CZ20014038A3

CZ20014038A3 - Pouľití ftalazinových derivátů

Info

Publication number: CZ20014038A3
Application number: CZ20014038A
Authority: CZ
Inventors: Wilfried Lubisch; Jens Sadovski; Michael Kock; Thomas Höger
Original assignee: Basf Aktiengesellschaft
Priority date: 1999-05-11
Filing date: 2000-05-03
Publication date: 2002-06-12
Also published as: HUP0202477A3; DE50014190D1; JP2003502286A; BR0010428A; CN1399573A; ES2284499T3; SK15952001A3; EP1231982B1; PL352150A1; BG106056A; KR20020000642A; TR200103236T2; NO20015462L; AU5064000A; US6903098B1; NO20015462D0; ATE357272T1; WO2000067734A3; CA2372704A1; EP1231982A2

Description

Použití ftalazinových derivátů

Oblast techniky

Tento vynález se týká použití ftalazinových derivátů jako inhibitorů enzymu póly(ADP-ribosa)polymerasa nebo PARP (EC 2.4.2.30), jako inhibitorů homologických enzymů PARP a zejména tyto ftalazinové deriváty také selektivně inhibují homologické enzymy PARP.

Dosavadní strav techniky

Póly(ADP-ribosa)polymerasa (PARP), také nazývaná póly(ADP-ribosa)synthasa (PARS) je regulační enzym, který se nachází v buněčných jádrech (K.Ikai et al., J.Histochem.

Cytochem. 1983, 31, 1261 - 1264). Předpokládá se, že PARP je zapojen do reparace DNA zlomů (M.S.Satoh et al., Nátuře 1992, 356, 356 - 358). Poškození nebo zlomy DNA řetězců aktivuje enzym PARP, který po aktivaci katalyzuje přenos ADP-ribosy z NAD (S. Shaw, Adv. Radiat. Biol., 1984, 11, 1 - 69). Během tohoto procesu je nikotinamid uvolněn z NAD. Nikotinamid je přeměněn zpět na NAD prostřednictvím dalších enzymů za spotřeby přenašeče energie ATP. Nadměrná aktivace PARP by proto měla za následek nefyziologicky velkou spotřebu ATP, což vede v extrémních případech k poškození buněk a k zániku buněk.

Je známo, že volné radikály, jako je hyperoxidový anion, NO a peroxid vodíku, mohou poškodit DNA v buňkách a tak aktivují PARP. Tvorba velkého množství volných radikálů je pozorována při mnoha patofyziologických stavech a předpokládá se, že akumulace volných radikálů vede nebo má podíl na poškození buněk či orgánů. Mezi tato poškození například patří ischemické stavy orgánů, jako je mrtvice, infarkt myokardu (C. Thiemermann et al., Proč. Nati. Acad.

Sci. USA, 1997, 94, 679-683) nebo ischémie ledvin, ale také • · · ♦ »· f ·« · I » * » « · ί · * · » · · • ···»» · · 4· « · • ···· ·«· » S · · · · · f «·· ·· ··«· reperfuzní poškození, ke kterému například dochází po lýze infarktu myokardu (viz. výše C. Thiemermann et al.)

Inhibice enzymu PARP by proto mohla být alespoň částečným prostředkem pro zabránění nebo zmírnění tohoto poškození.

Inhibitory PARP by tak mohly představovat nové terapeutické přístupy pro léčbu řady onemocnění.

Enzym PARP ovlivňuje reparaci poškozené DNA a tak může také hrát úlohu při léčbě karcinomů, neboť ve spojení s látkami mající cytostatickou aktivitu byl pozorován větší akční potenciál na tumorózní tkáň (T. Chen et al., Cancer Chemo. Pharmacol. 1988, 22, 303).

Dále bylo zjištěno, že inhibitory PARP mohou vykazovat imunosupresivní účinek (D. Weltin et al., Int. J.

Immunopharmacol. 1995, 17, 265-271).

Rovněž bylo zjištěno, že PARP je zapojena v řadě imunologických poruch nebo onemocnění, ve kterých hraje imunitní systém důležitou úlohu jako je například revmatický zánět kloubů a septický šok, inhibitory PARP také vykazují kladný účinek v průběhu onemocnění (H. Kroger et al., Inflammation, 1996, 20, 203-215; W. Ehrlich et al., Rheumatol. Int., 1995, 15, 171-172; C. Szabo et al., Proč.

Nati. Acad. Sci. USA, 1998, 95, 3867-3872; S. Cuzzocrea et al., Eur. J. Pharmacol., 1998, 342, 67-76).

Inhibitor PARP 3-aminobenzamid má ochranný účinek v modelu oběhového selhání (S.Cuzzocrea et al., Br. J.

Pharmacol., 1997, 121, 1065 - 1074).

Rovněž bylo experimentálně prokázáno, že inhibitory enzymu PARP mohou být prospěšné jako medikamenty pro léčbu cukrovky (V.Burkart et al., Nátuře Med., 1999, 5, 314 319) .

Ftalaziny a jejich deriváty představují široce používanou třídu látek. 2H-Ftalazin-l-ony mají navíc • · • ···· · · · o··· ·· ·· ··· ·· ···· substituenty v poloze 4, avšak doposud nebyly důkladně popsány. Methylenamidy, methylenmočoviny a methylenimidy byly popsány v publikaci Puodzhyunas et al., Pharm. Chem.

J. 1973, 7, 566; W. Mazkanowa et al., Zh. Obshch. Khim., 1958, 28, 2822 a F.K. Mohamed et al., Ind. J. Chem. B,

1994, 33, 769. Cyklické aminy a alkylaminy, ve kterých aminoskupina může být jak cyklickým, tak i alifatickým aminem, byly popsány J. Singh et al., Ind. J.Chem. B, 1983, 22, 1083, Y. Egushi et al., Chem Pharm. Bull., 1991, 9,

1846 a Iyo Kizai Kenkyusho Hokoku, 1998, 12, 41, (CA 91, 91579), ačkoli tyto sloučeniny byly studovány z hlediska antiaterosklerotických účinků, inhibice agregace krevních destiček nebo snížení krevního tlaku.

WO 99/11649 popisuje ftalazinony, které mají fenylpiperazinylmethylové radikály v poloze 4 jako inhibitory enzymu PARP.

2H-Ftalazinony s fenoxymethylovými deriváty v poloze 4 byly připraveny dle A. M. Bernard et al., Synthesis, 1998, 317.

Podstata vynálezu

Tento vynález popisuje nové ftalazinové deriváty obecného vzorce I, které jsou překvapivě inhibitory PARP.

Dále bylo zjištěno, že sloučeniny mající obecný vzorec I také inhibují homologické enzymy PARP. Tyto sloučeniny navíc selektivně inhibují homologické enzymy PARP, t.j. tyto sloučeniny inhibují homologické enzymy silněji než samotný enzym PARP.

Ftalaziny podle tohoto vynálezu výhodně vykazují inhibiční účinek, který je 5-krát silnější u homologů PARP (PARP2) oproti známé PARP (PARP1).

• · to · ·· · ·· • ·· · · ··« · · * « to ····· · a ·· · · • ···· «toto ···· «· to· ··· ·· to···

Jako homolog PARP je zejména označován homolog PARP-2, který je nárokován v WO 99/64572 (lidská PARP2). Ten může být výhodně izolován z lidského mozku, srdce, kosterních svalů, ledvin a jater. Exprese lidského PARP2 je výrazně menší v jiných tkáních a orgánech.

Lidská PARP2, která může být izolována z lidského mozku a její funkční ekvivalenty jsou zejména výhodnými látkami pro vývoj inhibitorů mrtvice. Předpokládá se, že vývoj aktivních látek, jejichž základem je PARP2, umožní vývoj inhibitorů, které budou optimalizovány pro léčbu lidského mozku. Nelze vyloučit, že vyvinuté inhibitory na bázi PARP2 mohou být rovněž použity pro léčbu patologických stavů jiných orgánů, které jsou vyvolány PARP. Podle distribuce tkáňových proteinů lze podle tohoto vynálezu určit příslušné orgány, které jsou ohroženy ischemickými stavy. Mezi tyto stavy patří ischémie mozku (mrtvice), ischémie srdce (infarkt myokardu), poškození během nebo po infarktové lýze (například TPA, reteplazí nebo mechanicky laserem nebo Rotablatorem), mikroinfarkty během a po náhradě srdeční chlopně, resekce aneurysmatu a srdeční transplantace, ischémie ledvin (akutní selhání činnosti ledvin nebo poškození během a po transplantacích ledvin), poškození jater nebo kosterních svalů.

Také je možná léčba a prevence neurodegenerativních poruch, ke kterým dochází po ischémii, poranění (kraniocerebrální poranění), rozsáhlém krvácení, subarachnoidálním krvácení a mrtvici. Mezi neurodegenerativní poruchy patří multiinfarktová demence, Alzheimerova choroba, Huntingtonova choroba a epilepsie, zejména generalizované epileptické záchvaty, jako je například malý epileptický záchvat, tonoklonické záchvaty a parciální epileptické záchvaty, jako je záchvat spánkového laloku a komplikovaný parciální záchvat. Tyto proteiny mohou také být důležité při léčbě revaskularizace kriticky

• * • ·	♦ · •	ftft ·	ft ·	ft	ft * • «
ft	ft	•	• ·
9	• ·	• ft	•	•	•	• ·	ft	ft
•		•	•	•	•	•	•	«
• · · ·	• ft			ft ·	ftftft	« ·		ftftftft

zúžených koronárních tepen a kriticky zúžených periferních tepen, jako jsou tepny dolních končetin. Tyto proteiny mohou dále hrát úlohu v chemoterapii nádorů, v prevenci metastází, při léčbě zánětů a revmatických poruch jako například při revmatickém zánětu kloubů. K dalším patologickým stavům může docházet na těchto nebo jiných orgánech.

PARP2 se podobá PARP1 v tom, že je aktivována poškozenou DNA, ačkoliv mechanismus je pravděpodobně odlišný. Je možná také úloha při reparaci DNA. Inhibice PARP enzymů podle tohoto vynálezu by také mohla být užitečná pro indikaci nádorů (například při radiosenzibilizaci pacientů s nádorem).

Výše popsané specifické zkušební systémy pro vazebné složky PARP1 a PARP2 byly použity k vývoji aktivních a selektivních inhibitorů proteinů podle tohoto vynálezu.

Inhibitory získané podle tohoto vynálezu mají velmi výraznou inhibiční aktivitu k PARP2. Hodnoty Ký mohou být v těchto případech menší než asi 1000 nM, jako například menší než asi 700 nM, menší než asi 100 nM a menší než asi 30 nM, jako například asi 1 až 20 nM.

Výhodné inhibitory podle tohoto vynálezu mají překvapivě výraznou selektivitu k PARP2. Poměr Ki (PARPl):Ki(PARP2) pro inhibitory podle tohoto vynálezu je například větší než 5. Další skupina inhibitorů byla vyvinuta za účelem současné inhibice PARPl a PARP2.

Z důvodu exprese je výhodně konstrukt rekombinantní nukleové kyseliny nebo genový konstrukt vložen do hostitelsky specifického vektoru, který umožní optimální expresi genů možnou v hostitelské buňce. Vektory jsou dobře známy odborníkům v oboru a mohou být například nalezeny v publikaci „Cloning Vectors (Pouwels P.H. et al., edítors. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985). Mezi ** ·· » <«· ·· ««·· » · · · · * · · • ··· .«« « · « · · • · Λ β · ·«· • · · · · · · · · · · «· · · · · vektory patří kromě plazmidů také všechny další vektory známé odborníkovi v oboru, jako jsou například fágy, viry (jako je SV40, CMV, baculovirus, adenovirus), transpozony, IS elementy, phazmidy, cosmidy a lineární nebo kruhová DNA. Tyto vektory mohou v hostitelském organismu podléhat autonomní replikaci nebo chromozomální replikaci.

Exprese konstruktů

Pro rekombinantní konstrukty podle tohoto vynálezu je výhodné, že jsou zaváděny a exprimovány ve vhodném hostitelském systému. Pro vyvolání exprese těchto nukleových kyselin v určitých expresních systémech jsou výhodně použity klonovací a transfekční metody známé odborníkům v oboru. Vhodné systémy jsou například popsány v publikaci „Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al., editors, Wiley Interscience, New York,

1997.

Vhodnými hostitelskými organismy jsou v zásadě všechny organismy umožňující expresi nukleových kyselin podle tohoto vynálezu, jejich alelických variant, jejich funkčních ekvivalentů nebo derivátů, nebo konstruktů rekombinantních nukleových kyselin. Mezi hostitelské organismy například patří bakterie, houby, kvasinky, rostlinné a živočišné buňky. Výhodnými organismy jsou bakterie rodů Escherichia, jako například Escherichia coli, Streptomyces, Bacillus nebo Pseudomonas a dále eukaryotické mikroorganismy, jako Saccharomyces cerevisiae, Aspergilus, vyšší eukaryotické buňky zvířat nebo rostlin, jako například Sf9 nebo CHO buňky.

Exprese genových produktů může také pokud je to žádoucí probíhat v transgenních organismech, jako jsou transgenní živočichové (zejména myši, ovce) nebo transgenní rostliny. Transgenní organismy mohou být také tzv.

• · · · «· « 44 «4 • · » » « * 4 4 4 4 4 4 « 44444 · 4 44 4 4

4444 444

4444 «« ·· ·»· ·· 4444 „knockout živočichové nebo rostliny, ve kterých byl vypnut odpovídající endogenní gen, k čemuž mohlo například dojít mutací, parciální nebo úplnou delecí.

Kombinace hostitelských organismů a vhodných vektorů, jako jsou plazmidy, viry nebo fágy, vytváří expresní systém. K těmto vektorům například patří plazmidy se systémem RNA-polyraerasa/promotor, fágy λ, μ nebo jiné mírné fágy nebo transpozony a /nebo jiné výhodné regulační sekvence. Termín expresní systém výhodně představuje například kombinaci savčích buněk, jako jsou CHO buňky, a vektorů, jako je pcDNA3neo vektor, které jsou vhodné pro savčí buňky.

Jak bylo popsáno výše, exprese genového produktu také může výhodně probíhat v transgenních zvířatech (například v myších, ovcích) nebo transgenních rostlinách. Také je možné naprogramovat bezbuněčné translační systémy prostřednictvím RNA odvozené od této nukleové kyseliny.

Příprava protilátek

Příprava protilátek proti PAR.P2 probíhá běžným způsobem známým odborníkům v oboru. Mezi tyto protilátky patří buď polyklonální, monokíonální, lidské nebo humanizované protilátky nebo jejich fragmetny, protilátky s jednoduchým řetězcem nebo jiné syntetické protilátky a také fragmenty protilátek, jako jsou Fv, Fab a F(ab')₂.

Vhodné postupy přípravy jsou popsány například v publikaci Campbell, A.M., Monoclonal Antibody Technology, (1987),

Elsevier Verlag, Amsterdam, New York, Oxford a v Breitllng,

F. a Důbel, S., Rekombinante Antikčrper (1997), Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg.

·· * ·· ·· * « · · « · · « ♦ ····· · • · · · · · •· ··· · · ····

Příklad A: Izolace PARP2 cDNA

Tyto cDNA sekvence byly poprvé stanoveny při sekvenční analýze cDNA klonů během sestavování cDNA knihovny lidského mozku (Human Brain 5'Stretch Plus c DNA Library, #

HL3002a, Clontech). Sekvence tohoto klonu je popsána v SEQ ID NO:1.

Příklad B: Příprava enzymů

Lidský PARPl byl rekombinantně exprimován v baculovirovém systému běžným způsobem a byl částečně purifikován jak bylo popsáno (Shah et al., Analytical Biochemistry, 1995, 227, 1-13). Hovězí PARPl o čistotě 30 a ž 50 % (c = 0,22 mg/ml, specifická aktivita 170 nmol ADPribosy/min/mg celkového proteinu při teplotě 25 °C) byl koupen od firmy BIOMOL (obj. č. SE-165). Lidský PARP2 byl rekombinatně exprimován v baculovirovém systému (Bac-to-Bac System, BRL LifeScience). Pro tento účel byly odpovídající cDNA klonovány do pFASTBAC-1 vektoru. Po přípravě rekombinantního baculoviru DNA rekombinací v E. coli byly hmyzí buňky (Sf9 nebo high five) transfektovány odpovídajícím rekombinantním baculovirem DNA. Exprese odpovídajících proteinů byla ověřena analýzou Western blot. Virové řetězce byly pomnoženy běžným způsobem. Větší množství rekombinantních proteinů bylo infikováno infekcí 500 ml hmyzí buněčné kultury (2 x 10⁶ buněk/ml) s viry v MOI (multíplicity of infection, poměr virů k buňkám 5-10) a inkubováno po dobu 3 až 4 dnů. Hmyzí buňky byly potom peletizovány odstředěním a získané proteiny byly přečištěny.

Přečištění proteinů bylo uskutečněno klasickými postupy a enzymy byly detekovány za použití vhodných specifických protilátek. V některých případech byly proteiny přečištěny na afinitní koloně s 3-aminobenzamidem, jak je popsáno v publikaci Burtscher et al., Anal Biochem,

1986, 152: 285 - 290). Čistota proteinů byla větší než 90

Q, “5 .

Příklad C: Testovací systémy pro stanovení aktivity PARP2 a inhibičního efektu efektorů na PARP1 a PARP2

a) Příprava protilátek proti póly(ADP-ribose)

Póly(ADP-ribosa) může být použita jako antigen při tvorbě protilátek proti póly(ADP-ribose), Příprava protilátek proti póly(ADP-ribose) je popsána v literatuře (Kanai Y, et al., 1974, Biochem Biophys Rem Comm 59:1, 300306; Kawamaitsu H. et al.,1984, Biochemistry, 23, 37713777; Kanai Y. et al., 1978, Immunolology 34, 501 - 508).

Při stanovení byly použity protilátky anti-poly (ADPribosy) (polyklonální antisérum, králík), BIOMOL; obj.č. SA-276. Protilátky anti-poly(ADP-riposy) (monoklonální, myš, klon 10H, afinitně přečištěný hybridomový supernatant).

Antisérum nebo monoklonální protilátky získané ze supernatantu hybridomové kultury byly přečištěny běžným způsobem afinitní chromatografií s proteinem A.

b) Test - ELISA

Materiály:

Elisa barevné činidlo: směs TMB, Sigma, T-8540

96-jamková mikrotitrační destička (FALCON Micro-Test lila Flexible Assay Plate, # 3912) byla potažena histony (SIGMA, H-7755). Histony byly pro tento účel rozpuštěny v uhličitanovém pufru (0,05M NaHC0₃; pH 9,4) v koncentraci 50 pg/ml. Jednotlivé jamky mikrotitrační destičky byly inkubovány se 150 μΐ histonového roztoku při laboratorní teplotě po dobu alespoň 2 hodin nebo přes noc při teplotě 4 °C. Potom bylo do jamek přidáno 150 μΐ roztoku BSA o ·· *·· koncentraci 1 % (SIGMA, A-7888) v uhličitanovém pufru a reakce probíhala při laboratorní teplotě po dobu 2 hodin. Následně byly jamky promyty vymývací pufrem (0,05% Tween 10 v PBS; (PBS - fosfátem pufrovaný fyziologický roztok;

Gibco, obj. č. 10010): 0,21 g/1 KH₂P0₄, 9 g/1 NaCl, 0,726 g/1 Na₂HPO₄ · 7 H₂0, pH 7,4). Promývání bylo prováděno v promývacím zařízení mikrotitračních destiček („Columbus microtiter plate washer, SLT-Labinstruments, Austria). Enzymový reakční roztok a substrátový roztok byly používány ve formě premixů. Celkové množství těchto roztoků závisí na počtu testovaných jamek.

Složení enzymového reakčního roztoku na jamku:

- 4 μΐ PARP reakčního pufru (1 M Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM MgCl₂, 10 mM DTT)

- 20 ng PARPl (lidského nebo hovězího) nebo 8 ng PARP2 (lidského)

- 4 pl aktivované DNA (1 mg/ml; SIGMA, D-4522)

- 4 0 μΐ H₂0

Složení substrátového roztoku na jamku:

- 5 μΐ PARP reakčního pufru (10 x)

- 0,8 μΐ NAD roztoku (10 mM, SIGMA, N-1511)

- 40 μΐ H_ZO

Inhibitory byly rozpuštěny v PARP reakčním pufru. Při občasném použití DMSO pro rozpuštění vyšších koncentrací inhibitorů nedocházelo k žádným problémům až do konečné koncentrace 2 %. U enzymových reakcí bylo 40 μΐ enzymového reakčního roztoku napipetováno do každé jamky a inkubováno s 10 μΐ inhibičního roztoku po dobu 10 minut. Enzymová reakce byla potom nastartována v každé jamce přidáním 50 μΐ substrátového roztoku. Reakce probíhala při laboratorní teplotě a po 30 minutách byla ukončena 3-násobným promytí promývacím pufrem.

Použité primární protilátky byly specifickými protilátkami proti póly(ADP-ribose) v ředění 1 : 5000. Ředění probíhalo v protilátkovém pufru (1 % BSA v PBS; 0,05 % Tween 20). Inkubační doba primárních protilátek byla 1 hodina při laboratorní teplotě. Po 3-násobném promytí promývacím pufrem pokračovala inkubace se sekundárním protilátkou (anti-myší IgG, Fab fragmenty, spřažená s peroxidasou, Boehringer Mannheim, obj. č. 1500,686; antikráličí IgG, spřažená s peroxidasou, SIGMA, obj.č. A-6154) při ředění 1 : 10 000 v protilátkovém pufru při laboratorní teplotě po dobu jedné hodiny. Po 3-násobném promytí promývacím pufrem proběhla barevná reakce po napipetování do každé jamky 100 μΐ zbarvovacího činidla (směs TMB,

SIGMA), reakce probíhala asi 15 minut při laboratorní teplotě. Zbarvovací reakce byla ukončena přidáním 100 μΐ 2M H2SO4. Po ukončení reakce byla jamková destička okamžitě měřena na destičkovém čtecím zařízení ELISA (EAR340AT „Easy Reader, SLT-Labinstruments, Austria) při vlnové délce 450 nm oproti vlnové délce 620 nm. Princip měření je graficky znázorněn na obrázku 6.

Různé koncentrace byly použity pro sestrojení grafické závislosti dávkování pro stanovení Ki inhibitoru. Pro každou koncentraci inhibitoru bylo prováděno měření třikrát. Aritmetické průměry byly stanoveny za použití Microsoft© Excel. IC50 byla stanovena za použití Microcal© Origin Software (Verš. 5.0) („Sigmoidal Fit). Konverze IC50 hodnot na Ki byla provedena za použití „kalibračních inhibitorů. „Kalibrační inhibitory byly měřeny v každé analýze. Ki hodnoty z „kalibračních inhibitorů byly stanoveny ve stejném testovacím systému analýzou Dixonova diagramu způsobem známým odborníkovi v oboru.

c) Zkouška HTRF („homogenous time - resolved fluorescence)

»* • 4 4	• 4 ·	44 •	4	44 4 «
«	•	• ·
444 4	•	•	♦	• 4	4	•
4 4 4 4	•	• • ·	4 44 4	4 44	4	• ·«··

Ve zkoušce HTRF PARP podle tohoto vynálezu jsou histony jako cílové proteiny pro modifikaci prostřednictvím PARP, nepřímo značeny fluoroforem XL665. Protilátky jsou značeny přímo kryptátem europia. Jestliže je fluorofor XL665 v přímém sousedství místa, které zajišťuje vazbu póly(ADP-ribosy) a histonu, potom je umožněn přenos energie. Emise při 665 nm je tak přímo úměrná množství navázané protilátky, což je naopak ekvivalentem množství póly(ADP-ribosy). Naměřený signál tak odpovídá aktivitě PARP. Princip měření je graficky znázorněn na obrázku 7. Použité materiály byly stejné jako při stanovení ELISA metodou, jestliže není výslovně uvedeno jinak.

Histony byly rozpuštěny v Hepes pufru (50 mM, pH =

7,5) v koncentraci 3 mg/ml. Biotinylace se uskutečnila za pomocí sulfo-NHS-LC-biotinu (Pierce, #21335T). Byl použit molární poměr 4 biotinových molekul na jednu molekulu histonu. Inkubační doba byla 90 minut (pokojová teplota). Biotinylované histony byly potom přečištěny na koloně G25 SF HR10/10 (Pharmacia, 17-0591-01) za použití Hepes pufru (50 mM, pH = 7,0) z důvodu odstranění biotinylačního činidla. Protilátka anti-poly(ADP-ribosy) byla značena kryptátem europia za použití bifukčního kondenzačního činidla (Lopez, E. et al., Clin. Chem. 39(2), 196-201,

1993; US patentový spis 5,534,622). Přečištění bylo prováděno na koloně G25SF HR10/30. Bylo dosaženo molárního poměru 3,1 kryptátu na protilátku. Výtěžek byl 25 %. Tyto konjugáty byly skladovány při -80 °C za přítomnosti 0,1 % BSA ve fosfátovém pufru (0,1 M, pH = 7).

Pro enzymovou reakci bylo pipetováno do každé jamky:

- 10 μΐ PARP roztoku v PARP HTRF reakčním pufru (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT) s 20 ng PARP1 (lidského nebo hovězího) nebo 8 ng PARP2 (lidského)

• 4 4 4 4 · • · · · 4 ··· «4 4444

- 10 pl aktivované DNA v PARP HTRF reakčním pufru (50 pg/ml)

- 10 pl biotinylovaných histonů v PARP HTRF reakčním pufru (1,25 pM)

- 10 pl v PARP HTRF reakčním pufru.

Tato činidla byla preinkubována po dobu 2 minut před zahájením reakce přidáním

- 10 pl NAD roztoku v PARP HTRF reakčním pufru (400 μΜ/ml).

Reakce probíhala při pokojové teplotě po dobu 30 minut.

Reakce byla potom ukončena přidáním

- 10 pl inhibitoru PARP (25 pM, Ki - 10 nM) ve ,,vymývacím pufru (100 mM Tris-HCl pH = 7,2; 0,2 M KF, 0,05% BSA)

Potom bylo přidáno:

- 10 pl EDTA roztoku (SIGMA, E-7889, 0,5M v H₂0)

- 100 pl Sa-XL665 (Packard Instruments) ve „vymývacím pufru (15 - 31,25 nM)

- 50 pl anti-PARP kryptátu ve „vymývacím pufru (1,6 - 3,3 nM). Měření bylo potom možné po 30 minutách (až po dobu 4 hodin). Měření bylo prováděno ve čtecím zařízení pro měření mikrodestiček „Discovery HTRF Microplate Analyzer (Packard Instruments). Ki hodnoty byly vypočteny stejným postupem jak je popsáno při stanovení metodou ELISA.

Tento vynález se týká použití substituovaných ftalazinů obecného vzorce I,

• 9 99 * 9 · 9	• 4	• • 9	• 9 9	9 9 9 9 9
•	9
♦ 999	• 9	9	9	• 9	9	9
• ·	•	9	9	9	9	9
• · · · 9 9	• ·		9 9 9	99		9999

(I) ve kterých

R¹ je vodík, chlor, fluor, brom, jod, rozvětvený a nerozvětvený Ci-Cg-alkyl, OH, nitroskupina, CF₃, CN, NR¹¹R¹², NH-CO-R¹³, O-Ci-C4-alkyl, kde R¹¹ a R¹² jsou nezávisle na sobě vodík nebo Ci-C4-alkyl a R¹³ je vodík, Ci-C₄-alkyl, fenyl-Ci~C₄-alkyl nebo fenyl, a

A¹ je přímý nebo rozvětvený radikál C₀-C6~alkylu, a

A² je NR², NR²-Ci-C6-alkyl, 0, S, a

R² je vodík a Ci-Cg-alkyl, a

A³ je aromatický nebo heteroaromatický kruh s 5 nebo 6 atomy, a až 3 heteroatomy vybranými N, 0, S, jako je například fenyl, thiofen, pyridin, pyrimidín, naftalen, indol, imidazol, které mohou být také substituován R⁴ a jednou nebo dvěma skupinami R³, kde R³ může být vodík, chlor, fluor, brom, jod, rozvětvený a nerozvětvený Ci-Cgalkyl, OH, nitroskupina, CF3, CN, NR¹¹R¹², SO2NR^UR¹², SO2-Ci“ C4-alkyl, S-Ci-C4-alkyl, O-Ph, O-CF3, NH-CO-R¹³, O-Ci-C4alkyl, kde R¹¹ a R¹² jsou nezávisle na sobě vodík nebo C1-C4alkyl a R¹³ může být vodík, Ci-C₄-alkyl, fenyl-Ci~C₄-alkyl nebo fenyl,

R⁴ je vodík, (X) 0,i^-Ci-C4-alkyl-NR⁴¹R⁴², kde X = 0, S a NR⁴³,

R⁴¹ a R⁴² mohou být nezávisle na sobě vodík, Ci-Ce-alkyl, • · · · · · fcfc · · · · • · · · · · · · * • ····· · · fcfc · · • · · · · ··· ···· ·· ·· ··· ·· fcfcfc· fenyl-Ci-Cí-alkyl a 3 až 7-členný cyklický amin a R⁴³ může být vodík a Ci-C₄-alkyl, a jejich tautomerní formy, možné enantiomerní a diastereomerní formy, a jejich prekurzory léčiv.

Sloučeniny mající vzorec I mohou být použity jako racemáty, jako enantiomerně čisté sloučeniny nebo jako diastereomery. V případě, že jsou požadovány enantiomerně čisté látky, mohou být získány například klasickým dělením racemátů sloučenin vzorce I nebo jejich meziproduktů za použití vhodných opticky aktivních zásad nebo kyselin.

Vynález se také týká sloučenin, které jsou mezomery nebo tautomery sloučenin vzorce I.

Vynález se dále týká fyziologicky přijatelných solí sloučenin vzorce I, které mohou být získány reakcí sloučenin vzorce I s vhodnou kyselinou nebo zásadou. Příklady vhodných kyselin a zásad jsou uvedeny v publikaci Fortschritte der Arzneimittelforschung, 1966, Birkháuser Verlag, Volume 10, pp. 224 - 285. Mezi tyto látky například patří kyselina chlorovodíková, kyselina citrónová, kyselina vinná, kyselina mléčná, kyselina orthofosforečná, kyselina methansulfonová, kyselina octová, kyselina mravenčí, kyselina maleinová, kyselina fumarová atd., a hydroxid sodný, hydroxid lithný, hydroxid draselný a Tris.

Výraz prekurzory léčiv znamená, že sloučeniny jsou metabolizovány in vivo na sloučeniny vzorce I. Typickými prekurzory léčiv jsou fosfáty, karbamaty aminokyselin, estery a jiné sloučeniny.

Ftalazinové deriváty vzorce I podle tohoto vynálezu mohou být připraveny různými způsoby, které již byly popsány v literatuře.

. _ -- - — » w w • · · · · ··· ···· ·· ·· _M, II ····

Možné způsoby syntézy jsou například popsány v publikacích Puodzhyanas et al., Pharm. Chem. J., 1973, 7,

566; W. Mazkanowa et al., Zh. Obshch. Kim., 1958, 28, 2822;

F.K. Mohamed et al., Ind. J. Chem. B, 1994, 33, 769;

J.Singh et al., Ind. J.Chem. B, 1983, 22, 1083; Y. Egushi et al., Chem. Pharm. Bull., 1991, 9, 1846 a Iyo Kizai Kenkyusho Hokoku, 1998, 12, 41 (CA 91, 91579) nebo již byly uvedeny v tomto vynálezu. Sloučeniny podle tohoto vynálezu mohou být připraveny obdobně podle způsobů popsaných v tomto vynálezu.

Substituované ftalaziny vzorce I obsažené v tomto vynálezu jsou inhibitory enzymu póly(ADP-ribosa)polymerasa a vykazují zejména selektivitu vůči novým homoiogickým enzymům PARP,

Inhibiční účinek derivátů substituovaných ftalazinů vzorce I byl stanoven enzymovou zkouškou, která byla již popsána v literatuře, jako míra tohoto inhibičního účinku byl určena Ki. U ftalazinových derivátů vzorce I byl měřen inhibiční účinek pomocí enzymu póly(ADP-ribosa)polymerasa nebo PARP (EC 2.4.2.30) .

4-(4-Fenylpiperazin-l-yl)methyl=2H-ftalazin-l^on byl popsán v WO 99/11649 jako inhibitor PARP a je strukturně podobný sloučeninám podle tohoto vynálezu. Tato sloučenina byla zkoumána deklarovanou HTRF zkouškou na inhibiční účinek PARPl. Tato sloučenina však vykazuje pouze slabý inhibiční účinek (38 % při koncentrací 10 μΜ).

Překvapivě bylo zjištěno, že sloučeniny podle tohoto vynálezu neinhibují pouze enzymy PARP, ale jsou výrazně účinnější.

99 »·	9·	9	99		9«
* · » ·	• «	• ·	•	1	» ·
• ···	• · ·	•	« 1	1	• •
• · ···· ··	• 9 • ·	« * 91	.1 11	•	• ·· · 9

Příklad PARP1

Ki/μΜ

0,62

0,19

1,80

0,78

0,74

0,69

Substituované deriváty ftalazinu mající obecný vzorec I jsou inhibitory póly(ADP-ribosy)polymerasy (PARP) nebo také nazývané póly(ADP-ribosy)synthasy (PARS) a tak mohou být používány k léčbě a prevenci onemocnění spojených se zvýšenou aktivitou těchto enzymů.

Sloučeniny mající vzorec I mohou být použity k výrobě medikamentů pro léčbu poškození po ischémiích a pro prevenci očekávaných ischémií v různých orgánech.

Předložené deriváty ftalazinu obecného vzorce I mohou proto být použity k léčbě a prevenci neurodegenerativních onemocnění vyskytujících se po ischémií, poranění, (kraniocerebrální poranění), rozsáhlém krvácení, subarachnoídálních krváceních a mrtvici. Mezi neurodegenerativní poruchy patří multiinfarktová demence, Alzheimerova choroba, Huntingtonova choroba a epilepsie, zejména generalizované epileptické záchvaty jako je například malý epileptický záchvat a tonoklonícké záchvaty a parciální epileptické záchvaty jako je záchvat spánkového laloku a komplikovaný parciální záchvat. Dále tyto deriváty ftalazinu mohou být použity k léčbě a prevenci poškození srdce po srdeční ischémií a poškození ledvin po renální ischémií jako je například akutní selhání činnosti ledvin nebo poškození, ke kterým dochází během a po transplantaci ledvin. Sloučeniny mající obecný vzorec I mohou být dále ·· ·· • · to to • · · » · · » · · ·· ··*· to · · • ··· · • · <··· ·· použity k léčbě akutního infarktu myokardu a k léčbě poškození, ke kterému dochází během nebo po medicínské (například při TPA, reteplazi, streptokinase nebo mechanicky laserem nebo Rotablatorem) a k léčbě a prevenci mikroínfarktů během a po náhradě srdeční chlopně, resekcích aneurysmat a srdečních transplantacích. Tyto ftalaziny vzorce I mohou také být užitečné při léčbě revaskularizace kriticky zúžených koronárních tepen jako například při PTCA, operacích bypassu a rovněž při léčbě kriticky zúžených periferních tepen, jako jsou například tepny dolních končetin. Dále ftalaziny vzorce I mohou být prospěšné při chemoterapii nádorů a jejich metastáz a mohou být použity k léčbě zánětů a revmatických poruch, jako je například revmatický zánět kloubů, a k léčbě cukrovky.

Farmaceutické přípravky podle tohoto vynálezu obsahují kromě běžných farmaceutických vehikul i terapeuticky účinné množství sloučeniny vzorce I.

Pro místní vnější použití jsou přípravky například ve formě zásypů, mastí nebo sprejů, aktivní látky mohou být přítomny v obvyklých koncentracích. Aktivní látky jsou běžně přítomny v množství od 0,001 do 1 % hmotn., výhodně od 0,001 do 0,1 % hmotn.

Při vnitřním použití jsou přípravky podávány v jednotkových dávkách. Jednotková dávka obsahuje od 0,1 do 100 mg na kilogram tělesné hmotnosti. Přípravky mohou být podávány v jedné nebo více dávkách denně v závislosti na povaze a síle poruchy.

V závislosti na požadovaném způsobu podávání farmaceutické přípravky podle tohoto vynálezu obsahují kromě aktivní látky i běžné nosiče a ředidla. Pro místní vnější použití je možné použít farmaceutické vehikulum, jako je ethanol, isopropanol, ethoxylovaný ricínový olej, ethoxylovaný hydrogenovaný ricínový olej, polyakrylová lýze « · • · 9 9 <8 · 9 » • ·* «' · · · · ft ft * • 9 9 ♦ 9

9 9 tO φΛ ft · « ft 9 ·

9 9

9 999 9 kyselina, polyethylenglykol, polyethylenglykolstearát, ethoxylované mastné alkoholy, tekutý pafafín, technická vazelína a tuk z vlny. Mezi vhodná vehikula pro vnitřní použití patří laktóza, propylenglykol, ethanol, škrob, mastek a polyvinylpyrrolidon.

V těchto farmaceutických přípravcích mohou být také přítomny antioxidanty, jako je tokoferol, butylovaný hydroxyanisol a butylovaný hydroxytoluen, aditiva upravující Chuť a vůni, stabilizátory, emulgátory a maziva.

Látky přítomné v přípravcích mimo aktivní látky a látky používané při výrobě těchto farmaceutických přípravků jsou toxikologicky přijatelné a slučitelné s určitou aktivní látkou. Farmaceutické přípravky jsou vyráběny běžným způsobem, například mícháním aktivní látky s běžnými nosiči a ředidly.

Tyto farmaceutické přípravky mohou být podávány různými způsoby jako například orálně, parenterálně, intravenózně infuzí, podkožně, intraperitoneálně a místně. Přípravky mohou být ve formě tabletek, emulzí, infuzí, injekčních roztoků, past, mastí, gelů, krémů, lotion, zásypů a sprejů.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

4(N(4-Hydroxyfényl)aminomethyl)-2H-ftalazin-l-on ¹H-NMR (D₆-DMSO) : δ =4,4 (2H) , 5,5 (IH), 6,55 (4H), 7,75 8,3 (4H), 8,5 (IH) a asi 12,5 (IH) ppm.

Příklad 2

4(N(4-(Ν,Ν-Dimethylsulfamoyl)fenyl)aminomethyl)-2Hftalazin-l-on • · <

Příklad 3

4(N(4-Chlorfenyl)aminomethyl)-2H-ftalazin-l-on ¹H-NMR (D₆-DMSO) : δ =4,6 (2H), 6,4 (IH), 6,75 (2H) , 7,1 (2H), 7,9 - 8,4 (4H), a asi 12,5 (široký) ppm.

Příklad 4

4(N-Fenylaminomethyl)-2H-ftalazin-l-on ¹H-NMR (Ds-DMSO): δ =4,6 (2H), 6,3 (IH), 6,2 (IH), 6,8 (2H), 7,1 (2H), 7,9 - 8,5 (4H), a asi 12,5 (široký) ppm.

Příklad 5

4(N(3-Trifluormethylfenyl)aminomethyl)-2H-ftalazin-l-on ¹H-NMR (Dg-DMSQ) : δ =4,6 (2H), 6,7 (IH), 6,8 (IH), 7,0 (2H), 7,3 (IH), 7,9 - 8,4 (4H), a asi 12,5 (široký) ppm.

Příklad 6

4(N(3-Kyanofenyl)aminomethyl)-2H-ftalazin-l-on ¹H-NMR (D₆-DMSO): δ =4,8 (2H) , 6,7 (2H) , 7,1 (IH), 7,5 7,8 (2H), 7,95 (IH), 8,1 (IH), 8,4 (2H) a asi 12,5 (IH) ppm.

Příklad 7

4(N(4-Methoxyfenyl)aminomethyl)-2H-ftalazin-l-on ¹H-NMR (Dg-DMSO): δ = 3,7 (3H), 4,5 (2H), 5,8 (IH), 6,7 (4H), 7,9 - 8,3 (4H) , a asi 12,5 (široký) ppm.

Příklad 8

4(N(2,4-Dichlorfenyl)aminomethyl)-2H~ftalazin-l-on

¹H-NMR (Dg-DMSO): δ =4,8 (2H), 6,3 (1H), 7,0 (1H), 7,2 (ÍH), 7,4 (ÍH), 7,9 (ÍH), 8,0 (ÍH), 8,3 (2H) a asi 12,5 (široký) ppm.

Příklad 9 (N (4-Nitrofenyl)amínomethyl) -2H-ftalazin-l-on

X-NMR (D₆-DMSO) : δ =4,8 (2H), 6,8 (2H), 7,8 - 8,4 (7H), a asi 12,5 (široký) ppm.

Příklad 10

4(N(3-Methylmerkaptofenyl)amínomethyl)-2H-ftalazin-l-on ^-NMR (De-DMSO): δ = 2,4 (3H) , 4,6 (2H) , 6,3 (ÍH), 6,4-6,7 (3H), 7,0 (ÍH), 7,9 - 8,4 (4H), a asi 12,5 (široký) ppm.

Příklad 11

4(N(2,4-Difluorfenyl)amínomethyl)-2H-ftalazin-l-on ¹H-NMR (De-DMSO) ; δ =4,7 (2H), 6,0 (ÍH), 7,0 (2H), 7,1 (ÍH), 7,9 (ÍH), 8,0 (ÍH), 8,3 (2H) a asi 12,5 (široký) ppm.

Příklad 12

4(N(4-Fenoxyfenyl)amínomethyl)-2H-ftalazin-l-on ¹H-NMR (D₆-DMSO) : δ =4,6 (2Ή) , 6,2 (1H), 6,8 (2H) , 6,9 (3H), 7,1 (1H), 7,4 (2H), 8,0 - 8,5 (4H), a asi 12,5 (1H) ppm.

Příklad 13

4(N(4-Trifluormethoxyfenyl)aminomethyl)-2H-ftalazin-l-on ¹H-NMR (De-DMSO): δ =4,6 (2H), 6,5 (ÍH), 6,75 (2H) , 7,1 (2H), 7,8 - 8,4 (4H), a asi 12,5 (ÍH) ppm.

Příklad 14

4(N(4-Trifluormethylfenyl)amínomethyl)-2H-ftalazín-l-on ««

• ·	♦» ·	4 4 4 4
9 4 4	•	a	• ·
* · · *	«	•	•	9 4 4
• • · ·	•	• • ·	• 9 4·	4 4 4 ·

i ¹H-NMR (D₆-DMSO): δ =4,7 (2H) , 6,8 (2H), 6,95 (1H) , 7,4 (2H), 7,8 - 8,4 (4H), a asi 12,5 (široký) ppm.

Příklad 15

4(N-Methyl-N-fenylaminomethyl}-2H-ftalazin-l-on x HCl ¹H-NMR (D₆-DMSO): δ =2,7 (1,5H), 3,0 (1,5H), 3,8 (0,5H),

4,0 (0,5H), 4,5 (1H), 4,9 (1H), 6,5 - 8,3 (9H), a asi 12,5 (široký) ppm.

Příklad 16

4(S(4-Chlorfenyl)merkaptomethyl)-2H-ftalazin-l-on ¹H-NMR (De-DMSO): δ =4,6 (2H), 7,4 (4H), 7,9 - 8,5 (4H), a asi 12,5 (široký) ppm.

Příklad 17

4(S(l-Methylimídazol-2yl)merkaptomethyl)-2H-ftalazin-l-on

Příklad 18

4(N(5-Methylmerkapto-l,3,4-triazol-2yl)aminomethyl)-2Hftalazin-l-on ¹H-NMR (D₆-DMSO): δ =2,4 (3H), 4,7 (2H), 7,1 (1H), 7,8 8,3 (4H), a asi 12,5 (široký) ppm.

Příklad 19

4(S(2-Pyridyl)merkaptomethyl)-2H-ftalazin-l-on ¹H-NMR (D₆-DMSO) : δ =4,8 (2H) , 7,2 (1H), 7,4 (1H), 7,7 (1H), 7,9 (1H), 8,0 (1H), 8,2 (1H), 8,5 (1H) a asi 12,5 (1H) ppm.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Použití sloučenin vzorce I, (I) ve kterých

R¹ je vodík, chlor, fluor, brom, jod, rozvětvený a nerozvětvený Ci-C₆-alkyl, OH, nitroskupina, CF₃, CN, NřXR¹², NH-CO-R¹³, O-Ci-C4-alkyl, kde R¹¹ a R¹² jsou nezávisle na sobě vodík nebo Ci~C4-alkyl a R¹³ je vodík, Ci-C₄-alkyl, fenyl-Ci-C₄-alkyl nebo fenyl, a

A¹ je přímý nebo rozvětvený radikál Co-Cg-alkylu, a

A² je NR², NR²-Ci-C₆-alkyl-, 0 a S, a

R² je vodík a Ci-C6~alkyl, a

A³ je aromatický nebo heteroaromatický kruh s 5 nebo 6 atomy, a až 3 heteroatomy vybranými z N, 0, S, který může být substituován R⁴ nebo jednou nebo dvěma skupinami R³, kde R³ může být vodík, chlor, fluor, brom, jod, rozvětvený a nerozvětvený Cj.-C6-alkyl, OH, nitroskupina, CF3, CN, NRⁿR¹², SO2NR^1:LR¹², SO2-Ci~C4-alkyl, SC1-C4-alkyl, O-Ph, O-CF3, NH-CO-R¹³, O-Ci-C4-alkyl kde R¹¹ a R¹² jsou nezávisle na sobě vodík nebo Ci-C4-alkyl a R¹³ může být vodík, Ci-C4-alkyl, fenyl-Ci-C₄-alkyl nebo fenyl, ·· ·· • · · I . z :

♦ · · • · · · · · a NR

R⁴ je vodík, (X) 0,i-Ci-C4-alkyl-NR⁴¹R⁴², kde X = O, S R⁴¹, R⁴² mohou být nezávisle na sobě vodík, Ci-C6-alkyl, fenyl-Ci-C4-alkyl a 3 až 7-členný cyklický amin a R⁴³ může být vodík a Ci-C₄-alkyl a jejich tautomerní formy, možné enantiomerní a diastereomerní formy, a jejich prekurzory léčiv pro přípravu léčiv určených k prevenci nebo léčbě zdravotních poruch souvisejících se zvýšenou aktivitou poly(ADPribosa)polymerasy (PARP).
2. Použití sloučenin vzorce I podle nároku 1 jako inhibitorů homologických enzymů PARP nebo PARS.
3. Použití sloučenin vzorce I podle nároku 1 jako inhibitorů homologických enzymů PARP nebo PARS, kde uvedené sloučeniny selektivně inhibují tyto homology ve srovnání se samotnou PARP nebo PARS.
4. Použití sloučenin vzorce I podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 k výrobě léčiv pro léčbu neurodegenerativních zdravotních poruch a neuronového poškození.
5. Použití podle nároku 4 pro léčbu neurodegenerativních zdravotních poruch a neuronového poškození způsobených ischémií, poraněním nebo rozsáhlým krvácením.
6. Použití podle nároku 4 pro léčbu mrtvice a kraniocerebrálního poranění.
7. Použití podle nároku 4 pro léčbu Alzheimerovy choroby, Parkinsonovy choroby a Huntigtonovy choroby.

··· 9 «· · · J ♦ 9 • · · · · · · •· 9 9 9·♦ Λ« 9··φ
8. Použití sloučenin vzorce I podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 k výrobě léčiv pro léčbu nebo prevenci poškození způsobených ischémii.
9. Použití sloučenin vzorce I podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 k výrobě léčiv pro léčbu epilepsií, zejména generalizovaných epileptických záchvatů, jako je například malý epileptický záchvat a tonoklonické záchvaty, a parciálních epileptických záchvatů, jako je temporální lalokový a komplikovaný parciální záchvat.
10. Použití sloučenin vzorce I podle kteréhokoliv z nároků

1 až 3 k výrobě léčiv pro léčbu poškození ledvin po renální ischémii a pro léčbu během a po transplantacích ledvin.
11. Použití sloučenin vzorce I podle kteréhokoliv z nároků

1 až 3 k výrobě léčiv pro léčbu poškození srdce po srdeční ischémii.
12. Použití sloučenin vzorce I podle kteréhokoliv z nároků

1 až 3 k výrobě léčiv pro léčbu mikroinfarktů, jako například během a po náhradě srdeční chlopně, resekcích aneurysmat a srdečních transplantacích.
13. Použití sloučenin vzorce I podle kteréhokoliv z nároků

1 až 3 k výrobě léčiv pro léčbu v případech revaskularizace kriticky zúžených koronárních tepen jako například při operacích PTCA a bypassu nebo v případech kriticky zúžených periferních tepen, zejména v tepnách dolních končetin.
14. Použití sloučenin vzorce I podle kteréhokoliv z nároků

1 až 3 k výrobě léčiv pro léčbu akutního infarktu myokardu a poškození během a po jejich medicínské nebo mechanické lýze.

• · • < • • · • · • 9 *4 • * 4 4 · • • · · • · • • 4 4 4 4 • * 4 4 • • « · • • · · • * · • • 4 4 · ·
15. Použití sloučenin vzorce I podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 k výrobě léčiv pro léčbu nádorů a jejich metastáz.
16. Použití sloučenin vzorce I podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 k výrobě léčiv pro léčbu sepse a septického šoku.
17. Použití sloučenin vzorce I podle kteréhokoliv z nároků

1 až 3 k výrobě léčiv pro léčbu imunologických poruch, jako jsou záněty a revmatické poruchy, jako je například revmatický zánět kloubů.
18. Použití sloučenin vzorce I podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 k výrobě léčiv pro léčbu cukrovky.
19. Použití sloučenin, které inhibují PARP2 alespoň 5-krát silněji než PARPl k výrobě léčiv pro prevenci a léčbu poruch, kterým je předcházeno či které jsou léčeny selektivní inhibici PARP2.