JP2839038B2 - 酵素活性のアッセイ - Google Patents
酵素活性のアッセイInfo
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- fatty acids
- fatty acid
- enzyme
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/44—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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Description
【発明の詳細な説明】 ［技術分野］ 本発明は、長鎖脂肪酸の放出を直接又は間接に触媒す
る酵素、若しくは逆にこのような酵素の基質を臨床サン
プルに適用しうるアッセイ（assay）に関する。これに
限定されるものではないが、本発明は特に、リパーゼ及
びホスホリパーゼのアッセイ、又はこのような酵素のた
めのエステル基質、例えばリパーゼのためのトリグリセ
リド基質及びホスホリパーゼのためのリン脂質基質のア
ッセイを目的とする。
る酵素、若しくは逆にこのような酵素の基質を臨床サン
プルに適用しうるアッセイ（assay）に関する。これに
限定されるものではないが、本発明は特に、リパーゼ及
びホスホリパーゼのアッセイ、又はこのような酵素のた
めのエステル基質、例えばリパーゼのためのトリグリセ
リド基質及びホスホリパーゼのためのリン脂質基質のア
ッセイを目的とする。
［従来技術］ リパーゼ、ホスホリパーゼ及びトリグリセリドやジグ
リセリドのようなそれらの基質は、細胞膜機能及びエネ
ルギー輸送のあらゆる面に偏在する基本的なものであ
る。従ってこれらの成分のアッセイは臨床診断の多くの
領域で興味のあるものである。例えば、臨床標本のトリ
グリセリド含量は、最近の食物脂肪摂取量や、肝臓がエ
ネルギー源として脂肪を代謝する能力をある程度示唆す
ることができる。しかしながら、Sigma Chemical Co.
Ltd.（Poole,Dorset,UK）からキットとして市販されて
いるような、現在入手できるトリグリセリドアッセイ法
は、酵素の加水分解によって放出されるグリセロールの
測定によるものである。かくして、Sigma procedure
no.405では、トリグリセリドをイソプロパノール中に抽
出し、水酸化カリウムでけん化する。次いで放出された
グリセロールを過ヨウ素酸酸化によってホルムアルデヒ
ドに交換する、アセチルアセトンと反応させると、ホル
ムアルデヒドは黄色のジアセチルジヒドロルチジンを形
成し、これを比色分析で測定する。
リセリドのようなそれらの基質は、細胞膜機能及びエネ
ルギー輸送のあらゆる面に偏在する基本的なものであ
る。従ってこれらの成分のアッセイは臨床診断の多くの
領域で興味のあるものである。例えば、臨床標本のトリ
グリセリド含量は、最近の食物脂肪摂取量や、肝臓がエ
ネルギー源として脂肪を代謝する能力をある程度示唆す
ることができる。しかしながら、Sigma Chemical Co.
Ltd.（Poole,Dorset,UK）からキットとして市販されて
いるような、現在入手できるトリグリセリドアッセイ法
は、酵素の加水分解によって放出されるグリセロールの
測定によるものである。かくして、Sigma procedure
no.405では、トリグリセリドをイソプロパノール中に抽
出し、水酸化カリウムでけん化する。次いで放出された
グリセロールを過ヨウ素酸酸化によってホルムアルデヒ
ドに交換する、アセチルアセトンと反応させると、ホル
ムアルデヒドは黄色のジアセチルジヒドロルチジンを形
成し、これを比色分析で測定する。
Sigma procedure no.336,337,339及び334では、リ
パーゼを酵素的に用いてトリグリセリドからグリセロー
ルを放出させ、グリセロールを更にATPと反応させてグ
リセロールー１−ホスフェートを形成する。上記４つの
方法は、グリセロールー１−ホスフェートを更に反応さ
せて分光光度的に測定する吸光度に違いがある点におい
てのみ異なる。このようなアッセイを臨床サンプルに適
用すると、グリセロール自体は細胞代謝の産物であるの
で、血液標本中のグリセロール含量のアッセイが被験体
中を循環するトリグリセリドレベルの正確な値をしめさ
ない、という欠点を有する［Cole,Clin.Chem.36/7,1267
−1268（1960）参照］。低濃度で、又は少量の臨床血液
標本中で正確な結果を与える、トリグリセリドをアッセ
イする他の方法の開発が明らかに必要である。
パーゼを酵素的に用いてトリグリセリドからグリセロー
ルを放出させ、グリセロールを更にATPと反応させてグ
リセロールー１−ホスフェートを形成する。上記４つの
方法は、グリセロールー１−ホスフェートを更に反応さ
せて分光光度的に測定する吸光度に違いがある点におい
てのみ異なる。このようなアッセイを臨床サンプルに適
用すると、グリセロール自体は細胞代謝の産物であるの
で、血液標本中のグリセロール含量のアッセイが被験体
中を循環するトリグリセリドレベルの正確な値をしめさ
ない、という欠点を有する［Cole,Clin.Chem.36/7,1267
−1268（1960）参照］。低濃度で、又は少量の臨床血液
標本中で正確な結果を与える、トリグリセリドをアッセ
イする他の方法の開発が明らかに必要である。
また、迅速かつ正確な、低濃度でのリパーゼ活性のア
ッセイが必要とされている。臨床診断では、特に急性腹
部緊急事態に関わる、膵臓炎の信頼できる検出法が必要
である。膵臓炎の診断を確認するには、血液中の膵臓酵
素、特にアミラーゼとリパーゼの上昇レベルを検出する
ことに依っているが、通常はアミラーゼレベルを測定す
ることによってなされている。しかし、アミラーゼは理
的なマーカーではない。何故なら、アミラーゼは小さ
く、腎臓で部分的に濾過されるので、膵臓中のレベルは
腎臓の逆機能によって影響されるからである。アミラー
ゼの血中上昇レベルは、大量の唾液アミラーゼを生産す
る耳下腺の障害によっても起きる。リパーゼはより良い
代替物となる可能性があり、この種のアッセイについて
の文献も含んでいるM.Ventrucci et al.,Digestive Dis
eases and Science 34,39−45（January 1989）を参照
されたい。しかし、この酵素のために今までに開発され
た臨床アッセイは、遅くて鋭敏ではない。血清中のリパ
ーゼ活性測定用のSigma procedure no.800はこの典型
である。酵素基質としてオリーブオイルを用い、形成さ
れる脂肪酸の量を標準化希釈水酸化ナトリウム溶液で滴
定して測定する、チモールフタレインの終点に要するア
ルカリの量が、リパーゼ活性に比例する。
ッセイが必要とされている。臨床診断では、特に急性腹
部緊急事態に関わる、膵臓炎の信頼できる検出法が必要
である。膵臓炎の診断を確認するには、血液中の膵臓酵
素、特にアミラーゼとリパーゼの上昇レベルを検出する
ことに依っているが、通常はアミラーゼレベルを測定す
ることによってなされている。しかし、アミラーゼは理
的なマーカーではない。何故なら、アミラーゼは小さ
く、腎臓で部分的に濾過されるので、膵臓中のレベルは
腎臓の逆機能によって影響されるからである。アミラー
ゼの血中上昇レベルは、大量の唾液アミラーゼを生産す
る耳下腺の障害によっても起きる。リパーゼはより良い
代替物となる可能性があり、この種のアッセイについて
の文献も含んでいるM.Ventrucci et al.,Digestive Dis
eases and Science 34,39−45（January 1989）を参照
されたい。しかし、この酵素のために今までに開発され
た臨床アッセイは、遅くて鋭敏ではない。血清中のリパ
ーゼ活性測定用のSigma procedure no.800はこの典型
である。酵素基質としてオリーブオイルを用い、形成さ
れる脂肪酸の量を標準化希釈水酸化ナトリウム溶液で滴
定して測定する、チモールフタレインの終点に要するア
ルカリの量が、リパーゼ活性に比例する。
この方法は緊急臨床処置として用いるには明らかに適
当ではない。従って血清リパーゼのための迅速かつ鋭敏
なアッセイが求められている。
当ではない。従って血清リパーゼのための迅速かつ鋭敏
なアッセイが求められている。
［発明の開示］ このような酵素を基質に作用させて脂肪酸を放出さ
せ、次いで放出された脂肪酸と、脂肪酸と高い親和性で
結合するタンパク質（10-5M又はそれ以下の解離定数を
有する）との結合を検出又は測定することによって、血
清などの臨床サンプル中の酵素及び基質を迅速かつ鋭敏
にアッセイできることが今回発見された。このようなタ
ンパク質は脂肪酸結合タンパク質（fatty acid bindi
ng protein:FABP）として知られているものが好まし
く、例えば動物の肝臓から抽出される天然産物である。
これ以後本発明はFABPについて記載するが、このような
高い親和性で脂肪酸と結合する他の結合性タンパク質も
FABPに代えて用いることができ、従ってこれらも“脂肪
酸結合タンパク質”の語に含まれることが理解されるで
あろう。更に、本発明は臨床標本として血清について記
載するが、全血及び血漿のような他の臨床標本、またそ
れに由来する部分精製画分にも本発明は適用できること
が理解されるであろう。脂肪酸−FABP結合の相互作用の
アッセイは、標識プローブ（labelled probe）、実際
にはFABP上での結合部位に対してリパーゼによって放出
される脂肪酸と競合する標識脂肪酸を用いて実施するの
が最も便宜的である。便宜的には、遊離の標識化、即ち
FABPと結合していない標識化物の量を次いで測定する。
しかしながら、臨床標本の正常な成分である血清アルブ
ミン（SA）もまた高い親和性で脂肪酸と結合する部位を
有している。これらの結合部位のいくつかが開放されて
いる（free）とき、即ち脂肪酸の可能結合容量の全てが
飽和されているのではないときには、血清リパーゼによ
って放出される脂肪酸はFABPよりもむしろSAと結合しが
ちであり、従って脂肪酸とFABP用プローブとの競合は生
じない。脂肪酸はまず最初に不飽和SA部位を飽和しなけ
ればならないので、アッセイは鋭敏でなくなったり、ま
た間違ったネガティブな結果を与えることになる。本発
明では、酵素又はその基質のアッセイに用いる血清サン
プルからSAを除去することによって問題を克服する。SA
と結合する脂肪酸の有意な量をサンプル中に放出するこ
となく、これを実施できることが今回発見された。
せ、次いで放出された脂肪酸と、脂肪酸と高い親和性で
結合するタンパク質（10-5M又はそれ以下の解離定数を
有する）との結合を検出又は測定することによって、血
清などの臨床サンプル中の酵素及び基質を迅速かつ鋭敏
にアッセイできることが今回発見された。このようなタ
ンパク質は脂肪酸結合タンパク質（fatty acid bindi
ng protein:FABP）として知られているものが好まし
く、例えば動物の肝臓から抽出される天然産物である。
これ以後本発明はFABPについて記載するが、このような
高い親和性で脂肪酸と結合する他の結合性タンパク質も
FABPに代えて用いることができ、従ってこれらも“脂肪
酸結合タンパク質”の語に含まれることが理解されるで
あろう。更に、本発明は臨床標本として血清について記
載するが、全血及び血漿のような他の臨床標本、またそ
れに由来する部分精製画分にも本発明は適用できること
が理解されるであろう。脂肪酸−FABP結合の相互作用の
アッセイは、標識プローブ（labelled probe）、実際
にはFABP上での結合部位に対してリパーゼによって放出
される脂肪酸と競合する標識脂肪酸を用いて実施するの
が最も便宜的である。便宜的には、遊離の標識化、即ち
FABPと結合していない標識化物の量を次いで測定する。
しかしながら、臨床標本の正常な成分である血清アルブ
ミン（SA）もまた高い親和性で脂肪酸と結合する部位を
有している。これらの結合部位のいくつかが開放されて
いる（free）とき、即ち脂肪酸の可能結合容量の全てが
飽和されているのではないときには、血清リパーゼによ
って放出される脂肪酸はFABPよりもむしろSAと結合しが
ちであり、従って脂肪酸とFABP用プローブとの競合は生
じない。脂肪酸はまず最初に不飽和SA部位を飽和しなけ
ればならないので、アッセイは鋭敏でなくなったり、ま
た間違ったネガティブな結果を与えることになる。本発
明では、酵素又はその基質のアッセイに用いる血清サン
プルからSAを除去することによって問題を克服する。SA
と結合する脂肪酸の有意な量をサンプル中に放出するこ
となく、これを実施できることが今回発見された。
SAを除去するための好ましい試薬は10（１−ナフトイ
ルアミノ）デシルアガロース（NADA）である。この試薬
はアッセイに何ら影響を及ぼさずに、血清アルブミンを
吸収することが今回発見された。多環性試薬であるNADA
は、恐らくそのビリルビン−結合部位でSAと結合し、高
親和性脂肪酸−結合部位と有意に結合してこの部位から
脂肪酸を放出させることをしない。全体の結果として、
NADAは、脱アルブミン化血清サンプル中に遊離脂肪酸を
有意に放出することなく、SAと結合する。血清中への脂
肪酸の放出は、間違ったポジティブ値、又は過剰な値を
アッセイに与えることになるので、好ましくない。
ルアミノ）デシルアガロース（NADA）である。この試薬
はアッセイに何ら影響を及ぼさずに、血清アルブミンを
吸収することが今回発見された。多環性試薬であるNADA
は、恐らくそのビリルビン−結合部位でSAと結合し、高
親和性脂肪酸−結合部位と有意に結合してこの部位から
脂肪酸を放出させることをしない。全体の結果として、
NADAは、脱アルブミン化血清サンプル中に遊離脂肪酸を
有意に放出することなく、SAと結合する。血清中への脂
肪酸の放出は、間違ったポジティブ値、又は過剰な値を
アッセイに与えることになるので、好ましくない。
従って、上記の原理を実施化するために、アルブミン
−含有臨床サンプル中における、長鎖脂肪酸の放出を直
接又は間接に触媒する酵素、又はこのような酵素のため
のエステル基質をアッセイする以下の構成の方法が提供
される： （１）臨床サンプルから全てのアルブミンを実質的に除
去し； （２）アルブミンを含まない臨床サンプルを、アッセイ
すべき酵素のためのエステル基質と、又はアッセイすべ
き基質上で作用する酵素と共に、それから脂肪酸を放出
させるのに効果的な条件下にインキュベーションし（in
cubating）； （３）かくして放出された脂肪酸を脂肪酸結合タンパク
質（FABP）と結合させ；そして （４）FABPの脂肪酸との結合をアッセイする。
−含有臨床サンプル中における、長鎖脂肪酸の放出を直
接又は間接に触媒する酵素、又はこのような酵素のため
のエステル基質をアッセイする以下の構成の方法が提供
される： （１）臨床サンプルから全てのアルブミンを実質的に除
去し； （２）アルブミンを含まない臨床サンプルを、アッセイ
すべき酵素のためのエステル基質と、又はアッセイすべ
き基質上で作用する酵素と共に、それから脂肪酸を放出
させるのに効果的な条件下にインキュベーションし（in
cubating）； （３）かくして放出された脂肪酸を脂肪酸結合タンパク
質（FABP）と結合させ；そして （４）FABPの脂肪酸との結合をアッセイする。
本発明の特に好ましい態様によると、血清サンプル中
のリパーゼをアッセイする、以下の構成の方法が提供さ
れる： （１）好ましくは血清アルブミン（SA）と結合した脂肪
酸を血清中に全く放出することなく、血清サンプルから
全てのSAを実質的に除去し； （２）アルブミンを含まない血清サンプルを、トリグリ
セリド脂肪酸エステルであるリパーゼ用基質と共に、リ
パーゼの作用によってそれから脂肪酸を放出させるのに
効果的な条件下にインキュベーションし； （３）かくして放出された脂肪酸を脂肪酸結合タンパク
質（FABP）と結合させ；そして （４）脂肪酸のFABPとの結合をアッセイする。
のリパーゼをアッセイする、以下の構成の方法が提供さ
れる： （１）好ましくは血清アルブミン（SA）と結合した脂肪
酸を血清中に全く放出することなく、血清サンプルから
全てのSAを実質的に除去し； （２）アルブミンを含まない血清サンプルを、トリグリ
セリド脂肪酸エステルであるリパーゼ用基質と共に、リ
パーゼの作用によってそれから脂肪酸を放出させるのに
効果的な条件下にインキュベーションし； （３）かくして放出された脂肪酸を脂肪酸結合タンパク
質（FABP）と結合させ；そして （４）脂肪酸のFABPとの結合をアッセイする。
本発明は、本発明のアッセイを実施するための以下の
構成のキットをも含む： （１）臨床サンプルから血清アルブミン（SA）などの全
てのアルブミンを実質的に除去する試薬、及び （２）脂肪酸結合タンパク質（FABP）。
構成のキットをも含む： （１）臨床サンプルから血清アルブミン（SA）などの全
てのアルブミンを実質的に除去する試薬、及び （２）脂肪酸結合タンパク質（FABP）。
好ましくは、キットはアッセイされるべき酵素のため
の適当な基質、又はアッセイされるべき基質を加水分解
することができる酵素をも含む。リパーゼアッセイの場
合には、必要な脂肪酸エステル基質は単にオリーブオイ
ルでよいので、キットの一部として売らなくてもよい。
脂肪酸と競合してFABPと結合する標識プローブはキット
に含まれていることが好ましい。
の適当な基質、又はアッセイされるべき基質を加水分解
することができる酵素をも含む。リパーゼアッセイの場
合には、必要な脂肪酸エステル基質は単にオリーブオイ
ルでよいので、キットの一部として売らなくてもよい。
脂肪酸と競合してFABPと結合する標識プローブはキット
に含まれていることが好ましい。
SAの不溶化にNADAを使用することは、アッセイに使用
するか否かは別として、それ自体新規であると考えられ
る。
するか否かは別として、それ自体新規であると考えられ
る。
［発明を実施するための最良の形態］ 本発明のアッセイは原則的にあらゆる哺乳動物の血清
に適用できるが、もちろん主としてヒトに関心がある。
本アッセイの目的の一つは、血液中、従って血清中の高
濃度の酵素リパーゼによって明らかにされる、膵臓機能
の異常を検出することである。
に適用できるが、もちろん主としてヒトに関心がある。
本アッセイの目的の一つは、血液中、従って血清中の高
濃度の酵素リパーゼによって明らかにされる、膵臓機能
の異常を検出することである。
また他の目的は、血清中のホスホリパーゼの存在を検
出することであり、このホスホリパーゼは、リン脂質を
長鎖脂肪酸に直接加水分解することのできるホスホリパ
ーゼＡ、又はリン脂質をジアシルグリセロール（このジ
アシルグリセロールは過剰のリパーゼの作用によってそ
れ自体容易に加水分解されて長鎖脂肪酸を放出する）に
加水分解するホスホリパーゼＣでありうる。後者の場
合、可能性ある他のリパーゼ基質、即ちトリグリセリド
を除去するために血清の脱脂肪化が必要である。更に他
の目的は、血液中のトリグリセリドの濃度を検出及び／
又はモニターすることである。本アッセイはまた、適当
なコレステロール基質を用いる、血清中のコレステロー
ルエステルのアッセイにも適用できる。
出することであり、このホスホリパーゼは、リン脂質を
長鎖脂肪酸に直接加水分解することのできるホスホリパ
ーゼＡ、又はリン脂質をジアシルグリセロール（このジ
アシルグリセロールは過剰のリパーゼの作用によってそ
れ自体容易に加水分解されて長鎖脂肪酸を放出する）に
加水分解するホスホリパーゼＣでありうる。後者の場
合、可能性ある他のリパーゼ基質、即ちトリグリセリド
を除去するために血清の脱脂肪化が必要である。更に他
の目的は、血液中のトリグリセリドの濃度を検出及び／
又はモニターすることである。本アッセイはまた、適当
なコレステロール基質を用いる、血清中のコレステロー
ルエステルのアッセイにも適用できる。
本アッセイにおいては、血清アルブミン（SA）がまず
サンプルから除去される。既に説明したように、これは
脂肪酸結合部位以外の結合部位でSAと結合する試薬を用
いて、試薬−SA複合体を固定化し、そしてこの固定化複
合体を血清から分離することによって実施することが好
ましい。
サンプルから除去される。既に説明したように、これは
脂肪酸結合部位以外の結合部位でSAと結合する試薬を用
いて、試薬−SA複合体を固定化し、そしてこの固定化複
合体を血清から分離することによって実施することが好
ましい。
SAの除去のための試薬は通常、脂肪酸結合部位に試薬
が近づくのを立体的に防ぐための嵩高い基と、長鎖疎水
基とからなり。アガロースとカップリングしているもの
がよい。もちろん、不安定な化合物は避けるべきであ
る。
が近づくのを立体的に防ぐための嵩高い基と、長鎖疎水
基とからなり。アガロースとカップリングしているもの
がよい。もちろん、不安定な化合物は避けるべきであ
る。
好ましい試薬:10−（１′−ナフトイルアミノ）デシ
ルアガロース（NADA）は以下の化学式を有する： この化合物自体は公知であり、D.C.Wioton,Biochem
J.261,273−276（1989）を参照されたいが，該文献には
その脂肪酸結合タンパク質（FABP）の精製への使用が記
載されている。このゼラチン性不溶性試薬はリパーゼ濃
度に何ら影響を及ぼさないように見える。これは約5mg/
mlゲルの高結合能力を有する。結合は実質的に即座に起
こり、血清を単にゲルと混合し、結合した物質を遠心で
除去する。又はNADAのミクロカラムを用いる。
ルアガロース（NADA）は以下の化学式を有する： この化合物自体は公知であり、D.C.Wioton,Biochem
J.261,273−276（1989）を参照されたいが，該文献には
その脂肪酸結合タンパク質（FABP）の精製への使用が記
載されている。このゼラチン性不溶性試薬はリパーゼ濃
度に何ら影響を及ぼさないように見える。これは約5mg/
mlゲルの高結合能力を有する。結合は実質的に即座に起
こり、血清を単にゲルと混合し、結合した物質を遠心で
除去する。又はNADAのミクロカラムを用いる。
対応するダンシル化合物： も用い得るが、長期間の光には不安定である。
SAを除去する他の方法も用い得る。例えばSAの固定化
抗体を用いることができる。５−ブチル−１−シクロヘ
キシルバルビツール酸のようなSAのビルビンー又はヘム
ー結合部位に結合し、かつ支持物質にカップリングする
ことが知られている、他の試薬を用いることもできる。
抗体を用いることができる。５−ブチル−１−シクロヘ
キシルバルビツール酸のようなSAのビルビンー又はヘム
ー結合部位に結合し、かつ支持物質にカップリングする
ことが知られている、他の試薬を用いることもできる。
脂肪酸結合部位で結合する試薬を用いてSAを除去する
ことも可能であるが、あまり好ましくない。アッセイの
結果を評価する際に、既にSAと結合した脂肪酸の可能な
置換についての斟酌がなされるべきである。オレオイル
−又はパルミチルωアミノアルキルアミノアガロースが
適当である。T.Peters et al.,Bio.Chem.248,2447−245
1（1973）を参照されたい。
ことも可能であるが、あまり好ましくない。アッセイの
結果を評価する際に、既にSAと結合した脂肪酸の可能な
置換についての斟酌がなされるべきである。オレオイル
−又はパルミチルωアミノアルキルアミノアガロースが
適当である。T.Peters et al.,Bio.Chem.248,2447−245
1（1973）を参照されたい。
アッセイの第２段階では、第１段階で全SAが実質的に
除去された血清サンプルを、アッセイすべき酵素のため
の基質、又はアッセイすべき基質上で作用する酵素と共
にインキュベーションする。例えば、リパーゼのアッセ
イにおいては、リパーゼ酵素はグリセリルエステルの加
水分解に特異的であるので、基質はほとんど常に脂肪酸
エステルでなければならない。ここで使用する“脂肪
酸”の語は、主として長い脂肪族鎖とカルボン酸基とを
有する酸を意味する。長鎖の脂肪族基は、飽和、不飽和
のいずれでもよい。鎖の長さはFABPとの結合の必要性に
よって決定され、広くは10から20であり、好ましくは16
から18炭素原子である。例えば、オレイン、リノレン
パルミチン、ミリスチン又はステアリン酸である。エス
テル中のアルコール残基はどのようなものでもよいが、
エステルはグリセリドであるのが都合がよい。好ましい
エステルはオリーブオイルとして市販されているオレイ
ン酸トリグリセリドである。血清サンプルを、リパーゼ
による酵素的加水分解に効果的な温度で、リパーゼ基質
とインキュベーションする。最も便宜的には室温（20−
25℃）が用いられるが、15から40℃の温度で通常作用す
る。
除去された血清サンプルを、アッセイすべき酵素のため
の基質、又はアッセイすべき基質上で作用する酵素と共
にインキュベーションする。例えば、リパーゼのアッセ
イにおいては、リパーゼ酵素はグリセリルエステルの加
水分解に特異的であるので、基質はほとんど常に脂肪酸
エステルでなければならない。ここで使用する“脂肪
酸”の語は、主として長い脂肪族鎖とカルボン酸基とを
有する酸を意味する。長鎖の脂肪族基は、飽和、不飽和
のいずれでもよい。鎖の長さはFABPとの結合の必要性に
よって決定され、広くは10から20であり、好ましくは16
から18炭素原子である。例えば、オレイン、リノレン
パルミチン、ミリスチン又はステアリン酸である。エス
テル中のアルコール残基はどのようなものでもよいが、
エステルはグリセリドであるのが都合がよい。好ましい
エステルはオリーブオイルとして市販されているオレイ
ン酸トリグリセリドである。血清サンプルを、リパーゼ
による酵素的加水分解に効果的な温度で、リパーゼ基質
とインキュベーションする。最も便宜的には室温（20−
25℃）が用いられるが、15から40℃の温度で通常作用す
る。
アッセイの第２段階で選択する基質は、アッセイした
いと考える酵素に依存することが理解されるであろう。
従って、膵臓ホスホリパーゼA2のアッセイには、ジオレ
オイルホスファチジルグリセロール、又はその他のホス
ホリパーゼA2源にはジオレオイルホスファチジルコリン
のような、その基質が以下の方法で分析しうる長鎖脂肪
酸を生産しうる酵素基質を用いるのが適当である。若し
くは、ホスホリパーゼＣのアッセイには、ジオレオイル
ホスファチジルコリンのようなこの酵素用の基質を用い
るのが適当であるが、この酵素は間接的にのみアッセイ
しうる長鎖脂肪酸産物を放出するので、ジアシルグリセ
リド産物を加水分解して長鎖脂肪酸を放出させることの
できる過剰の酵素（リパーゼなど）をも用いることが必
要となる。
いと考える酵素に依存することが理解されるであろう。
従って、膵臓ホスホリパーゼA2のアッセイには、ジオレ
オイルホスファチジルグリセロール、又はその他のホス
ホリパーゼA2源にはジオレオイルホスファチジルコリン
のような、その基質が以下の方法で分析しうる長鎖脂肪
酸を生産しうる酵素基質を用いるのが適当である。若し
くは、ホスホリパーゼＣのアッセイには、ジオレオイル
ホスファチジルコリンのようなこの酵素用の基質を用い
るのが適当であるが、この酵素は間接的にのみアッセイ
しうる長鎖脂肪酸産物を放出するので、ジアシルグリセ
リド産物を加水分解して長鎖脂肪酸を放出させることの
できる過剰の酵素（リパーゼなど）をも用いることが必
要となる。
もしもアッセイが酵素自身でなく、基質の存在決定を
目的とするものである場合には、アッセイの第２段階で
加えるのは適切な酵素である。かくしてアッセイサンプ
ル中のトリグリセリドの量をアッセイするのに過剰のリ
パーゼが用いられる。コレステロールエステルのアッセ
イにはコレステロールエステラーゼが用いられる。
目的とするものである場合には、アッセイの第２段階で
加えるのは適切な酵素である。かくしてアッセイサンプ
ル中のトリグリセリドの量をアッセイするのに過剰のリ
パーゼが用いられる。コレステロールエステルのアッセ
イにはコレステロールエステラーゼが用いられる。
次いで脂肪酸結合タンパク質（FABP）をインキュベー
ション混合物に加える。各種のタイプのFABPを用い得
る。これらは好ましくは細胞質ゾル性であり、通常これ
らが単離された組織、例えば、小腸、心筋、肝臓及び脂
肪性組織などによって命名される。肝FABPが好ましく、
ラット、ブタ又はウシなどの動物の肝臓から便宜的に抽
出される。好ましい抽出方法は、D.C.Wilton,Biochem
J.261,273−276（1989）に記載されている。FABPは天然
産物とは限らない。酸に結合する合成類似体であっても
よいし、又は組み換えDNA法で得られた天然産物の類似
体、例えば大腸菌中の遺伝子発現で生産されるラット肝
臓FABP［J.B.Lowe et al.,J.Biol.Chem,259,12696−127
04（1984）参照］であってもよい。リパーゼによって放
出される酸に効果的に結合させるインキュベーション条
件ならば、いかなるものでも使用できる。広く言えば、
加水分解段階と同じ温度で作用する。
ション混合物に加える。各種のタイプのFABPを用い得
る。これらは好ましくは細胞質ゾル性であり、通常これ
らが単離された組織、例えば、小腸、心筋、肝臓及び脂
肪性組織などによって命名される。肝FABPが好ましく、
ラット、ブタ又はウシなどの動物の肝臓から便宜的に抽
出される。好ましい抽出方法は、D.C.Wilton,Biochem
J.261,273−276（1989）に記載されている。FABPは天然
産物とは限らない。酸に結合する合成類似体であっても
よいし、又は組み換えDNA法で得られた天然産物の類似
体、例えば大腸菌中の遺伝子発現で生産されるラット肝
臓FABP［J.B.Lowe et al.,J.Biol.Chem,259,12696−127
04（1984）参照］であってもよい。リパーゼによって放
出される酸に効果的に結合させるインキュベーション条
件ならば、いかなるものでも使用できる。広く言えば、
加水分解段階と同じ温度で作用する。
次いで酸−FABP結合が起こったことを検出することが
必要である。これを行う好ましい方法は、FABP上の限ら
れた数の結合部位に対して、標識脂肪酸種を、リパーゼ
によって放出された脂肪酸と競合させる競合アッセイで
ある。標識種をここでは“プローブ”と呼ぶ。これは通
常標識部分と、酸基と結合しており、典型的には酸基を
除いて９から19炭素原子を有する長鎖脂肪族部分とから
構成される。標識部分は例えば蛍光団、発色団又は発光
団でありうる。放射性標識はあまり好ましくない。
必要である。これを行う好ましい方法は、FABP上の限ら
れた数の結合部位に対して、標識脂肪酸種を、リパーゼ
によって放出された脂肪酸と競合させる競合アッセイで
ある。標識種をここでは“プローブ”と呼ぶ。これは通
常標識部分と、酸基と結合しており、典型的には酸基を
除いて９から19炭素原子を有する長鎖脂肪族部分とから
構成される。標識部分は例えば蛍光団、発色団又は発光
団でありうる。放射性標識はあまり好ましくない。
特に好ましい態様においては、標識は多環性蛍光団、
とりわけ極性鋭敏な蛍光団基を有するナフタレン又はア
ントラセンである。極性鋭敏な蛍光基とは、それが極性
から非極性環境へと移動するときに、蛍光発光（量子収
量及び最大波長）を変化させるものをいう。プローブが
FABP分子の非極性ミクロー環境から極性ミクロー環境
（通常は水性であるアッセイ媒質）へと移動する最に、
一定波長における蛍光シグナルの大きな変化が観察され
る。プローブは負に電荷しており、従って通常酸性塩の
形で存在する。特に好ましいプローブは以下の化学式： Pc−Ｚ−NH−（CH2）ｎ−X- ［式中、 Pcは、ナフタレン又はアントラセン残基を表し； Ｚは、−CO−又は−SO2を表し；そして X-は、酸基のアニオン、好ましくはCOO-を表す。
とりわけ極性鋭敏な蛍光団基を有するナフタレン又はア
ントラセンである。極性鋭敏な蛍光基とは、それが極性
から非極性環境へと移動するときに、蛍光発光（量子収
量及び最大波長）を変化させるものをいう。プローブが
FABP分子の非極性ミクロー環境から極性ミクロー環境
（通常は水性であるアッセイ媒質）へと移動する最に、
一定波長における蛍光シグナルの大きな変化が観察され
る。プローブは負に電荷しており、従って通常酸性塩の
形で存在する。特に好ましいプローブは以下の化学式： Pc−Ｚ−NH−（CH2）ｎ−X- ［式中、 Pcは、ナフタレン又はアントラセン残基を表し； Ｚは、−CO−又は−SO2を表し；そして X-は、酸基のアニオン、好ましくはCOO-を表す。
ｎは４から24、好ましくは８から19、特に８から12の
数である］ を有するものである。
数である］ を有するものである。
以下の式： を有する11−（ダンシルアミノ）ウンデカノン酸（DAUD
A）の塩が特に好ましい。このプローブは脂肪酸と競合
してFABPと結合することが知られている［T.C.I.Wilkin
son and D.C.Wioton,Biochem.J.247,485−488（1987）
参照］。使用できる他の蛍光団は９−アンスロイルオキ
シ脂肪酸［J,Storch et al.,J.Biol.Chem.264,8708−87
13（1989）参照）］及びシスーパリナリン酸（ポリエン
脂肪酸）［H.J.K.Keuper et al.,Chem.Phys.Lipids 38,
159−178（1985）参照］である。
A）の塩が特に好ましい。このプローブは脂肪酸と競合
してFABPと結合することが知られている［T.C.I.Wilkin
son and D.C.Wioton,Biochem.J.247,485−488（1987）
参照］。使用できる他の蛍光団は９−アンスロイルオキ
シ脂肪酸［J,Storch et al.,J.Biol.Chem.264,8708−87
13（1989）参照）］及びシスーパリナリン酸（ポリエン
脂肪酸）［H.J.K.Keuper et al.,Chem.Phys.Lipids 38,
159−178（1985）参照］である。
より好ましいものではないが、その他のアッセイは、
14C又は3Hなどで放射性標識した標識酸、或いはこれに
発色団を結合させたものをアッセイ媒質に加え、FABPの
限られた結合部位に対する標識酸と、リパーゼによって
放出された酸との競合後に、溶液中に残っている標識酸
の量を測定することからなる。標識酸の測定は、これを
Lipidex 1000［J.F.C.Glatz and J.H.Veerkamp,Anal.B
iochem 132,89−95（1983）参照］上で不溶化し、アッ
セイ媒質からLipidex 1000を分離して、その上にある
標識物質の量を測定することによって実施できる。
14C又は3Hなどで放射性標識した標識酸、或いはこれに
発色団を結合させたものをアッセイ媒質に加え、FABPの
限られた結合部位に対する標識酸と、リパーゼによって
放出された酸との競合後に、溶液中に残っている標識酸
の量を測定することからなる。標識酸の測定は、これを
Lipidex 1000［J.F.C.Glatz and J.H.Veerkamp,Anal.B
iochem 132,89−95（1983）参照］上で不溶化し、アッ
セイ媒質からLipidex 1000を分離して、その上にある
標識物質の量を測定することによって実施できる。
競合アッセイ種は通常、脂肪酸の前、同時、又は後で
アッセイ混合物に加えることができる。ある種がFABPか
らの他のものに置換して、可逆反応の平衡位置に達した
とき、アッセイは“競合的”であると見なされる。競合
種がFABPと結合するとき、その結合は各種の方法で測定
することができる。極性鋭敏な蛍光団の場合、蛍光の変
化を容易にモニターすることができる。色及び発色団の
強度変化、又は発光団の強度変化もまた測定可能であ
る。若しくは、FABP−プローブ種を沈殿させて、沈殿を
分離し、そしてFABPと結合した標識の量、又は溶液中に
残っている遊離の標識の量を測定することも可能であ
る。これは例えば、FABPに対する固定化抗体を用いる
か、或いはアガローズのような不溶性物質にFABPを直接
カップリングさせることにより実施できる。
アッセイ混合物に加えることができる。ある種がFABPか
らの他のものに置換して、可逆反応の平衡位置に達した
とき、アッセイは“競合的”であると見なされる。競合
種がFABPと結合するとき、その結合は各種の方法で測定
することができる。極性鋭敏な蛍光団の場合、蛍光の変
化を容易にモニターすることができる。色及び発色団の
強度変化、又は発光団の強度変化もまた測定可能であ
る。若しくは、FABP−プローブ種を沈殿させて、沈殿を
分離し、そしてFABPと結合した標識の量、又は溶液中に
残っている遊離の標識の量を測定することも可能であ
る。これは例えば、FABPに対する固定化抗体を用いる
か、或いはアガローズのような不溶性物質にFABPを直接
カップリングさせることにより実施できる。
また代替的な方法では、例えば脂肪酸エステルを蛍光
リポーター基と結合させることによって脂肪酸エステル
をその酸部分で標識し、放出される蛍光脂肪酸のFABPへ
の結合を、結合時に生じる適当な特定変化によって測定
する。
リポーター基と結合させることによって脂肪酸エステル
をその酸部分で標識し、放出される蛍光脂肪酸のFABPへ
の結合を、結合時に生じる適当な特定変化によって測定
する。
本発明を以下の実施例で例示する。
実施例１ 血清からの血清アルブミンの除去 血清サンプル0.002ml（Pathology Laboratory,South
ampton General Hospitalから入手）をプラスティッ
クミクロ遠心管中のナフトイルーアガロースの50容量％
水性懸濁液1mlに加えた。得られた混合物を10秒間撹拌
し、次いでEppendorf microfugeで15秒間遠心した。得
られた上澄みの典型的には0.05mlを蛍光アッセイで測定
した。
ampton General Hospitalから入手）をプラスティッ
クミクロ遠心管中のナフトイルーアガロースの50容量％
水性懸濁液1mlに加えた。得られた混合物を10秒間撹拌
し、次いでEppendorf microfugeで15秒間遠心した。得
られた上澄みの典型的には0.05mlを蛍光アッセイで測定
した。
リパーゼ活性の蛍光アッセイ 基質及び蛍光プローブを含むバッファー溶液を以下の
ように調製した。Sterilin管中の0.1M NaCl及び2.5mM
CaCl2を含む0.1MトリスバッファーpH8.0 20mlにエタ
ノール中の10mg/mlオリーブオイル0.2ml及びメタノール
中の0.1mM 11−（ダンシルアミノ）ウンデカノン酸（D
AUDA）0.2mlを加えた。混合物をしばらく振った。この
アッセイ溶液2mlを4mlのプラスティックの使い捨て蛍光
分析器用セルに加えて、これを25℃でPerkin−Elmer L
S3B蛍光分析器に入れた。励起波長は350nmで、蛍光は50
0nmで測定した。蛍光なしの読み取りを得るために器械
の目盛りをゼロに戻した。脱アルブミン化血清サンプル
0.05mlをアッセイに加え、次いでFABP0.025mg（典型的
には2.5mg/ml溶液を0.01ml）を加えた。蛍光の初期落ち
込みが２分までの間に記録された。
ように調製した。Sterilin管中の0.1M NaCl及び2.5mM
CaCl2を含む0.1MトリスバッファーpH8.0 20mlにエタ
ノール中の10mg/mlオリーブオイル0.2ml及びメタノール
中の0.1mM 11−（ダンシルアミノ）ウンデカノン酸（D
AUDA）0.2mlを加えた。混合物をしばらく振った。この
アッセイ溶液2mlを4mlのプラスティックの使い捨て蛍光
分析器用セルに加えて、これを25℃でPerkin−Elmer L
S3B蛍光分析器に入れた。励起波長は350nmで、蛍光は50
0nmで測定した。蛍光なしの読み取りを得るために器械
の目盛りをゼロに戻した。脱アルブミン化血清サンプル
0.05mlをアッセイに加え、次いでFABP0.025mg（典型的
には2.5mg/ml溶液を0.01ml）を加えた。蛍光の初期落ち
込みが２分までの間に記録された。
図１は、蛍光置換過程を示すものであり、（ａ）から
（ｂ）は、膵臓炎患者からの脱アルブミン化血清の添加
（それぞれ血清0.1,0.2,0.4及び0.8μｌと等価）を示
し、（ｅ）は対照患者（正常脱アルブミン化血清の1.0
μｌと等価）を示し、そして（ｆ）は血清サンプルを加
えない対照を示す。
（ｂ）は、膵臓炎患者からの脱アルブミン化血清の添加
（それぞれ血清0.1,0.2,0.4及び0.8μｌと等価）を示
し、（ｅ）は対照患者（正常脱アルブミン化血清の1.0
μｌと等価）を示し、そして（ｆ）は血清サンプルを加
えない対照を示す。
このアッセイは、血清不存在下に既知の量のオレイン
酸（典型的にはメタノール中の１−10nモルの溶液）を
加えて、得られる蛍光の量子の落ち込み（quantum ? f
all）を記録することによって検定できる。
酸（典型的にはメタノール中の１−10nモルの溶液）を
加えて、得られる蛍光の量子の落ち込み（quantum ? f
all）を記録することによって検定できる。
このアッセイは脂肪酸放出率を約100ピカモル/ml/分
まで量的に測定することが見いだされ、これは約３ピカ
カタールの酵素活性に対応した（カタールは酵素の変換
率を測定する単位であり、モル／秒である）。従って、
対照血清サンプルのためには、アッセイは血清0.001−
0.01mlと等価で実施される。
まで量的に測定することが見いだされ、これは約３ピカ
カタールの酵素活性に対応した（カタールは酵素の変換
率を測定する単位であり、モル／秒である）。従って、
対照血清サンプルのためには、アッセイは血清0.001−
0.01mlと等価で実施される。
実施例２ ホスホリパーゼA2のアッセイ 長鎖脂肪酸を放出するリパーゼ以外の酵素アッセイに
本発明を適用できることを示すために、実施例１に記載
したのと本質的には同じ蛍光アッセイを用いて、市販の
ブタ膵臓ホスホリポーゼA2（Sigma Chemical.Co.Ltd.
より入手）をアッセイした。アッセイ（2ml）は、ジオ
レオイルホスファチジルコリン0.05mg/ml、１μＭ DAU
DA及びFABP 0.125mg/mlを含んでいた。図２に示すよう
な蛍光置換過程が得られ、ここで（ａ）はホスホリパー
ゼA2を加えないものであり；（ｂ）は酵素10ng;（ｃ）
は酵素100ng;（ｄ）は酵素500ng添加を示す。
本発明を適用できることを示すために、実施例１に記載
したのと本質的には同じ蛍光アッセイを用いて、市販の
ブタ膵臓ホスホリポーゼA2（Sigma Chemical.Co.Ltd.
より入手）をアッセイした。アッセイ（2ml）は、ジオ
レオイルホスファチジルコリン0.05mg/ml、１μＭ DAU
DA及びFABP 0.125mg/mlを含んでいた。図２に示すよう
な蛍光置換過程が得られ、ここで（ａ）はホスホリパー
ゼA2を加えないものであり；（ｂ）は酵素10ng;（ｃ）
は酵素100ng;（ｄ）は酵素500ng添加を示す。
実施例３ 血清中のトリグリセリドのアッセイ 実施例１に記載したように血清サンプル0.01mlからア
ルブミンを除去した。過剰のリパーゼ（Rhizopus arrh
izus由来）と共にインキュベーションした脱アルブミン
化血清0.5μｌ等価を用いて、（CaCl2を含まないバッフ
ァーを用いること以外は）実施例１に記載したアッセイ
を実施して、DAUDA置換による蛍光の急速な落ち込みが
３分間にわたって観察された。正常血清サンプルの蛍光
置換過程は図３に示すように得られ、適当な脂肪酸測定
酵素を用いる血清中の特定の脂肪アシル基質測定の原理
を表す。過程（ａ）はH2O対照、即ち脱アルブミン化血
清の不存在下を表し、（ｄ）は脱アルブミン化血清0.5
μｌ等価を用いるアッセイを表す。蛍光の落ち込みはリ
パーゼ添加で放出された脂肪酸1.5nモルと等価であっ
た。リパーゼによるトリグリセリドからの３つの脂肪酸
全ての放出を考えて、この血清1mM中のトリグリセリド
値が得られた。
ルブミンを除去した。過剰のリパーゼ（Rhizopus arrh
izus由来）と共にインキュベーションした脱アルブミン
化血清0.5μｌ等価を用いて、（CaCl2を含まないバッフ
ァーを用いること以外は）実施例１に記載したアッセイ
を実施して、DAUDA置換による蛍光の急速な落ち込みが
３分間にわたって観察された。正常血清サンプルの蛍光
置換過程は図３に示すように得られ、適当な脂肪酸測定
酵素を用いる血清中の特定の脂肪アシル基質測定の原理
を表す。過程（ａ）はH2O対照、即ち脱アルブミン化血
清の不存在下を表し、（ｄ）は脱アルブミン化血清0.5
μｌ等価を用いるアッセイを表す。蛍光の落ち込みはリ
パーゼ添加で放出された脂肪酸1.5nモルと等価であっ
た。リパーゼによるトリグリセリドからの３つの脂肪酸
全ての放出を考えて、この血清1mM中のトリグリセリド
値が得られた。
実施例４ ジグリセリドリパーゼ基質のアッセイ 本発明をジアシルグリセリドリパーゼ基質に適用でき
ることを示すために、市販の１−ステアロイル−２−ア
ラキドニル−sn−グリセロール（Sigma Chemical Co.
Ltd.から入手）を本質的には実施例１に記載した蛍光ア
ッセイによってアッセイした。アッセイ（2ml）は実施
例３に記載したようにリパーゼ、DAUDA及びFABPを含ん
でいた。エタノール中の0.1mg/ml １−ステアロイル−
２−アラキドニル−sn−グリセロール１から10μｌをア
ッセイ中に滴定して蛍光の初期落ち込みを測定して、ア
ッセイに添加したジグリセリドの量に対してプロットし
たものを図４に示す。
ることを示すために、市販の１−ステアロイル−２−ア
ラキドニル−sn−グリセロール（Sigma Chemical Co.
Ltd.から入手）を本質的には実施例１に記載した蛍光ア
ッセイによってアッセイした。アッセイ（2ml）は実施
例３に記載したようにリパーゼ、DAUDA及びFABPを含ん
でいた。エタノール中の0.1mg/ml １−ステアロイル−
２−アラキドニル−sn−グリセロール１から10μｌをア
ッセイ中に滴定して蛍光の初期落ち込みを測定して、ア
ッセイに添加したジグリセリドの量に対してプロットし
たものを図４に示す。
実施例５ ホスホリパーゼＣのアッセイ 長鎖脂肪酸を間接的に放出することのできる酵素のア
ッセイに本発明を適用できることを示すために、Bacill
us cereusの由来の市販のホスホリパーゼＣ（引用特異
的活性2500μモル／分/mg、Sigma Chemical Co.Ltd.
より入手）を本質的には実施例１に記載した蛍光アッセ
イによってアッセイした。アッセイ（2ml）はジオレオ
イルホスファチジルコリン0.05mg/ml（Lipid Product
s,UKより入手）１μＭ−DAUDA、FABP 0.01mg及び精製
ブタ膵臓リパーゼ10μｇ（引用特異的活性95600μモル
／時/mg、Sigma Chemical Co.Ltd.から入手）を含ん
でいた。蛍光置換過程が図５に示すように得られ、ここ
で（ａ）はホスホリパーゼＣを加えないものであり；
（ｂ）は酵素2ng添加；（ｃ）は酵素10ng添加；（ｄ）
は酵素50ng添加及び（ｅ）は酵素200ng添加を示す。
ッセイに本発明を適用できることを示すために、Bacill
us cereusの由来の市販のホスホリパーゼＣ（引用特異
的活性2500μモル／分/mg、Sigma Chemical Co.Ltd.
より入手）を本質的には実施例１に記載した蛍光アッセ
イによってアッセイした。アッセイ（2ml）はジオレオ
イルホスファチジルコリン0.05mg/ml（Lipid Product
s,UKより入手）１μＭ−DAUDA、FABP 0.01mg及び精製
ブタ膵臓リパーゼ10μｇ（引用特異的活性95600μモル
／時/mg、Sigma Chemical Co.Ltd.から入手）を含ん
でいた。蛍光置換過程が図５に示すように得られ、ここ
で（ａ）はホスホリパーゼＣを加えないものであり；
（ｂ）は酵素2ng添加；（ｃ）は酵素10ng添加；（ｄ）
は酵素50ng添加及び（ｅ）は酵素200ng添加を示す。
Claims (23)
- 【請求項１】（１）臨床サンプルから全てのアルブミン
を実質的に除去し； （２）アルブミンを含まない臨床サンプルを、アッセイ
すべき酵素のためのエステル基質と、又はアッセイすべ
き基質上で作用する酵素と共に、それから脂肪酸を放出
させるのに効果的な条件下にインキュベーションし； （３）かくして放出された脂肪酸を脂肪酸結合タンパク
質（FABP）と結合させ；そして （４）FABPの脂肪酸との結合をアッセイする、 ことからなる、アルブミン−含有臨床サンプル中におけ
る、長鎖脂肪酸の放出を直接又は間接に触媒する酵素、
又はこのような酵素のためのエステル基質のアッセイ方
法。 - 【請求項２】脂肪酸と競合してFABPと結合する標識プロ
ーブが、FABPと相互作用することが可能であり、次いで
遊離の、又は結合した標識プローブをアッセイする競合
法によってFABP−脂肪酸結合をアッセイする、請求の範
囲第１項記載の方法。 - 【請求項３】プローブが、酸基のアニオンを末端に有す
る長鎖脂肪族部分と結合した標識部分を含む、請求の範
囲第２項記載の方法。 - 【請求項４】標識が、極性鋭敏な蛍光基がFABPと結合す
るようになるとその蛍光スペクトルの変化をプローブに
与える極性鋭敏な蛍光基である、請求の範囲第３項記載
の方法。 - 【請求項５】長鎖脂肪族部分が酸基を除いて、８から19
個の炭素原子を有する、請求の範囲第３項記載の方法。 - 【請求項６】脂肪族部分がウンデカノン酸残基である、
請求の範囲第４項記載の方法。 - 【請求項７】プローブが11−（ダンシルアミノ）ウンデ
カノン酸のアニオンである、請求の範囲第２項から第６
項のいずれかに記載の方法。 - 【請求項８】アルブミンを試薬と結合させることによっ
て除去し、これが臨床サンプルへのアルブミンからの脂
肪酸の有意な放出をもたらさないが、サンプルからのア
ルブミンの実質的な除去をもたらす、前記請求の範囲の
いずれか１項に記載の方法。 - 【請求項９】アルブミン−結合試薬を固相にカップリン
グさせて不溶性物質を除去する、請求の範囲第８項記載
の方法。 - 【請求項１０】アルブミン−結合化合物が10−（１′−
ナフトイルアミノ）デシルアガロースである、請求の範
囲第９項記載の方法。 - 【請求項１１】FABPが肝臓性のものである、請求の範囲
第10項記載の方法。 - 【請求項１２】臨床サンプルが血清サンプルである、前
記請求の範囲のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１３】アッセイがリパーゼ用のものであり、第
２段階が、アルブミンを含まないサンプルを脂肪酸エス
テルであるリパーゼ用基質と共に、リパーゼの作用によ
ってそれから脂肪酸を放出させるのに効果的な条件下に
インキュベーションすることからなる、前記請求の範囲
のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１４】（１）臨床サンプルから全てのアルブミ
ンを実質的に除去する試薬、及び （２）脂肪酸結合タンパク質（FABP） からなる、アルブミン−含有臨床サンプル中における、
長鎖脂肪酸の放出を直接又は間接に触媒する酵素、又は
このような酵素のためのエステル基質のアッセイを実施
するためのキット。 - 【請求項１５】アッセイすべき酵素のための適当な基
質、又はアッセイすべき基質を加水分解できる酵素を更
に含む、請求の範囲第14項記載のキット。 - 【請求項１６】（１）血清サンプルから全ての血清アル
ブミン（SA）を実質的に除去する試薬、及び （２）脂肪酸結合タンパク質（FABP） からなる、血清サンプル中におけるリパーゼのアッセイ
を実施するための請求の範囲第14項又は第15項記載のキ
ット。 - 【請求項１７】リパーゼ用脂肪酸エステル基質を更に含
む、請求の範囲第16項記載のキット。 - 【請求項１８】脂肪酸と競合してFABPと結合する標識プ
ローブを更に含む、請求の範囲第14項から第17項のいず
れかに記載のキット。 - 【請求項１９】プローブが請求の範囲第４、５、６又は
７項で定義したものである、請求の範囲第18項記載のキ
ット。 - 【請求項２０】アルブミン−除去試薬が、アルブミンか
らの脂肪酸の有意な放出をもたらさないが、臨床サンプ
ルからのアルブミンの実質的な除去をもたらすものであ
る、請求の範囲第14項から第19項のいずれかに記載のキ
ット。 - 【請求項２１】アルブミン−除去試薬が固体である、請
求の範囲第20項記載のキット。 - 【請求項２２】アルブミン−結合化合物が10−（１′−
ナフトイルアミノ）デシルアガロースである、請求の範
囲第21項記載のキット。 - 【請求項２３】FABPが肝臓性である、請求の範囲第14項
から第21項のいずれかに記載のキット。
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