JPH05504674A - 酵素活性のアッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 酵素活性のアッセイ ［技術分野］ 本発明は、長鎖脂肪酸の放出を直接又は間接に触媒する酵素、若しくは逆にこの ような酵素の基質を臨床サンプルに適用しうるアッセイ（ａｓｓａｙ）に関する 。これに限定されるものではないが、本発明は特に、リパーゼ及びホスホリパー ゼのアッセイ、又はこのような酵素のためのエステル基質、例えばリパーゼのた めのトリグリセリド基質及びホスホリパーゼのためのリン脂質基質のアッセイを 目的とする。

［従来技術］ リパーゼ、ホスホリパーゼ及びトリグリセリドやジグリセリドのようなそれらの 基質は、細胞膜機能及びエネルギー輸送のあらゆる面に偏在する基本的なもので ある。従ってこれらの成分のアッセイは臨床診断の多くの領域で興味のあるもの である。例えば、臨床標本のトリグリセリド含量は、最近の食物脂肪摂取量や、 肝臓がエネルギー源として脂肪を代謝する能力をある程度示唆することができる 。

しかしながら、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、Ｌｔｄ、（Ｐｏｏｌｅ。

Ｄｏｒｓｅｔ、ＵＫ）からキットとして市販されているような、現在入手できる トリグリセリドアッセイ法は、酵素の加水分解によって放出されるグリセロール の測定によるものである。かくして、Ｓｉｇｍａ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ　ｎｏ。

４０５では、トリグリセリドをインプロパツール中に抽出し、水酸化カリウムで けん化する。次いで放出されたグリセロールを過ヨウ素酸酸化によってホルムア ルデヒドに変換する。アセチルアセトンと反応させると、ホルムアルデヒドは黄 色のジアセチルジヒドロルチジンを形成し、これを比色分析で測定する。

Ｓｉｇｍａ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ　ｎｏ、３３６，３３７．３３９及び３３４で は、リパーゼを酵素的に用いてトリグリセリドからグリセロールを放出させ、グ リセロールを更にＡＴＰと反応させてグリセロール−１−ホスフェートを形成す る。上記４つの方法は、グリセロール−１−ホスフェートを更に反応させて分光 光度的に測定する吸光度に違いがある点においてのみ異なる。このようなアッセ イを臨床サンプルに適用すると、グリセロール自体は細胞代謝の産物であるので 、血液標本中のグリセロール含量のアッセイが被験体中を循環するトリグリセリ ドレベルの正確な値をしめさない、という欠点を有する［Ｃｏ１ｅ、　Ｃ１１ｎ 、Ｃｈｅ＋ａ、　３６／７．１２６７−１２６８　（１９６０）参照］。低濃度 で、又は少量の臨床血液標本中で正確な結果を与える、トリグリセリドをアッセ イする他の方法の開発が明らかに必要である。

また、迅速かつ正確な、低濃度でのリパーゼ活性のアッセイが必要とされている 。臨床診断では、特に急性腹部緊急事態に関わる、膵臓炎の信頼できる検出法が 必要である。膵臓炎の診断を確認するには、血液中の膵臓酵素、特にアミラーゼ とリパーゼの上昇レベルを検出することに依っているが、通常はアミラーゼレベ ルを測定することによってなされている。しかし、アミラーゼは理想的なマーカ ーではない。何故なら、アミラーゼは小さく、腎臓で部分的に濾過されるので、 膵臓中のレベルは腎臓の逆機能によって影響されるからである。アミラーゼの血 中上昇レベルは、大量の唾液アミラーゼを生産する耳下腺の障害によっても起き る。リパーゼはより良い代替物となる可能性があり、この種のアッセイについて の文献も含んでいる麗、Ｖｅｎｔｒｕｃｃｉ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｄｉｇｅｓｔｉ ｖｅ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ　ａｎｄ　５ｃｉｅｎｃｅ　３４゜３９−４５　（Ｊａ ｎｕａｒｙ　１９８９）を参照されたい。しかし、この酵素のために今までに開 発された臨床アッセイは、遅くて鋭敏ではない。血清中のリパーゼ活性測定用の Ｓｉｇｍａ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ　ｎｏ、８００はこの典型である。酵素基質と してオリーブオイルを用い、形成される脂肪酸の量を標準化希釈水酸化ナトリウ ム溶液で滴定して測定する。チモールフタレインの終点に要するアルカリの量が 、リパーゼ活性に比例する。

この方法は緊急臨床処置として用いるには明らかに適当ではない。従って血清リ パーゼのための迅速かつ鋭敏なアッセイがめられている。

［発明の開示コ このような酵素を基質に作用させて脂肪酸を放出させ、次いで放出された脂肪酸 と、脂肪酸と高い親和性で結合するタンパク質（１０−’Ｍ又はそれ以下の解離 定数を有する）との結合を検出又は測定することによって、血清などの臨床サン プル中の酵素及び基質を迅速かつ鋭敏にアッセイできることが今回発見された。

このようなタンパク質は脂肪酸結合タンパク質（ｆａｔｔｙ　ａｃｉｄ　ｂｉｎ ｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ：ＦＡＢＰ）として知られているものが好ましく、例 えば動物の肝臓から抽出される天然産物である。これ以後本発明はＦＡＢＰにつ いて記載するが、この種の他の結合性タンパク質もＦＡＢＰに代えて用い得るこ とが理解されるであろう。更に、本発明は臨床標本として血清について記載する が、全血及び血漿のような他の臨床標本、またそれに由来する部分精製画分にも 本発明は適用できることが理解されるであろう。脂肪酸−ＦＡＢＰ結合の相互作 用のアッセイは、標識プローブ（ｌａｂｅｌｌｅｄ　ｐｒｏｂｅ）、実際にはＦ ＡＢＰ上での結合部位に対してリパーゼによって放出される脂肪酸と競合する標 識脂肪酸を用いて実施するのが最も便宜的である。便宜的には、遊離の標識化、 即ちＦＡＢＰと結合していない標識化物の量を次いで測定する。しかしながら、 臨床標本の正常な成分である血清アルブミン（ＳＡ）もまた高い親和性で脂肪酸 と結合する部位を有している。これらの結合部位のいくつかが開放されている（ ｆｒｅｅ）とき、即ち脂肪酸の可能結合容量の全てが飽和されているのではない ときには、血清リパーゼによって放出される脂肪酸はＦＡＢＰよりもむしろＳＡ と結合しがちであり、従って脂肪酸とＦＡＢＰ用プローブとの競合は生じない。

脂肪酸はまず最初に不飽和ＳＡ部位を飽和しなければならないので、アッセイは 鋭敏でなくなったり、また間違ったネガティブな結果を与えることになる。本発 明では、酵素又はその基質のアッセイに用いる血清サンプルからＳＡを除去する ことによってこの問題を克服する。ＳＡと結合する脂肪酸の有意な量をサンプル 中に放出することなく、これを実施できることが今回発見された。

ＳＡを除去するための好ましい試薬は１Ｏ−（１−ナフトイルアミノ）デシルア ガロース（ＮＡＤＡ）である。この試薬はアッセイに何ら影響を及ぼさずに、血 清アルブミンを吸収することが今回発見された。多環性試薬であるＮＡＤＡは、 恐らくそのビリルビン−結合部位でＳＡと結合し、高親和性脂肪酸−結合部位と 有意に結合してこの部位から脂肪酸を放出させることをしない。全体の結果とし て、ＮＡＤＡは、脱アルブミン化血清サンプル中に遊離脂肪酸を有意に放出する ことなく、ＳＡと結合する。血清中への脂肪酸の放出は、間違ったポジティブ値 、又は過剰な値をアッセイに与えることになるので、好ましくない。

従って、上記の原理を実施化するために、アルブミン−含有臨床サンプル中にお ける、長鎖脂肪酸の放出を直接又は間接に触媒する酵素、又はこのような酵素の ためのエステル基質をアッセイする以下の構成の方法が提供される：（１）臨床 サンプルから全てのアルブミンを実質的に除去し：（２）アルブミンを含まない 臨床サンプルを、アッセイすべき酵素のためのエステル基質と、又はアッセイす べき基質上で作用する酵素と共に、それから脂肪酸を放出させるのに効果的な条 件下にインキュベーションしく１ｎｃｕｂａｔ　ｉｎｇ）； （３）かくして放出された脂肪酸を脂肪酸結合タンパクｉｆ　（ＦＡＢＰ）と結 合させ；そして （４）ＦＡＢＰの脂肪酸との結合をアッセイする。

本発明の特に好ましい態様によると、血清サンプル中のリパーゼをアッセイする 、以下の構成の方法が提供される： （１）好ましくは血清アルブミン（ＳＡ）と結合した脂肪酸を血清中に全く放出 することなく、血清サンプルから全てのＳＡを実質的に除去し：（２）アルブミ ンを含まない血清サンプルを、トリグリセリド脂肪酸エステルであるリパーゼ用 基質と共に、リパーゼの作用によってそれから脂肪酸を放出させるのに効果的な 条件下にインキュベーションし；（３）かくして放出された脂肪酸を脂肪酸結合 タンパク質（ＦＡＢＰ）と結合させ：そして （４）脂肪酸のＦＡＢＰとの結合をアッセイする。

本発明は、本発明のアッセイを実施するための以下の構成のキットをも含む＝（ １）臨床サンプルから血清アルブミン（ＳＡ）などの全てのアルブミンを実質的 に除去する試薬、及び （２）脂肪酸結合タンパク質（ＦＡＢＰ）。

好ましくは、キットはアッセイされるべき酵素のための適当な基質、又はアッセ イされるべき基質を加水分解することができる酵素をも含む。リパーゼアッセイ の場合には、必要な脂肪酸エステル基質は単にオリーブオイルでよいので、キッ トの一部として売らなくてもよい。脂肪酸と競合してＦＡＢＰと結合する標識プ ローブはキットに含まれていることが好ましい。

ＳＡの不溶化にＮＡＤＡを使用することは、アッセイに使用するか否かは別とし て、それ自体新規であると考えられ、本発明の一部を構成する。

［発明を実施するための最良の形態］ 本発明のアッセイは原則的にあらゆる哺乳動物の血清に適用できるが、もちろん 主としてヒトに関心がある。本アッセイの目的の一つは、血液中、従って血清中 の高濃度の酵素リパーゼによって明らかにされる、膵臓機能の異常を検出するこ とである。

また他の目的は、血清中のホスホリパーゼの存在を検出することであり、このホ スホリパーゼは、リン脂質を長鎖脂肪酸に直接加水分解することのできるホスホ リパーゼＡ、又はリン脂質をジアシルグリセロール（このジアシルグリセロール は過剰のリパーゼの作用によってそれ自体容易に加水分解されて長鎖脂肪酸を放 出する）に加水分解するホスホリパーゼＣでありうる。後者の場合、可能性ある 他のリパーゼ基質、即ちトリグリセリドを除去するために血清の脱脂肪化が必要 である。更に他の目的は、血液中のトリグリセリドの濃度を検出及び／又はモニ ターすることである。本アッセイはまた、適当なコレステロール基質を用いる、 血清中のコレステロールエステルのアッセイにも適用できる。

本アッセイにおいては、血清アルブミン（ＳＡ）がまずサンプルから除去される 。既に説明したように、これは脂肪酸結合部位以外の結合部位でＳＡと結合する 試薬を用いて、試薬−ＳＡ複合体を固定化し、そしてこの固定化複合体を血清か ら分離することによって実施することが好ましい。

ＳＡの除去のための試薬は通常、脂肪酸結合部位に試薬が近づ（のを立体的に防 ぐための嵩高い基と、長鎖疎水基とからなり、アガロースとカップリングしてい るものがよい。もちろん、不安定な化合物は避けるべきである。

好ましい試薬：　１０−　（１°　−ナフトイルアミノ）デシルアガロース（Ｎ ＡＤＡ）は以下の化学式を有する・ この化合物自体は公知であり、Ｄ、Ｃ，ｆｉｏｔｏｎ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｊ、 　２６１．２７３−２７６　（１９８９）を参照されたいが、該文献にはその脂 肪酸結合タンパク質（ＦＡＢＰ）の精製への使用が記載されている。このゼラチ ン性不溶性試薬はリパーゼ濃度に何ら影響を及ぼさないように見える。これは約 ５ｍｇ／ｍｌゲルの高結合能力を有する。

結合は実質的に即座に起こり、血清を単にゲルと混合し、結合した物質を遠心で 除去する。又はＮＡＤＡのミクロカラムを用いる。

対応するダンシル化合物： も用い得るが、長期間の光には不安定である。

ＳＡを除去する他の方法も用い得る。例えばＳＡの固定化抗体を用いることがで きる。５−ブチル−１−シクロへキシルバルビッール酸のようなＳＡのピルビン −又はヘム−結合部位に結合し、かつ支持物質にカップリングすることが知られ ている、他の試薬を用いることもできる。

脂肪酸結合部位で結合する試薬を用いてＳＡを除去することも可能であるが、あ まり好ましくない。アッセイの結果を評価する際に、既にＳＡと結合した脂肪酸 の可能な置換についての側酌がなされるべきである。オレオイル−又はパルミチ ルーωアミノアルキルアミノアガロースが適当である。Ｔ、Ｐｅｔｅｒｓ　ｅｔ 　ａｌ、、　Ｂｉｏ。

Ｃｈｅｔ　２４ｇ、　２４４７−２４５１　（１９７３）を参照されたい。

アッセイの第２段階では、第１段階で全ＳＡが実質的に除去された血清サンプル を、アッセイすべき酵素のための基質、又はアッセイすべき基質上で作用する酵 素と共にインキュベーションする。例えば、リパーゼのアッセイにおいては、リ パーゼ酵素はグリセリルエステルの加水分解に特異的であるので、基質はほとん ど常に脂肪酸エステルでなければならない。ここで使用する”脂肪酸“の語は、 主として長い脂肪族鎖とカルボン酸基とを有する酸を意味する。長鎖の脂肪族基 は、飽和、不飽和のいずれでもよい。鎖の長さはＦＡＢＰとの結合の必要性によ って決定され、広（は１０から２０であり、好ましくは１６から１８炭素原子で ある。例えば、オレイン、リルン　パルミチン、ミリスチン又はステアリン酸で ある。エステル中のアルコール残基はどのようなものでもよいが、エステルはグ リセリドであるのが都合がよい。好ましいエステルはオリーブオイルとして市販 されているオレイン酸トリグリセリドである。血清サンプルを、リパーゼによる 酵素的加水分解に効果的な温度で、リパーゼ基質とインキュベーションする。最 も便宜的には室温（２０−２５℃）が用いられるが、１５から４０℃の温度で通 常作用する。

アッセイの第２段階で選択する基質は、アッセイしたいと考える酵素に依存する ことが理解されるであろう。従って、膵臓ホスホリパーゼＡ２のアッセイには、 ジオレオイルホスファチジルグリセロール、又はその他のホスホリパーゼＡ２源 にはジオレオイルホスファチジルコリンのような、その基質が以下の方法で分析 しうる長鎖脂肪酸を生産しつる酵素基質を用いるのが適当である。若しくは、ホ スホリパーゼＣのアッセイには、ジオレオイルホスファチジルコリンのようなこ の酵素用の基質を用いるのが適当であるが、この酵素は間接的にのみアッセイし うる長鎖脂肪酸産物を放出するので、ジアシルグリセリド産物を加水分解して長 鎖脂肪酸を放出させることのできる過剰の酵素（リパーゼなど）をも用いること が必要となる。

もしもアッセイが酵素自身でなく、基質の存在決定を目的とするものである場合 には、アッセイの第２段階で加えるのは適切な酵素である。かくしてアッセイサ ンプル中のトリグリセリドの量をアッセイするのに過剰のリパーゼが用いられる 。コレステロールエステルのアッセイにはコレステロールエステラーゼが用いら れる。

次いで脂肪酸結合タンパク質（ＦＡＢＰ）をインキュベージコン混合物に加える 。各種のタイプのＦＡＢＰを用い得る。これらは好ましくは細胞質ゾル性であり 、通常これらが単離された組織、例えば、小腸、心筋、肝臓及び脂肪性組織など によって命名される。肝ＦＡＢＰが好ましく、ラット、ブタ又はウシなどの動物 の肝臓から便宜的に抽出される。好ましい抽出方法は、Ｄ、Ｃ，Ｗｉｌｔｏｎ、 　ＢｉｏｃｈｅｍＪ、　２６１．２７３−２７６　（１９８９）に記載されてい る。ＦＡＢＰは天然産物とは限らない。

酸に結合する合成類似体であってもよいし、又は組み換えＤＮＡ法で得られた天 然産物の類似体、例えば大腸菌中の遺伝子発現で生産されるラット肝臓ＦＡＢＰ ［Ｊ、　Ｂ、　Ｌｏｖｅ　ｅｔ　ａｌｌ、　Ｊ、Ｂｆｏｌ、Ｃｈｅｔ　２５９． １２６９６−１２７０４　（１９８４）参照］であってもよい。リパーゼによっ て放出される酸に効果的に結合させるインキュベーション条件ならば、いかなる ものでも使用できる。広く言えば、加水分解段階と同じ温度で作用する。

次いで酸−ＦＡＲＰ結合が起こったことを検出することが必要である。これを行 う好ましい方法は、ＦＡＢＰ上の限られた数の結合部位に対して、標識脂肪酸種 を、リパーゼによって放出された脂肪酸と競合させる競合アッセイである。標識 種をここでは”プローブ′と呼ぶ。これは通常標識部分と、酸基と結合しており 、典型的には酸基を除いて９から１９炭素原子を有する長鎖脂肪族部分とから構 成される。標識部分は例えば蛍光団、発色団又は発光団でありうる。放射性標識 はあまり好ましくない。

特に好ましい態様においては、標識は多環性蛍光団、とりわけ極性鋭敏な蛍光団 基を有するナフタレン又はアントラセンである。極性鋭敏な蛍光基とは、それが 極性から非極性環境へと移動するときに、蛍光発光（量子収量及び最大波長）を 変化させるものをいう。プローブがＦＡＢＰ分子の非極性ミクロ−環境から極性 ミクロ−環境（通常は水性であるアッセイ媒質）へと移動する際に、一定波長に おける蛍光シグナルの大きな変化が観察される。プローブは負に荷電しており、 従って通常酸性塩の形で存在する。特に好ましいプローブは以下の化学式：％式 ％ ［式中、 Ｐｃは、ナフタレン又はアントラセン残基を表し；Ｚは、−ＣＯ−又は一５Ｏ２ −を表し、そしてＸ−は、酸基のアニオン、好ましくはＣＯＯ−を表す。

ｎは４から２４、好ましくは８から１９、特に８から１２の数である］を有する ものである。

以下の式： を有する１１−（ダンシルアミノ）ウンデカノン酸（ＤＡＵＤＡ）の塩が特に好 ましい。このプローブは脂肪酸と競合してＦＡＥＰと結合することが知られてい る［Ｔ、Ｃ，１，Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ　ａｎｄ　Ｄ、Ｃ，Ｗｉｏｔｏｎ、　Ｂｉ ｏｃｈｅｔ　Ｊ、　２４７．４８５−４８８　（１９８７）Q 照］。使用できる他の蛍光団は９−アンスロイルオキシ脂肪酸［Ｊ、　５ｔｏｒ ｃｈ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｔ　２６４．８７０ｇ−８７ １３（１９８９）参照］及びシスーパリナリン酸（ポリエン脂肪酸）　［１１， １，に、Ｋｅｕｐｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｈｅｗ、Ｐｈｙｓ、Ｌｆｐｉｄｓ　 ３８．　１５９−１７８　（１９８５）参照］である。

より好ましいものではないが、その他のアッセイは、１４Ｃ又は３Ｈなどで放射 性標識した標識酸、或いはこれに発色団を結合させたものをアッセイ媒質に加え 、ＦＡＢＰの限られた結合部位に対する標識酸と、リパーゼによって放出された 酸との競合後に、溶液中に残っている標識酸の量を測定することからなる。標識 酸の測定は、これをＬ　ｉ　ｐ　１ｄｅｘ　１０００　［Ｊ、Ｆ、Ｃ，Ｇｌａｔ ｚ　ａｎｄ　Ｊ」、　Ｖｅｅｒｋａｓ＋ｐ。

Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ　１３２．８９−９５　（１９８３）参照コ上で不 溶化し、アッセイ媒質からＬｉｐｉｄｅｘ　１０００を分離して、その上にある 標識物質の量を測定することによって実施できる。

競合アッセイ種は通常、脂肪酸の前、同時、又は後でアッセイ混合物に加えるこ とができる。ある種がＦＡＢＰからの他のものに置換して、可逆反応の平衡位置 に達したとき、アッセイは”競合的“であると見なされる。競合種がＦＡＢＰと 結合するとき、その結合は各種の方法で測定することができる。極性鋭敏な蛍光 団の場合、蛍光の変化を容易にモニターすることができる。色及び発色団の強度 変化、又は発光団の強度変化もまた測定可能である。若しくは、ＦＡＢＰ−プロ ーブ種を沈殿させて、沈殿を分離し、モしてＦＡＢＰと結合した標識の量、又は 溶液中に残っている遊離の標識の量を測定することも可能である。これは例えば 、ＦＡＢＰに対する固定化抗体を用いるか、或いはアガローズのような不溶性物 質にＦＡＢＰを直接カップリングさせることにより実施できる。

また代替的な方法では、例えば脂肪酸エステルを蛍光リポータ−基と結合させる ことによって脂肪酸エステルをその酸部分で標識し、放出される蛍光脂肪酸のＦ ＡＢＰへの結合を、結合時に生じる適当な特定変化によって測定する。

本発明を以下の実施例で例示する。

実施例１ 血清からの血清アルブミンの除去 血清サンプル０．００２ｍ１　（Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ。

Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｈｏ５ｐｉｔａｌから入手）をプラ スティックミクロ遠心管中のナフトイル−アガロースの５０容量％水性懸濁液１ ｍｌに加えた。得られた混合物を１０秒間撹拌し、次いでＥｐｐｅｎｄｏｒｆｍ ｉｃｒｏｆｕｇｅで１５秒間遠心した。得られた上澄みの典型的には０．０５ｍ １を蛍光アッセイで測定した。

リパーゼ活性の蛍光アッセイ 基質及び蛍光プローブを含むバッファー溶液を以下のように調製した。５ｔｅｒ ｉｌｉｎ管中のＯ，ＬＭ　ＮａＣ１及び２．５ｍＭ　ＣａＣ１ｚを含む０．　１ Ｍトリスバッフｙ−ｐＨ８，０２０ｍ１にエタノール中の１０ｍｇ／ｍｌオリー ブオイル３．　２ｍｌ及びメタノール中の０．１ｍＭ１１−（ダンシルアミノ） ウンデカノン酸（ＤＡＵＤＡ）０．２ｍｌを加えた。混合物をしばら（振った。

このアッセイ溶液２ｍｌを４ｍｌのプラスティックの使い捨て蛍光分析器用セル に加えて、これを２５℃でＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　ＬＳ３Ｂ蛍光分析器に入 れた。励起波長は３５０ｎｍで、蛍光は５００ｎｍで測定した。蛍光なしの読み 取りを得るために器械の目盛りをゼロに戻した。脱アルブミン化血清サンプル０ ゜０５ｍ１をアッセイに加え、次いでＦＡＢＰｏ、０２５ｍｇ　（典型的には２ ．５ｍｇ／ｍｌ溶液をＯ，０１ｍ１）を加えた。蛍光の初期落ち込みが２分まで の間に記録された。

図１は、蛍光置換過程を示すものであり、（ａ）から（ｄ）は、膵臓炎患者から の脱アルブミン化血清の添加（それぞれ血清０．　１．　０．　２．　０．　４ 及び０゜８Ｉ＋１と等価）を示し、（ｅ）は対照患者（正常脱アルブミン化血清 の１．０ｊｔと等価）を示し、そして（ｆ）は血清サンプルを加えない対照を示 す。

このアッセイは、血清の不存在下に既知の量のオレイン酸（典型的にはメタノー ル中の１−１０ｎモルの溶液）を加えて、得られる蛍光の量子の落ち込み（ｑｕ ａｎｔｕｍ　ｆａ　ｌ　１）を記録することによって検定できる。

このアッセイは脂肪酸放出率を約１００ビカモル／ｍｌ／分まで量的に測定する ことが見いだされ、これは約３ビカカタールの酵素活性に対応した（カタールは 酵素の変換率を測定する単位であり、モル７秒である）。従って、対照血清サン プルのためには、アッセイは血清０．００１−０．０１ｍ１と等価で実施される 。

長鎖脂肪酸を放出するリパーゼ以外の酵素アッセイに本発明を適用できることを 示すために、実施例１に記載したのと本質的には同じ蛍光アッセイを用いて、市 販のブタ膵臓ホスホリパーゼＡ、（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｃｏ、Ｌｔ ｄ、より入手）をアッセイした。アッセイ（２ｍｌ）は、ジオレオイルホスファ チジルコリン０．０５ｍｇ／ｍＬ　ＩＩＩＭ　ＤＡＵＤＡ及びＦＡＢＰ　０１１ ２５ｍｇ／ｍｌを含んでいた。図２に示すような蛍光置換過程が得られ、ここで （ａ）はホスホリパーゼＡ１を加えないものであり：　（ｂ）は酵素ＩＱｎｇ； 　（ｃ）は酵素１１００ｎ；　（ｄ）は酵素５００ｎｇ添加を示す。

実施例３ 血清中のトリグリセリドのアッセイ 実施例１に記載したように血清サンプルＯ，０１ｍ１からアルブミンを除去した 。過剰のリパーゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ａｒｒｈｉｚｕｓ由来）と共にインキュ ベーションした脱アルブミン化血清０．５μｍ等価を用いて、（ＣａＣＩｚを含 まないバッファーを用いること以外は）実施例１に記載したアッセイを実施して 、ＤＡＵＤＡ置換による蛍光の急速な落ち込みが３分間にわたって観察された。

正常血清サンプルの蛍光置換過程は図３に示すように得られ、適当な脂肪酸測定 酵素を用いる血清中の特定の脂肪アシル基質測定の原理を表す。過程（ａ）はＨ ２０対照、即ち脱アルブミン化血清の不存在下を表し、（ｂ）は脱アルブミン化 血清０．５μｍ等価を用いるアッセイを表す。蛍光の落ち込みはリパーゼ添加で 放出された脂肪酸１．５ｎモルと等価であった。リパーゼによるトリグリセリド からの３つの脂肪酸全ての放出を考えて、この血清１ｍＭ中のトリグリセリド値 が得られた。

本発明をジアシルグリセリドリパーゼ基質に適用できることを示すために、市販 の１−ステアロイル−２−アラキトニル−５ｎ−グリセロール（Ｓ　ｉ　ｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、Ｌｔｄ、から入手）を本質的には実施例１に記載した 蛍光アッセイによってアッセイした。アッセイ（２ｍｌ）は実施例３に記載した ようにリパーゼ、ＤＡＵＤＡ及びＦＡＢＰを含んでいた。エタノール中の０．１ ｍｇ／ｍｌ　１−ステアロイル−２−アラキトニル−５ｎ−グリセロール１から １０μｌをアッセイ中に滴定して蛍光の初期落ち込みを測定して、アッセイに添 加したジグリセリドの量に対してプロットしたものを図４に示す。

長鎖脂肪酸を間接的に放出することのできる酵素のアッセイに本発明を適用でき ることを示すために、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ由来の市販のホスホリパ ーゼＣ（引用特異的活性２５００ｇモル／分／ｍｇ、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃ ａｌ　Ｃｏ、Ｌｔｄ、より入手）を本質的には実施例１に記載した蛍光アッセイ によってアッセイした。アッセイ（２ｍｌ）はジオレオイルホスファチジルコリ ン０．０５ｍｇ／ｍｌ　（Ｌｉｐｉｄ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、ＵＫより入手）ｉｌ ｌＭ−ＤＡＵＤＡ、ＦＡＢＰ　領　０１ｍｇ及び精製ブタ膵臓リパーゼ１０ｇｇ （引用特異的活性９５６００ＩＩモル／時／ｍｇ％Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａ ｌ　Ｃｏ、Ｌｔｄ、から入手）を含んでいた。蛍光置換過程が図５に示すように 得られ、ここで（ａ）はホスホリパーゼＣを加えないものであり：　（ｂ）は酵 素２ｎｇ添加；　（Ｃ）は酵素Ｌｏｎｇ添加：　（ｄ）は酵素５０ｎｇ添加及び （ｅ）は酵素２００ｎｇ添加を示す。

補正書の翻訳文掲出書 （特許法第１８４条の８ン 平成　４年　３月１９日 特許庁長官　深　沢　亘　殿　Ｄ田 １、特許出願の表示 ＰＣＴ／ＧＢ９０１０１３５４ ２、発明の名称 酵素活性のアッセイ ３、特許出願人 住　所　イギリス国ロンドン、ニスイード６ビーユー。

ニューイントン・コーズウェイ　１０１名　称　ブリティッシュ・テクノロジー ・グループ・ピーエルシー４、代理人 住　所　東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手町ビル　２０６区 ５、補正書の提出日 ［発明の開示］ このような酵素を基質に作用させて脂肪酸を放出させ、次いで放出された脂肪酸 と、脂肪酸と高い親和性で結合するタンパク質（１０”Ｍ又はそれ以下の解離定 数を有する）との結合を検出又は測定することによって、血清などの臨床サンプ ル中の酵素及び基質を迅速かつ鋭敏にアッセイできることが今回発見された。

このようなタンパク質は脂肪酸結合タンパク質（ｆａｔｔｙ　ａｃｉｄ　ｂｉｎ ｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ：ＦＡＢＰ）として知られティるもツカ好マシ＜、例 えば動物の肝臓から抽出される天然産物である。これ以後本発明はＦＡＢＰにつ いて記載するが、このような高い親和性で脂肪酸と結合する他の結合性タンパク 質もＦＡＢＰに代えて用いることができ、従ってこれらも”脂肪酸結合タンパク 質”の語に含まれることが理解されるであろう。更に、本発明は臨床標本として 血清について記載するが、全血及び血漿のような他の臨床標本、専なそれに由来 する部分精製画分にも本発明は適用できることが理解されるであろう。

好ましくは、キットはアッセイされるべき酵素のための適当な基質、又はアッセ イされるべき基質を加水分解することができる酵素をも含む。リパーゼアッセイ の場合には、必要な脂肪酸エステル基質は単にオリーブオイルでよいので、キッ トの一部として売らな（でもよい。脂肪酸と競合してＦＡＢＰと結合する標識プ ローブはキットに含まれていることが好ましい。

ＳＡの不溶化にＮＡＤＡを使用することは、アッセイに使用するか否かは別とし て、それ自体新規であると考えられる。

［発明を実施するための最良の形態］ 本発明のアッセイは原則的にあらゆる哺乳動物の血清に適用できるが、もちろん 主としてヒトに関心がある。本アッセイの目的の一つは、血液中、従って血清中 の高濃度の酵素リパーゼによって明らかにされる、膵臓機能の異常を検出するこ とである。

１、（１）臨床サンプルから全てのアルブミンを実質的に除去し：（２）アルブ ミンを含まない臨床サンプルを、アッセイすべき酵素のためのエステル基質と、 又はアッセイすべき基質上で作用する酵素と共に、それから脂肪酸を放出させる のに効果的な条件下にインキユベーションし；（３）かくして放出された脂肪酸 を脂肪酸結合タンパク質（ＦＡＢＰ）と結合させ：そして （４）ＦＡＢＰの脂肪酸との結合をアッセイする、ことからなる、アルブミン− 含有置床サンプル中における、長鎖脂肪酸の放出を直接又は間接に触媒する酵素 、又はこのような酵素のためのエステル基質のアッセイ方法。

２、脂肪酸と競合してＦＡＢＰと結合する標識プローブが、ＦＡＢＰと相互作用 することが可能であり、次いで遊離の、又は結合した標識プローブをアッセイす る競合法によってＦＡＢＰ−脂肪酸結合を特徴とする請求の範囲第１項記載の方 法。

３、プローブが、酸基のアニオンを末端に有する長鎖脂肪族部分と結合した標識 部分を含む、請求の範囲第２項記載の方法。

４、標識が、極性鋭敏な蛍光基がＦＡＢＰと結合するようになるとその蛍光スペ クトルの変化をプローブに与える極性鋭敏な蛍光基である、請求の範囲第３項記 載の方法。

５、長鎖脂肪族部分が酸基を除いて、８から１９個の炭素原子を有する、請求の 範囲第３項記載の方法。

６、脂肪族部分がウンデカノン酸残基である、請求の範囲＄４項記載の方法。

７、プローブが１１−（ダンシルアミノ）ウンデカノン酸のアニオンである、請 求の範囲第２項から第６項のいずれかに記載の方法。

国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、（１）臨床サンプルから全てのアルブミンを実質的に除去し；（２）アルブ ミンを含まない臨床サンプルを、アッセイすべき酵素のためのエステル基質と、 又はアッセイすべき基質上で作用する酵素と共に、それから脂肪酸を放出させる のに効果的な条件下にインキュベーションし；（３）かくして放出された脂肪酸 を脂肪酸結合タンパク質（ＦＡＢＰ）と結合させ；そして （４）ＦＡＢＰの脂肪酸との結合をアッセイする、ことからなる、アルブミン− 含有臨床サンプル中における、長鎖脂肪酸の放出を直接又は間接に触媒する酸素 、又はこのような酸素のためのエステル基質のアッセイ方法。 ２、脂肪酸と競合してＦＡＢＰと結合する標識プローブが、ＦＡＢＰと相互作用 することが可能であり、次いで遊離の、又は結合した標識プローブをアッセイす る競合法によってＦＡＢＰ−脂肪酸結合をアッセイする、請求の範囲第１項記載 の方法。 ３、プローブが、酸基のアニオンを末端に有する長鎖脂肪族部分と結合した標識 部分を含む、請求の範囲第２項記載の方法。 ４、標識が、極性鋭敏な蛍光基がＦＡＢＰと結合するようになるとその蛍光スペ クトルの変化をプローブに与える極性鋭敏な蛍光基である、請求の範囲第３項記 載の方法。 ５、長鎖脂肪族部分が酸基を除いて、４から２４個の炭素原子を有する、請求の 範囲第３項記載の方法。 ６、脂肪族部分がウンデカノン酸残基である、請求の範囲第４項記載の方法。 ７、プローブが１１−（ダンシルアミノ）ウンデカノン酸のアニオンである、請 求の範囲第２項から第６項のいずれかに記載の方法。 ８、アルブミンを試薬と結合させることによって除去し、これが臨床サンプルヘ のアルブミンからの脂肪酸の有意な放出をもたらさないが、サンプルからのアル ブミンの実質的な除去をもたらす、前記請求の範囲のいずれか１項に記載の方法 。 ９、アルブミン−結合試薬を固相にカップリングさせて不溶性物質を除去する、 請求の範囲第８項記載の方法。 １０、アルブミン−結合化合物が１０−（１′−ナフトイルアミノ）デシルアガ ロースである、請求の範囲第９項記載の方法。 １１、ＦＡＢＰが肝臓性のものである、請求の範囲第１０項記載の方法。 １２、臨床サンプルが血清サンプルである、前記請求の範囲のいずれか１項に記 載の方法。 １３、アッセイがリパーゼ用のものであり、第２段階が、アルブミンを含まない サンプルを脂肪酸エステルであるリパーゼ用基質と共に、リパーゼの作用によっ てそれから脂肪酸を放出させるのに郊果的条件下にインュベーションすることか らなる、前記請求の範囲のいずれか１項に記載の方法。 １４、（１）臨床サンプルから全てのアルブミンを実質的に除去する試薬、及び （２）脂肪酸結合タンパク質（ＦＡＢＰ）からなる、アルブミン−含有臨床サン プル中における、長鎖脂肪酸の放出を直接又は間接に触媒する酸素、又はこのよ うな酸素のためのエステル基質のアッセイを実施するためのキット。 １５、アッセイすべき酸素のための適当な基質、又はアッセイすべき基質を加水 分解できる酸素を更に含む、請求の範囲第１４項記載のキット。 １６、（１）血清サンプルから全ての血清アルブミン（ＳＡ）を実質的に除去す る試薬、及び （２）脂肪酸結合タンパク質（ＦＡＢＰ）からなる、血清サンプル中におけるリ パーゼのアッセイを実施するための請求の範囲第１４項又は第１５項記載のキッ ト。 １７、リパーゼ用脂肪酸エステル基質を更に含む、請求の範囲第１６項記載のキ ット。 １８、脂肪酸と競合してＦＡＢＰと結合する標識プローブを更に含む、請求の範 囲第１４項から第１７項のいずれかに記載のキット。 １９、プローブが請求の範囲第４、５、６又は７項で定義したものである、請求 の範囲第１８項記載のキット。 ２０、アルブミン−除去試薬が、アルブミンからの脂肪酸の有意な放出をもたら さないが、臨床サンプルからのアルブミンの実質的な除去をもたらすものである 、請求の範囲第１４項から第１９項のいずれかに記載のキット。 ２１、アルブミン−除去試薬が固体である、請求の範囲第２０項記載のキット。 ２２、アルブミン−結合化合物が１０−（１′−ナフトイルアミノ）デシルアガ ロースである、請求の範囲第２１項記載のキット。 ２３、ＦＡＢＰが肝臓性である、請求の範囲第１４項から第２１項のいずれかに 記載のキット。