgaa aggtgacatt 780 gagaaatgcc tcacagctat cgtgaagtgc gccacaagca aaccagcttt ctttgcagag 840 aagcttcatc aagccatgaa aggtgttgga actcgccata aggcattgat caggattatg 900 gtttcccgtt ctgaaattga catgaatgat atcaaagcat tctatcagaa gatgtatggt 960 atctcccttt gccaagccat cctggatgaa accaaaggag attatgagaa aatcctggtg 1020 gctctttgtg gaggaaacta a 1041 <210> 10 <211> 346 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Met Ala Met Val Ser Glu Phe Leu Lys Gln Ala Trp Phe Ile Glu Asn 1 5 10 15 Glu Glu Gln Glu Tyr Val Gln Thr Val Lys Ser Ser Lys Gly Gly Pro 20 25 30 Gly Ser Ala Val Ser Pro Tyr Pro Thr Phe Asn Pro Ser Ser Asp Val 35 40 45 Ala Ala Leu His Lys Ala Ile Met Val Lys Gly Val Asp Glu Ala Thr 50 55 60 Ile Ile Asp Ile Leu Thr Lys Arg Asn Asn Ala Gln Arg Gln Gln Ile 65 70 75 80 Lys Ala Ala Tyr Leu Gln Glu Thr Gly Lys Pro Leu Asp Glu Thr Leu 85 90 95 Lys Lys Ala Leu Thr Gly His Leu Glu Glu Val Val Leu Ala Leu Leu 100 105 110 Lys Thr Pro Ala Gln Phe Asp Ala Asp Glu Leu Arg Ala Ala Met Lys 115 120 125 Gly Leu Gly Thr Asp Glu Asp Thr Leu Ile Glu Ile Leu Ala Ser Arg 130 135 140 Thr Asn Lys Glu Ile Arg Asp Ile Asn Arg Val Tyr Arg Glu Glu Leu 145 150 155 160 Lys Arg Asp Leu Ala Lys Asp Ile Thr Ser Asp Thr Ser Gly Asp Phe 165 170 175 Arg Asn Ala Leu Leu Ser Leu Ala Lys Gly Asp Arg Ser Glu Asp Phe 180 185 190 Gly Val Asn Glu Asp Leu Ala Asp Ser Asp Ala Arg Ala Leu Tyr Glu 195 200 205 Ala Gly Glu Arg Arg Lys Gly Thr Asp Val Asn Val Phe Asn Thr Ile 210 215 220 Leu Thr Thr Arg Ser Tyr Pro Gln Leu Arg Arg Val Phe Gln Lys Tyr 225 230 235 240 Thr Lys Tyr Ser Lys His Asp Met Asn Lys Val Leu Asp Leu Glu Leu 245 250 255 Lys Gly Asp Ile Glu Lys Cys Leu Thr Ala Ile Val Lys Cys Ala Thr 260 265 270 Ser Lys Pro Ala Phe Phe Ala Glu Lys Leu His Gln Ala Met Lys Gly 275 280 285 Val Gly Thr Arg His Lys Ala Leu Ile Arg Ile Met Val Ser Arg Ser 290 295 300 Glu Ile Asp Met Asn Asp Ile Lys Ala Phe Tyr Gln Lys Met Tyr Gly 305 310 315 320 Ile Ser Leu Cys Gln Ala Ile Leu Asp Glu Thr Lys Gly Asp Tyr Glu 325 330 335 Lys Ile Leu Val Ala Leu Cys Gly Gly Asn 340 345 <210> 11 <211> 204 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Met Asn Leu Ile Leu Arg Tyr Thr Phe Ser Lys Met Ala Met Val Ser 1 5 10 15 Glu Phe Leu Lys Gln Ala Trp Phe Ile Glu Asn Glu Glu Gln Glu Tyr 20 25 30 Val Gln Thr Val Lys Ser Ser Lys Gly Gly Pro Gly Ser Ala Val Ser 35 40 45 Pro Tyr Pro Thr Phe Asn Pro Ser Ser Asp Val Ala Ala Leu His Lys 50 55 60 Ala Ile Met Val Lys Gly Val Asp Glu Ala Thr Ile Ile Asp Ile Leu 65 70 75 80 Thr Lys Arg Asn Asn Ala Gln Arg Gln Gln Ile Lys Ala Ala Tyr Leu 85 90 95 Gln Glu Thr Gly Lys Pro Leu Asp Glu Thr Leu Lys Lys Ala Leu Thr 100 105 110 Gly His Leu Glu Glu Val Val Leu Ala Leu Leu Lys Thr Pro Ala Gln 115 120 125 Phe Asp Ala Asp Glu Leu Arg Ala Ala Met Lys Gly Leu Gly Thr Asp 130 135 140 Glu Asp Thr Leu Ile Glu Ile Leu Ala Ser Arg Thr Asn Lys Glu Ile 145 150 155 160 Arg Asp Ile Asn Arg Val Tyr Arg Glu Glu Leu Lys Arg Asp Leu Ala 165 170 175 Lys Asp Ile Thr Ser Asp Thr Ser Gly Asp Phe Arg Asn Ala Leu Leu 180 185 190 Ser Leu Ala Lys Gly Asp Arg Ser Glu Asp Phe Gly 195 200 <210> 12 <211> 115 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Met Ala Met Val Ser Glu Phe Leu Lys Gln Ala Trp Phe Ile Glu Asn 1 5 10 15 Glu Glu Gln Glu Tyr Val Gln Thr Val Lys Ser Ser Lys Gly Gly Pro 20 25 30 Gly Ser Ala Val Ser Pro Tyr Pro Thr Phe Asn Pro Ser Ser Asp Val 35 40 45 Ala Ala Leu His Lys Ala Ile Met Val Lys Gly Val Asp Glu Ala Thr 50 55 60 Ile Ile Asp Ile Leu Thr Lys Arg Asn Asn Ala Gln Arg Gln Gln Ile 65 70 75 80 Lys Ala Ala Tyr Leu Gln Glu Thr Gly Lys Pro Leu Asp Glu Thr Leu 85 90 95 Lys Lys Ala Leu Thr Gly His Leu Glu Glu Val Val Leu Ala Leu Leu 100 105 110 Lys Thr Pro 115 <210> 13 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> light chain variable region of VJ-4B6 <400> 13 aacattgtaa tgacccaatc tcccaaatcc atgtccatgt cagtaggaga gagggtcacc 60 ttgacctgca aggccagtga gaatgtggtt acttatgttt cctggtatca acagaaacca 120 gagcagtctc ctaaactgct gatatacggg gcatccaacc ggtacactgg ggtccccgat 180 cgcttcacag gcagtggatc tgcaacagat ttcactctga ccatcagcag tgtgcaggct 240 gaagaccttg cagattatca ctgtggacag ggttacagct atccgtacac gttcggaggg 300 gggaccaagc tggaaataaa a 321 <210> 14 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> anti-sense of light chain variable region of VJ-4B6 <400> 14 ttgtaacatt actgggttag agggtttagg tacaggtaca gtcatcctct ctcccagtgg 60 aactggacgt tccggtcact cttacaccaa tgaatacaaa ggaccatagt tgtctttggt 120 ctcgtcagag gatttgacga ctatatgccc cgtaggttgg ccatgtgacc ccaggggcta 180 gcgaagtgtc cgtcacctag acgttgtcta aagtgagact ggtagtcgtc acacgtccga 240 cttctggaac gtctaatagt gacacctgtc ccaatgtcga taggcatgtg caagcctccc 300 ccctggttcg acctttattt t 321 <210> 15 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> amino acid sequence of the light chain variable region of VJ-4B6 <400> 15 Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met Ser Met Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Leu Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Val Thr Tyr 20 25 30 Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Asp Tyr His Cys Gly Gln Gly Tyr Ser Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 16 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> amino acid sequence of light chain variable region of VJ-4B6 <400> 16 Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met Ser Met Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Leu Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Val Thr Tyr 20 25 30 Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Asp Tyr His Cys Gly Gln Gly Tyr Ser Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala 100 105 110 Pro Thr Val 115 <210> 17 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> heavy chain variable region of VJ-4B6 <400> 17 caggtccagc tgcagcagtc tggacctgaa ctggtcaggc ctgggacttc agtgaagatg 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcact aactactgga taggttgggc aaagcagagg 120 cctggacatg gccttgagtg gattggagat atttaccctg gaggtgatta tactaactac 180 aatgagaagt tcaagggcaa ggccacactg actgcagaca aatcctccag cacagcctac 240 atgcagttca gcagcctgac atctgaggac tctgccatct attattgtgc aagatggggg 300 ttaggatact actttgacta ctggggccaa ggcatcactc tcacagtctc ctca 354 <210> 18 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> anti sense of heavy chain variable region of VJ-4B6 <400> 18 gtccaggtcg acgtcgtcag acctggactt gaccagtccg gaccctgaag tcacttctac 60 aggacgttcc gaagacctat gtggaagtga ttgatgacct atccaacccg tttcgtctcc 120 ggacctgtac cggaactcac ctaacctcta taaatgggac ctccactaat atgattgatg 180 ttactcttca agttcccgtt ccggtgtgac tgacgtctgt ttaggaggtc gtgtcggatg 240 tacgtcaagt cgtcggactg tagactcctg agacggtaga taataacacg ttctaccccc 300 aatcctatga tgaaactgat gaccccggtt ccgtagtgag agtgtcagag gagt 354 <210> 19 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> amino acid sequence of heavy chain variable region of VJ-4B6 <400> 19 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Ile Gly Trp Ala Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Phe Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Trp Gly Leu Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ile 100 105 110 Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 20 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> amino acid sequence of heavy chain variable region of VJ-4B6 <400> 20 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Ile Gly Trp Ala Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Phe Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Trp Gly Leu Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ile 100 105 110 Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro 115 120

Claims (22)

  1. 상보성 결정 영역(CDRs) VLCDR1, VLCDR2, VLCDR3, VHCDR1, VHCDR2 및 VHCDR3을 포함하는, 서열번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 인간 Anx-A1에 결합하는 항체 또는 이의 단편으로서,
    VLCDR1이 유럽 세포 배양 보관 기관(European Collection of Cell Cultures, ECACC)에 2010년 6월 3일자로 기탁되어 수탁번호 10060301로 지정된 하이브리도마 세포주에 의해 생산된 항체의 VLCDR1에 대해 보존적 치환을 한 개까지 가지는 아미노산 서열을 가지고, 여기서 보존적 치환은 글리신에서 알라닌으로의 치환이며,
    VLCDR2, VLCDR3, VHCDR1, VHCDR2 및 VHCDR3 각각이 유럽 세포 배양 보관 기관(European Collection of Cell Cultures, ECACC)에 2010년 6월 3일자로 기탁되어 수탁번호 10060301로 지정된 하이브리도마 세포주에 의해 생산된 항체의 VLCDR2, VLCDR3, VHCDR1, VHCDR2 및 VHCDR3 각각에 상응하는, 항체 또는 이의 단편.
  2. 제1항에 있어서, 유럽 세포 배양 보관 기관(ECACC)에 2010년 6월 3일자로 기탁되어 수탁번호 10060301로 지정된 하이브리도마 세포주에 의해 생산된 항체의 상보성 결정 영역(CDRs) VLCDR1, VLCDR2, VLCDR3, VHCDR1, VHCDR2 및 VHCDR3을 포함하는 것인, 항체 또는 이의 단편.
  3. 제1항에 있어서, 항체가 하기를 포함하는 것인, 항체 또는 이의 단편:
    유럽 세포 배양 보관 기관(ECACC)에 2010년 6월 3일자로 기탁되어 수탁번호 10060301로 지정된 하이브리도마 세포주에 의해 생산된 경쇄 가변 영역 또는 이의 인간화된 경쇄 가변 영역 및
    개개의 아미노산 서열이 하기와 같은, 상보성 결정 영역(CDRs) VHCDR1, VHCDR2 및 VHCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역:
    VHCDR1은 GYTFTNYWIG이고,
    VHCDR2는 DIYPGGDYTNYNEKFKG이고,
    VHCDR3은 WGLGYYFDY임.
  4. 제1항에 있어서, 항체가 모노클로날 항체인 것인, 항체 또는 이의 단편.
  5. 제1항에 있어서, 항체가 인간화된 항체인 것인, 항체 또는 이의 단편.
  6. 제4항에 있어서, 단편이 Fab, F(ab')2 또는 Fv 단편 또는 scFv 분자인 것인, 항체 또는 이의 단편.
  7. 제1항에 있어서, 서열번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 단편.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 의약에 사용하기 위한, 항체 또는 이의 단편.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포 매개된 질환의 치료에 사용하기 위한 것으로서, 상기 T 세포 매개된 질환이 이식편 대 숙주 질환, 이식편 거부, 아테롬성 동맥경화증, HIV, AIDS, 유산 및 자가면역 질환으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 항체 또는 이의 단편.
  10. 제9항에 있어서, 상기 자가면역 질환이 류마티스성 관절염(RA), 다발성 경화증(MS), 전신 홍반성 낭창(SLE), 애디슨 질환, 그레이브 질환, 경피증, 다발성 근염, 당뇨병, 자가면역 포도망막염, 궤양성 대장염, 심상성 천포창, 염증성 장 질환, 자가면역 갑상선염, 포도막염, 베쳇트 질환, 소그렌 증후군 및 건선으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인, 항체 또는 이의 단편.
  11. 제10항에 있어서, 상기 자가면역 질환이 류마티스성 관절염(RA), 다발성 경화증(MS) 및 전신 홍반성 낭창(SLE)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인, 항체 또는 이의 단편.
  12. 제11항에 있어서, 상기 자가면역 질환이 류마티스성 관절염(RA) 또는 다발성 경화증(MS)인 것인, 항체 또는 이의 단편.
  13. 제9항에 있어서, 상기 T 세포 매개된 질환이 아테롬성 동맥경화증, HIV 및 AIDS로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인, 항체 또는 이의 단편.
  14. 서열번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 인간 Anx-A1에 결합하는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주로서,
    상기 항체가 상보성 결정 영역(CDRs) VLCDR1, VLCDR2, VLCDR3, VHCDR1, VHCDR2 및 VHCDR3을 포함하고,
    VLCDR1이 유럽 세포 배양 보관 기관(European Collection of Cell Cultures, ECACC)에 2010년 6월 3일자로 기탁되어 수탁번호 10060301로 지정된 하이브리도마 세포주에 의해 생산된 항체의 VLCDR1에 대해 보존적 치환을 한 개까지 가지는 아미노산 서열을 가지고, 여기서 보존적 치환은 글리신에서 알라닌으로의 치환이며,
    VLCDR2, VLCDR3, VHCDR1, VHCDR2 및 VHCDR3 각각이 유럽 세포 배양 보관 기관(European Collection of Cell Cultures, ECACC)에 2010년 6월 3일자로 기탁되어 수탁번호 10060301로 지정된 하이브리도마 세포주에 의해 생산된 항체의 VLCDR2, VLCDR3, VHCDR1, VHCDR2 및 VHCDR3 각각에 상응하는, 하이브리도마 세포주.
  15. 제14항에 있어서, 상기 항체가 유럽 세포 배양 보관 기관(ECACC)에 2010년 6월 3일자로 기탁되어 수탁번호 10060301로 지정된 하이브리도마 세포주에 의해 생산된 항체의 상보성 결정 영역(CDRs) VLCDR1, VLCDR2, VLCDR3, VHCDR1, VHCDR2 및 VHCDR3을 포함하는 것인, 하이브리도마 세포주.
  16. 제14항에 있어서, 항체가 하기를 포함하는 것인, 하이브리도마 세포주:
    유럽 세포 배양 보관 기관(ECACC)에 2010년 6월 3일자로 기탁되어 수탁번호 10060301로 지정된 하이브리도마 세포주에 의해 생산된 경쇄 가변 영역, 및
    개개의 아미노산 서열이 하기와 같은, 상보성 결정 영역(CDRs) VHCDR1, VHCDR2 및 VHCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역:
    VHCDR1은 GYTFTNYWIG이고,
    VHCDR2는 DIYPGGDYTNYNEKFKG이고,
    VHCDR3은 WGLGYYFDY임.
  17. 제15항에 있어서, 유럽 세포 배양 보관 기관(ECACC)에 2010년 6월 3일자로 기탁되어 수탁번호 10060301로 지정된, 하이브리도마 세포주.
  18. T 세포 매개된 질환의 치료에 사용하기 위한 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 단편을 포함하는 약학적 조성물로서, 상기 T 세포 매개된 질환이 이식편 대 숙주 질환, 이식편 거부 및 자가면역 질환으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 약학적 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 또 다른 치료학적 활성제를 추가로 포함하는, 약학적 조성물.
  20. 제18항에 있어서, 상기 자가면역 질환이 류마티스성 관절염(RA), 다발성 경화증(MS), 전신 홍반성 낭창(SLE), 애디슨 질환, 그레이브 질환, 경피증, 다발성 근염, 당뇨병, 자가면역 포도망막염, 궤양성 대장염, 심상성 천포창, 염증성 장 질환, 자가면역 갑상선염, 포도막염, 베쳇트 질환, 소그렌 증후군 및 건선으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인, 약학적 조성물.
  21. 제20항에 있어서, 상기 자가면역 질환이 류마티스성 관절염(RA), 다발성 경화증(MS) 및 전신 홍반성 낭창(SLE)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인, 약학적 조성물.
  22. 제20항에 있어서, 상기 자가면역 질환이 류마티스성 관절염(RA) 또는 다발성 경화증(MS)인 것인, 약학적 조성물.
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