KR20020000642A

KR20020000642A - 프탈라진 유도체의 용도

Info

Publication number: KR20020000642A
Application number: KR1020017014342A
Authority: KR
Inventors: 빌프리트 루비슈; 옌스 사도우스키; 미하엘 콕크; 토마스 회거
Original assignee: 스타르크, 카르크; 바스프 악티엔게젤샤프트
Priority date: 1999-05-11
Filing date: 2000-05-03
Publication date: 2002-01-05
Also published as: CN1399573A; CA2372704A1; ATE357272T1; BG106056A; SK286676B6; EP1231982A2; NO20015462L; WO2000067734A2; PL352150A1; DE19921567A1; JP2003502286A; TR200103236T2; EP1231982B1; BR0010428A; HUP0202477A2; WO2000067734A3; AU5064000A; IL146148A0; CZ20014038A3; ES2284499T3

Abstract

본 발명은 효소인 폴리(ADP-리보스) 폴리머라제 또는 PARP (EC 2.4.2.30)의 억제제로서의 프탈라진 유도체의 용도에 관한 것이고, PARP 상동성 효소의 억제제로서의 프탈라진 유도체의 용도에 관한 것이다. 또한 상기 유도체는 특히 PARP 상동성 효소를 선택적으로 억제한다.

Description

프탈라진 유도체의 용도 {Use of Phthalazine Derivatives}

본 발명은 효소인 폴리(ADP-리보스) 폴리머라제 또는 PARP (EC 2.4.2.30)의 억제제로서의 프탈라진 유도체의 용도에 관한 것이고, 또한 상기 유도체는 특히 PARP 상동성 효소를 선택적으로 억제하므로 PARP 상동성 효소의 억제제로서의 프탈라진 유도체의 용도에 관한 것이다.

폴리(ADP-리보스) 신타제 (PARS)라고도 알려져 있는 폴리(ADP-리보스) 폴리머라제 (PARP)는 세포 핵에서 발견되는 조절 효소이다 (문헌 [K. Ikai et al., J. Histochem. Cytochem. 1983, 31, 1261-1264] 참조). PARP는 DNA 파괴 복구에 관여하는 것으로 추측된다 (문헌 [M.S. Satoh et al., Nature 1992, 356, 356-358] 참조). DNA 가닥의 손상 또는 파괴는 PARP 효소를 활성화시키고, 이렇게 활성화된 효소는 NAD로부터 ADP-리보스의 전달을 촉매한다 (문헌 [S. Shaw, Adv. Radiat. Biol., 1984, 11, 1-69] 참조). 이러는 동안, 니코틴아미드가 NAD로부터 방출된다. 니코틴아미드는 다른 효소에 의해 에너지 운반체인 ATP를 소비하면서 NAD로 다시 전환된다. 그러므로, PARP의 과활성화는 비생리적으로 다량의 ATP를 소비하게 될 것이며, 이는 극한 경우, 세포 손상 및 세포 사멸을 초래한다.

과산화 음이온, NO 및 과산화수소 등과 같은 유리 라디칼이 세포에서 DNA 손상을 초래하여 PARP를 활성화시킬 수 있음은 공지되어 있다. 다량의 유리 라디칼형성이 여러 병태생리적 상태에서 관측되는데, 이로부터 이러한 유리 라디칼의 축적이 관측 세포 또는 기관의 손상을 일으키거나 이에 기여한다고 추측된다. 이러한 상태에는 예를 들어, 졸중, 심근경색에서 기관의 허혈 상태 (문헌 [C. Thiemermann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, 94, 679-683] 참조) 또는 신장의 허혈증 뿐 아니라, 예를 들면, 심근경색의 라이시스 (lysis) 후에 발생하는 것과 같은 재관류 손상 (상기 문헌 [C. Thiemermann et al.] 참조) 등이 포함된다. 그러므로, PARP 효소의 억제는 이러한 손상을 적어도 부분적으로 예방 또는 완화하는 수단이 될 수 있다. 그러므로, PARP 억제제는 여러 질병을 치료하는 신규 치료 성분이 될 수 있다.

PARP 효소는 DNA 손상 복구에 영향을 주며, 또한 세포증식억제 활성이 있는 물질과 함께 사용할 때 종양 조직에 대해 더 큰 활성 전위가 관측되었기 때문에 암 요법에서 역할을 할 수 있다 (문헌 [G. Chen et al., Cancer Chemo. Pharmacol. 1988, 22, 303] 참조).

또한, PARP 억제제가 면역억제 효과를 나타낼 수 있음이 밝혀졌다 (문헌 [D. Weltin et al., Int. J. Immunopharmacol. 1995, 17, 265-271] 참조).

마찬가지로, PARP는 예를 들어 류마티스성 관절염 및 패혈성 쇼크 등과 같이 면역계가 중요한 역할을 하는 면역학적 질환 또는 질병에 관여하며, PARP 억제제는 상기 질병의 진행에 유리한 효과를 나타낼 수 있다는 것도 밝혀졌다 (문헌 [H. Kroeger et al., Inflammation 1996, 20, 203-215], 문헌 [W. Ehrlich et al., Rheumatol. Int. 1995, 15, 171-172], 문헌 [C. Szabo et al., Proc. Natl. Acad.Sci. USA 1998, 95, 3867-3872], 문헌 [S. Cuzzocrea et al., Eur. J. Pharmacol. 1998, 342, 67-76] 참조).

또한, PARP 억제제인 3-아미노벤즈아미드는 순환계 기능부전 모델에서 보호 효과를 나타냈다 (문헌 [S. Cuzzocrea et al., Br. J. Pharmacol. 1997, 121, 1065-1074] 참조).

마찬가지로, PARP 효소 억제제가 진성 당뇨병 치료용 작용제로서 유용할 수 있다는 실험적 증거가 있다 (문헌 [V. Burkhart et al., Nature Med. 1999, 5, 314-319] 참조).

프탈라진 및 그의 유도체는 널리 사용되는 물질들의 클래스이다. 그러나, 4번 위치에 치환체를 추가로 갖는 2H-프탈라진-1-온은 현재까지 널리 개시되지 않았다. 그러므로, 메틸렌아미드, 메틸렌우레아 및 메틸렌이미드는 문헌 [Puodzhyunas et al., Pharm. Chem. J. 1973, 7, 566], 문헌 [W. Mazkanowa et al., Zh. Obshch. Khim. 1958, 28, 2822] 및 문헌 [F.K. Mohamed et al., Ind. J. Chem. B, 1994, 33, 769]에 기술되어 있다. 아미노 기가 시클릭 아민 및 지방족 아민 둘 다일 수 있는 시클릭 아민 및 알킬아민에 관한 것은, 항-죽상경화 (粥狀硬化) 효과, 혈액 혈소판 응집 억제 또는 혈압 저하에 대해 조사한 것이긴 하지만, 문헌 [J. Singh et al., Ind. J. Chem. B, 1983, 22, 1083], 문헌 [Y. Egushi et al., Chem Pharm. Bull. 1991, 9, 1846] 및 문헌 [Iyo Kizai Kenkyusho Hokoku, 1998, 12, 41 (CA 91, 91579)]에 기술되어 있다. WO 99/11649는 4번 위치에 페닐피페라지닐메틸 라디칼을 갖는 프탈라지논에 대해 언급하면서, 이를 PARP 효소 억제제로 기술하고 있다.

4번 위치에 페녹시메틸 유도체를 갖는 2H-프탈라지논은 문헌 [A.M. Bernard et al., Synthesis 1998, 317]에 따라 제조된다.

놀랍게도, 본 발명은 PARP 억제제인 하기 화학식 I의 신규 프탈라진 유도체에 관해 기술한다.

또한 놀랍게도, 이러한 화학식 I의 화합물들은 PARP 상동성 효소 역시 억제한다는 것이 밝혀졌다. 또한 놀랍게도, 이 화합물들은 PARP 상동성 효소를 선택적으로 억제하는데, 즉, 이 화합물들은 PARP 효소 그 자체보다 그의 상동성 효소를 더 강력하게 억제한다.

본 발명에 따른 프탈라진은 공지된 PARP (PARP1)에 대해서보다 PARP 상동체 (PARP2)에 대해 5 배 더 강력한 억제 효과를 나타내는 것이 바람직하다.

특히, PARP 상동체란 WO 99/64572에서 청구되는 PARP2 상동체 (인간 PARP2)를 의미한다. 이것은 인간 뇌, 심장, 골격근, 신장 및 간으로부터 유리하게 단리할 수 있다. 다른 조직 및 기관에서는 인간 PARP2의 발현이 뚜렷하게 적다.

인간 뇌로부터 단리할 수 있는 인간 PARP2, 및 그의 기능적 등가물은 졸중 억제제 개발에 있어서 특히 바람직한 작용제이다. 이는 지시제로서 PARP2 기재의 활성 물질을 개발하는 것이 인간 뇌에 사용하기에 최적인 억제제 개발을 가능케 할 것이라 추측되기 때문이다. 그러나, PARP2를 기재로 개발된 억제제는 다른 기관에서 PARP가 매개하는 병리적 상태의 요법에도 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 단백질 조직 분포를 바탕으로, 특히 관심있는 징후로는 적절한 기관의 허혈 상태 (뇌의 허혈 (졸중), 심장의 허혈 (심근경색), 경색 라이시스 (예를 들면, TPA, 레테플라제 (Reteplase), 또는 기계적 레이저 또는 로타블레이터 등을 사용) 중에 및 후에 발생한 손상, 및 심장 판막 대체술, 동맥류 절제술 및 심장 이식 중에 및 후에 발생한 미소경색, 신장 손상 (급성 신부전증, 급성 신장 부전, 또는 신장 이식 중에 및 후에 발생하는 손상), 간 또는 골격근 손상) 등이 있다. 또한, 허혈, 외상 (두개뇌외상), 다량 출혈, 거미막하 출혈 및 졸중 후에 발생하는 신경퇴행성 질병, 및 다중-경색 치매, 알쯔하이머병, 헌팅톤병 등과 같은 신경퇴행성 질병, 및 간질, 특히 전신성 간질 발작, 예를 들면 소발작 및 강직간대성 발작, 및 국소성 간질 발작, 예를 들면 측두엽 및 복합적인 국소성 발작의 치료 및 예방도 고려할 수 있다. 또한, 상기 단백질들은 매우 좁은 관상 동맥의 혈관재생 치료 및 매우 좁은 말초 동맥, 예를 들면 다리 동맥의 혈관재생 치료에도 사용될 수 있다. 또한, 상기 단백질들은 종양의 화학요법 및 전이 예방, 및 류마티스성 관절염 등과 같은 류마티스성 질환 및 염증 치료에서도 역할을 할 수 있다. 이들 기관 및 기타 기관들의 다른 병리적 상태도 고려할 수 있다.

PARP2의 활성화 메카니즘은 PARP1의 것과 상이한 것으로 추정되지만, 이 효소가 손상된 DNA에 의해 활성화된다는 점에서는 PARP1과 유사하다. 이는 DNA 복구에 중요한 효소라는 것을 고려할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 PARP 억제는 암 등에서의 징후 (예를 들면, 종양 환자의 방사선 민감화)에도 유리할 것이다.

본 발명에서는 PARP1 및 PARP2의 결합 파트너에 대해 상기 기술한 특이적 분석 시스템을 사용하여 상기 단백질들의 활성적 및 선택적 억제제를 개발했다.

본 발명에 따라 제공되는 억제제는 PARP2에 대해 매우 두드러진 억제 활성을 갖는다. 이 경우의 K_i값은 예를 들어 약 700 nM 미만, 약 100 nM 미만, 및 약 30 nM 미만, 예를 들면 약 1 내지 20 nM 등과 같이 약 1000 nM 미만일 수 있다.

놀랍게도, 본 발명에 따른 바람직한 억제제는 PARP2에 대해 두드러진 선택성을 갖는다. 그러므로, 본 발명에 따른 억제제의 K_i(PARP1) : K_i(PARP2) 비는 예를 들어 5 보다 크다. PARP1 및 PARP2를 동시에 억제하는 다른 군의 억제제를 개발했다.

재조합 핵산 구조물 또는 재조합 유전자 구조물이 적절한 숙주 생물에서 발현되도록 하기 위해, 상기 구조물을 이들이 그 숙주에서 최적으로 발현되게 하는 숙주 특이적 벡터로 유리하게 삽입했다. 벡터는 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들면 문헌 ["Cloning Vectors", Pouwels P.H. et al., editors, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985]에서 찾을 수 있다. 벡터란 플라스미드 이외에도 당업자에게 공지된 다른 모든 벡터, 예를 들면, 파지, SV40, CMV, 바쿨로바이러스 및 아데노바이러스 등의 바이러스, 트랜스포손 (transposon), 삽입요소 (IS element), 파스미드 (phasmid), 코스미드, 및 선형 또는 환형 DNA 등을 의미한다. 상기 벡터들은 숙주 생물에서 자동 복제되거나 염색체 복제시 자동 복제될 수 있다.

구조물의 발현

상기 기술한 본 발명에 따른 재조합 구조물을 적절한 숙주 시스템에 도입하여 발현시키는 것이 유리하다. 이와 관련해서, 당업자에게 공지되어 있는 통상적 클로닝 방법 및 형질감염 방법을 사용하여 상기 핵산을 특정 발현 시스템에서 발현시키는 것이 바람직하다. 적절한 시스템은 예를 들어 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al., editors, Wiley Interscience, New York, 1997]에 기술되어 있다.

원칙적으로, 적절한 숙주 생물은 본 발명에 따른 핵산, 그의 대립유전자 변이체, 그의 기능적 등가물 또는 유도체의 발현 또는 재조합 핵산 구조물의 발현을 가능케하는 모든 생물이다. 숙주 생물이란 예를 들어 박테리아, 진균, 효모, 식물 세포 또는 동물 세포 등을 의미한다. 바람직한 생물로는 에쉐리히아 (Escherichia) 속에 속하는 박테리아, 예를 들면, 대장균 (Escherichia coli), 스트렙토마이세스 (Streptomyces), 바실러스 (Bacillus) 또는 슈도모나스 (Pseudomonas), 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae), 아스페르질루스 (Aspergillus) 등과 같은 진핵 미생물, Sf9 또는 CHO 세포 등과 같은 동물 또는 식물의 고등 진행 세포 등이 있다.

필요하다면, 상기 유전자 생성물을 형질전환 생물, 특히 마우스, 양 등의 형질전환 동물 또는 형질전환 식물 등에서 발현시킬 수도 있다. 상기 형질전환 생물은 돌연변이 또는 부분적 또는 완전한 결실 등에 의해 상응하는 내인성 유전자가 차단 (switch off)된 소위 녹아웃 (knockout) 동물 또는 식물일 수도 있다.

숙주 생물 및 그 생물에 적합한 벡터, 예를 들어 플라스미드, 바이러스 또는 파지, 예를 들어 RNA-폴리머라제/프로모터 시스템을 갖는 플라스미드, 파지 λ, μ또는 다른 적당한 파지 또는 트랜스포손 및 (또는) 다른 유리한 조절 서열의 조합물이 발현 시스템을 형성한다. 발현 시스템이라는 용어는 바람직하게는 CHO 세포 등의 포유동물 세포와 pcDNA3neo 벡터 등과 같이 포유동물 세포에 적절한 벡터의 조합물을 의미한다.

상기 기술한 바와 같이, 상기 유전자 생성물을 형질전환 생물, 마우스, 양 등의 형질전환 동물 또는 형질전환 식물 등에서 발현시킬 수도 있다. 마찬가지로, 상기 핵산에서 유도된 RNA를 이용한 무세포 (cell-free) 번역 시스템을 계획할 수도 있다.

항체의 제조

항-PARP2 항체는 당업자에게 통상적인 방식으로 제조한다. 항체란 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 인간 항체 또는 인간화 항체 또는 그의 단편, 단쇄 항체 또는 그밖의 합성 항체, 및 Fv, Fab 및 F (ab')₂등의 항체 단편을 의미한다. 적절한 제조 방법은 문헌 [Campbell, A.M., Monoclonal Antibody Technology (1987), Elsevier Verlag, Amsterdam, New York, Oxford) 및 문헌 [Breitling, F. 및 Duebel, S., Rekombinante Antikoerper (1997), Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg] 등에 기술되어 있다.

실시예 A: PARP2 cDNA의 단리

본 발명에 따른 cDNA 서열을 인간 뇌 cDNA 라이브러리의 cDNA 클론 (인간 뇌5' 스트레치 플러스 cDNA 라이브러리, # HL3002a, Clontech 제품)을 서열분석하면서 처음으로 발견했다. 이 클론의 서열은 상기에 서열 1로 기술되어 있다.

실시예 B: 효소의 제조

비교하기 위해서, 인간 PARP1을 당업자에게 통상적인 방식으로 바쿨로바이러스 시스템에서 재조합 발현시키고, 문헌 [Shah et al., Analytical Biochemistry, 1995, 227, 1-13]에 기술된 바와 같이 부분적으로 정제했다. 순도 30-50％의 소 PARP1 (c = 0.22 mg/ml, 25℃에서 총 단백질의 비활성 (比活性)은 ADP-리보스 170 nmol/min/mg)을 BIOMOL로부터 구입 (주문 번호: SE-165)했다. 인간 PARP2를 바쿨로바이러스 시스템 (Bac-to-Bac 시스템, BRL LifeScience 제품)에서 재조합 발현시켰다. 이러한 목적을 위해서, 상응하는 cDNA를 pFASTBAC-1 벡터로 클로닝했다. 대장균에서의 재조합으로 재조합 바쿨로바이러스 DNA를 제조한 후, 이 재조합 바쿨로바이러스 DNA를 곤충 세포 (Sf9 또는 하이파이브 (high five))에 형질감염시켰다. 상응하는 단백질이 발현됨을 웨스턴 블럿팅으로 검증했다. 당업자에게 통상적인 방식으로 바이러스 균주를 증폭시켰다. 바이러스를 사용하여 MOI (감염다중도; 세포에 대한 바이러스의 비율) 5-10으로 곤충 세포 배양물 (2 ×10⁶세포/ml) 500 ml을 감염시키고 3 내지 4 일 동안 인큐베이션시켜 다량의 재조합 단백질을 발현시켰다. 그 다음, 상기 곤충 세포를 원심분리로 펠렛화하고, 이 펠렛으로부터 상기 단백질을 정제했다.

당업자에게 통상적인, 전형적인 단백질 정제 방법으로 단백질을 정제하고,적절한 특이적 항체를 사용하여 효소를 검출했다. 또한 일부의 경우, 상기 단백질들을 문헌 [Burtscher et al., Anal Biochem 1986, 152:285-290]에 기술되어 있는 바와 같이 3-아미노벤즈아미드 친화성 컬럼상에서 친화성 정제했다. 순도는 90％보다 높았다.

실시예 C: PARP2의 활성 및 PARP1 및 PARP2에 대한 이펙터들의 억제 효과를 측정하기 위한 분석 시스템

a) 폴리(ADP-리보스)에 대한 항체의 제조

폴리(ADP-리보스)를 항원으로 사용하여 항-폴리(ADP-리보스) 항체를 생성할 수 있다. 항-폴리(ADP-리보스) 항체의 제조 방법은 문헌 [Kanai Y et al. (1974) Biochem Biophys Res Comm 59:1, 300-306; Kawamaitsu H et al. (1984) Biochemistry 23, 3 77 1-3777; Kanai Y et al. (1978) Immunology 34, 501-508]에 기술되어 있다.

특히, BIOMOL로부터 구입한 항-폴리(ADP-리보스) 항체 (토끼에서 유도한 폴리클로날 항혈청 항체, 주문 번호: SA-276)를 사용했다. 또한, 항-폴리(ADP-리보스) 항체 (마우스에서 유도한 모노클로날 항체, 클론 1OH, 하이브리도마 상층액을 친화성 정제하여 얻음)도 사용했다.

하이브리도마 배양물의 상층액으로부터 얻은 항혈청 또는 모노클로날 항체를 단백질 A 친화성 크로마토그래피를 사용하여 당업자에게 통상적인 방식으로 정제했다.

b) ELISA (엘리사) 분석법

물질: 엘리사 착색제 (TMB 믹스, SIGMA 제품, T-8540)

96-웰 마이크로타이터 플레이트 (Micro-Test IIIae 가요성 분석 플레이트, FALCON 제품, # 3912)를 히스톤 (SIGMA 제품, H-7755)으로 코팅했다. 이 목적을 위해, 히스톤을 탄산염 완충액 (0.05 M Na₂HCO₃, pH 9.4) 중에 50 ㎍/㎖의 농도로 용해시켰다. 마이크로타이터 플레이트 개개의 웰에 상기 히스톤 용액 150 ㎕를 넣고, 각각을 실온에서 2 시간 이상 인큐베이션시키거나 4℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 그 다음, 이 웰에 탄산염 완충액 중 1％ 농도의 BSA 용액 (SIGMA 제품, A-7888) 150 ㎕를 첨가하고, 실온에서 2 시간 동안 블록킹시켰다. 그 다음, 세척 완충액 (1 ×PBS 중의 0.05％ 트윈10 (Tween10); PBS (인산염완충염수, Gibco 제품, 주문 번호: 10010): KH₂PO₄0.21 g/L, NaCl 9 g/L, Na₂HPO₄·7H₂O 0.726 g/L, pH 7.4)으로 3 회 세척했다. 세척 단계는 모두 마이크로타이터 플레이트 세척기 ("컬럼버스 (Columbus)" 마이크로타이터 플레이트 세척기, 오스트리아 소재의 SLT-Labinstruments 제품) 중에서 수행했다.

효소 반응에는 효소 반응 용액 및 기질 용액이 필요하였으며, 각각 프리믹스 (premix) 형태이었다. 상기 용액들의 절대량은 의도한 분석 웰 개수에 따라 다르다.

웰 당 효소 반응 용액의 조성:

-PARP 반응 완충액 (1 M 트리스-HCl, pH 8.0, 100 mM MgCl₂, 10 mM DTT) 4 ㎕

-PARP1 (인간 또는 소) 20 ng 또는 PARP2 (인간) 8 ng

-활성화 DNA (1 mg/ml, SIGMA 제품, D-4522) 4 ㎕

-H₂O 40 ㎕ 이하

웰 당 기질 용액의 조성:

-PARP 반응 완충액 (10 ×) 5 ㎕

-NAD 용액 (10 mM, SIGMA 제품, N-1511) 0.8 ㎕

-H₂O 44 ㎕

1 × PARP 반응 완충액에 억제제를 용해시켰다. 더 높은 농도의 억제제 용해에 종종 사용되는 DMSO는 최종 농도 2％까지 문제가 없었다. 각 웰에 효소 반응을 위한 효소 반응 용액 40 ㎕ 및 억제제 용액 10 ㎕를 넣고, 10 분 동안 인큐베이션시켰다. 그 다음, 각 웰에 기질 용액 50 ㎕를 첨가하여 효소 반응을 개시했다. 실온에서 30 분 동안 반응시킨 후, 세척 완충액으로 3 회 세척하여 중지시켰다.

사용한 1차 항체는 1 : 5000으로 희석한 특이적 항-폴리(ADP-리보스) 항체였다. 희석은 항체 완충액 (PBS 중의 1％ BSA; 0.05％ 트윈20) 중에서 수행했다. 실온에서 1차 항체를 1 시간 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 세척 완충액으로 3 회 세척한 후, 2차 항체 (퍼옥시다제와 커플링된 항-마우스 IgG의 Fab 단편, Boehringer Mannheim 제품, 주문 번호: 1500.686; 퍼옥시다제와 커플링된 항-래빗 IgG, SIGMA 제품, 주문 번호: A-6154)를 항체 완충액에 1 : 10,000으로 희석하여 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션시켰다. 세척 완충액으로 3 회 세척한 후, 웰당착색제 (TMB 믹스, SIGMA 제품) 100 ㎕를 사용하여 실온에서 약 15분 동안 착색 반응시켰다. 2M H₂SO₄100 ㎕를 첨가하여 착색 반응을 중지시켰다. 그 다음, 엘리사 (ELISA) 플레이트 판독기 (EAR340AT "이지 리더 (Easy Reader)", 오스트리아 소재의 SLT-Labinstruments 제품)에서 즉시 측정했다 (450 nm 대 620 nm). 측정 원리는 상기의 도 6에 도식적으로 나타나있다.

다양한 농도에서의 투여량-효과 플롯을 작성하여 억제제의 K_i를 결정했다. 특정한 억제제 농도에 대하여 3 회씩 반복하여 상기 값을 구했다. 마이크로소프트 (Microsoft) (등록상표) 엑셀을 사용하여 계산했다. 마이크로칼 (Microcal) (등록상표) 오리진 소프트웨어 (Origin Software) (버젼 5.0) ("S자형 피트 (Sigmoidal Fit)")를 사용하여 IC₅₀을 결정했다. 이렇게 계산한 IC₅₀값을 "보정 억제제 (calibration inhibitors)"를 사용하여 K_i값으로 변환시켰다. 또한 각각의 분석에서 "보정 억제제"를 측정했다. "보정 억제제"의 K_i값은 당업자에게 통상적인 방식의 딕슨 (Dixon) 도표 분석법을 사용하여 동일 분석 시스템에서 측정했다.

c) HTRF (Homogeneous Time-Resolved Fluorescence) 분석

본 발명에 따른 HTRF PARP 분석에서, XL665 형광단을 사용하여 표적 단백질로서 히스톤을 표지함으로써 PARP를 간접 표지했다. 항체는 유로퓸 크립테이트 (cryptate)로 직접 표지했다. XL665 형광단이 공간상 바로 인접해 있는 경우 (이는 히스톤 상의 폴리(ADP-리보스)에 결합함으로써 가능함), 에너지 전달이 가능했다. 그러므로, 665 nm에서의 방사량은 결합한 항체의 양에 직접 비례하고, 이는 폴리(ADP-리보스)의 양에 등가였다. 그러므로, 측정된 신호는 PARP 활성에 상응했다. 측정 원리는 상기의 도 7에 도식적으로 나타나있다. 특별히 언급하지 않는한, 사용한 물질은 엘리사 (상기 참조)에 사용한 물질과 동일했다.

히스톤을 헤페스 (Hepes) 완충액 (50 mM, pH =7.5) 중에 3 mg/㎖의 농도로 용해시켰다. 술포-NHS-LC-바이오틴 (Pierce 제품, # 21335T)을 사용하여 바이오틴화시켰다. 히스톤 1 몰에 대해 사용한 바이오틴의 몰비는 4였다. 실온에서 90 분 동안 인큐베이션시켰다. 그 다음, 바이오틴화된 히스톤을 헤페스 완충액 (50 mM, pH = 7.0) 중의 G25SF HR10/10 컬럼 (Pharmacia 제품, 17-0591-01) 상에서 정제하여 과량의 바이오틴화 시약을 제거했다. 이관능성 커플링 시약을 사용하여 항-폴리(ADP-리보스) 항체를 유로퓸 크립테이트로 표지했다 (문헌 [Lopez, E. et al., Clin. Chem. 39(2), 196-201 (1993), 미국 특허 제5,534,662호] 참조). G25SF HR10/30 컬럼 상에서 정제했다. 항체 1 몰에 대한 크립테이트의 몰비는 3.1이었다. 수율은 25％였다. 접합체를 인산염 완충액 (0.1 M, pH = 7) 중 0.1％ BSA의 존재하에 -80℃에서 저장했다.

효소 반응을 위해, 각 웰에 하기의 성분을 피펫으로 첨가했다:

- PARP HTRF 반응 완충액 (50 mM 트리스-HCl, pH 8.0, 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT) 중의 PARP 용액 10 ㎕ 및 PARP1 (인간 또는 소) 20 ng 또는 PARP2 (인간) 8 ng,

- PARP HTRF 반응 완충액 (50 ㎍/ml) 중의 활성화 DNA 10 ㎕

- PARP HTRF 반응 완충액 (1.25 μM) 중의 바이오틴화된 히스톤 10 ㎕

- PARP HTRF 반응 완충액 중의 억제제 10 ㎕

상기 시약을 2 분 동안 예비인큐베이션시킨 후에, PARP HTRF 반응 완충액 (400 μM/ml) 중의 NAD 용액 10 ㎕를 첨가하여 반응 개시했다. 실온에서 30 분 동안 반응시켰다.

그 다음, "레벨레이션 (Revelation)" 완충액 (100 mM, 트리스-HCl, pH 7.2, 0.2 M KF, 0.05％ BSA) 중의 PARP 억제제 (25 μM, K_i= 10 nM) 10 ㎕를 첨가하여 반응을 중지시켰다.

그 다음, 하기의 성분을 첨가했다:

-EDTA 용액 (SIGMA 제품, E-7889, H₂O 중 0.5 M) 10 ㎕

-"레벨레이션" 완충액 (15-31.25 nM) 중의 Sa-XL665 (Packard Instruments 제품) 100 ㎕

-"레벨레이션" 완충액 (1.6-3.3 nM) 중의 항-PARP 크립테이트 50 ㎕

이로부터 30 분 (최대 4 시간) 후, 측정이 가능했다. "디스커버리 HTRF 마이크로플레이트 애널라이져 (Discovery HTRF Microplate Analyzer)" (Packard Instruments 제품)를 사용하여 측정했다. 엘리사에 대해 기술된 바와 같이 K_i값을 계산했다.

본 발명은 하기 화학식 I의 치환된 프탈라진 및 그의 호변이성질체 형태, 가능한 거울상 이성질체 형태 및 부분입체 이성질체 형태, 및 그의 전구약물의 용도에 관한 것이다.

상기 식에서,

R¹은 수소, 염소, 불소, 브롬, 요오드, 분지 및 비분지 C₁-C₆-알킬, OH, 니트로, CF₃, CN, NR¹¹R¹², NH-CO-R¹³, O-C₁-C₄-알킬이며, 이 때 R¹¹및 R¹²는 서로 독립적으로 수소 또는 C₁-C₄-알킬이며, R¹³은 수소, C₁-C₄-알킬, 페닐-C₁-C₄-알킬 또는 페닐이고,

A¹는 직쇄 또는 분지 C₀-C₆-알킬 라디칼이고,

A²는 NR², NR²-C₁-C₆-알킬, O 및 S이고,

R²는 수소 및 C₁-C₆-알킬이고,

A³은 각각의 경우, 5 또는 6 개의 고리 원자 및 N, O, S로부터 선택된 3 개이하의 헤테로원자를 갖는 방향족 또는 헤테로방향족 고리로서, 예를 들면, 페닐, 티오펜, 피리딘, 피리미딘, 나프탈렌, 인돌, 이미다졸이고, 이는 또한 R⁴및 1 개 또는 2 개의 R³로 치환될 수도 있으며, 이 때 R³은 수소, 염소, 불소, 브롬, 요오드, 분지 및 비분지 C₁-C₆-알킬, OH, 니트로, CF₃, CN, NR¹¹R¹², SO₂NR¹¹R¹², SO₂-C₁-C₄-알킬, S-C₁-C₄-알킬, O-Ph, O-CF₃, NH-CO-R¹³, O-C₁-C₄-알킬이며, 이 때 R¹¹및 R¹²는 서로 독립적으로 수소 또는 C₁-C₄-알킬이며, R¹³은 수소, C₁-C₄-알킬, 페닐-C₁-C₄-알킬 또는 페닐일 수 있고,

R⁴는 수소, (X)_0,1-C₁-C₄-알킬-NR⁴¹R⁴²이며, 이 때 X = O, S 및 NR⁴³이고, R⁴¹및 R⁴²는 서로 독립적으로 수소, C₁-C₆-알킬, 페닐-C₁-C₄-알킬 및 3 내지 7-원의 시클릭 아민일 수 있고, R⁴³은 수소 및 C₁-C₄-알킬일 수 있다.

화학식 I의 화합물은, 라세미체, 거울상 이성질체적으로 순수한 화합물 또는 부분입체 이성질체로서 사용될 수 있다. 거울상 이성질체적으로 순수한 화합물이 요구되는 경우, 이들 화합물들은 예를 들어 적합한 광학 활성의 염기 또는 산을 사용하여 화학식 I의 화합물 또는 그의 중간체 상에서의 고전적인 라세미체 분할을 수행함으로써 얻어질 수 있다.

또한, 본 발명은 화학식 I의 화합물의 메소머 또는 호변이성질체인 화합물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 화학식 I의 화합물과 적합한 산 또는 염기를 반응시켜 얻을 수 있는 화학식 I의 화합물의 생리적으로 허용되는 염에 관한 것이다. 적합한 산 및 염기의 예가 문헌 [Fortschritte der Arzneimittelforschung, 1966, Birkhaeuser Verlag, Volume 10, pp.224-285]에 열거되어 있다. 이들의 예로는 염산, 시트르산, 타르타르산, 락트산, 인산, 메탄술폰산, 아세트산, 포름산, 말레산, 푸마르산 등, 및 수산화나트륨, 수산화리튬, 수산화칼륨 및 트리스 등이 있다.

전구약물이란 생체 내에서 화학식 I의 화합물로 대사되는 화합물을 의미한다. 전형적인 전구약물로는 아미노산, 에스테르 등의 인산염, 카르밤산염이 있다.

본 발명에 따른 화학식 I의 프탈라진 유도체는 문헌에서 이미 수행한 여러가지 방법으로 제조할 수 있다.

가능한 합성 방법은 문헌 [Puodzhyunas et al., Pharm. Chem. J. 1973, 7, 566], 문헌 [W. Mazkanowa et al., Zh. Obshch. Khim. 1958, 28, 2822], 문헌 [F.K. Mohamed et al., Ind. J. Chem. B, 1994, 33, 769], 문헌 [J. Singh et al., Ind. J. Chem. B, 1983, 22, 1083], 문헌 [Y. Egushi et al., Chem Pharm. Bull. 1991, 9, 1846] 및 문헌 [Iyo Kizai Kenkyusho Hokoku, 1998, 12, 41 (CA 91, 91579)] 등에 기술되어 있거나 본원에서 언급했다. 본 발명에 따른 화합물은 상기에 기술된 것과 유사한 방법으로 제조할 수 있다.

본 발명에 포함되는, 화학식 I의 치환된 프탈라진은 효소인 폴리(ADP-리보스) 폴리머라제의 억제제이고, 특히 신규 PARP 상동성 효소에 대한 선택성을 나타낸다.

상기 화학식 I의 치환된 프탈라진 유도체의 억제 효과는 문헌에 기술되어 있는 효소 분석법을 이용하여 K_i값을 효과 지표로서 측정했다. 효소인 폴리(ADP-리보스) 폴리머라제 또는 PARP (EC 2.4.2.30)에 대한 상기 화학식 I의 프탈라진 유도체의 억제 효과를 이런 방식으로 측정했다.

4-(4-페닐피페라진-1-일)메틸-2H-프탈라진-1-온은 WO 99/11649에 PARP 억제제로 기술되었으며, 이는 본 발명에 따른 화합물과 구조적으로 관련이 있다. 이 화합물을 상기에서 PARP1 억제 효과 측정에 사용했던 HTRF 분석법으로 조사했다. 그러나, 이 화합물은 단지 약한 효과만을 나타냈다 (10 μM일 때 38％ 억제함).

놀랍게도, 본 발명에 따른 화합물이 PARP 효소를 억제할 뿐 아니라, 뚜렷하게 더 효과적임이 밝혀졌다 (표 참조).

실시예	PARP1 (K_I/μM)
1	0.62
4	0.19
11	1.80
16	0.78
17	0.74
18	0.69

화학식 I의 치환된 프탈라진 유도체는 폴리(ADP-리보스) 신타제 (PARS)라고도 알려져 있는 폴리(ADP-리보스) 폴리머라제 (PARP)의 억제제이므로, 이들 효소의 활성 증가와 관련이 있는 질병의 치료 및 예방에 이용할 수 있다.

화학식 I의 화합물을 사용하여 허혈 후의 손상 치료 및 다양한 기관에서 예상되는 허혈 예방용 약물을 제조할 수 있다.

그러므로, 본 발명에 따른 화학식 I의 프탈라진 유도체는 허혈, 외상 (두개뇌외상), 다량 출혈, 거미막하 출혈 및 졸중 후에 발생하는 신경퇴행성 질병, 및 다중-경색 치매, 알쯔하이머병, 헌팅톤병 등과 같은 신경퇴행성 질병, 및 간질, 특히 전신성 간질 발작, 예를 들면 소발작 및 강직간대성 발작, 및 국소성 간질 발작, 예를 들면 측두엽 및 복합적인 국소성 발작의 치료 및 예방에 사용될 수 있으며, 또한, 심허혈 후의 심장 손상 및 신장 허혈 (예를 들면, 급성 신장 부전, 급성 신부전증) 후의 신장 손상 또는 신장 이식 중에 및 후에 발생하는 손상의 치료 및 예방에 사용될 수 있다. 또한, 화학식 I의 화합물은 급성 심근경색 및 의약 라이시스 (예를 들면, TPA, 레테플라제, 스트렙토키나제, 또는 기계적 레이저 또는 로타블레이터 등을 사용) 중에 및 후에 발생한 손상, 및 심장 판막 대체술, 동맥류 절제술 및 심장 이식 중에 및 후에 발생한 미소경색을 치료하는 데 사용될 수 있다. 마찬가지로, 본 발명에 따른 화학식 I의 프탈라진은 PTCA 및 바이패스술 (bypass operation) 등과 같은 매우 좁은 관상 동맥의 혈관재생 치료 및 매우 좁은 말초 동맥, 예를 들면 다리 동맥의 혈관재생 치료에도 사용될 수 있다. 또한, 화학식 I의 프탈라진은 종양 및 그의 전이의 화학요법에 유용할 수 있고, 류마티스성 관절염 등과 같은 류마티스성 질환 및 염증 치료, 및 진성 당뇨병 치료에 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 제약 제제는 치료 유효량의 화학식 I의 화합물 및 통상적인 제약 부형제를 포함한다.

국소 외용제, 예를 들면 산제, 연고제 또는 분무제인 경우, 활성 성분은 통상적인 농도로 존재할 수 있다. 통상적으로, 활성 물질은 0.001 내지 1 중량％, 바람직하게는 0.001 내지 0.1 중량％의 양으로 존재한다.

내복용인 경우, 상기 제제는 단일 투여로 투여된다. 단일 투여로 체중 1 kg 당 0.1 내지 100 ㎎이 투여된다. 제제는 질환의 특성 및 심각도에 따라 1일 1 회 이상 투여될 수 있다.

요구되는 투여 방법에 따라, 본 발명에 따른 제약 제제는 활성 성분 및 통상적인 담체 및 희석제를 포함한다. 국소 외용을 위해, 에탄올, 이소프로판올, 에톡실화 피마자유, 에톡실화 수소화 피마자유, 폴리아크릴산, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 스테아레이트, 에톡실화 지방 알콜, 액상 파라핀, 바셀린 및 양모지 (wool fat) 등과 같은 제약 부형제를 사용할 수 있다. 내복용에 적절한 예에는 락토스, 프로필렌 글리콜, 에탄올, 전분, 활석 및 폴리비닐피롤리돈이 있다.

토코페롤 및 부틸화 히드록시아니솔, 및 부틸화 히드록시톨루엔 등과 같은 산화방지제, 향 개질 첨가제, 안정화제, 유화제 및 윤활제가 존재할 수도 있다.

활성 성분 외에 제제 내에 존재하는 물질 및 제약 제제의 제조에 사용되는 물질은 독성학적으로 허용가능하며, 특정 활성 화합물과 상용가능하다. 제약 제제는 통상적인 부형제 및 희석제와 활성 성분의 혼합 등과 같은 통상적인 방법으로 제조된다.

제약 제제는 다양한 투여 방법, 예를 들면 경구, 비경구, 예를 들면 정맥내 주입, 피하, 복강내 및 국소적으로 투여될 수 있다. 그러므로, 가능한 제공 형태는 정제, 에멀젼제, 주입 및 주사 용액제, 페이스트제, 연고제, 겔제, 크림제, 로션제, 살포제 및 분무제이다.

실시예 1

4(N(4-히드록시페닐)아미노메틸)-2H-프탈라진-1-온

실시예 2

4(N(4-(N,N-디메틸술파모일)페닐)아미노메틸)-2H-프탈라진-1-온

실시예 3

4(N(4-클로로페닐)아미노메틸)-2H-프탈라진-1-온

실시예 4

4(N-페닐아미노메틸)-2H-프탈라진-1-온

실시예 5

4(N(3-트리플루오로메틸페닐)아미노메틸)-2H-프탈라진-1-온

실시예 6

4(N(2-시아노페닐)아미노메틸)-2H-프탈라진-1-온

실시예 7

4(N(4-메톡시페닐)아미노메틸)-2H-프탈라진-1-온

실시예 8

4(N(2,4-디클로로페닐)아미노메틸-2H-프탈라진-1-온

실시예 9

4(N(4-니트로페닐)아미노메틸)-2H-프탈라진-1-온

실시예 10

4-(N(3-메틸메르캅토페닐)아미노메틸)-2 H-프탈라진-1-온

실시예 11

4(N(2,4-디플루오로페닐)아미노메틸)-2H-프탈라진-1-온

실시예 12

4(N(4-페녹시페닐)아미노메틸)-2H-프탈라진-1-온

실시예 13

4(N(4-트리플루오로메톡시페닐)아미노메틸)-2H-프탈라진-1-온

실시예 14

4(N(4-트리플루오로메틸페닐)아미노메틸-2H-프탈라진-1-온

실시예 15

4(N-메틸-N-페닐아미노메틸)-2H-프탈라진-1-온 ×HC1

실시예 16

4(S(4-클로로페닐)메르캅토메틸)-2H-프탈라진-1-온

실시예 17

4(S(1-메틸이미다졸-2-일)메르캅토메틸)-2H-프탈라진-1-온

실시예 18

4(N(5-메틸메르캅토-1,3,4-트리아졸-2-일)아미노메틸)-2H-프탈라진-1-온

실시예 19

4(S(2-피리딜)메르캅토메틸)-2H-프탈라진-1-온

Claims

폴리(ADP-리보스) 폴리머라제 (PARP)의 활성 증가와 관련이 있는 질환의 치료 또는 예방용 약물 제조에 있어서, 하기 화학식 I의 화합물 및 그의 호변이성질체 형태, 가능한 거울상 이성질체 형태 및 부분입체 이성질체 형태, 및 그의 전구약물의 용도.

<화학식 I>

상기 식에서,

R¹은 수소, 염소, 불소, 브롬, 요오드, 분지 및 비분지 C₁-C₆-알킬, OH, 니트로, CF₃, CN, NR¹¹R¹², NH-CO-R¹³, O-C₁-C₄-알킬이며, 이 때 R¹¹및 R¹²는 서로 독립적으로 수소 또는 C₁-C₄-알킬이며, R¹³은 수소, C₁-C₄-알킬, 페닐-C₁-C₄-알킬 또는 페닐이고,

A¹는 직쇄 또는 분지 C₀-C₆-알킬 라디칼이고,

A²는 NR², NR²-C₁-C₆-알킬, O 및 S이고,

R²는 수소 및 C₁-C₆-알킬이고,

A³은 각각의 경우, 5 또는 6 개의 고리 원자 및 N, O, S로부터 선택된 3 개 이하의 헤테로원자를 갖는 방향족 또는 헤테로방향족 고리로서, 이는 또한 R⁴및 1 개 또는 2 개의 R³로 치환될 수도 있으며, 이 때 R³은 수소, 염소, 불소, 브롬, 요오드, 분지 및 비분지 C₁-C₆-알킬, OH, 니트로, CF₃, CN, NR¹¹R¹², SO₂NR¹¹R¹², SO₂-C₁-C₄-알킬, S-C₁-C₄-알킬, O-Ph, O-CF₃, NH-CO-R¹³, O-C₁-C₄-알킬이며, 이 때 R¹¹및 R¹²는 서로 독립적으로 수소 또는 C₁-C₄-알킬이며, R¹³은 수소, C₁-C₄-알킬, 페닐-C₁-C₄-알킬 또는 페닐일 수 있고,

R⁴는 수소, (X)_0,1-C₁-C₄-알킬-NR⁴¹R⁴²이며, 이 때 X = O, S 및 NR⁴³이고, R⁴¹및 R⁴²는 서로 독립적으로 수소, C₁-C₆-알킬, 페닐-C₁-C₄-알킬 및 3 내지 7-원의 시클릭 아민일 수 있고, R⁴³은 수소 및 C₁-C₄-알킬일 수 있다.
제1항에 있어서, PARP 상동성 효소 또는 PARS 상동성 효소의 억제제로서의 화학식 I의 화합물의 용도.
제1항에 있어서, PARP 또는 PARS 그 자체와 비교하여 PARP 상동성 효소 또는 PARS 상동성 효소를 선택적으로 억제하는, 상기 PARP 상동체 또는 PARS 상동체의 억제제로서의 화학식 I의 화합물의 용도.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 신경퇴행성 질환 및 신경 손상 치료용 약물을 제조하기 위한 화학식 I의 화합물의 용도.
제4항에 있어서, 허혈, 외상 또는 다량 출혈에 의해 초래되는 신경퇴행성 질환 및 신경 손상 치료를 위한 용도.
제4항에 있어서, 졸중 및 두개뇌외상의 치료를 위한 용도.
제4항에 있어서, 알쯔하이머병, 파킨슨병 및 헌팅톤병의 치료를 위한 용도.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 허혈에 기인한 손상의 치료 또는 예방용 약물을 제조하기 위한 화학식 I의 화합물의 용도.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 간질, 특히 전신성 간질 발작, 예를 들면 소발작 및 강직간대성 발작, 및 국소성 간질 발작, 예를 들면 측두엽 및 복합적인 국소성 발작의 치료용 약물을 제조하기 위한 화학식 I의 화합물의 용도.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 신장 허혈 후의 신장 손상 또는 신장 이식 중에 및 후에 발생하는 손상의 치료용 약물을 제조하기 위한 화학식 I의 화합물의 용도.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 심허혈 후의 심장 손상의 치료용 약물을 제조하기 위한 화학식 I의 화합물의 용도.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 예를 들면, 심장 판막 대체술, 동맥류 절제술 및 심장 이식 중에 및 후에 발생한 미소경색의 치료용 약물을 제조하기 위한 화학식 I의 화합물의 용도.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, PTCA 및 바이패스술 (bypass operation) 등과 같은 매우 좁은 관상 동맥의 혈관재생 치료 또는 매우 좁은 말초 동맥, 특히 다리 동맥의 혈관재생 치료용 약물을 제조하기 위한 화학식 I의 화합물의 용도.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 급성 심근경색 및 의약적 또는 기계적 라이시스 (lysis) 중에 및 후에 발생한 손상의 치료용 약물을 제조하기 위한 화학식 I의 화합물의 용도.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 종양 및 그의 전이의 치료용 약물을 제조하기 위한 화학식 I의 화합물의 용도.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 패혈증 및 패혈성 쇼크의 치료용 약물을 제조하기 위한 화학식 I의 화합물의 용도.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 류마티스성 관절염 등과 같은 류마티스성 질환 및 염증 등과 같은 면역학적 질환의 치료용 약물을 제조하기 위한 화학식 I의 화합물의 용도.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 진성 당뇨병 치료용 약물을 제조하기 위한 화학식 I의 화합물의 용도.
선택적인 PARP2 억제에 의해 예방되거나 치유되는 질환의 치료 또는 예방용 약물 제조에 있어서, PARP1보다 PARP2를 5 배 이상 더 강력하게 억제하는 화학식 I의 화합물의 용도.