JP6691212B2 - Ｌｐ−ＰＬＡ２活性の測定 - Google Patents

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Description

本発明はＬｐ−ＰＬＡ２活性の測定方法及び測定キット並びにそれらの利用に関する。
Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ａ２（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ａｃｅｔｙｌｈｙｄｒｏｌａｓｅ（ＰＡＦ−ＡＨ）と呼ばれる場合もある。以下Ｌｐ−ＰＬＡ２と記載）は、血小板活性化因子（ＰＡＦ）のｓｎ−２位のアセチル基を加水分解し、ＰＡＦを不活化する酵素である。Ｌｐ−ＰＬＡ２は、血管における破裂性プラークの形成に関係しており、Ｌｐ−ＰＬＡ２活性の測定はアテローム性動脈硬化により引き起こされる心血管イベントのリスク予測マーカーとして使用されてきた（非特許文献１、非特許文献２）。米国の食品医薬品局（ＦＤＡ）は２０１４年１２月に冠動脈性心疾患（ＣＨＤ）のリスク診断の一つの手段として、Ｌｐ−ＰＬＡ２活性測定キット、ＰＬＡＣ Ｔｅｓｔ Ｆｏｒ Ｌｐ−ＰＬＡ２ Ａｃｔｉｖｉｔｙ（旧ｄｉａＤｅｘｕｓ社（現Ｄｉａｚｙｍｅ社））に認可を与えている。前記キット以外にも体外診断用として、Ｄｉａｓｙｓ Ｌｐ−ＰＬＡ２ ＦＳ（Ｄｉａｓｙｓ社）が市販されている。また研究用試薬としてはＰＡＦ Ａｃｅｔｙｌｈｙｄｒｏｌａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社）が市販されており、研究用途でもＬｐ−ＰＬＡ２活性は測定ニーズがある。
Ｌｐ−ＰＬＡ２は様々な疾患や炎症と関連する因子として考えられている。また、近年ではＬｐ−ＰＬＡ２と癌との関連も示唆されてきており、したがって、Ｌｐ−ＰＬＡ２活性を測定することにより、心血管疾患、脳卒中など従来関係性が認められているものに加え、癌等のリスク予測等が可能である（非特許文献１）。
Ｌｐ−ＰＬＡ２活性の測定方法としては放射性同位体標識されたＰＡＦを用いる方法（特許文献１）が知られている。Ｌｐ−ＰＬＡ２活性の測定方法としてはその他に、遊離した際に発色性化合物又は蛍光発色性化合物となる置換基を有するＰＡＦ誘導体を用いる方法（特許文献２）や、ＰＡＦ誘導体から遊離した置換基の量を測定する方法（特許文献３又は４）も知られている。
国際公開２００５／００１４１６号公報 特開２００２−２２３７９４号公報 特開平０７−５９５９７号公報 特開平０４−３４６７９７号公報 国際公開２０１４／０１０６６７号公報
ＴＨＥ ＥＮＺＹＭＥＳ， Ｐｌａｔｅｌｅｔ−Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ Ａｃｅｔｙｌｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ（ＰＡＦ−ＡＨ），（２０１５）Ｖｏｌｕｍｅ ３８，１４５−１７９ ＰＬＡＣ Ｔｅｓｔ ｆｏｒ Ｌｐ−ＰＬＡ２ Ａｃｔｉｖｉｔｙ（ｄｉａＤｅｘｕｓ社、添付文書２０１５−０１−１５版） Ｄｉａｓｙｓ Ｌｐ−ＰＬＡ２ ＦＳ（Ｄｉａｓｙｓ社、添付文書Ｊｕｌｙ ２０１５／８版）
しかし、特許文献１の方法では使用者および使用施設が限定され汎用性が低く、多検体同時測定が困難で利便性に欠け、また安全性あるいは放射性試薬の廃棄等の問題がある。
また特許文献２で開示されたＰＡＦ誘導体の一つである１−ｍｙｒｉｓｔｏｙｌ−２−（４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｓｕｃｃｉｎｙｌ）ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅは中性のｐＨにおいて水溶性が低いために、酸性の水溶液組成物にしたり（非特許文献２、又は非特許文献３）、有機溶媒組成物（非特許文献３）としたりする必要がある。酸性の水溶液組成物を使用してＬｐ−ＰＬＡ２活性を測定する場合、空気中の炭酸ガスによりｐＨが変化する可能性がある。
特許文献４で開示されたＳＨ基検出試薬としてＤＴＮＢ（５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸））を用いる方法は、血清中に含まれるＳＨ基を有する干渉物質の影響を受けやすい。また特許文献３及び４の測定方法ではＳ／Ｒ比（試料／試薬比）が高い、又は多量のサンプル（試料）を用いている。
本発明が解決しようとする課題は、より汎用性が高く、簡便で、安全なＬｐ−ＰＬＡ２活性の測定方法を提供することである。本発明はまた、正確なＬｐ−ＰＬＡ２活性の測定方法を提供することを課題とする。更に本発明は、高感度なＬｐ−ＰＬＡ２活性の測定方法を提供することを課題とする。
本発明者らは既に、エタノールアミン型リゾプラスマローゲンに作用する酵素（特許文献５において、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質及び配列番号４の塩基配列によりコードされるタンパク質であって、Ｔｈｅｒｍｏｃｒｉｓｐｕｍ ｓｐ．ＮＩＴＥ ＢＰ−０１６２８由来のｌｙＰｌｓ ａｓｅとして記載。以下、「リゾＰＡＦ−ＰＬＤ」ともいう。）を見出している。上記課題を解決するために本発明者らは鋭意研究を行った結果、ＰＡＦとリゾＰＡＦが共存する環境下においてリゾＰＡＦ−ＰＬＤがＰＡＦに対してＰＬＤ活性（ホスフォリパーゼＤ様活性）を有さず、リゾＰＡＦに対してはＰＬＤ活性を有することを初めて見出し、この基質特異性がＬｐ−ＰＬＡ２の活性測定に有用であることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明としては以下のものが挙げられる。
［１’］
下記一般式Ｉで表される血小板活性化因子（ＰＡＦ）類：

（式中、
Ｒ１は、直鎖又は分岐の、飽和又は部分不飽和の、高級炭化水素基であり、
Ｒ２は直鎖の低級アルキル基であり、
Ｘは−Ｃ（Ｏ）−、−ＣＨ２−又は−ＣＨ＝ＣＨ−である。）
及び下記一般式ＩＩで表されるリゾＰＡＦ類：
（式中、
Ｒ１及びＸは、一般式Ｉにおいて定義したとおりである）
の存在下、前記ＰＡＦ類を加水分解してコリンを生成する反応を行わずに、前記リゾＰＡＦ類を加水分解してコリンを生成するための酵素の使用であって、前記酵素が以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のタンパク質である、使用：
（ａ）配列番号１又は９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質；
（ｂ）配列番号１又は９に記載のアミノ酸配列において１つ又は複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、ＰＡＦに対するホスフォリパーゼＤ様（ＰＬＤ）活性を有さず、かつ、リゾＰＡＦに対するＰＬＤ活性を有する、タンパク質；
（ｃ）配列番号１又は９に記載のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、ＰＡＦに対するＰＬＤ活性を有さず、かつ、リゾＰＡＦに対するＰＬＤ活性を有する、タンパク質。
［１’’］
下記一般式Ｉで表される血小板活性化因子（ＰＡＦ）類：
（式中、
Ｒ１は、直鎖又は分岐の、飽和又は部分不飽和の、高級炭化水素基であり、
Ｒ２は直鎖の低級アルキル基であり、
Ｘは−Ｃ（Ｏ）−、−ＣＨ２−又は−ＣＨ＝ＣＨ−である。）
を含み得る試料中の、下記一般式ＩＩで表されるリゾＰＡＦ類：
（式中、
Ｒ１及びＸは、一般式Ｉにおいて定義したとおりである）
の測定における、前記ＰＡＦ類を加水分解してコリンを生成する反応を行わずに、前記リゾＰＡＦ類を加水分解してコリンを生成するための酵素の使用であって、前記酵素が以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のタンパク質である、使用：
（ａ）配列番号１又は９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質；
（ｂ）配列番号１又は９に記載のアミノ酸配列において１つ又は複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、ＰＡＦに対するホスフォリパーゼＤ様（ＰＬＤ）活性を有さず、かつ、リゾＰＡＦに対するＰＬＤ活性を有する、タンパク質；
（ｃ）配列番号１又は９に記載のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、ＰＡＦに対するＰＬＤ活性を有さず、かつ、リゾＰＡＦに対するＰＬＤ活性を有する、タンパク質。
［１’’’］
下記一般式Ｉで表される血小板活性化因子（ＰＡＦ）類：
（式中、
Ｒ１は、直鎖又は分岐の、飽和又は部分不飽和の、高級炭化水素基であり、
Ｒ２は直鎖の低級アルキル基であり、
Ｘは−Ｃ（Ｏ）−、−ＣＨ２−又は−ＣＨ＝ＣＨ−である。）
を、下記一般式ＩＩで表されるリゾＰＡＦ類：
（式中、
Ｒ１及びＸは、一般式Ｉにおいて定義したとおりである）
に変換する酵素の活性の測定における、前記ＰＡＦ類を含み得る試料中の前記ＰＡＦ類を加水分解してコリンを生成する反応を行わずに、前記リゾＰＡＦ類を加水分解してコリンを生成するための酵素の使用であって、前記酵素が以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のタンパク質である、使用：
（ａ）配列番号１又は９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質；
（ｂ）配列番号１又は９に記載のアミノ酸配列において１つ又は複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、ＰＡＦに対するホスフォリパーゼＤ様（ＰＬＤ）活性を有さず、かつ、リゾＰＡＦに対するＰＬＤ活性を有する、タンパク質；
（ｃ）配列番号１又は９に記載のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、ＰＡＦに対するＰＬＤ活性を有さず、かつ、リゾＰＡＦに対するＰＬＤ活性を有する、タンパク質。
本発明としては以下のものも挙げられる。なお、以下で言及する［１］は、上記［１’］、［１’’］及び［１’’’］のいずれも含む。
［１−１］
前記酵素が以下の（ｄ）〜（ｆ）のいずれかに記載のタンパク質である、［１］に記載の使用：
（ｄ）配列番号２に記載の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質；
（ｅ）配列番号２に記載の塩基配列において１つ又は複数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質であって、ＰＡＦに対するＰＬＤ活性を有さず、かつ、リゾＰＡＦに対するＰＬＤ活性を有する、タンパク質；
（ｆ）配列番号２に記載の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質であって、ＰＡＦに対するＰＬＤ活性を有さず、かつ、リゾＰＡＦに対するＰＬＤ活性を有する、タンパク質。
［１−２］
Ｒ２がメチル基である、［１］又は［１−１］に記載の使用。
［１−３］
Ｒ１が、独立して、Ｃ１５及びＣ１７の直鎖アルキル基から選択される、［１］〜［１−２］のいずれかに記載の使用。
［１−４］
Ｘが−ＣＨ２−である、［１］〜［１−３］のいずれかに記載の使用。
［１−５］
Ｘが−Ｃ（Ｏ）−である［１］〜［１−３］のいずれかに記載の使用。
［１−６］
［１］の使用が、当該一般式Ｉで表されるＰＡＦ類の混在が疑われる該一般式ＩＩで表されるリゾＰＡＦ類についての測定において、当該（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のタンパク質である酵素を使用する［１］〜［１−５］のいずれかに記載の使用。
［２］
以下の工程（Ａ）〜工程（Ｃ）を含む、リポタンパク質関連ホスフォリパーゼＡ２（Ｌｐ−ＰＬＡ２）を含む試料中のＬｐ−ＰＬＡ２活性の測定方法：
（Ａ）下記一般式Ｉで表される血小板活性化因子（ＰＡＦ）類：
（式中、
Ｒ１は、直鎖又は分岐の、飽和又は部分不飽和の、高級炭化水素基であり、
Ｒ２は直鎖の低級アルキル基であり、
Ｘは−Ｃ（Ｏ）−、−ＣＨ２−又は−ＣＨ＝ＣＨ−である。）
を、試料中のＬｐ−ＰＬＡ２と反応させて下記一般式ＩＩで表されるリゾＰＡＦ類：
（式中、
Ｒ１及びＸは、一般式Ｉにおいて定義したとおりである）
に変換する工程：
（Ｂ）工程（Ａ）において生じた前記リゾＰＡＦ類を、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のタンパク質である酵素により加水分解して加水分解物を得る工程：
（ａ）配列番号１又は９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質；
（ｂ）配列番号１又は９に記載のアミノ酸配列において１つ又は複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、ＰＡＦに対するホスフォリパーゼＤ様（ＰＬＤ）活性を有さず、かつ、リゾＰＡＦに対するＰＬＤ活性を有する、タンパク質；
（ｃ）配列番号１又は９に記載のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、ＰＡＦに対するＰＬＤ活性を有さず、かつ、リゾＰＡＦに対するＰＬＤ活性を有する、タンパク質；
（Ｃ）工程（Ｂ）で得られた加水分解物由来の変化量を指標として試料中のＬｐ−ＰＬＡ２活性を測定する工程。
［３］
工程（Ｃ）における変化量が、加水分解物であるコリンの変化量である、［２］に記載の方法。
［３−１］
工程（Ｃ）における変化量が、加水分解物であるリゾＰＡＦ脱コリン体類の変化量である、［２］に記載の方法。
［４］
工程（Ｃ）が、コリンの変化量を測定する方法として、更に下記の工程（Ｃ−１）を含む、［３］に記載の方法：
（Ｃ−１）コリンとコリンオキシダーゼを反応させて過酸化水素を生成する工程。
［５］
工程（Ｃ）が、更に下記の工程（Ｃ−２）を含む、［４］に記載の方法：
（Ｃ−２）工程（Ｃ−１）で生成した過酸化水素の量を、発色試薬を用いた比色分析法により測定する工程。
［６］
工程（Ａ）に先立って、更に下記の工程（Ｄ）を含む、［２］〜［５］のいずれかに記載の方法：
（Ｄ）試料中のコリンを除去する工程。
［７］
工程（Ｄ）が、コリンオキシダーゼを用いて試料中のコリンを除去する工程である、［６］に記載の方法。
［８］
Ｒ２がメチル基である、［２］〜［７］のいずれかに記載の方法。
［９］
Ｒ１が、独立して、Ｃ１５及びＣ１７の直鎖アルキル基から選択される、［２］〜［８］のいずれかに記載の方法。
［１０］
Ｘが−ＣＨ２−である、［２］〜［９］のいずれかに記載の方法。
［１１］
Ｘが−Ｃ（Ｏ）−である、［２］〜［９］のいずれかに記載の方法。
［１２］
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のタンパク質である酵素：
（ａ）配列番号１又は９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質；
（ｂ）配列番号１又は９に記載のアミノ酸配列において１つ又は複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、血小板活性化因子（ＰＡＦ）に対するホスフォリパーゼＤ様（ＰＬＤ）活性を有さず、かつ、リゾＰＡＦに対するＰＬＤ活性を有する、タンパク質；
（ｃ）配列番号１又は９に記載のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、ＰＡＦに対するＰＬＤ活性を有さず、かつ、リゾＰＡＦに対するＰＬＤ活性を有する、タンパク質；
及び下記一般式Ｉで表される、ＰＡＦ類：
（式中、
Ｒ１は、直鎖又は分岐の、飽和又は部分不飽和の、高級炭化水素基であり、
Ｒ２は直鎖の低級アルキル基であり、
Ｘは−Ｃ（Ｏ）−、−ＣＨ２−又は−ＣＨ＝ＣＨ−である。）
を含む、試料中のリポタンパク質関連ホスフォリパーゼＡ２（Ｌｐ−ＰＬＡ２）活性の測定用キット。
［１３］
更にコリンオキシダーゼを含む、［１２］に記載のキット。
［１４］
更にペルオキシダーゼ、トリンダー試薬及びカップラーを含む、［１３］に記載のキット。
［１４−１］
更にペルオキシダーゼ及び発色試薬を含む、［１３］に記載のキット。
［１４−２］
発色試薬が、ロイコ型試薬、又はカップラー及びトリンダー型試薬である、［１４−１］に記載のキット。
［１４−３］
発色試薬がカップラー及びトリンダー型試薬である、［１４−１］に記載のキット。
［１４−４］
カップラーが４−アミノアンチピリンである、［１４−３］に記載のキット。
［１５］
前記酵素を含む第一試薬と、前記ＰＡＦ類を含む第二試薬とを含む、［１２］〜［１４−４］のいずれかに記載のキット。
［１６］
前記第一試薬が更にコリンオキシダーゼを含む、［１５］に記載のキット。
［１６−１］
前記第一試薬及び／又は前記第二試薬が更に、発色試薬を含む、［１５］又は［１６］に記載のキット。
［１６−２］
内容物が複数の容器に分けて保存されている、［１２］〜［１６−１］のいずれかに記載のキット。
［１６−３］
Ｒ２がメチル基である、［１２］〜［１６−２］のいずれかに記載のキット。
［１６−４］
Ｒ１がＣ１５又はＣ１７の直鎖アルキル基である、［１２］〜［１６−３］のいずれかに記載のキット。
［１６−５］
Ｘが−ＣＨ２−である、［１２］〜［１６−４］のいずれかに記載のキット。
［１６−６］
Ｘが−Ｃ（Ｏ）−である、［１２］〜［１６−４］のいずれかに記載のキット。
［１７］
［１２］〜［１６−６］のいずれかに記載のキットを用いて、被検体由来の試料中のＬｐ−ＰＬＡ２活性を測定する工程を含む、Ｌｐ−ＰＬＡ２が関与する疾患及び／又は状態を、診断及び／又は管理する方法。
［１８］
前記Ｌｐ−ＰＬＡ２が関与する疾患及び／又は状態が、アテローム性動脈硬化に伴う心血管疾患である［１７］に記載の方法。
［１９］
Ｌｐ−ＰＬＡ２が関与する疾患及び／又は状態の診断用キットである、［１２］〜［１６−６］のいずれかに記載のキット。
［２０］
前記Ｌｐ−ＰＬＡ２が関与する疾患及び／又は状態が、アテローム性動脈硬化に伴う心血管疾患である、［１９］に記載のキット。
本発明によれば、より汎用性が高く、簡便で、安全なＬｐ−ＰＬＡ２の活性測定が可能となる。更には干渉物質の影響を受けにくく正確に、又は高感度に、Ｌｐ−ＰＬＡ２の活性測定が可能となる。また本発明はアテローム性動脈硬化に代表されるＬｐ−ＰＬＡ２が関与する疾患又は状態の診断及び管理に有用である。
参考例１０において測定した、各温度におけるリゾＰＡＦ−ＰＬＤの残存活性。 実施例１において、各種濃度のＰＡＦを基質とした時の１０分間の反応時間の各測光ポイントにおける吸光度変化。 実施例１において、各種濃度のリゾＰＡＦを基質とした時の１０分間の反応時間の各測光ポイントにおける吸光度変化。 実施例１４において、血清プールＪ０４２に各種濃度のｒＬｐ−ＰＬＡ２を添加した時の吸光度変化。 実施例１４において、血清プールＡに各種濃度のｒＬｐ−ＰＬＡ２を添加した時の吸光度変化。 実施例１４において、血清プールＢに各種濃度のｒＬｐ−ＰＬＡ２を添加した時の吸光度変化。 実施例１４において、血清プールＣに各種濃度のｒＬｐ−ＰＬＡ２を添加した時の吸光度変化。 実施例１５における、本発明試薬とＣａｙｍａｎ社試薬によるＬｐ−ＰＬＡ２活性の測定値の相関。 実施例１６における、本発明試薬とＲ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ社ＥＬＩＳＡキットによるＬｐ−ＰＬＡ２活性の測定値の相関。 実施例１８における、本発明試薬での血清プールＪ０４２の反応タイムコース。 実施例１８における、ＰＬＡＣ Ｔｅｓｔでの血清プールＪ０４２の反応タイムコース。 実施例１８における、Ｌｐ−ＰＬＡ２ ＦＳでの血清プールＪ０４２の反応タイムコース。 実施例２０における、本発明試薬とＰＬＡＣ ＴｅｓｔによるＬｐ−ＰＬＡ２活性の測定値の相関。 実施例２０における、Ｌｐ−ＰＬＡ２ ＦＳと本発明試薬によるＬｐ−ＰＬＡ２活性の測定値の相関。 実施例２０における、ＰＬＡＣ ＴｅｓｔとＬｐ−ＰＬＡ２ ＦＳによるＬｐ−ＰＬＡ２活性の測定値の相関。 実施例２１における、本発明試薬によるＬｐ−ＰＬＡ２活性測定値の希釈直線性。 実施例２１における、ＰＬＡＣ ＴｅｓｔによるＬｐ−ＰＬＡ２活性測定値の希釈直線性。 実施例２１における、Ｌｐ−ＰＬＡ２ ＦＳによるＬｐ−ＰＬＡ２活性測定値の希釈直線性。 実施例２６において測定したＬp−ＰＬＡ２濃度から算出した変動係数（ＣＶ％）を白丸で、２ＳＤ（標準偏差の２倍）をエラーバーで示したグラフ。Ｌp−ＰＬＡ２濃度と変動係数を累乗近似し実線で示した（ｙ＝３７．６４４ｘ−１．１５５）。
以下、本発明の実施形態（「本実施形態」ともいう。）に基づき、本発明について詳しく説明する。以下の実施形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。
本明細書において、炭素原子を単に“Ｃ”で、水素原子を“Ｈ”で、酸素原子を“Ｏ”で、窒素原子を“Ｎ”で、またリン原子を“Ｐ”で表すことがある。またカルボニル基を単に“−Ｃ（Ｏ）−”で、エーテル結合を“−Ｏ−”で表すことがある（この場合の“−”は結合を表す）。また二重結合を単に“＝”で表すことがある。
炭化水素基とは炭化水素から水素原子１個又は２個以上を除いた残りの原子団であり、直鎖でもよく、分岐を有してもよく、また一部が不飽和化されていてもよい。本明細書及び特許請求の範囲において、「高級」及び「低級」とは炭素数を表す用語であり、その範囲は当業者には容易に理解できる。例えば、高級炭化水素基としては、炭素数１０〜３０のものが例示され、１０〜２０が好ましく、１５〜１７がより好ましい。また、低級炭化水素基としては、炭素数１〜９のものが例示され、１〜４が好ましく、１がより好ましい。
本明細書において、「アルキル」とは、直鎖状、又は分枝状である飽和炭化水素基を示す。
本明細書において、炭化水素部分の炭素原子の数は「Ｃｐ」によって示され、即ち「Ｃｐ」は「ｐ」個の炭素原子を有することを示す。
本実施形態の一態様において、血小板活性化因子（ＰＡＦ）類及びリゾＰＡＦ類の存在下、前記ＰＡＦ類を加水分解してコリンを生成する反応を行わずに、前記リゾＰＡＦ類を加水分解してコリンを生成するための、特定の酵素の使用が提供される。また、本実施形態の一態様において、リゾＰＡＦ類を特定の酵素により加水分解して得られた加水分解物の変化量を指標としてリゾＰＡＦ類の濃度を測定する方法が提供される。
また、本実施形態の一態様において、以下の工程（Ａ）〜工程（Ｃ）を含む、リポタンパク質関連ホスフォリパーゼＡ２（Ｌｐ−ＰＬＡ２）を含む試料中のＬｐ−ＰＬＡ２活性の測定方法が提供される。
（Ａ）ＰＡＦ類を、試料中のＬｐ−ＰＬＡ２と反応させてリゾＰＡＦ類に変換する工程：
（Ｂ）工程（Ａ）において生じた前記リゾＰＡＦ類を、特定の酵素により加水分解して加水分解物を得る工程：
（Ｃ）工程（Ｂ）で得られた加水分解物由来の変化量を指標として試料中のＬｐ−ＰＬＡ２活性を測定する工程。
本実施形態の一態様において、Ｌｐ−ＰＬＡ２活性測定の反応系は以下の図式で表される。
本実施形態の一態様において、上記工程（Ａ）は、例えば、後述の実施例に示すとおり、Ｌｐ−ＰＬＡ２を含む試料とＰＡＦを含む試薬を混ぜ合わせることで実施できる。
本実施形態において、「試料」とは測定対象のことであり、Ｌｐ−ＰＬＡ２活性を測定できる「試料」としては、Ｌｐ−ＰＬＡ２を含むか又は含み得る試料であれば特に限定されない。そのような試料としては、ヒト又は動物の血液、血清、血漿、尿若しくは羊水等の体液、並びにヒト又は動物の細胞、臓器若しくは細胞及び臓器の抽出液等が挙げられる。試料は、ヒト由来の血液、血清、血漿であることが好ましい。後述の実施例２４及び２５に記載のとおり、本実施形態によれば、試料を通常の検体保存温度範囲（例えば室温（１〜３０℃）及びそれ以下の温度であるディープフリーザー（〜−８０℃））で保存後も、安定して、高感度なＬｐ−ＰＬＡ２活性測定が可能である。
本実施形態において、Ｌｐ−ＰＬＡ２（Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ａ２）は、少なくともＰＡＦのｓｎ−２位のアセチル基を加水分解してリゾＰＡＦを産生し、ＰＡＦを不活化する酵素を指す。Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ａｃｅｔｙｌｈｙｄｒｏｌａｓｅ（ＰＡＦ−ＡＨ）と呼ばれることもある。
本実施形態において血小板活性化因子（ＰＡＦ類）とは、下記一般式Ｉ：
で表される化合物である。
一般式Ｉ中、Ｒ１は、直鎖又は分岐の、飽和又は部分不飽和の、高級炭化水素基であり、Ｃ１０以上Ｃ３０以下の炭化水素基が例示され、Ｃ１０以上Ｃ２０以下の炭化水素基が好ましく、Ｃ１５以上Ｃ１７以下の炭化水素基がより好ましい。一態様において、Ｃ１０以上の直鎖アルキル基が例示され、Ｃ１５の直鎖アルキル基、又はＣ１７の直鎖アルキル基が好ましく、Ｃ１５の直鎖アルキル基が更に好ましい。一態様において、Ｒ１は、一部が不飽和化された炭化水素基であってもよい。不飽和結合が存在する場合、その数は１つ又は２つが好ましく、１つがより好ましい。一部が不飽和化されたＲ１としては、ゲラニル基、ゲラニルゲラニル基、オレイル基等が例示される。
一般式Ｉ中、Ｒ２は、直鎖の低級アルキル基であり、Ｃ１以上Ｃ９以下のアルキル基が例示される。一般式ＩにおけるＲ２の分子が小さいほどＬｐ−ＰＬＡ２の基質として好ましいことから（臨床検査２０１２年２月５６巻Ｎｏ．２ １５２頁）、一態様において、Ｒ２は、Ｃ１以上Ｃ４以下のアルキル基が好ましく、メチル基又はブチル基が好ましく、メチル基がより好ましい。
一般式Ｉ中、Ｘは、−Ｃ（Ｏ）−、−ＣＨ２−又は−ＣＨ＝ＣＨ−であり、一態様において−ＣＨ２−が好ましく、他の一態様において、−Ｃ（Ｏ）−が更に好ましい。一態様において、Ｘが−Ｃ（Ｏ）−の場合、Ｒ１はＣ１５の直鎖アルキルであることが好ましく（例えば、後述の１−ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−２−ａｃｅｔｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ＰＣが例示される）、Ｘが−ＣＨ２−の場合、Ｒ１はＣ１５又はＣ１７の直鎖アルキルであることが好ましい。また、Ｘが、−ＣＨ＝ＣＨ−の場合、シス体であってもトランス体であってもよく、トランス体が好ましい。
本実施形態において、ＰＡＦ類は以下に説明するＰＡＦ及びＰＡＦ類縁体の総称であり、天然に存在するＰＡＦ類であっても、人工的に合成したＰＡＦ類であってもよく、立体化学がＳ体及びＲ体であるＰＡＦ類並びにそれらの任意の割合の混合物としてのＰＡＦ類を含む。本実施形態の一態様において、Ｌｐ−ＰＬＡ２活性の測定感度の観点から光学活性体のＰＡＦ類を用いることが好ましい場合があり、製造費用等の経済的観点からラセミ体のＰＡＦ類を用いることが好ましい場合もある。
本実施形態において「ＰＡＦ」とは、一般式Ｉにおいて、Ｘが−ＣＨ２−であり、Ｒ１がＣ１５又はＣ１７の直鎖アルキル基であり、Ｒ２がメチル基である化合物であり（それぞれ、「ＰＡＦ（Ｃ１６）」又は「ＰＡＦ（Ｃ１８）」と呼ぶ場合もある。）、天然に存在するＰＡＦであっても、人工的に合成したＰＡＦであってもよく、立体化学がＳ体及びＲ体であるＰＡＦ並びにそれらの任意の割合の混合物としてのＰＡＦを含む。
本実施形態において「ＰＡＦ類縁体」とは、一般式Ｉで定義されるＰＡＦ類のうち前記ＰＡＦ以外の化合物であり、天然に存在するＰＡＦ類縁体であっても、人工的に合成したＰＡＦ類縁体であってもよく、立体化学がＳ体及びＲ体であるＰＡＦ類縁体並びにそれらの任意の割合の混合物としてのＰＡＦ類縁体を含む。「ＰＡＦ類縁体」の例としてはプラスマローゲン（Ｐｌａｓｍａｌｏｇｅｎ）が挙げられる。プラスマローゲンは天然に存在するプラスマローゲン、人工的に合成したプラスマローゲン及び光学活性がある場合はその任意の割合の混合物としてのプラスマローゲンを含む。そのようなプラスマローゲンとしては、例えば、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１６年３８巻１０９−１１６頁に記載のプラスマローゲンが挙げられる。一態様において、ＰＡＦ類がプラスマローゲンの場合、Ｒ２は、メチル基又はブチル基が好ましい。
ＰＡＦ類はＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ社（Ａｌａｂａｍａ ＵＳＡ）やＢａｃｈｅｍ社（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）などから入手できる。光学活性体のＰＡＦ類はＪ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９５年６０巻７７０６−７７０８頁で開示された方法で合成してもよい。ラセミ体のＰＡＦ類は、１−Ｏ−Ｈｅｘａｄｅｃｙｌ−ｒａｃ−ｇｌｙｃｅｒｏｌを出発原料として、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９５年６０巻７７０６‐７７０８頁でで開示された方法で合成してもよい。
本実施形態の工程（Ａ）において、ＰＡＦ類の使用量としては、Ｌｐ−ＰＬＡ２活性が、定量的、半定量的又は定性的に測定できる量であればよく、好ましくは定量的に測定できる使用量であり、その下限値として１ｍＭ以上、好ましくは５ｍＭ以上、更に好ましくは７ｍＭ以上が例示され、上限値は特に制限されないが、好ましくは５０ｍＭ以下、更に好ましくは２０ｍＭ以下、特に好ましくは１５ｍＭ以下が例示される。
本実施形態において「リゾＰＡＦ類」とは、前記ＰＡＦ類のｓｎ−２位を加水分解することで生じる化合物であり、下記一般式ＩＩ：
で表される化合物であり、式中、Ｒ１及びＸは、一般式Ｉにおいて定義したとおりである。リゾＰＡＦ類は、以下に説明するリゾＰＡＦ及びリゾＰＡＦ類縁体の総称である。
本実施形態において「リゾＰＡＦ」とは、一般式ＩＩにおいて、Ｘが−ＣＨ２−であり、Ｒ１がＣ１５、又はＣ１７の直鎖アルキル基である化合物であり、天然に存在するリゾＰＡＦであっても、人工的に合成したリゾＰＡＦであってもよく、立体化学がＳ体及びＲ体であるリゾＰＡＦ並びにそれらの任意の割合の混合物としてのリゾＰＡＦを含む。リゾＰＡＦは反応系中で生成させてもよい。
本実施形態において「リゾＰＡＦ類縁体」とは、一般式ＩＩで定義されるリゾＰＡＦ類のうち、前記リゾＰＡＦ以外の化合物であり、天然に存在するリゾＰＡＦ類縁体であっても、人工的に合成したリゾＰＡＦ類縁体であってもよく、立体化学がＳ体及びＲ体であるリゾＰＡＦ類縁体並びにそれらの任意の割合の混合物としてのリゾＰＡＦ類縁体を含む。リゾＰＡＦ類縁体は反応系中で生成させてもよい。
本実施形態の一態様において、工程（Ｂ）は、例えば後述の実施例に示すとおり、工程（Ａ）でＬｐ−ＰＬＡ２によってＰＡＦ類から生じたリゾＰＡＦ類と、このリゾＰＡＦ類を加水分解してコリンを生成するための酵素を含む試薬とを共存させることで実施できる。
一態様において、工程（Ｂ）で用いる酵素は、以下のタンパク質である。
（ａ）配列番号１又は９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質；
（ｂ）配列番号１又は９に記載のアミノ酸配列において１つ又は複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、ＰＡＦに対するホスフォリパーゼＤ様（ＰＬＤ）活性を有さず、かつ、リゾＰＡＦに対するＰＬＤ活性を有する、タンパク質；
（ｃ）配列番号１又は９に記載のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、ＰＡＦに対するＰＬＤ活性を有さず、かつ、リゾＰＡＦに対するＰＬＤ活性を有する、タンパク質。
一態様において、工程（Ｂ）で用いる酵素は、以下のタンパク質であってもよい。
（ｄ）配列番号２に記載の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質；
（ｅ）配列番号２に記載の塩基配列において１つ又は複数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質であって、ＰＡＦに対するＰＬＤ活性を有さず、かつ、リゾＰＡＦに対するＰＬＤ活性を有する、タンパク質；
（ｆ）配列番号２に記載の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質であって、ＰＡＦに対するＰＬＤ活性を有さず、かつ、リゾＰＡＦに対するＰＬＤ活性を有する、タンパク質。
上記の（ｂ）のタンパク質において、「１つ又は複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」とは、タンパク質が所望の活性を有する限り特に限定されないが、例えば、１又は数個、より具体的には、１〜９個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸が欠失等したアミノ酸配列である。
同様に、上記の（ｅ）のタンパク質において、「１つ又は複数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列」とは、コードされるタンパク質が所望の活性を有する限り特に限定されないが、例えば、１又は数個、より具体的には、１〜９個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個の塩基が欠失等した塩基配列を指す。
上記（ｃ）のタンパク質において、「配列番号１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列」とは、タンパク質が所望の活性を有する限り特に限定されないが、例えば、９２％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、更に好ましくは９９％以上の上記配列同一性を有するアミノ酸配列である。
同様に、上記（ｆ）のタンパク質において、「配列番号２に記載の塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列」とは、タンパク質が所望の活性を有する限り特に限定されないが、例えば、９２％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、更に好ましくは９９％以上の上記配列同一性を有する塩基配列である。
上記（ａ）〜（ｆ）のタンパク質は、本実施形態の酵素を菌体外やペリプラズムへ輸送する為のＳＥＣ系又はＴＡＴ系のシグナルペプチド、効率的な精製を行う為のヒスチジンタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、ＴＡＲＧＥＴタグ、ＦＬＡＧタグなどのアフィニティータグ、発現した蛋白質の凝集を改善するためのマルトースバインディングプロテインタグ、チオレドキシンタンパクタグ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼタグ、タンパク質の発現量を増大するためのＴＥＥタグ、マーカーとしてのＧＦＰタグ等、機能性を有するペプチド、タグ及びその他のリンカーなど機能を持たないアミノ酸配列からなる部分を、Ｎ末端側及び／又はＣ末端側に付加したものであってもよい。それらのアミノ酸配列は、直列して付加してもよいし、各アミノ酸配列の間等に数個のプロテアーゼ認識アミノ酸配列を配置して付加してもよい。これらのアミノ酸配列（例えば、タグ）は、本実施形態の酵素の機能を最大限にするためなどの目的で、その全部又は一部を削除したものであってもよい。一態様において、上記（ａ）〜（ｆ）のタンパク質は、配列番号９に記載のアミノ酸配列或いは配列番号９に記載のアミノ酸配列において１つ又は複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列に、上述のシグナルペプチド等のアミノ酸配列が付加したものである。
本実施形態において好適なシグナルペプチドの例としては、ＯｍｐＴやＰｅｌＢ等、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２００７年２８２巻８３０９−８３１６頁、Ｒｅｃｅｎｔ Ｐａｔｅｎｔｓ ｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０１０年４巻２３−２９頁に記載の大腸菌のＴＡＴ系及びＳＥＣ系シグナルペプチド並びに配列番号１の１〜２５番目のアミノ酸配列が挙げられる。
本実施形態において、上記（ａ）〜（ｆ）のタンパク質を「リゾＰＡＦ−ＰＬＤ」ということもある。「リゾＰＡＦ−ＰＬＤ」は、例えば特許文献５に記載の方法に準じて製造でき、具体的には、例えば後述の参考例１〜３に示すように、配列番号１又は９のアミノ酸配列をコードする遺伝子または配列番号２の塩基配列を有する遺伝子を含む微生物、または該遺伝子を含む組換えベクターによる形質転換体を培地で培養する工程、培養物中にリゾＰＡＦ−ＰＬＤを生成蓄積させる工程、及び該培養物からリゾＰＡＦ−ＰＬＤを採取する工程を含む方法により製造することができる。リゾＰＡＦ−ＰＬＤは、原料や他の製造物等が混在したまま用いてもよいが、目的や用途等場合によっては実質的に不純物を包含しないようにすることが好ましく、通常は、例えば５０％以上、７０％以上又は９５％以上の純度に精製することができる。経済性を高くする場合は純度が低いリゾＰＡＦ−ＰＬＤを使用すればよく、特異性を高くする場合は純度が高いリゾＰＡＦ−ＰＬＤを使用すればよい。また、リゾＰＡＦ−ＰＬＤの変異体である上記（ｂ）、（ｃ）、（ｅ）及び（ｆ）のタンパク質は、当業者に公知の手法を用いて例えば、リゾＰＡＦ−ＰＬＤのプラスミドを鋳型とし、市販のＫＯＤ‐Ｐｌｕｓ‐Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｃｏｄｅ Ｎｏ.:ＳＭＫ‐１０１）の添付文書に従い、Ｉｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲを行うことにより取得することができる。
本実施形態において、リゾＰＡＦ−ＰＬＤの使用量はＬｐ−ＰＬＡ２活性が測定できる限り特に限定されないが、安定な測定を行うために、０．１ｍｇ／ｍＬ以上が好ましく、経済性の観点からは０．０１ｍｇ／ｍＬ〜１．５ｍｇ／ｍＬの範囲が好ましく、通常は両方の観点から０．１ｍｇ／ｍＬから１．５ｍｇ／ｍＬの範囲が好ましい。
本実施形態において、「ＰＬＤ活性」とは、ホスフォリパーゼＤ（Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ｄ）様の活性であり、例えばＰＡＦやリゾＰＡＦの、コリン部位とリン酸部位の間の結合を加水分解する酵素活性を指す。例えば、基質がＰＡＦ類の場合、ＰＬＤ活性とは、以下の反応を触媒して、ＰＡＦ類を加水分解してＰＡＦ脱コリン体類と、コリンとを生成する酵素活性を指す。
同様に、基質がリゾＰＡＦ類の場合、ＰＬＤ活性とは、リゾＰＡＦ類を加水分解してリゾＰＡＦ脱コリン体類と、コリンとを生成する酵素活性を指す。
本実施形態において、「リゾＰＡＦ脱コリン体類」とは、前記リゾＰＡＦ類のコリン部位とリン酸部位の間の結合を加水分解することで生じるリン酸誘導体である。下記の一般式ＩＩＩ：
（式中、Ｒ１は一般式Ｉにおいて定義したとおりである）で表される化合物が例示される。
リゾＰＡＦ脱コリン体類は下記の一般式ＩＶ：
（式中、Ｒ１は一般式Ｉにおいて定義したとおりである）で表される鎖状体として存在するものも含む。
工程（Ｂ）で用いる酵素は、ＰＡＦに対するＰＬＤ活性を有さず、かつ、リゾＰＡＦに対するＰＬＤ活性を有する、タンパク質である。このような特異性により、工程（Ａ）で試料中のＬｐ−ＰＬＡ２活性によりＰＡＦ類から生じたリゾＰＡＦ類のみが、工程（Ｂ）で加水分解される。酵素がＰＡＦに対するＰＬＤ活性を有するか否か、及び酵素がリゾＰＡＦに対するＰＬＤ活性を有するか否かは、後述の実施例１に記載のように、ＰＡＦ又はリゾＰＡＦと、酵素とを反応させ、ＰＬＤ活性により生じる反応生成物（好ましくはコリン）の有無を確認することで実施することができる。例えば、本実施形態において、酵素が「ＰＡＦに対するＰＬＤ活性を有さず」というとき、後述の実施例１に記載の条件でＰＡＦと酵素とを反応させた場合に、ＰＡＦの９５％以上が分解せずに残存する酵素活性を指し、好ましくはＰＡＦの９８％以上、より好ましくはＰＡＦの９９％以上が分解せずに残存する酵素活性を指す。
工程（Ａ）と（Ｂ）における試料（ｓａｍｐｌｅ）と試薬(ｒｅａｇｅｎｔ)の比率、すなわちＳ／Ｒ比はＬｐ−ＰＬＡ２活性が測定できる限り任意の比率であることができるが、試料由来の共存物質の影響を避ける観点から、１：４０〜１：２００の範囲が好ましく、より高感度で測定を行うという観点から、１：５〜１：２０の範囲が好ましい。一態様において、上記両方の観点からＳ／Ｒ比は、１：３０〜１：１００の範囲が好ましい。なお、例えば試料５μＬ、第一試薬１５０μＬ及び第二試薬１００μＬを用いる場合、Ｓ／Ｒ比は１：５０である。
本実施形態の一態様において、上記工程（Ｃ）において指標とする、「工程（Ｂ）で得られた加水分解物由来の変化量」は、それを指標として試料中のＬｐ−ＰＬＡ２活性を測定することができる量であれば特に限定されず、コリン量又はリゾＰＡＦ脱コリン体類量が例示され、測定容易性の観点からコリン量がより好ましい。
本実施形態の一態様において、工程（Ｃ）は更に以下の工程（Ｃ−１）：
（Ｃ−１）コリンとコリンオキシダーゼを反応させて、過酸化水素を生成する工程
を含むことができる。
工程（Ｃ−１）は、後述の実施例に示すとおり、リゾＰＡＦ−ＰＬＤによってリゾＰＡＦから生じたコリンとコリンオキシダーゼを含む試薬を接触させることで実施できる。
本実施形態の一態様において、工程（Ｃ）は更に以下の工程（Ｃ−２）：
（Ｃ−２）工程（Ｃ−１）で生成した過酸化水素の量を、発色試薬を用いた比色分析法により測定する工程
を含むことができる。
工程（Ｃ−２）は、例えば後述の実施例に示すとおり、工程（Ｃ−１）で生じた過酸化水素をペルオキシダーゼ及び発色試薬と反応させた後に吸光度を測定することで実施できる。
本実施形態において工程（Ｃ−１）で生成した過酸化水素の量を測定する方法としては、ペルオキシダーゼ等を用いて色素等を生成し、発色を比色分析により測定する方法が例示されるが、これに限らず、公知の測定方法を用いればよい。例えば、上記過酸化水素量を、発光、蛍光等により測定してもよく、また電気化学的手法によって測定してもよい。
工程（Ｂ）で得られた加水分解物由来の変化量としてコリン量を測定する場合、コリンを直接、例えばＨＰＬＣによる方法、ＬＣ／ＭＳを用いた方法等で測定してもよい。
本実施形態において用いるコリンオキシダーゼは、試料及び反応系中に含まれるコリンに有効に作用し、コリンを酸化することができれば限定されないが、ＥＣ １．１．３．１７で分類される酵素が好ましい。例えば、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ由来のコリンオキシダーゼや、コリンオキシダーゼ（Ｃｈｏｌｉｎｅ ｏｘｉｄａｓｅ（ＣＯＤ、旭化成ファーマ株式会社（Ｔ−０５））、(Ｉｋｕｔａ， Ｓ．， Ｍａｔｓｕｕｒａ， Ｋ．， Ｉｍａｍｕｒａ， Ｓ．， Ｍｉｓａｋｉ， Ｈ． ａｎｄ Ｈｏｒｉｕｃｈｉ， Ｙ．（１９７７）Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ８２， １５７−１６３)）又はその組換え体、及び東洋紡株式会社製のコリンオキシダーゼ（商品名：ＣＨＯ−３０１）等が挙げられる。
過酸化水素の量を測定する際の発色試薬としては、ペルオキシダーゼの存在下で４−ＡＡ若しくは３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）等のカップラーとフェノール等の色原体との酸化縮合により色素を生成するトリンダー試薬、ペルオキシダーゼの存在下で直接酸化、呈色するロイコ型試薬等を用いることができる。トリンダー型試薬の色原体としては、フェノール誘導体、アニリン誘導体、トルイジン誘導体等が使用可能であり、具体例として、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン，ナトリウム塩，２水和物（ＴＯＯＳ）、Ｎ，Ｎ−ビス（４−スルホプロピル）−３−メチルアニリン，２ナトリウム塩（ＴＯＤＢ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリンナトリウム塩（ＤＡＯＳ）（以上、同人化学研究所社製）等、同人化学研究所社の第３０版総合カタログに記載の色原体が挙げられる。またロイコ型試薬の具体例としては、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４−ビス（ジメチルアミノ）ビフェニルアミン（ＤＡ６４）、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン（ＤＡ６７）（以上、和光純薬社製）等が挙げられる。一態様において、測定感度の観点から、トリンダー試薬としては、ＴＯＯＳ又はＴＯＤＢを使用することが好ましい。
過酸化水素の量を蛍光法により測定する場合には、酸化によって蛍光を発する化合物、例えばホモバニリン酸、４−ヒドロキシフェニル酢酸等を、化学発光法により測定する場合には、触媒としてルミノール、ルシゲニン、イソルミノール等を用いて、公知の手法により測定することができる。
過酸化水素の量を、電極を用いて測定する場合、電極は、過酸化水素との間で電子を授受することのできる材料である限り特に制限されないが、例えば白金、金、銀若しくはガラス状炭素などの炭素素材等が挙げられ、電極測定方法としてはアンペロメトリー、ポテンショメトリー、クーロメトリー等の公知の方法を用いることができる。更に、オキシダーゼまたは基質と電極との間の反応に電子伝達体を介在させ、得られる酸化、還元電流あるいはその電気量を測定してもよい。電子伝達体としては電子伝達機能を有する任意の物質が使用可能であり、例えばフェロセン誘導体、キノン誘導体等の物質が挙げられる。またオキシダーゼ反応により生成する過酸化水素と電極の間に電子伝達体を介在させ得られる酸化、還元電流またはその電気量、電位の変化を測定してもよい。
本実施形態において「Ｌｐ−ＰＬＡ２の活性測定」として、コリン量を測定する方法が例示されるが、これに限らず、リゾＰＡＦ脱コリン体類を定量することでもＬｐ−ＰＬＡ２活性を測定することができる。リゾＰＡＦ脱コリン体類の定量方法としては既存の定量方法を用いればよく、例えばＨＰＬＣによる方法、発色試薬を用いた方法、ＬＣ／ＭＳやＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いた方法等で測定することができる。
本実施形態の一態様において、Ｌｐ−ＰＬＡ２活性の測定方法は以下の工程（Ｄ）：
（Ｄ）試料中のコリンを除去する工程：
を工程（Ａ）に先立って含むことができる。
工程（Ｄ）は後述の実施例に示すとおり、コリンを含む試料とコリンオキシダーゼを含む試薬を共存させることで実施できる。
本実施形態において「コリンを除去する工程」として、コリンオキシダーゼを用いて試料中のコリンを酸化し、除去する工程が例示されるが、これに限らず、本測定系に影響を与えない範囲にコリンを反応系中から除去できればよく、透析、ゲル濾過、限外濾過等によっても行うことができる。
本実施形態において、Ｌｐ−ＰＬＡ２活性の測定方法における各工程の「温度」は３７℃が例示されるが、これに限らず、用いる酵素が通常機能する温度範囲で測定すればよく、各工程の温度は同一でなくてもよい。例えば、工程（Ｂ）はリゾＰＡＦ−ＰＬＤが活性を有する任意の温度で実施することができる。後述の参考例１０に示すように、リゾＰＡＦ−ＰＬＤは２０〜６０℃で保存しても失活しないので、２０〜６０℃の範囲でＬｐ−ＰＬＡ２活性を測定することが好ましい。
また、コリンオキシダーゼも２０〜６０℃において完全には失活しないため、コリンオキシダーゼを用いた工程も、この温度範囲で実施することができる。コリンオキシダーゼは、特に４０℃以下では安定性が高いため、４０℃以下で測定することが特に好ましい。
本実施形態において、Ｌｐ−ＰＬＡ２活性の測定方法を実施する「測定時間」としては１０分が例示されるが、これに限定されない。測定に先立って、例えばＰＡＦ類とリゾＰＡＦ−ＰＬＤとを混合するプレインキュベーションの時間を設けることもできる。プレインキュベーションの時間は無くてもよく、試料の成分と第１試薬が十分に反応できる時間であればより好ましい。プレインキュベーションとは、測定精度や反応性を上げるために試料と試薬を予め混合させたり、試薬単独で行ったりする予備加温工程である。時間や温度はプレインキュベーションの目的に応じて適宜変更することができ、例えば試料中や試薬原料中の不要な物質を酵素により消去する目的で行う際には、酵素がよく機能する温度（例えば３７℃程度）で実施することができる。
また、後述の実施例１８で示すとおり、試料とリゾＰＡＦ−ＰＬＤを含む第１試薬とを混合してプレインキュベーション後、ＰＡＦを含む第２試薬を加えた直後から反応が開始していることから、工程（Ａ）〜（Ｃ）は同時に開始することもできる。
本実施形態において試料量は適宜増減して用いればよく、高感度に測定する場合は試料量を大きくし、ヘモグロビンやビリルビンなどの干渉物質の影響を低減する場合は試料量を小さくすればよく、一態様において、３μＬ以上用いるのが好ましい。
本実施形態の一態様において、使用する酵素の反応性及び／又は安定性を維持及び／又は高めるという観点から、蛋白質・酵素の基礎実験法（改訂第２版、堀尾武一、１９９４年南光堂）や同人化学研究所社の第３０版総合カタログに記載の「緩衝液（緩衝剤という場合もある）」を用いることが好ましい。「緩衝液」は、目的のｐＨを保つことができれば限定されないが、グッドのｐＨ緩衝液（ＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、ＥＰＰＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳ等）、Ｔｒｉｓ緩衝液、ジエタノールアミン緩衝液、炭酸緩衝液、グリシン緩衝液、硼酸緩衝液、リン酸緩衝液、グリシルグリシン緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、マレイン酸緩衝液、トリスエタノールアミン緩衝液、イミダゾール緩衝液等が例示できる。これらの緩衝液は、塩酸等の強酸やＮａＯＨ等の強アルカリを用いて、緩衝剤として使用可能なｐＨ範囲に調整して使用することができる。ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＰＩＰＥＳ、Ｐｉ−Ｋ（リン酸カリウム）、Ｔｒｉｓが好ましく、Ｔｒｉｓがより好ましい。
「緩衝液」の濃度は目的のｐＨを保つことができる限り特に限定されないが、下限値として３ｍＭ以上、好ましくは５ｍＭ以上、更に好ましくは１０ｍＭ以上が例示され、上限値としては５００ｍＭ以下、好ましくは２００ｍＭ以下、更に好ましくは１００ｍＭ以下が例示される。より好ましい濃度としては２５ｍＭ以上１００ｍＭ以下が例示され、５０ｍＭが更に好ましい。
本実施形態の一態様において、各工程の「ｐＨ」は、酵素活性が失われないｐＨであれば限定されず、下限値としてｐＨ５．０以上、好ましくはｐＨ６．０以上、更に好ましくはｐＨ７．０以上が例示され、上限値としてはｐＨ９．０以下、好ましくはｐＨ８．５以下、更に好ましくはｐＨ８．０以下が例示される。一態様において、各工程はｐＨ７．５で実施される。ｐＨは、使用する各酵素の至適ｐＨを参照して適宜設定することができ、例えば、Ｌｐ−ＰＬＡ２活性の至適ｐＨという観点からは、そのｐＨは、下限値としてｐＨ６．０以上が例示され、上限値としてはｐＨ９．０以下が例示され、好ましくはｐＨ７．５以上ｐＨ８．０以下が例示され、更に好ましくはｐＨ７．５以上ｐＨ７．７５以下が例示される。中性付近で測定が実施可能であることから、空気中の炭酸ガスの影響を受けにくい測定を実施することができる。
本実施形態の一態様におけるＬｐ−ＰＬＡ２活性測定方法は、上記の酵素、緩衝剤等を含有する組成物（試薬）を使用して行うことができる。そのような組成物には、以下に記載するように、安定性、正確性及び／又は特異性を改善するための酵素、活性化剤、塩、界面活性剤、安定化剤、キレート剤、糖又は防腐剤等の酵素の活性測定用組成物に一般に用いられているものを更に追加して使用してもよい。
本実施形態において、試料中に含まれるアスコルビン酸を消去するためにアスコルビン酸オキシダーゼ（ａｓｃｏｒｂａｔｅ ｏｘｉｄａｓｅ）を使用することができる。アスコルビン酸オキシダーゼは、アスコルビン酸を実質的に消去する作用を有するものが好ましく、ＥＣ １．１０．３．３と分類される酵素がより好ましい。例えば、ウリ科植物由来のアスコルビン酸オキシダーゼを使用することができる。好適な例として、酵素の安定性が高いという観点からはＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍ属由来のアスコルビン酸オキシダーゼ（旭化成ファーマ株式会社（Ｔ−５３））、アジ化ナトリウムによる阻害を受けないという観点からは天野エンザイム株式会社製のアスコルビン酸オキシダーゼ（商品名ＡＳＯ−３）が挙げられる。アスコルビン酸はＡＡＱ（アスコルビン酸クエンチャー、同仁化学製）などを使用して化学的に消去してもよい。
本実施形態において、過酸化水素を消去するためにカタラーゼ（ｃａｔａｌａｓｅ）を使用する場合がある。カタラーゼは、アジ化ナトリウムで活性が阻害され、過酸化水素を実質的に消去する作用を有するものが好ましく、ＥＣ １．１１．１．６と分類される酵素がより好ましいがこれに限定されない。カタラーゼの使用量は限定されないが、通常１０〜５０００Ｕ／ｍＬの範囲で使用する。カタラーゼの好適な例としては、純度が高いという観点からはＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属由来（旭化成ファーマ株式会社）、安価で入手が容易である観点からは動物由来（ＳＩＧＭＡ（Ｃ１３４５等））のカタラーゼが挙げられる。
本実施形態において、試料中に含まれるビリルビンを消去するために、フェロシアン化カリウム塩（Ｋ４［Ｆｅ（ＣＮ）６］、（カウンターイオンは任意である））を使用する場合がある。フェロシアン化カリウムの使用量は限定されないが、通常１〜５００μＭの範囲で使用する。フェロシアン化カリウムが非特異的発色を誘起するなど本実施形態に悪い影響を与える場合は、その濃度を低くしたり、後述するキレート剤を添加したりすればよい。フェロシアン化カリウムは水溶液中で溶存酸素の影響によりフェリシアン化カリウムとの平衡状態で存在することは公知である。
本実施形態において、試料中及び／又は試薬原料中にグリセロホスフォコリン（以下、ＧＰＣ）が混在する場合には、ＧＰＣを消去する目的でグリセロホスフォリルコリンホスフォジエステラーゼ（ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ。以下ＧＰＣＰ）活性を有する酵素を使用することができる。ＧＰＣＰは、ＧＰＣを実質的に消去する作用を有するものが好ましく、ＥＣ ３．１．４．２と分類される酵素がより好ましい。市販品としてはＧｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ由来のＧＰＣＰ（旭化成ファーマ株式会社（Ｔ−３３））が挙げられる。また、ＥＣ ３．１．４．４６と分類されるグリセロホスフォジエステルホスフォジエステラーゼ（ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒ ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ）もＧＰＣを消去する作用を有し、使用できる。また、配列が既知のＧＰＣＰ活性を有する酵素の組換え体を遺伝子工学的手法に基づいて作製し（田村隆明（２０１２）．基礎から学ぶ遺伝子工学，等）、使用することもできる。
本実施形態において、上記のように試料中の物質の消去を行う場合、必要に応じて試料と上記の各酵素のいずれか１以上を含む試薬をプレインキュベーションしてもよい。また、試薬原料に含まれる物質を予め消去したい場合は、試薬調製後、必要に応じてプレインキュベーションしてもよい。
本実施形態において、酵素の活性化剤として「塩」を使用する場合がある。「塩」の好適な例はＣａＣｌ２であり、その他の例としてはリゾＰＡＦ−ＰＬＤ及びコリンオキシダーゼを活性化する塩が挙げられ、例えばＭｇＣｌ２、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、硫安やＮＨ３Ｃｌ等が挙げられる。また、複数種類の塩を任意の割合で混合して用いてもよい。酵素が作用する限り、塩を構成する陰イオンはＣｌ-に限定されない。
本実施形態において、「塩」の使用濃度としては、リゾＰＡＦ−ＰＬＤ及びコリンオキシダーゼを活性化する量であればよく、下限値として０ｍＭ以上が例示され、上限値は特に制限されないが、好ましくは２００ｍＭ以下、更に好ましくは１００ｍＭ以下、特に好ましくは１０ｍＭ以下が例示される。また、試料及び反応系中に酵素の活性化に必要な金属イオンが十分量含まれる場合は、塩を加えなくてもよい。
本実施形態において、測定の安定性、正確性、及び特異性を上げるために「界面活性剤」を使用する場合がある。「界面活性剤」としてはトリトンＸ−１００（以下、Ｔｘ−１００）が例示されるが、これに限らず、Ｌｐ−ＰＬＡ２活性が測定できるものであればよい。例えばポリオキシエチレンアルキルエーテル類、ポリオキシエチレン２級アルキルエーテル類、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル類、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル類、ポリオキシエチレンソルビット脂肪酸エステル類、ポリオキシエチレンアルキルフェニルホルムアルデヒド縮合物、ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレンステロール類、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル類、ポリオキシエチレンラノリン類、ポリオキシエチレンアルキルアミン・脂肪酸アミド類、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸・リン酸塩類、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩類、ポリグリセリン脂肪酸エステル類、グリセリン脂肪酸エステル類、プロピレングリコール脂肪酸エステル類、ソルビタン脂肪酸エステル類、Ｎアシルアミノ酸塩類、アルキルエーテルカルボン酸塩類、アルキルリン酸塩、Ｎアシルタウリン酸塩、スルホン酸塩、アルキル硫酸、酢酸ベタイン型両性界面活性剤、イミダゾリン型両性界面活性剤、レシチン誘導体、ポリエチレングリコール類、ポリエチレングリコールラウリルエーテル、ポリエチレングリコールイソオクチルフェニルエーテル、ポリプロピレングリコール、ポリビニルアルコール等、当業者に公知の任意の界面活性剤を用いることができる。好ましい例としては、非イオン性界面活性剤のエーテル型又はエステル型が挙げられ、更に好ましい例としては、ＨＬＢ値が１２以上１９以下のポリオキシエチレン誘導体、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、及びポリオキシエチレンアルキルアミンからなる群から選択される非イオン界面活性剤が挙げられ、更に好ましくは、ポリオキシエチレン２級アルキル（７−２１）エーテル、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル等が挙げられる。市販の界面活性剤としては、ＮＩＫＫＯＬ ＢＴ−７、ＮＩＫＫＯＬ ＢＴ−９、ＮＩＫＫＯＬ ＢＴ−１２、ＮＩＫＫＯＬ ＢＴ−２１（日光ケミカルズ株式会社）、Ｔｘ−１００、エマルゲン ７０９、エマルゲン １０８、エマルゲン １１０８、エマルゲン １１１８Ｓ−７０、エマルゲン １１５０Ｓ−６０、ＬＳ−１０６、ＬＳ−１１０（花王株式会社）等が例示される。界面活性剤の溶解性の観点からは、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル系非イオン性界面活性剤が好ましい。商品名としてはＴｘ−１００、エマルゲン ９０９、エマルゲン ９１０、エマルゲン９１１（花王株式会社）、ＮＩＫＫＯＬ ＯＰ−３、ＮＩＫＫＯＬ ＯＰ−１０、ＮＩＫＫＯＬ ＯＰ−３０（日光ケミカルズ株式会社）、ノニオンＨＳ−２０８、ＨＳ−２１０、ＨＳ−２０８、ＨＳ−２０８．５、ＮＳ２１０（日油株式会社）等が例示される。環境負荷低減や健康被害防止を理由に１９９０年代末頃からＮＰＥの代替法が広く検討されており（ノニルフェノール及びノニルフェノールエトキシレートのリスク管理の現状と今後のあり方 独立行政法人 製品評価技術基盤機構(http://www.nite.go.jp/data/000010070.pdf)）、その観点で開発された、下記のカタログに記載の界面活性剤を選択してもよく（花王の界面活性剤 花王株式会社 ２０１２／８、製品総合カタログ 日光ケミカルズ株式会社等）、エマルゲン １１１８Ｓ−７０、エマルゲン １１５０Ｓ−６０が好ましい。また、複数種類の界面活性剤を混合して用いてもよい。
本実施形態において、界面活性剤の使用濃度は特に限定されず、使用する界面活性剤の種類に応じて適宜設定することができるが、０．２％以下が例示され、０．１％以下が好ましい。
本実施形態において、測定の安定性、正確性、及び特異性を上げるために、蛋白質・酵素の基礎実験法（改訂第２版、堀尾武一、１９９４年南光堂）や同人化学研究所社の第３０版総合カタログに記載の「キレート剤」を使用する場合がある。そのような「キレート剤」としては、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＮＡＴ及びクエン酸やコハク酸などの有機酸等が挙げられ、その種類や濃度は限定されない。例えばＥＤＴＡを含有する場合の濃度は、通常は０．０５ｍＭ以上１０ｍＭ以下の範囲である。キレート剤は、金属を活性発現に利用するプロテアーゼが組成物内容物中に混在する場合、該活性を阻害する作用により、組成物中の酵素の安定化剤として機能し得る。
本実施形態において、測定試薬を組成物とする場合、組成物の安定性を上げるために「安定化剤」を使用する場合がある。そのような「安定化剤」として、牛アルブミン、卵アルブミン、ヒトアルブミン、クリスタリン等の触媒作用をもたないタンパク質が使用でき、その種類や濃度は限定されない。例えば牛アルブミンを含有する場合、通常その含有量は０．０１（ｗ／ｖ）％以上５（ｗ／ｖ）％以下の範囲である。これらのタンパク質はプロテアーゼの基質となるため、酵素の安定化剤となる場合がある。また、組成物を凍結乾燥する場合には賦型剤として機能し得る。
本実施形態において、測定試薬を組成物とする場合、組成物の安定性を上げるために「糖」を使用する場合がある。そのような「糖」としては、マンニトール、トレハロース、シクロデキストリン等が挙げられ、その濃度は溶解可能な範囲内であれば限定されない。例えばシュークロースを含有する場合、０．０５（ｗ／ｖ）％以上、好ましくは０．１（ｗ／ｖ）％以上、更に好ましくは０．３（ｗ／ｖ）％以上であり、上限値は３０（ｗ／ｖ）％以下、好ましくは１０（ｗ／ｖ）％以下、更に好ましくは５（ｗ／ｖ）％以下である。また、これらの「糖」は、組成物を凍結乾燥する場合には賦型剤として機能し得る。
本実施形態において、測定試薬を組成物とする場合、組成物の変敗や変質等を防ぐために「防腐剤」が使用でき、その種類や濃度は限定されない。例えばアジ化ナトリウムやプロクリン（品番４８９１１−Ｕ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用する場合、０．００５（ｗ／ｖ）％以上、好ましくは０．０１（ｗ／ｖ）％以上、更に好ましくは０．０３（ｗ／ｖ）％以上が例示され、上限値は１（ｗ／ｖ）％以下、好ましくは０．５（ｗ／ｖ）％以下、更に好ましくは０．１（ｗ／ｖ）％以下が例示される。例えば抗生物質を使用する場合、下限値は５μｇ／ｍＬ以上、好ましくは１０μｇ／ｍＬ以上、更に好ましくは３０μｇ／ｍＬ以上が例示され、上限値は１００μｇ／ｍＬ以下、好ましくは７５μｇ／ｍＬ以下、更に好ましくは６０μｇ／ｍＬ以下が例示される。
本実施形態の一態様において、Ｌｐ−ＰＬＡ２活性を測定するための組成物は、液状品、液状品の凍結物、液状品の凍結乾燥品又は液状品の乾燥品（加熱乾燥及び／又は風乾及び／又は減圧乾燥等による）等の形態で提供することができる。また、例えば、ポイントオブケア装置のキャピラリーへの使用又は酵素センサーとしての使用の場合、各成分の濃度は通常よりも高い濃度が好ましく、例えば、固定化したり、紙や膜に染み込ませたり、ゲル・ゾル状検査試薬キットとしたりして使用することが好ましい。
本実施形態における上記組成物は、組成物中の各成分を単一の組成物としてもよいが、２以上の組成物に分離することもできる。このような２以上の組成物を合わせてキットという場合もある。
本実施形態は、一態様において、リゾＰＡＦ−ＰＬＤ及びＰＡＦ類を含む、試料中のＬｐ−ＰＬＡ２活性を測定するキットを提供する。
本実施形態におけるキットは、更に少なくとも既知量のＬｐ−ＰＬＡ２を含むキャリブレーション試薬とともに用いるキットとしてもよい。上記のキャリブレーション試薬としては、例えば、少なくとも既知量のＬｐ−ＰＬＡ２を含む試薬が挙げられ、好ましくは上述の活性化剤、塩、界面活性剤、安定化剤、キレート剤、糖又は防腐剤等の１又は複数を更に含む。例えば、市販品としてはＴｒｕＣａｌ Ｌｉｐｉｄ（Ｄｉａｓｙｓ社製）等が挙げられる。これらの試薬の成分の種類や濃度等の条件等は、当業者であれば適宜決定することができる。上記試薬を用いたキャリブレーション方法としては、一点検量の他、多点検量（折れ線やスプライン）や多点検量の直線回帰などを適宜選択することができる。
キャリブレーション試薬中のＬｐ−ＰＬＡ２の既知量は特に限定されず、試料中のＬｐ−ＰＬＡ２を正確に測定することができるよう適宜選択すればよい。試料が被験者の血清または血漿である場合、キャリブレーション試薬中のＬｐ−ＰＬＡ２の既知量の下限値は５Ｕ／Ｌ以上、好ましくは１０Ｕ／Ｌ以上、更に好ましくは１５Ｕ／Ｌ以上、上限値は６００Ｕ／Ｌ以下、好ましくは３００Ｕ／Ｌ以下、更に好ましくは１５０Ｕ／Ｌ以下とすることができる。なお、これらの値は試薬組成、温度、測定波長、副波長などの測定条件や活性値の定義で異なる場合がある。
一態様において、キャリブレーション試薬中のＬｐ−ＰＬＡ２の既知量（既知濃度）は、より多くの試料の測定値が検量線の範囲内に入るという観点からは高濃度に設定することが好ましく、試料の測定値の正確度（ａｃｃｕｒａｃｙ）を高めるという観点からは試料のＬｐ−ＰＬＡ２濃度最頻値（例えば、試料がヒト由来の血清又は血漿である場合、約２０Ｕ／Ｌ）付近に設定することが好ましい。
キャリブレーション試薬中のＬｐ−ＰＬＡ２の既知量を高濃度にする方法としてはリコンビナント（組換体）Ｌｐ−ＰＬＡ２を添加する方法（ＷＯ ２０１５／０４８１７７）が例示される。また、リコンビナントＬｐ−ＰＬＡ２を使用しない場合（例えば、天然のヒト型Ｌｐ−ＰＬＡ２を使用する場合）、Ｌｐ−ＰＬＡ２濃度が高いと想定される試料（例えば、ヒト由来の血清、血漿等）をそのまま、あるいはプールして、キャリブレーション試薬を調整することができる。Ｌｐ−ＰＬＡ２濃度が高いと想定される試料は、Ｌｐ−ＰＬＡ２濃度と相関が高いと報告されている、ＬＤＬ−Ｃ（ＬＤＬコレステロール）や体重を参考に選択することができる（非特許文献１）。また、ヒト型Ｌｐ−ＰＬＡ２を精製したり、凍結乾燥などにより濃縮したりして使用することもできる。
Ｌｐ−ＰＬＡ２濃度最頻値付近のキャリブレーション試薬を調製する場合、一般の試料（ヒト由来の血清又は血漿等）またはそれらをプールして使用すればよい。そのようなキャリブレーション試薬の一例として、後述の実施例に記載の血清プールＪ０４２−ＩＩが挙げられる。なお、キャリブレーション試薬はキャリブレーターという場合もある。また、（Ｕ／Ｌ）を（ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍＬ）と表現する場合もある。
このようなキャリブレーション試薬に使用するＬｐ−ＰＬＡ２はヒト型Ｌｐ−ＰＬＡ２が望ましいが、反応性が一致すれば動物由来などを用いることもできる。
本実施形態におけるキットは、１試薬系でもよく、２試薬系以上であってもよく、２試薬系が好ましい。２試薬系とする場合、一態様において、経済的観点及び各試薬の組成を簡素化して測定条件の設定を簡便に行うという観点から、第一試薬にリゾＰＡＦ−ＰＬＤ、第二試薬にＰＡＦ類を含むキットとすることが好ましい。更に、コリンオキシダーゼを第１試薬に含むキットとすることがより好ましい。
本実施形態の一態様において、キットを２試薬系とする場合、リゾＰＡＦ−ＰＬＤは第１試薬及び第２試薬の両方に含めることができ、第１試薬のみに含めることが好ましい。また、リゾＰＡＦ−ＰＬＤは第１試薬にではなく、第２試薬に含めることによっても実施できる。この際に、ＰＬＡ１活性を有する酵素及びＧＰＣＰを第１試薬に更に加えてもよい。ＰＬＡ１活性を有する酵素としてはＰＡＦには作用せず血清中のリゾリン脂質（リゾホスファチジルコリン等）を分解する酵素であればよく、例えばＭＧＬＰＩＩ、ＬＹＰＬが挙げられ、ＭＧＬＰＩＩが好ましい。
なお、後述の実施例２２及び２３に示すとおり、本実施形態の一態様において、第１試薬及び第２試薬を調製後、長期間（例えば、４℃で１８ヶ月、３７℃で２週間、等）保存後であっても、Ｌｐ−ＰＬＡ２活性を簡便かつ高感度に測定することができる。
キットは更にコリンオキシダーゼを含んでいてもよい。本実施形態の一態様において、コリンオキシダーゼは第１試薬及び第２試薬の両方に含めることができ、測定感度の観点から、第１試薬のみに含めることが好ましい。第１試薬にコリンオキシダーゼを含ませることで、試料中に予め含まれるコリンを除去することができる。なお、第１試薬ではなく、第２試薬に入れることによっても測定を実施することができる。
キットは更にペルオキシダーゼ、及び発色試薬を含んでいてもよい。本実施形態の一態様において、ペルオキシダーゼは第１試薬及び第２試薬の何れに含まれてもよい。本実施形態の一態様において、発色試薬としてロイコ型試薬を用いる場合、第１試薬及び第２試薬の何れに含まれてもよい。また、発色試薬としてカップラー及びトリンダー型試薬を用いる場合、両者が第１試薬と第２試薬に分かれて含まれていれば、いずれに含まれてもよい。
キットは更に、前記緩衝液、前記活性化剤、前記塩、前記界面活性剤、前記安定化剤、前記キレート剤、前記酵素、前記糖又は前記防腐剤等の酵素の活性測定用組成物に一般に用いられているものを更に追加して使用してもよい。
本実施形態の測定方法、組成物及びキットによれば、リゾＰＡＦ−ＰＬＤの基質特異性を利用して、汎用の生化学自動分析機を使用してＬｐ−ＰＬＡ２活性ができ、また、２試薬系で測定可能であることから、汎用性が高く簡便な測定方法を提供することができる。更に、放射性同位元素等を使用せずにＬｐ−ＰＬＡ２活性を測定できることから、安全な測定方法を提供することができる。更に、Ｌｐ−ＰＬＡ２の本来の基質であるＰＡＦを使用し、Ｌｐ−ＰＬＡ２の物質量ではなくその活性値を測定する方法であることから、生体内のＬｐ−ＰＬＡ２活性を正確に反映し得る測定方法を提供することができる。
本実施形態はまた、前記組成物又はキットを含む、Ｌｐ−ＰＬＡ２が関与する疾患及び／又は状態の診断用キットに関する。本実施形態は、更に、前記キットを用いた、Ｌｐ−ＰＬＡ２が関与する疾患又は状態の診断及び管理に関する。Ｌｐ−ＰＬＡ２は様々な疾患や炎症と関連する因子として考えられており、欧米の各種ガイドラインにも掲載されている（（１）ＡＣＣＦ／ＡＨＡ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ ｆｏｒ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｒｉｓｋ ｉｎ Ａｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ Ａｄｕｌｔｓ（２０１０）、（２）ＡＨＡ／ＡＳＡ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔｒｏｋｅ（２０１１）、（３）ＡＡＣＥ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ ｆｏｒ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｄｙｓｌｉｐｉｄｅｍｉａ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ（２０１２），（４）Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ ｏｎ ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｉｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｒａｃｔｉｃｅ（２０１２））本実施形態のキットにより診断及び／又は管理することができる、Ｌｐ−ＰＬＡ２が関与する疾患又は状態としては、心血管疾患、炎症性疾患、腎疾患、敗血症、癌等が挙げられ、心血管疾患としてはアテローム性動脈硬化症や脳卒中等が挙げられ、一態様において、アテローム性動脈硬化に伴う心血管疾患が好ましい。
以下、本発明を実施例及び参考例（以下、「実施例等」と呼ぶことがある。）により更に具体的に説明するが、本発明の範囲は以下の実施例等に限定されるものではない。例えば、本実施例等における「本発明試薬」とは、本発明の一具体例にすぎず、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
文中の略語は下記の意味を示す。
ＰＬＤ：ホスフォリパーゼ Ｄ（Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ｄ）
ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸（Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）
Ｔｒｉｓ：２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（２−Ａｍｉｎｏ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ−１,３−ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌ）
Ｔｘ−１００：トリトンＸ−１００（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）
ＣＶ：カラムボリューム（Ｃｏｌｕｍｎ Ｖｏｌｕｍｅ）
ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ）
ＰＡＧＥ：ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｐｏｌｙ Ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ Ｇｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）
ＡＳＯＭ：アスコルビン酸オキシダーゼ（Ａｓｃｏｒｂａｔｅ Ｏｘｉｄａｓｅ）
ＴＯＤＢ：Ｎ，Ｎ−ビス（４−スルホブチル）−３−メチルアニリン ２ナトリウム（Ｎ,Ｎ−Ｂｉｓ（４−ｓｕｌｆｏｂｕｔｙｌ）−３−ｍｅｔｈｙｌａｎｉｌｉｎｅ, ｄｉｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ）
４−ＡＡ：４−アミノアンチピリン（４−Ａｍｉｎｏａｎｔｉｐｙｒｉｎｅ）
ＳＲ比：試料（Ｓａｍｐｌｅ）と試薬（Ｒｅａｇｅｎｔ）量の比
ｒＬｐ−ＰＬＡ２：組換え体Ｌｐ−ＰＬＡ２（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｌｐ−ＰＬＡ２）
Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ：ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｉｍｉｎｏｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈａｎｅ）
ＨＥＰＥＳ：２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸（２−［４−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）
ＭＯＰＳ：３−モルホリノプロパンスルホン酸（３−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）
ＴＥＳ：Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（Ｎ−Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）
ＰＩＰＥＳ：ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）（Ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−１,４−ｂｉｓ（２−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ））
ＰＣ：ホスフォコリン（ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ）
ＦＴＵ：ホルマジン濁度（Ｆｏｒｍａｚｉｎ Ｔｕｒｂｉｄｉｔｙ Ｕｎｉｔ）
本実施例等で使用した試薬は下記の製造元から適宜購入して用いた。
１）Ｔｒｉｓ（和光純薬社製）
２）ＥＤＴＡ（同仁化学研究所社製）
３）ＫＣｌ（和光純薬社製）
４）Ｔｘ−１００（和光純薬工業社製）
５）ＣａＣｌ２（和光純薬社製）
６）ＡＳＯＭ（Ｔ−５３，旭化成ファーマ社製）
７）ＴＯＤＢ（同仁化学研究所社製）
８）ペルオキシダーゼ（ＳＩＧＭＡ社製）
９）４−ＡＡ（和光純薬工業社製）
１０）コリンオキシダーゼ（Ｔ−０５，旭化成ファーマ社製）
１１）Ｃ１６−０２:０ ＰＣ（１−Ｏ−ｈｅｘａｄｅｃｙｌ−２−ａｃｅｔｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ）（品番：８７８１１０Ｐ，Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ社製）。以下ＰＡＦ（Ｃ１６）と呼ぶ。
１２）Ｃ１６ Ｌｙｓｏ ＰＡＦ（１−Ｏ−ｈｅｘａｄｅｃｙｌ−２−ｈｙｄｒｏｘｙ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ）（品番：８７８１１９Ｐ，Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ社製）。以下リゾＰＡＦ（Ｃ１６）と呼ぶ。
１３）Ｃ１８−０２:０ ＰＣ（１−Ｏ−ｏｃｔａｄｅｃｙｌ−２−ａｃｅｔｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ）（品番：８７８１１４Ｐ，Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ社製）。以下ＰＡＦ（Ｃ１８）と呼ぶ。
１４）ＰＡＦ（ｆｒｏｍ Ｈｅａｒｔ ＰＣ）（１−ａｌｋｙｌ−２−ａｃｅｔｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ）（品番：８４０００９Ｐ，Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ社製）。以下、天然ＰＡＦと呼ぶ。
１５）１６:０−０２：０ ＰＣ（１−ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−２−ａｃｅｔｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ（品番：８８０６２２Ｃ，Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ社製）
１６）プロクリンＴＭ３００（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製）
１７）フェロシアン化カリウム（和光純薬社製）
１８）Ｌ（＋）−アスコルビン酸（和光純薬社製）
本実施例において、試薬に使用している組換え体リゾＰＡＦ−ＰＬＤは、後述の参考例１〜３の方法で製造した。また、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ由来のコリンオキシダーゼ（Ｔ−０５）の組換え体（以降、組換え体コリンオキシダーゼとする）は、本明細書及び本明細書の参考文献（田村隆明（２０１２）．基礎から学ぶ遺伝子工学）などに記載される技術に倣って製造した。Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｍｏｎｏｓｐｏｒｕｓ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｇｌａｕｃａと呼ばれる場合もある）由来のコリンオキシダーゼ（以降、組換え体コリンオキシダーゼＩＩＩとする）は特開平５−３１７０５６で開示された方法で製造した。また、ラセミ体ＰＡＦ（Ｃ１６）は、１−Ｏ−Ｈｅｘａｄｅｃｙｌ−ｒａｃ−ｇｌｙｃｅｒｏｌを出発原料として、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９５年６０巻７７０６−７７０８頁で開示された方法に従って合成した。
本実施例で試料として使用した血清や血漿は、下記の製造元、販売元、提供元より入手したものを使用した。社内ボランティア血清は、医師、看護師の協力の元、インフォームドコンセントを得て採取した。
個人血清（Ｎｏ１〜３２及び７８）：ビジコムジャパン株式会社
血清プールＡ〜Ｄ、ヘパリン血漿プール、クエン酸血漿プール（コージンバイオ株式会社）及びＢＪプール（ビジコムジャパン株式会社）
血清プールＪ０４２、血清プールＪ０４２−ＩＩ：日本臨床検査標準協議会（ＪＣＣＬＳ）
個人血清Ａ〜Ｅ：社内ボランティア血清
本実施例で使用した組換え体Ｌｐ−ＰＬＡ２（ｒＬｐ−ＰＬＡ２）はJ. Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９５年１０月２７日第４３号２７０巻２５４８１−２５４８７頁で開示された情報を元に、参考例４〜６に従って製造した。
本実施例における活性測定には、７０８０形日立自動分析装置、７６００−０１０Ｓ形日立自動分析装置、又は７１７０形日立自動分析装置（日立ハイテクノロジーズ株式会社）を用いた。分析法、測光ポイントなどの各パラメーターに関する詳細情報は、各装置のマニュアルを参照した。
本実施例では、特に断りがない限り、下記の１）に記載のＬｐ−ＰＬＡ２活性値の算出方法１を使う。なお本実施例において、（ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍＬ）を（Ｕ／Ｌ）と表現する場合もある。
１）Ｌｐ−ＰＬＡ２活性値の算出方法１（特に断りがない場合）
測光ポイントにおける吸光度より算出された１分間当たりの吸光度変化の値（ΔｍＡｂｓ／ｍｉｎ）と、ＴＯＤＢの５４６ｎｍにおけるミリモル吸光係数ε＝３６より、以下の式によって算出する。
Ｌｐ−ＰＬＡ２活性値（ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍＬ）
＝｛（ΔＡｂｓ／ｍｉｎ）／ＴＯＤＢミリモル吸光係数｝÷｛（試料量）／（試料量＋Ｒ１試薬量＋Ｒ２試薬量）｝×１０００
＝｛（ΔｍＡｂｓ／ｍｉｎ）／３６｝÷｛（試料量）／（試料量＋Ｒ１試薬量＋Ｒ２試薬量）｝
２）Ｌｐ−ＰＬＡ２活性値の算出方法２（キャリブレーターを使用する場合）
既知濃度のキャリブレーターと、同時に測定した蒸留水を０（ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍＬ（Ｕ／Ｌ））とする一点検量（二点検量という場合もある）を選択し、検量線から、試料におけるＬｐ−ＰＬＡ２活性値（ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍＬ）を算出する。
［参考例１］
＜Ｔｈｅｒｍｏｃｒｉｓｐｕｍ ｓｐ．由来リゾＰＡＦ−ＰＬＤを産生する形質転換体の製造＞
Ｔｈｅｒｍｏｃｒｉｓｐｕｍ ｓｐ．（ＮＩＴＥ ＢＰ−０１６２８としてブダペスト条約に基づき国際寄託。寄託機関：独立行政法人製品評価技術基盤機構、特許微生物寄託センター。住所：２９２−０８１８ 日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８ １２２号室。寄託日：２０１３年５月１７日）より取得した染色体ＤＮＡを、フェノール・クロロホルム法にて抽出した。配列番号３に記載の塩基配列をセンスプライマー、配列番号４に記載の塩基配列をアンチセンスプライマーとして、ＫＯＤ ＦＸ（品番：ＫＦＸ−１０１，東洋紡社製）を用いてＰＣＲを行い、約９２０ｂｐのＰＣＲ産物を得た。得られたＰＣＲ産物をＮｄｅＩ（タカラバイオ社製）とＥｃｏＲＩ（タカラバイオ社製）で消化し、発現ベクターであるｐＥＴ−２１ａ（＋）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＩ部位に挿入して、リゾＰＡＦ−ＰＬＤ／ｐＥＴ２１ａ（＋）発現用プラスミドを得た。上記発現プラスミドをＯｎｅ ｓｈｏｔ ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に形質転換し、リゾＰＡＦ−ＰＬＤをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドを含む組換えベクターを有する形質転換体、リゾＰＡＦ−ＰＬＤ／ｐＥＴ−２１ａ（＋）／ＢＬ２１（ＤＥ３）を得た。
［参考例２］
＜組換え体リゾＰＡＦ−ＰＬＤを産生する形質転換体の培養と菌体の可溶化＞
参考例１に記載の形質転換体１コロニーを５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む液体ＬＢ培地５ｍＬに植菌し、試験管にて２５℃で１６時間培養してシードとした。上記のシードを５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む液体培地（１％グリセロール入りＯｖｅｒｎｉｇｈｔ ＥｘｐｒｅｓｓＴＭＩｎｓｔａｎｔ ＴＢ Ｍｅｄｉｕｍ、０．１％アデカノールＬＧ−１０９（ＡＤＥＫＡ社製））１．６Ｌに１／１０００量植菌し、ジャーファーメンターにて３４℃、ｐＨ６．８、６５０ｒｐｍの条件で２６時間培養した。培養液を遠心分離して集菌した後、菌体を溶液Ａ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５），１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ９．０），０．１％ Ｔｘ‐１００，０．１％リゾチーム塩酸塩（製造番号：３６Ａ５５Ｋ，エーザイ社製））に溶解し、５０℃で３０分間反応させた。溶液Ａにより菌体を可溶化した後、遠心分離し、得られた上清を粗酵素液とした。
［参考例３］
＜組換え体リゾＰＡＦ−ＰＬＤの精製＞
参考例２で得られた粗酵素液を、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）溶液で平衡化したＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｂｉｇ Ｂｅａｄｓ（ＧＥヘルスケア社製）を充填したカラムに吸着させた。その後１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）溶液と０．５ＭのＫＣｌを含む１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）溶液を用いた１０ＣＶのリニアグラジエントにより溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて組換え体リゾＰＡＦ−ＰＬＤの溶出画分を確認した後、溶出画分の溶液をペンシル型モジュール（ＵＦ）（旭化成ケミカルズ社製）で１／１０量となるまで濃縮し、３ＭのＫＣｌを添加した。３ＭのＫＣｌを添加したリゾＰＡＦ−ＰＬＤを含む溶液を、３ＭのＫＣｌを含む１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）溶液で平衡化したＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ｈｉｇｈ ｓｕｂ）（ＧＥヘルスケア社製）を充填したカラムに吸着させ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）溶液と３ＭのＫＣｌを含む１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）溶液を用いた１０ＣＶのリニアグラジエントにより溶出した。溶出画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて確認後回収し、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５遠心式フィルターユニット（ミリポア社製）で濃縮した後、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）溶液で透析した。透析後の溶液を、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）溶液で平衡化したＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（ＧＥヘルスケア社製）を充填したカラムに吸着させた。その後１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）と０．５ＭのＫＣｌを含む１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）溶液を用いた１２ＣＶのリニアグラジエントにより溶出した。溶出画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて確認後回収し、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５遠心式フィルターユニット（ミリポア社製）で濃縮後、ＰＤ−１０カラム（ＧＥヘルスケア社製）で脱塩することで配列番号９に記載の組換え体リゾＰＡＦ−ＰＬＤの酵素溶液を得た。
［参考例４］
＜ヒト由来Ｌｐ−ＰＬＡ２を産生する形質転換体の製造＞
ヒトのＬｐ−ＰＬＡ２の遺伝子の配列情報を元に、大腸菌型に最適化した（大腸菌型のコドンユーセージに合わせた）遺伝子を合成した（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社（ＮＪ、ＵＳＡ））。合成ＤＮＡをテンプレートとし、４２番目のイソロイシンを開始メチオニンの配列に変更した配列番号５に記載の塩基配列をセンスプライマー、配列番号６に記載の塩基配列をアンチセンスプライマーとして、ＫＯＤ ＦＸ（東洋紡社製）を用いてＰＣＲを行い、約１２００ｂｐのＰＣＲ産物を得た。得られたＰＣＲ産物をＮｄｅＩ（タカラバイオ社製）とＢａｍＨＩ（タカラバイオ社製）で消化し、発現ベクターであるｐＥＴ−１９ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ部位に挿入して、Ｌｐ−ＰＬＡ２／ｐＥＴ−１９ｂ発現用プラスミドを得た。上記発現プラスミドをＯｎｅ ｓｈｏｔ ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉに形質転換し、Ｎ末にベクター由来のヒスチジンタグが付加されたＬｐ−ＰＬＡ２をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドを含む組換えベクターを有する形質転換体、Ｌｐ−ＰＬＡ２／ｐＥＴ−１９ｂ／ＢＬ２１（ＤＥ３）を得た。
［参考例５］
＜組換え体Ｌｐ−ＰＬＡ２を産生する形質転換体の培養と菌体の可溶化＞
参考例４に記載の形質転換体１コロニーを５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む液体ＬＢ培地５ｍＬに植菌し、試験管にて２５℃で１６時間培養してシードとした。上記のシードを５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む液体培地（１％グリセロール入りＯｖｅｒｎｉｇｈｔ ＥｘｐｒｅｓｓＴＭＩｎｓｔａｎｔ ＴＢ Ｍｅｄｉｕｍ）０．８Ｌに１／１０００ 量植菌し、フラスコにて３０℃で２４時間培養した。培養液を遠心分離して集菌した後、菌体を０．３ＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭのリン酸カリウム溶液（ｐＨ７．０）に溶解し、超音波破砕を行った。超音波破砕による菌体の可溶化の後、遠心分離し、得られた上清を粗酵素液とした。
［参考例６］
＜組換え体Ｌｐ−ＰＬＡ２（ｒＬｐ−ＰＬＡ２）の精製＞
参考例５で得られた粗酵素液を０．３ＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭのリン酸カリウム溶液（ｐＨ７．０）で平衡化したＣｈｅｌａｔｉｎｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（ＧＥヘルスケア社製）を充填したカラムに吸着させた。その後０．３ＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭのリン酸カリウム溶液（ｐＨ７．０）と、４００ｍＭのイミダゾール及び０．３ＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭのリン酸カリウム溶液（ｐＨ７．０）を用いたリニアグラジエントにより溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで組換え体Ｌｐ−ＰＬＡ２の溶出画分を確認した後、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で一晩透析し、１／６５量になるまでＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５（３０Ｋ）遠心式フィルターユニット（ミリポア社製）で濃縮した。
［参考例７］
＜大腸菌由来ＧＰＣＰを産生する形質転換体の製造＞
大腸菌Ｋ株において、ＧＰＣＰ活性を有するｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ ｄｉｅｓｔｅｒ ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ（ＧｌｐＱ）の遺伝子の配列情報を元に、大腸菌ＬＥ３９２株（国立遺伝学研究所より譲渡）をテンプレートとし、配列番号７に記載の塩基配列をセンスプライマー、配列番号８に記載の塩基配列をアンチセンスプライマーとして、ＫＯＤ ＦＸ（東洋紡社製）を用いてＰＣＲを行い、約１０００ｂｐのＰＣＲ産物を得た。得られたＰＣＲ産物をＮｈｅＩ（タカラバイオ社製）とＥｃｏＲＩ（タカラバイオ社製）で消化し、発現ベクターであるｐＥＴ−２１ａ（＋）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＮｈｅＩ−ＥｃｏＲＩ部位に挿入して、ＧＰＣＰ／ｐＥＴ−２１ａ（＋）発現用プラスミドを得た。上記発現プラスミドをＯｎｅ ｓｈｏｔ ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉに形質転換し、ＧＰＣＰをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドを含む組換えベクターを有する形質転換体、ＧＰＣＰ／ｐＥＴ−２１ａ（＋）／ＢＬ２１（ＤＥ３）を得た。
［参考例８］
＜組換え体ＧＰＣＰを産生する形質転換体の培養と菌体の可溶化＞
参考例７で得られた形質転換体１コロニーを５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む液体ＬＢ培地５ｍＬに植菌し、試験管にて３０℃で１６時間培養してシードとした。上記のシードを５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む液体培地（１％グリセロール入りＯｖｅｒｎｉｇｈｔ ＥｘｐｒｅｓｓＴＭＩｎｓｔａｎｔ ＴＢ Ｍｅｄｉｕｍ）６００ｍＬに１／１０００量植菌し、フラスコで３４℃、２４時間培養した。培養液を遠心分離して集菌した後、菌体を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に溶解し、超音波破砕を行った。超音波破砕による菌体の可溶化の後、遠心分離し、得られた上清を粗酵素液とした。
［参考例９］
＜組換え体ＧＰＣＰの精製＞
参考例８で得られた粗酵素液を、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）溶液で平衡化したＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア社製）を充填したカラムに吸着させた。その後１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）溶液と０．５ＭのＫＣｌを含む１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）溶液を用いた１０ＣＶのリニアグラジエントにより溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて組換え体ＧＰＣＰの溶出画分を確認し、１８％の硫酸アンモニウムを添加した。１８％の硫酸アンモニウムを添加したＧＰＣＰを含む溶液を、１８％の硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）溶液で平衡化したＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ｈｉｇｈ ｓｕｂ）を充填したカラムに吸着させ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）溶液と１８％の硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）溶液を用いた１０ＣＶのリニアグラジエントにより溶出した。溶出画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて確認後回収し、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５遠心式フィルターユニット（ミリポア社製）で濃縮した後、ＰＤ−１０カラムで脱塩して組換え体ＧＰＣＰ酵素溶液を得た。
［参考例１０］
＜リゾＰＡＦ−ＰＬＤの熱安定性試験＞
精製したリゾＰＡＦ−ＰＬＤを２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）溶液中において、各温度で６０分間インキュベートし、以下の反応液により残存活性を調べた。基質として、Ｃ１８（Ｐｌａｓｍ）ＬＰＣ（品番：８５２４６５Ｐ，Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ社製）を用いた。

（反応液組成）
８０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）
０．４ ｍＭ 基質
２ ｍＭ ＣａＣｌ２

（発色液組成）
０．０３％ ４−ＡＡ
０．０２％ ＴＯＤＢ
０．７５ Ｕ／ｍＬ コリンオキシダーゼ（Ｔ−０５，旭化成ファーマ社製）
５ Ｕ／ｍＬ ペルオキシダーゼ
１０ ｍＭ ＥＤＴＡ

５０μＬの反応液を３７℃、５分間プレインキュベートし、酵素液を５μＬ添加した後、５０℃で１分間酵素反応を行った。その後、２００μＬの発色液を添加し３７℃で１０分間反応後５５０ｎｍでの吸光度を測定した。活性値は以下の式により算出した。
リゾＰＡＦ−ＰＬＤ活性値（Ｕ／ｍＬ）
＝｛（ΔＡｂｓ／ｍｉｎ）／５５０ｎｍでのＴＯＤＢのミリモル分子吸光係数｝÷｛（試料量）／（試料量＋Ｒ１試薬量＋Ｒ２試薬量）｝
＝｛（ΔＡｂｓ／ｍｉｎ）／３９｝÷｛（試料量）／（試料量＋Ｒ１試薬量＋Ｒ２試薬量）｝
４℃保存での活性値を１００％とした時の各温度における残存活性を図１に示した。
［参考例１１］
＜キャリブレーション試薬の調製＞
血清プールＪ０４２−ＩＩをキャリブレーション試薬（キャリブレーター）とするため、血清プールＪ０４２−ＩＩ中のＬｐ−ＰＬＡ２活性（ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍＬ（Ｕ／Ｌ））をｎ＝５で５日間測定し、その平均値をＬｐ−ＰＬＡ２の既知量（既知濃度）として値付けした。試薬組成は以下のとおりである。
（本発明試薬）
＜Ｒ１試薬＞
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．８）
０．２ｍＭ ＣａＣｌ２
４Ｕ／ｍＬ ＡＳＯＭ
０．０５％ プロクリン３００
１．６μＭ フェロシアン化カリウム
０．０５％ エマルゲン１１５０Ｓ−６０
３．３Ｕ／ｍＬ 組換え体リゾＰＡＦ−ＰＬＤ
０．１ｍＭ ＥＤＴＡ
７５ｍＭ ＮａＣｌ
３％ トレハロース
１０μＭ ＦＡＤ（フラビンアデニンジヌクレオチド）
０．０２％ ＴＯＤＢ
４Ｕ／ｍＬ ペルオキシダーゼ
４Ｕ／ｍＬ 組換え体コリンオキシダーゼＩＩＩ

＜Ｒ２試薬＞
５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ（ｐＨ ７．０）
０．２ｍＭ ＣａＣｌ２
０．０５％ プロクリン３００
０．０５％ エマルゲン１１５０Ｓ−６０
０．１ｍＭ ＥＤＴＡ
０．２５％ ＫＣｌ
０．１３％ シュークロース
０．０８％ ４−ＡＡ
２ｍＭ ラセミ体ＰＡＦ（Ｃ１６）
（試料）
血清プールＪ０４２−ＩＩ
（活性測定）
活性の測定には７１７０形日立自動分析装置を使用した。測定パラメーターを以下に示す。
（７１７０形日立自動分析装置測定パラメーター）
分析方法 Ｒａｔｅ Ａ
測定波長（副／主） ６６０ｎｍ／５４６ｎｍ
反応時間 １０分
測光ポイント ３０−３３
試料量 ４μＬ
Ｒ１試薬量 １６０μＬ
Ｒ２試薬量 ４０μＬ
４μＬの試料と１６０μＬのＲ１試薬を混合して３７℃で５分間インキュベートした後（測光ポイント１−１６）、４０μＬのＲ２試薬を添加して反応を開始した（測光ポイント１７）。Ｒ２試薬の添加による反応開始後約３．６−４．５分（測光ポイント３０−３３）の試料の吸光度から、水（ブランク）の同測光ポイントにおける吸光度を差し引き、１分間当たりの吸光度変化の値（ΔｍＡｂｓ／ｍｉｎ）を算出した。Ｌｐ−ＰＬＡ２活性値（ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍＬ）は前記式に従って算出した。
測定の結果、血清プールＪ０４２−ＩＩ中のＬｐ−ＰＬＡ２量（濃度）は、２３．１（ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍＬ（Ｕ／Ｌ））（標準偏差（ＳＤ）＝０．３６（ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍＬ（Ｕ／Ｌ））であり、これを既知量（既知濃度）として値付けした。血清プールを使用したキャリブレーション試薬（キャリブレーター）を調製することができた。なお、このキャリブレーション試薬の実用性は実施例２４などで確認された。
［実施例１］
＜組換え体リゾＰＡＦ−ＰＬＤの特異性＞
参考例３で精製した組換え体リゾＰＡＦ−ＰＬＤの特異性を調べるため、ＰＡＦ（Ｃ１６）及びリゾＰＡＦ（Ｃ１６）に対する活性を調べた。試薬の組成は以下のとおりである。
（本発明試薬）
＜Ｒ１試薬＞
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）
１ｍＭ ＣａＣｌ２
４Ｕ／ｍＬ ＡＳＯＭ
０．１％ Ｔｘ−１００
０．０３％ ＴＯＤＢ
４Ｕ／ｍＬ ペルオキシダーゼ
５Ｕ／ｍＬ 組換え体コリンオキシダーゼ

＜Ｒ２試薬＞
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）
１ｍＭ ＣａＣｌ２
０．０４％ ４−ＡＡ
０．１％ Ｔｘ−１００
０．１３ｍｇ／ｍＬ 組換え体リゾＰＡＦ−ＰＬＤ
（試料）
０〜０．５ｍＭのＰＡＦ（Ｃ１６）又はリゾＰＡＦ（Ｃ１６）を含む０．１％ Ｔｘ−１００溶液。
（活性測定）
活性の測定には７０８０形日立自動分析装置を使用した。測定パラメーターは以下に示す。
（７０８０形日立自動分析装置測定パラメーター）
分析方法 ２ポイントエンド
測定波長（副／主） ６６０ｎｍ／５４６ｎｍ
反応時間 １０分
測光ポイント １６−３１
試料量 ５μＬ
Ｒ１試薬量 １５０μＬ
Ｒ２試薬量 ５０μＬ
ＰＡＦ（Ｃ１６）又はリゾＰＡＦ（Ｃ１６）をそれぞれ０、０．１、０．２、０．３、０．４又は０．５ｍＭの濃度で含む５μＬの試料と１５０μＬのＲ１試薬を３７℃で５分間インキュベートした後（測光ポイント１−１５）、５０μＬのＲ２試薬を添加して５分間反応させた（測光ポイント１６−３１）。ＰＡＦを試料とした時の１０分間の反応時間の各測光ポイントにおける吸光度をプロットした結果を図２に、リゾＰＡＦを試料として同様にプロットした結果を図３に、それぞれ示した。
活性測定の結果、図２及び３に示すとおり、リゾＰＡＦを試料とした場合のみ、Ｒ２試薬添加後の吸光度が変化した。このことより、Ｒ２試薬中のリゾＰＡＦ−ＰＬＤがリゾＰＡＦを加水分解してコリンが生じ、コリンの酸化で生じた過酸化水素による酸化還元発色反応が行われていることが示された。したがって、ＰＡＦとリゾＰＡＦは構造的に類似しているにもかかわらず、組換え体リゾＰＡＦ−ＰＬＤは、ＰＡＦに対してはＰＬＤ活性を示さず、リゾＰＡＦに対してのみＰＬＤ活性を示すことが明らかになった。
この組換え体リゾＰＡＦ−ＰＬＤの特異性を利用した、試料中のＬｐ−ＰＬＡ２活性の測定について検討した。より詳細には、試料にＰＡＦを添加し、試料中に含まれるＬｐ−ＰＬＡ２によってＰＡＦをリゾＰＡＦに加水分解した後、組換え体リゾＰＡＦ−ＰＬＤによってリゾＰＡＦを更に加水分解し、得られた加水分解生成物を測定する原理に基づく、試料中のＬｐ−ＰＬＡ２活性の測定について検討した。
以下実施例２〜１０においてＬｐ−ＰＬＡ２活性測定試薬の基本組成成分の検討を行っている。本実施例において高感度であるとは添加した試薬成分の条件により試薬中の酵素の反応が円滑に進行し、また１分間当たりの吸光度変化（感度）（ΔｍＡｂｓ／ｍｉｎ）の値が高く、算出されるＬｐ−ＰＬＡ２活性値（ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍＬ）が高くなることを指す。
［実施例２］
＜Ｌｐ−ＰＬＡ２活性測定試薬のｐＨ検討１（ｐＨ６．０〜９．０）＞
Ｌｐ−ＰＬＡ２活性測定試薬におけるｐＨの影響を検討するため、試薬のｐＨをＴｒｉｓ及びＢｉｓ−Ｔｒｉｓ（同仁化学研究所社製）を用いて６．０〜９．０まで０．５間隔で調整し、試料中のＬｐ−ＰＬＡ２活性を測定した。試薬の組成は以下のとおりである。
（本発明試薬）
＜Ｒ１試薬＞
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（各ｐＨ）
１ｍＭ ＣａＣｌ２
４Ｕ／ｍＬ ＡＳＯＭ
０．１％ Ｔｘ−１００
０．１３ｍｇ／ｍＬ 組換え体リゾＰＡＦ−ＰＬＤ
０．０３％ ＴＯＤＢ
４Ｕ／ｍＬ ペルオキシダーゼ
５Ｕ／ｍＬ 組換え体コリンオキシダーゼ

＜Ｒ２試薬＞
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（各ｐＨ）
１ｍＭ ＣａＣｌ２
０．０４％ ４−ＡＡ
０．５％ Ｔｘ−１００
１０ｍＭ ＰＡＦ（Ｃ１６）
（試料）
個人血清Ｎｏ１６、個人血清Ｎｏ７８。
（活性測定）
活性の測定には７０８０形日立自動分析装置を使用した。測定パラメーターは以下に示す。
（７０８０形日立自動分析装置測定パラメーター）
分析方法 Ｒａｔｅ Ａ
測定波長（副／主） ６６０ｎｍ／５４６ｎｍ
反応時間 １０分
測光ポイント ２３−２６
試料量 ３μＬ
Ｒ１試薬量 １５０μＬ
Ｒ２試薬量 １００μＬ
３μＬの試料と１５０μＬのＲ１試薬を混合して３７℃で５分間インキュベートした後（測光ポイント１−１５）、１００μＬのＲ２試薬を添加して反応を開始した（測光ポイント１６）。Ｒ２試薬の添加による反応開始後約２−３分（測光ポイント２３−２６）の試料の吸光度から、水（ブランク）の同測光ポイントにおける吸光度を差し引き、１分間当たりの吸光度変化の値（ΔｍＡｂｓ／ｍｉｎ）を算出し、前記の式に従ってＬｐ−ＰＬＡ２活性値（ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍＬ）を算出した。各ｐＨにおける１分間当たりの吸光度変化の値（感度）（ΔｍＡｂｓ／ｍｉｎ）とＬｐ−ＰＬＡ２活性値（ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍＬ）を表１及び２に示した。



測定の結果、表１、２よりｐＨ６．０〜９．０の範囲全てにおいて、Ｌｐ−ＰＬＡ２活性が測定可能であった。また、ｐＨ７．５〜８．０付近においてより高感度にＬｐ−ＰＬＡ２活性が測定可能であった。
［実施例３］
＜Ｌｐ−ＰＬＡ２活性測定試薬のｐＨ検討２（ｐＨ７．２５〜７．７５）＞
実施例２より、試薬のｐＨが７．５付近において最も高感度にＬｐ−ＰＬＡ２活性を測定できることが明らかになったので、ｐＨ７．５前後におけるｐＨの影響をより詳細に調べるため、試薬のｐＨをＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液で７．２５、７．５及び７．７５に調整し、試料中のＬｐ−ＰＬＡ２活性を測定した。試薬の組成は以下のとおりである。
（本発明試薬）
＜Ｒ１試薬＞
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２５又は７．５又は７．７５）
１ｍＭ ＣａＣｌ２
４Ｕ／ｍＬ ＡＳＯＭ
０．１％ Ｔｘ−１００
０．１３ｍｇ／ｍＬ 組換え体リゾＰＡＦ−ＰＬＤ
０．０３％ ＴＯＤＢ
４Ｕ／ｍＬ ペルオキシダーゼ
５Ｕ／ｍＬ 組換え体コリンオキシダーゼ

＜Ｒ２試薬＞
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２５、７．５、又は７．７５）
１ｍＭ ＣａＣｌ２
０．０４％ ４−ＡＡ
０．５％ Ｔｘ−１００
１０ｍＭ ＰＡＦ（Ｃ１６）
（試料と活性測定）
試料種、測定装置と測定パラメーター、及び活性値の算出は実施例２と同条件で行った。各ｐＨにおける１分間当たりの吸光度変化の値（感度）（ΔｍＡｂｓ／ｍｉｎ）とＬｐ−ＰＬＡ２活性値（ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍＬ）を表３及び４に示した。



測定の結果、表３及び４より、試薬のｐＨが７．５と７．７５の場合により高感度にＬｐ−ＰＬＡ２活性を測定可能であった。
［実施例４］
＜Ｌｐ−ＰＬＡ２活性測定試薬の緩衝液の検討＞
Ｌｐ−ＰＬＡ２活性測定試薬における緩衝液の違いの影響を検討するため、試薬のｐＨを７．５で固定し、緩衝液の種類を変えて、試料中のＬｐ−ＰＬＡ２活性を測定した。緩衝液はグッドの緩衝液であるＨＥＰＥＳ（同仁化学研究所社製）、ＭＯＰＳ（同仁化学研究所社製）、ＴＥＳ（同仁化学研究所社製）、ＰＩＰＥＳ（同仁化学研究所社製）、リン酸カリウム（Ｐｉ−Ｋ）及びＴｒｉｓ（和光純薬社製）の計６種類を用いた。リン酸カリウムのｐＨはリン酸水素二カリウム（和光純薬社製）とリン酸二水素カリウム（和光純薬社製）を用いて調整した。試薬の組成は以下のとおりである。
（本発明試薬）
＜Ｒ１試薬＞
５０ｍＭ 各緩衝液（ｐＨ７．５）
１ｍＭ ＣａＣｌ２
４Ｕ／ｍＬ ＡＳＯＭ
０．１％ Ｔｘ−１００
０．１３ｍｇ／ｍＬ 組換え体リゾＰＡＦ−ＰＬＤ
０．０３％ ＴＯＤＢ
４Ｕ／ｍＬ ペルオキシダーゼ
５Ｕ／ｍＬ 組換え体コリンオキシダーゼ

＜Ｒ２試薬＞
５０ｍＭ 各緩衝液（ｐＨ７．５）
１ｍＭ ＣａＣｌ２
０．０４％ ４−ＡＡ
０．５％ Ｔｘ−１００
１０ｍＭ ＰＡＦ（Ｃ１６）
（試料と活性測定）
試料種、活性測定装置と測定パラメーター、及び活性値の算出は実施例２と同条件で行った。各緩衝液を用いた場合の１分間当たりの吸光度変化の値（感度）（ΔｍＡｂｓ／ｍｉｎ）とＬｐ−ＰＬＡ２活性値（ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍＬ）を表５及び６に示した



測定の結果、表５及び６より６種類のいずれの緩衝液を用いた場合にもＬｐ−ＰＬＡ２活性が測定可能であった。本実施例における５０ｍＭという緩衝液濃度では、試薬の緩衝液としてＴｒｉｓを用いた際に、最も高感度にＬｐ−ＰＬＡ２活性を測定可能であった。
［実施例５］
＜Ｌｐ−ＰＬＡ２活性測定試薬のＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）濃度の検討＞
Ｌｐ−ＰＬＡ２活性測定試薬におけるＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）濃度の影響を検討するため、試薬のＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）濃度を２５ｍＭ、５０ｍＭ又は１００ｍＭに調製し、試料中のＬｐ−ＰＬＡ２活性を測定した。試薬組成は以下のとおりである。
（本発明試薬）
＜Ｒ１試薬＞
２５〜１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
１ｍＭ ＣａＣｌ２
４Ｕ／ｍＬ ＡＳＯＭ
０．１％ Ｔｘ−１００
０．１３ｍｇ／ｍＬ 組換え体リゾＰＡＦ−ＰＬＤ
０．０３％ ＴＯＤＢ
４Ｕ／ｍＬ ペルオキシダーゼ
５Ｕ／ｍＬ 組換え体コリンオキシダーゼ

＜Ｒ２試薬＞
２５〜１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
１ｍＭ ＣａＣｌ２
０．０４％ ４−ＡＡ
０．５％ Ｔｘ−１００
１０ｍＭ ＰＡＦ（Ｃ１６）
（試料と活性測定）
試料種、活性測定装置と測定パラメーター、及び活性値の算出は実施例２と同条件で行った。各緩衝液における１分間当たりの吸光度変化の値（感度）（ΔｍＡｂｓ／ｍｉｎ）とＬｐ−ＰＬＡ２活性値（ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍＬ）を表７及び８に示した。



測定の結果、表７及び８より試薬のＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）の濃度が２５、５０及び１００ｍＭの全ての場合にＬｐ−ＰＬＡ２活性が測定可能であった。試薬のＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）の濃度を５０ｍＭとしたときにより高感度にＬｐ−ＰＬＡ２活性を測定可能であった。
［実施例６］
＜Ｌｐ−ＰＬＡ２活性測定試薬のＣａＣｌ２濃度＞
Ｌｐ−ＰＬＡ２活性測定試薬におけるＣａＣｌ２濃度の影響を検討するため、試薬のＣａＣｌ２濃度を０（無添加）、０．２５、０．５、０．７５、１、２．５、５又は１０ｍＭに調整し、試料中のＬｐ−ＰＬＡ２活性を測定した。試薬組成は以下のとおりである。
（本発明試薬）
＜Ｒ１試薬＞
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）
０〜１０ｍＭ ＣａＣｌ２
４Ｕ／ｍＬ ＡＳＯＭ
０．１％ Ｔｘ−１００
０．１３ｍｇ／ｍＬ 組換え体リゾＰＡＦ−ＰＬＤ
０．０３％ ＴＯＤＢ
４Ｕ／ｍＬ ペルオキシダーゼ
５Ｕ／ｍＬ 組換え体コリンオキシダーゼ

＜Ｒ２試薬＞
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）
０〜１０ｍＭ ＣａＣｌ２
０．０４％ ４−ＡＡ
０．５％ Ｔｘ−１００
１０ｍＭ ＰＡＦ（Ｃ１６）
（試料と活性測定）
試料種、活性測定装置と測定パラメーター、及び活性値の算出は実施例２と同条件で行った。各緩衝液における１分間当たりの吸光度変化の値（感度）（ΔｍＡｂｓ／ｍｉｎ）とＬｐ−ＰＬＡ２活性値（ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍＬ）を表９及び１０に示した。




測定の結果、表９及び１０より試薬のＣａＣｌ２の濃度は、０〜１０ｍＭのいずれの場合でもＬｐ−ＰＬＡ２活性が測定可能であった。全ての濃度においてＬｐ−ＰＬＡ２活性値に差異はなく、本実施例においては試料由来のＣａＣｌ２濃度で十分に試薬中の酵素が機能していると考えられた。
［実施例７］
＜Ｌｐ−ＰＬＡ２活性測定試薬の界面活性剤のスクリーニング＞
Ｌｐ−ＰＬＡ２活性測定試薬における界面活性剤の影響を検討するため、界面活性剤の濃度をＲ１試薬は０．１％、Ｒ２試薬は０．１％又は０．５％に固定し、試薬に添加する界面活性剤の種類を変えて、試料中のＬｐ−ＰＬＡ２活性を測定した。試薬組成は以下のとおりである。
（本発明試薬）
＜Ｒ１試薬＞
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）
１Ｍ ＣａＣｌ２
４Ｕ／ｍＬ ＡＳＯＭ
０．１％ 各種界面活性剤
０．１３ｍｇ／ｍＬ 組換え体リゾＰＡＦ−ＰＬＤ
０．０３％ ＴＯＤＢ
４Ｕ／ｍＬ ペルオキシダーゼ
５Ｕ／ｍＬ 組換え体コリンオキシダーゼ

＜Ｒ２試薬＞
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）
１ｍＭ ＣａＣｌ２
０．０４％ ４−ＡＡ
０．１又は０．５％ 各種界面活性剤
１０ｍＭ ＰＡＦ
（使用した界面活性剤）
検討に使用した界面活性剤の詳細は表１１に示す。


上記界面活性剤のうち、Ｎｏ.１のＴｘ−１００はＲ２試薬への添加濃度を０．１％と０．５％の２種類検討した。また、Ｎｏ.２〜９はＲ２試薬への添加濃度を０．５％、Ｎｏ.１０〜１２はＲ２試薬への添加濃度を０．１％で検討した。
（試料と活性測定）
試料種、活性測定装置と測定パラメーター、及び活性値の算出は実施例２と同条件で行った。各緩衝液における１分間当たりの吸光度変化の値（感度）（ΔｍＡｂｓ／ｍｉｎ）とＬｐ−ＰＬＡ２活性値（ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍＬ）、及びＴｘ−１００でのＬｐ−ＰＬＡ２活性値を１００とした時の各界面活性剤における相対活性を表１２〜表１５に示した。







測定の結果、表１２から表１５よりいずれの界面活性剤を使用した場合においてもＬｐ−ＰＬＡ２活性が測定可能であった。Ｔｘ−１００、エマルゲン１１１８Ｓ−７０及びエマルゲン１１５０Ｓ−６０を用いた際に、より高感度にＬｐ−ＰＬＡ２活性を測定可能であった。
［実施例８］
＜Ｌｐ−ＰＬＡ２測定試薬の界面活性剤濃度の検討＞
Ｌｐ−ＰＬＡ２活性測定試薬における界面活性剤濃度の影響を検討するため、界面活性剤としてエマルゲン１１１８Ｓ−７０を用い、試薬のエマルゲン１１１８Ｓ−７０濃度を０〜０．２％に調製し、試料中のＬｐ−ＰＬＡ２活性を測定した。試薬組成は以下のとおりである。
（本発明試薬）
＜Ｒ１試薬＞
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
１ｍＭ ＣａＣｌ２
４Ｕ／ｍＬ ＡＳＯＭ
０〜０．２％ エマルゲン１１１８Ｓ−７０
０．１３ｍｇ／ｍＬ 組換え体リゾＰＡＦ−ＰＬＤ
０．０３％ ＴＯＤＢ
４Ｕ／ｍＬ ペルオキシダーゼ
５Ｕ／ｍＬ 組換え体コリンオキシダーゼＩＩＩ

＜Ｒ２試薬＞
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
１ｍＭ ＣａＣｌ２
０．０４％ ４−ＡＡ
０〜０．２％ エマルゲン１１１８Ｓ−７０
１０ｍＭ ラセミ体ＰＡＦ（Ｃ１６）
試料種、活性測定装置と測定パラメーター、及び活性値の算出は実施例２と同条件で行った。各緩衝液における１分間当たりの吸光度変化の値（感度）（ΔｍＡｂｓ／ｍｉｎ）とＬｐ−ＰＬＡ２活性値（ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍＬ）を表１６〜表１８に示した。





測定の結果、表１６〜表１８よりいずれの濃度の界面活性剤を使用した場合においてもＬｐ−ＰＬＡ２活性が測定可能であった。界面活性剤の濃度が０．１％以下において、より高感度にＬｐ−ＰＬＡ２活性を測定可能であった。
[実施例９]
＜様々な基質を用いたＬｐ−ＰＬＡ２活性の測定＞
基質として光学活性体の合成基質であるＰＡＦ（Ｃ１６）とＰＡＦ（Ｃ１８）、ラセミ体ＰＡＦ（Ｃ１６）及び天然ＰＡＦ、ＰＡＦ類縁体である１−ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−２−ａｃｅｔｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ＰＣを用い、試料中のＬｐ−ＰＬＡ２活性を測定した。試薬の組成は以下のとおりである。
（本発明試薬）
・ラセミ体ＰＡＦ（Ｃ１６）以外を基質とした時の試薬組成
＜Ｒ１試薬＞
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）
１ｍＭ ＣａＣｌ２
４Ｕ／ｍＬ ＡＳＯＭ
０．０５％ エマルゲン１１５０Ｓ−６０
０．１３ｍｇ／ｍＬ 組換え体リゾＰＡＦ−ＰＬＤ
０．０３％ ＴＯＤＢ
４Ｕ／ｍＬ ペルオキシダーゼ
５Ｕ／ｍＬ 組換え体コリンオキシダーゼＩＩＩ

＜Ｒ２試薬＞
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）
１ｍＭ ＣａＣｌ２
０．０４％ ４−ＡＡ
０．０５％ エマルゲン１１５０Ｓ−６０
１０ｍＭ 各基質

・ラセミ体ＰＡＦ（Ｃ１６）を基質とした時の試薬組成
＜Ｒ１試薬＞
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）
１ｍＭ ＣａＣｌ２
４Ｕ／ｍＬ ＡＳＯＭ
０．０５％ エマルゲン１１５０Ｓ−６０
０．１３ｍｇ／ｍＬ 組換え体リゾＰＡＦ−ＰＬＤ
０．０３％ ＴＯＤＢ
４Ｕ／ｍＬ ペルオキシダーゼ
５Ｕ／ｍＬ 組換え体コリンオキシダーゼＩＩＩ

＜Ｒ２試薬＞
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）
１ｍＭ ＣａＣｌ２
０．０４％ ４−ＡＡ
０．０５％ エマルゲン１１５０Ｓ−６０
０．１３ｍｇ／ｍＬ 組換え体リゾＰＡＦ−ＰＬＤ
４Ｕ／ｍＬ ペルオキシダーゼ
５Ｕ／ｍＬ 組換え体コリンオキシダーゼＩＩＩ
１０ｍＭ ラセミ体ＰＡＦ（Ｃ１６）
（試料）
血清プールＪ０４２、血清プールＣ、個人血清１６、ヘパリン血漿プール、クエン酸血漿プール、ｒＬｐ−ＰＬＡ２（０．０１７ｍｇ／ｍＬ）。
（活性測定）
活性の測定には７０８０形日立自動分析装置を使用した。測定パラメーターは以下に示す。
（７０８０形日立自動分析装置測定パラメーター）
分析方法 Ｒａｔｅ Ａ
測定波長（副／主） ６６０ｎｍ／５４６ｎｍ
反応時間 １０分
測光ポイント ２７−３０
試料量 ５μＬ
Ｒ１試薬量 １５０μＬ
Ｒ２試薬量 １００μＬ
５μＬの試料と１５０μＬのＲ１試薬を混合して３７℃で５分間インキュベートした後（測光ポイント１−１５）、１００μＬのＲ２試薬を添加して反応を開始した（測光ポイント１６）。Ｒ２試薬の添加による反応開始後約３．５−４．５分（測光ポイント２７−３０）の試料の吸光度から、水（ブランク）の同測光ポイントにおける吸光度を差し引き、１分間当たりの吸光度変化の値（ΔｍＡｂｓ／ｍｉｎ）を算出し、前記の式に従ってＬｐ−ＰＬＡ２活性値（ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍＬ）を算出した。１分間当たりの吸光度変化の値（感度）（ΔｍＡｂｓ／ｍｉｎ）とＬｐ−ＰＬＡ２活性値（ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍＬ）、及びＰＡＦ（Ｃ１６）に対するＬｐ−ＰＬＡ２活性値を１００とした時の各基質に対する相対活性を表１９〜表２４に示した。











測定の結果、表１９〜表２４よりいずれの基質を使用した場合においても、Ｌｐ−ＰＬＡ２活性の測定が可能であった。天然ＰＡＦの主成分はＣ１６であり、基質としては、Ｃ１６の光学活性体を用いるとより高感度にＬｐ−ＰＬＡ２活性を測定可能であった。
［実施例１０］
＜トリンダー試薬の検討＞
発色試薬としてＴＯＤＢと４−ＡＡ以外の組み合わせにおいてもＬｐ−ＰＬＡ２活性が測定可能か検討するため、トリンダー試薬の種類を検討した。ＴＯＤＢ以外のトリンダー試薬として、ＴＯＯＳ（品番：ＯＣ１３，同仁化学研究所社製）、ＤＡＯＳ（品番：ＯＣ０６，同仁化学研究所社製）の２種類を用いた。比較としてＴＯＤＢを用いた測定も行った。試薬組成は以下のとおりである。
（本発明試薬）
＜Ｒ１試薬＞
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）
１ｍＭ ＣａＣｌ２
４Ｕ／ｍＬ ＡＳＯＭ
０．１％ Ｔｘ−１００
０．１３ｍｇ／ｍＬ 組換え体リゾＰＡＦ−ＰＬＤ
０．０３％ トリンダー試薬
４Ｕ／ｍＬ ペルオキシダーゼ
５Ｕ／ｍＬ 組換え体コリンオキシダーゼＩＩＩ

＜Ｒ２試薬＞
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）
１ｍＭ ＣａＣｌ２
０．０４％ ４−ＡＡ
０．１％ Ｔｘ−１００
０．１３ｍｇ／ｍＬ 組換え体リゾＰＡＦ−ＰＬＤ
４Ｕ／ｍＬ ペルオキシダーゼ
５Ｕ／ｍＬ 組換え体コリンオキシダーゼＩＩＩ
１０ｍＭ ラセミ体ＰＡＦ（Ｃ１６）
（試料）
個人血清Ｎｏ１６、個人血清Ｎｏ７８、血清プールＪ０４２。
（活性測定）
ＴＯＯＳ、ＴＯＤＢを用いた測定においては、試料量は３μＬとし、それ以外の測定パラメーター、活性測定装置、活性値の算出は実施例９と同条件で行った。ＤＡＯＳを用いた測定においては、試料量は３μＬとし、測定波長（副／主）を７００ｎｍ／６００ｎｍとし、それ以外の測定パラメーター、活性測定装置、活性値の算出は実施例９と同条件で行った。各トリンダー試薬を用いた活性測定の１分間当たりの吸光度変化の値（感度）（ΔｍＡｂｓ／ｍｉｎ）とＬｐ−ＰＬＡ２活性値（ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍＬ）を表２５に示した。


測定の結果、いずれの組み合わせにおいても測定が可能であった。その中でもＴＯＯＳとＴＯＤＢを用いた場合の吸光度変化の値（感度）はＤＡＯＳを用いた場合の約２倍であり、より高感度に測定可能であった。
［実施例１１］
＜試薬組成検討１（リゾＰＡＦ−ＰＬＤ Ｒ２試薬処方）＞
血清中に数百μＭの濃度で含まれているとされているアシル型リゾリン脂質を消去するために、Ｒ１試薬に、リン脂質の１位のアシル基を分解するＰＬＡ１活性を有する酵素と、それにより生じるＧＰＣを加水分解するＧＰＣＰを、コリンオキシダーゼとともに加え、リゾＰＡＦ−ＰＬＤを含むＲ２試薬存在下、Ｌｐ−ＰＬＡ２活性が測定可能か検討した。ＰＬＡ１活性を有する酵素として、ＭＧＬＰＩＩ（Ｔ−１１７，旭化成ファーマ社製）およびＬＹＰＬ（Ｔ−３２，旭化成ファーマ社製）を用いた。Ｒ１試薬に用いた大腸菌由来ＧＰＣＰは参考例７〜９で作製したものを使用した。試薬の組成は以下のとおりである。
（本発明試薬）
＜Ｒ１試薬＞
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）
１ｍＭ ＣａＣｌ２
４Ｕ／ｍＬ ＡＳＯＭ
０．１％ Ｔｘ−１００
５０Ｕ／ｍＬ ＭＧＬＰＩＩまたは１０Ｕ／ｍＬ ＬＹＰＬ
０．１９ｍｇ／ｍＬ 大腸菌由来組換え体ＧＰＣＰ
０．０３％ ＴＯＤＢ
４Ｕ／ｍＬ ペルオキシダーゼ
５Ｕ／ｍＬ 組換え体コリンオキシダーゼＩＩＩ

＜Ｒ２試薬＞
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）
１ｍＭ ＣａＣｌ２
０．１３ｍｇ／ｍＬ リゾＰＡＦ−ＰＬＤ
０．０４％ ４−ＡＡ
０．１％ Ｔｘ−１００
４Ｕ／ｍＬ ペルオキシダーゼ
５Ｕ／ｍＬ 組換え体コリンオキシダーゼＩＩＩ
１０ｍＭ ラセミ体ＰＡＦ（Ｃ１６）
（試料と活性測定）
試料種は実施例１０と同条件で行い、活性測定装置と測定パラメーター、及び活性値の算出は実施例９と同条件で行った。測定結果を表２６に示した。


表２６に示した測定結果と、リゾＰＡＦ−ＰＬＤをＲ１試薬に処方した表２５のＴＯＤＢの結果より、リゾＰＡＦ−ＰＬＤがＲ２試薬のみに含まれている場合においても、Ｒ１試薬にＭＧＬＰＩＩとＧＰＣＰを添加した場合、リゾＰＡＦ−ＰＬＤがＲ１試薬に含まれている場合と同様にＬｐ−ＰＬＡ２活性が測定可能であった。また、Ｒ１試薬にＬＹＰＬとＧＰＣＰを添加した場合にも測定が可能であった。
［実施例１２］
＜試薬組成検討２（コリンオキシダーゼＲ２処方検討）＞
前もって試料中のコリンを消去する過程を含まない場合、すなわちコリンオキシダーゼをＲ２試薬に含む場合にＬｐ−ＰＬＡ２活性が測定可能であるか検討した。試薬の組成は以下のとおりである。
（本発明試薬）
＜Ｒ１試薬＞
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）
１ｍＭ ＣａＣｌ２
４Ｕ／ｍＬ ＡＳＯＭ
０．１％ Ｔｘ−１００
０．１３ｍｇ／ｍＬ リゾＰＡＦ−ＰＬＤ
０．０３％ ＴＯＤＢ
４Ｕ／ｍＬ ペルオキシダーゼ

＜Ｒ２試薬＞
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）
１ｍＭ ＣａＣｌ２
０．１％ Ｔｘ−１００
０．０４％ ４−ＡＡ
４Ｕ／ｍＬ ペルオキシダーゼ
０．１３ｍｇ／ｍＬ リゾＰＡＦ−ＰＬＤ
５Ｕ／ｍＬ 組換え体コリンオキシダーゼＩＩＩ
１０ｍＭ ラセミ体ＰＡＦ（Ｃ１６）
（試料と活性測定）
試料種は実施例１０と同条件で行い、活性測定装置と測定パラメーター、及び活性値の算出は実施例９と同条件で行った。測定結果を表２７に示した。


表２７に示す測定結果から、コリンオキシダーゼがＲ２試薬のみに含まれていてもＬｐ−ＰＬＡ２活性は測定可能であった。しかしながらコリンオキシダーゼがＲ１試薬及びＲ２試薬に含まれている表２５のＴＯＤＢの結果と比較すると、測定値が高かった。試料中に残存するコリンが影響していると考えられた。
［実施例１３］
＜Ｌｐ−ＰＬＡ２測定におけるＳＲ比の検討＞
本発明試薬におけるＳＲ比を検討するため、試料量を変化させ、Ｌｐ−ＰＬＡ２活性を測定した。試薬の組成は以下のとおりである。
（本発明試薬）
＜Ｒ１試薬＞
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．８）
１ｍＭ ＣａＣｌ２
３Ｕ／ｍＬ ＡＳＯＭ
０．１％ Ｔｘ−１００
０．１３ｍｇ／ｍＬ 組換え体リゾＰＡＦ−ＰＬＤ
０．０２２５％ ＴＯＤＢ
４Ｕ／ｍＬ ペルオキシダーゼ
５Ｕ／ｍＬ 組換え体コリンオキシダーゼＩＩＩ

＜Ｒ２試薬＞
５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ（ｐＨ ７．０）
１ｍＭ ＣａＣｌ２
０．０８％ ４−ＡＡ
０．１％ Ｔｘ−１００
０．２６ｍｇ／ｍＬ 組換え体リゾＰＡＦ−ＰＬＤ
４Ｕ／ｍＬ ペルオキシダーゼ
５Ｕ／ｍＬ 組換え体コリンオキシダーゼＩＩＩ
２０ｍＭ ラセミ体ＰＡＦ（Ｃ１６）
（試料）
血清プールＪ０４２。
（活性測定）
活性の測定には７０８０形日立自動分析装置を使用した。測定パラメーターは以下に示す。
（７０８０形日立自動分析装置測定パラメーター）
分析方法 Ｒａｔｅ Ａ
測定波長（副／主） ６６０ｎｍ／５４６ｎｍ
反応時間 １０分
測光ポイント ２７−３０
試料量 ２，４，６μＬ
Ｒ１試薬量 １６０μＬ
Ｒ２試薬量 ４０μＬ
各試料と１６０μＬのＲ１試薬を混合して３７℃で５分間インキュベートした後（測光ポイント１−１５）、４０μＬのＲ２試薬を添加して反応を開始した（測光ポイント１６）。Ｒ２試薬の添加による反応開始後約３．５−４．５分（測光ポイント２７−３０）の試料の吸光度から、水（ブランク）の同測光ポイントにおける吸光度を差し引き、１分間当たりの吸光度変化の値（ΔｍＡｂｓ／ｍｉｎ）を算出し、前記の式に従ってＬｐ−ＰＬＡ２活性値（ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍＬ）を算出した。１分間当たりの吸光度変化の値（感度）（ΔｍＡｂｓ／ｍｉｎ）とＬｐ−ＰＬＡ２活性値（ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍＬ）を表２８に示した。


試料量が２μＬ（Ｓ：Ｒ＝１：１００）、試料量が４μＬ（Ｓ：Ｒ＝１：５０）、試料量が６μＬ（Ｓ：Ｒ＝１：３３）の全ての場合で測定が可能であった。
［実施例１４］
＜血清におけるＬｐ−ＰＬＡ２添加回収試験＞
Ｌｐ−ＰＬＡ２活性を示す血清試料とＬｐ−ＰＬＡ２活性を示さない血清試料を用い、各試料に０〜３３．２μｇ／ｍＬのｒＬｐ−ＰＬＡ２を添加して活性測定を行い、回収率を求めた。試薬組成は実施例１３と同様である。
（試料）
血清プールＪ０４２及び血清プールＡ〜Ｃの４種類に、０、３．３、６．６、１３．３、１６．６及び３３．２μｇ／ｍＬのｒＬｐ−ＰＬＡ２をそれぞれ添加したもの。なお、血清プールＡはＬｐ−ＰＬＡ２活性を示さない血清試料である。
（活性測定）
試料量は４μＬとし、活性測定装置と試料量以外の測定パラメーター、及び活性値の算出は実施例１３と同条件で行った。回収率は、以下の式で算出した。
回収率（％）
＝｛（ｒＬｐ−ＰＬＡ２を添加した血清の活性値）−（血清自体の活性値）｝÷（ｒＬｐ−ＰＬＡ２を添加した血清プールＡ（Ｌｐ−ＰＬＡ２活性を示さない血清）の活性値）×１００
＝（添加したｒＬｐ−ＰＬＡ２の活性値）÷（血清プールＡに添加したｒＬｐ−ＰＬＡ２の活性値）×１００
各試料における１分間当たりの吸光度変化（ΔｍＡｂｓ／ｍｉｎ）、各濃度のｒＬｐ−ＰＬＡ２を添加した時の活性値（ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍＬ）、添加したｒＬｐ−ＰＬＡ２の活性値（ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍＬ）、及び回収率（％）を表２９〜３１に示した。また、ｘ軸が添加したｒＬｐ−ＰＬＡ２濃度（μｇ／ｍＬ）、ｙ軸が１分間当たりの吸光度変化となるようにプロットしたものを図４〜７に示した。






測定の結果、図４〜７より添加したｒＬｐ−ＰＬＡ２濃度依存的な吸光度変化が見られ、表２９〜３１よりほぼ１００％±１０％以内で回収できた。
［実施例１５］
＜Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社のＰＡＦ Ａｃｅｔｙｌｈｙｄｒｏｌａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ及び本発明試薬の測定値の比較＞
本発明試薬とＣａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社のＰＡＦ Ａｃｅｔｙｌｈｙｄｒｏｌａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを用い、Ｌｐ−ＰＬＡ２活性を測定した。Ｃａｙｍａｎ社の試薬による活性測定はキットの添付文書に従って行い、活性値は添付文書に従って算出した。試薬組成は以下のとおりである。
（本発明試薬）
＜Ｒ１試薬＞
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）
１ｍＭ ＣａＣｌ２
４Ｕ／ｍＬ ＡＳＯＭ
０．１％ Ｔｘ−１００
０．２６ｍｇ／ｍＬ 組換え体リゾＰＡＦ−ＰＬＤ
０．０３％ ＴＯＤＢ
４Ｕ／ｍＬ ペルオキシダーゼ
５Ｕ／ｍＬ 組換え体コリンオキシダーゼ

＜Ｒ２試薬＞
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）
１ｍＭ ＣａＣｌ２
０．０４％ ４−ＡＡ
０．１％ Ｔｘ−１００
１０ｍＭ ＰＡＦ（Ｃ１６）
（試料）
個人血清Ｎｏ１〜３２。
（活性測定）
Ｃａｙｍａｎ社試薬での活性測定には、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ３（モレキュラーデバイスジャパン社製）マイクロプレートリーダーを使用した。また本発明方法による活性の測定には、７６００−０１０Ｓ形日立自動分析装置を使用した。測定パラメーターは以下に示す。
（７６００−０１０Ｓ形日立自動分析装置測定パラメーター）
分析方法 Ｒａｔｅ Ａ
測定波長（副／主） ６６０ｎｍ／５４６ｎｍ
反応時間 １０分
測光ポイント ２５−２８
試料量 ３μＬ
Ｒ１試薬量 １５０μＬ
Ｒ２試薬量 １００μＬ
３μＬの試料と１５０μＬのＲ１試薬を混合して３７℃で５分間インキュベートした後（測光ポイント１−１６）、１００μＬのＲ２試薬を添加して反応を開始した（測光ポイント１７）。Ｒ２試薬の添加による反応開始後約２−３分（測光ポイント２５−２８）の試料の吸光度から、水（ブランク）の同測光ポイントにおける吸光度を差し引き、１分間当たりの吸光度変化の値（ΔｍＡｂｓ／ｍｉｎ）を算出し、前記の式に従ってＬｐ−ＰＬＡ２活性値（ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍＬ）を算出した。本発明法とＣａｙｍａｎ社試薬でのＬｐ−ＰＬＡ２活性値（ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍＬ）を表３２に示した（なお、乳ビ検体は＋を付して示し、＋の数が多いほど乳ビが強いことを示す）。Ｃａｙｍａｎ社試薬による活性値（ｘ軸（ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍＬ））と、本発明法による活性値（ｙ軸（ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍＬ））を図８に比較して示した。

測定の結果、Ｃａｙｍａｎ社試薬と本発明試薬で上記試料を測定した測定値（ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍＬ）の相関は、相関式ｙ＝２．２５４ｘ＋３．４６５６、相関係数はｒ＝０．８０５で示された（図８）。

本実施例により、個人血清のＬｐ−ＰＬＡ２活性を本発明試薬でＣａｙｍａｎ社試薬とｒ＝０．８０５の相関で測定できることが示された。９６穴プレートを用いているＣａｙｍａｎ社試薬より、汎用自動分析機を使用する本発明試薬の方が診断薬としての実用性は高いといえる。
活性値の定義が異なるために、Ｃａｙｍａｎ社試薬と本発明試薬により測定した活性値は異なり相関式の傾きが１では無いが、活性値の定義やキャリブレーターの値を同一にすれば相関式の傾きは１に近づくと考えられる。
［実施例１６］
＜Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ社のＨｕｍａｎ ＰＬＡ２Ｇ７／ＰＡＦ−ＡＨ／Ｌｐ−ＰＬＡ２ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ及び本発明試薬で試料を測定した測定値の比較＞
Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ社のＨｕｍａｎ ＰＬＡ２Ｇ７／ＰＡＦ−ＡＨ／Ｌｐ−ＰＬＡ２ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔを用い、キットの添付文書に従って、Ｌｐ−ＰＬＡ２の物質量を定量した。
（活性測定）
Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ社キットでの定量には、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ３（モレキュラーデバイスジャパン社製）マイクロプレートリーダーを使用した。実施例１５で測定した本発明試薬によるＬｐ−ＰＬＡ２活性値（ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍＬ）とＲ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ社キットでのＬｐ−ＰＬＡ２量（ｎｇ／ｍＬ）を表３３に示した。Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ社キットによる定量値（ｘ軸（ｎｇ／ｍＬ））と、本発明試薬による活性値（ｙ軸（ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍＬ））を図９に比較して示した。

測定の結果、Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ社のＨｕｍａｎ ＰＬＡ２Ｇ７／ＰＡＦ−ＡＨ／Ｌｐ−ＰＬＡ２ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔによる測定値（ｎｇ／ｍＬ）と本発明法による測定値（ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍＬ）の相関は、相関式ｙ＝０．２９１７ｘ＋１８．５８２、相関係数はｒ＝０．８００で示された（図９）。
本実施例により、本発明試薬で個人血清を、Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ社のＨｕｍａｎ ＰＬＡ２Ｇ７／ＰＡＦ−ＡＨ／Ｌｐ−ＰＬＡ２ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔによる測定値とｒ＝０．８００の相関で測定できることが示された。Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ社のＨｕｍａｎ ＰＬＡ２Ｇ７／ＰＡＦ−ＡＨ／Ｌｐ−ＰＬＡ２ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔによる測定値はＬｐ−ＰＬＡ２の量であり、活性値ではない点で本発明試薬による測定値とは異なる。
［実施例１７］
＜本発明試薬の吸光度変化の値とＬｐ−ＰＬＡ２活性値の測定＞
本発明試薬の１分間当たりの吸光度変化の値（感度）（ΔｍＡｂｓ／ｍｉｎ）及びＬｐ−ＰＬＡ２活性値（ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍＬ）を測定した。
なお、参考のため、ｄｉａＤｅｘｕｓ社のＰＬＡＣ Ｔｅｓｔ Ｆｏｒ Ｌｐ−ＰＬＡ２ Ａｃｔｉｖｉｔｙ（ＰＬＡＣ Ｔｅｓｔ）、及びＤｉａｓｙｓ社のＤｉａｓｙｓ Ｌｐ−ＰＬＡ２ ＦＳ（Ｌｐ−ＰＬＡ２ ＦＳ）も用いてＬｐ−ＰＬＡ２活性を測定した。ＰＬＡＣ Ｔｅｓｔ及びＬｐ−ＰＬＡ２ ＦＳの測定波長は４１５ｎｍとした。本発明方法で用いた試薬組成は以下のとおりである。
（本発明試薬）
＜Ｒ１試薬＞
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）
１ｍＭ ＣａＣｌ２
４Ｕ／ｍＬ ＡＳＯＭ
０．０５％ エマルゲン１１５０Ｓ−６０
０．１３ｍｇ／ｍＬ 組換え体リゾＰＡＦ−ＰＬＤ
２５μＭ フェロシアン化カリウム
０．０５％ プロクリン３００
０．０３％ ＴＯＤＢ
４Ｕ／ｍＬ ペルオキシダーゼ
５Ｕ／ｍＬ 組換え体コリンオキシダーゼＩＩＩ

＜Ｒ２試薬＞
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）
１ｍＭ ＣａＣｌ２
０．０５％ エマルゲン１１５０Ｓ‐６０
０．１３ｍｇ／ｍＬ 組換え体リゾＰＡＦ−ＰＬＤ
０．０５％ プロクリン３００
４Ｕ／ｍＬ ペルオキシダーゼ
５Ｕ／ｍＬ 組換え体コリンオキシダーゼＩＩＩ
０．０４％ ４−ＡＡ
１０ｍＭ ラセミ体ＰＡＦ（Ｃ１６）
（試料）
水、ＰＬＡＣ Ｔｅｓｔのキャリブレーター５本（０ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍＬ（キャリブ１）、５０ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍＬ（キャリブ２）、１００ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍＬ（キャリブ３）、２５０ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍＬ（キャリブ４）、４００ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍＬ（キャリブ５））、別売りのＬｐ−ＰＬＡ２ ＦＳ用キャリブレーター（ＴｒｕＣａｌ Ｌｉｐｉｄ，４４７Ｕ／Ｌ）。
（活性測定）
活性の測定には、７６００−０１０Ｓ形日立自動分析装置を使用した。各試薬における測定パラメーターは以下に示す。
（７６００−０１０Ｓ形日立自動分析装置測定パラメーター）
（本発明試薬の活性測定用パラメーター）
分析方法 Ｒａｔｅ Ａ
測定波長（副／主） ６６０ｎｍ／５４６ｎｍ
反応時間 １０分
測光ポイント ２９−３２
試料量 ５μＬ
Ｒ１試薬量 １５０μＬ
Ｒ２試薬量 １００μＬ
本発明試薬による活性測定は、５μＬの試料と１５０μＬのＲ１試薬を混合して３７℃で５分間インキュベートした後（測光ポイント１−１６）、１００μＬのＲ２試薬を添加して反応を開始した（測光ポイント１７）。Ｒ２試薬の添加による反応開始後約３．５−４．５分（測光ポイント２９−３２）の試料の吸光度から、水（ブランク）の同測光ポイントにおける吸光度を差し引き、１分間当たりの吸光度変化の値（ΔｍＡｂｓ／ｍｉｎ）を算出した。Ｌｐ−ＰＬＡ２活性値（ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍＬ）は前記式に従って算出した。
（ＰＬＡＣ Ｔｅｓｔ測定用パラメーター）
分析方法 Ｒａｔｅ Ａ
測定波長（副／主） ５０５ｎｍ／４１５ｎｍ
反応時間 １０分
測光ポイント １９−２２
試料量 ３０μＬ
Ｒ１試薬量 １２０μＬ
Ｒ２試薬量 ３０μＬ
ＰＬＡＣ Ｔｅｓｔによる活性測定は、３０μＬの試料と１２０μＬのＲ１試薬を混合して３７℃で５分間インキュベートした後（測光ポイント１−１６）、３０μＬのＲ２試薬を添加して反応を開始した（測光ポイント１７）。Ｒ２試薬の添加による反応開始後約０．５−２分（測光ポイント１９−２２）の試料の吸光度から、水（ブランク）の同測光ポイントにおける吸光度を差し引き、１分間当たりの吸光度変化の値（ΔｍＡｂｓ／ｍｉｎ）を算出した。Ｌｐ−ＰＬＡ２活性値（ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍＬ）はＰＬＡＣ Ｔｅｓｔの５本のキャリブレーターの１分間当たりの吸光度変化の値をｘ軸、活性値をｙ軸にプロットして導いた以下の式により算出した。
ｙ＝０．００１３ｘ２＋０．５２９２ｘ−０．３２１３
（Ｌｐ−ＰＬＡ２ ＦＳ測定用パラメーター）
分析方法 Ｒａｔｅ Ａ
測定波長（副／主） ５０５ｎｍ／４１５ｎｍ
反応時間 １０分
測光ポイント ２２−３０
試料量 ２μＬ
Ｒ１試薬量 ２００μＬ
Ｒ２試薬量 ５０μＬ
Ｌｐ−ＰＬＡ２ ＦＳによる活性測定は、２μＬの試料と２００μＬのＲ１試薬を混合して３７℃で５分間インキュベートした後（測光ポイント１−１６）、５０μＬのＲ２試薬を添加して反応を開始した（測光ポイント１７）。Ｒ２試薬の添加による反応開始後約２−４分（測光ポイント２２−３０）の試料の吸光度から、水（ブランク）の同測光ポイントにおける吸光度を差し引き、１分間当たりの吸光度変化の値（ΔｍＡｂｓ／ｍｉｎ）を算出した。Ｌｐ−ＰＬＡ２活性値（Ｕ／Ｌ）は、Ｌｐ−ＰＬＡ２ ＦＳの添付文書に従い、以下の式より算出した。
Ｌｐ−ＰＬＡ２活性値（Ｕ／Ｌ）
＝｛（ΔＡｂｓ／ｍｉｎ．Ｓａｍｐｌｅ）／（ΔＡｂｓ／ｍｉｎ．Ｃａｌ．）｝×Ｃｏｎｃ．Ｃａｌ．（Ｕ／Ｌ）
＝｛（１分間当たりの試料の吸光度変化）／（１分間当たりのキャリブレーターの吸光度変化）｝×キャリブレーター濃度（４４７Ｕ／Ｌ）
各試薬における１分間当たりの吸光度変化の値（ΔｍＡｂｓ／ｍｉｎ）と活性値（ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍＬ及びＵ／Ｌ）を表３４〜３６に示した。






本実施例により、本発明試薬によりＰＬＡＣ Ｔｅｓｔキャリブ１から５、及びＬｐ−ＰＬＡ２ ＦＳ用キャリブレーター（ＴｒｕＣａｌ Ｌｉｐｉｄ）を測定できることが示された。
［実施例１８］
＜本発明試薬、ＰＬＡＣ Ｔｅｓｔ、及びＬｐ−ＰＬＡ２ ＦＳの同時再現性の比較＞
本発明試薬と、ＰＬＡＣ Ｔｅｓｔ、及びＬｐ−ＰＬＡ２ ＦＳの同時再現性を比較するため、ｎ＝５でＬｐ−ＰＬＡ２活性を測定した。試薬組成は実施例１７と同様である。
（試料）
ＰＬＡＣ ＴｅｓｔのＣＯＮＴＲＯＬ ＬＯＷ（ＭＥＡＮ：１１８．８ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍＬ）（以下、ＰＬＡＣ ＣＯＮＴ−Ｌとする）及びＣＯＮＴＲＯＬ ＨＩＧＨ（ＭＥＡＮ：２９８．３ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍＬ）（以下、ＰＬＡＣ ＣＯＮＴ−Ｈとする）、血清プールＪ０４２、コンセーラ（日水製薬社製）。
（活性測定）
活性測定装置と測定パラメーター、及び活性値の算出は実施例１７と同条件で行った。
各試薬における１分間当たりの吸光度変化の値（感度）（ΔｍＡｂｓ／ｍｉｎ）と平均値（ＡＶＥ）、標準偏差（ＳＤ）、変動係数（ＣＶ％）、活性値（ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍＬ及びＵ／Ｌ）を表３７〜４２に示した。また各試薬において、血清プールＪ０４２を試料とした時の１０分間の反応時間の各測光ポイントにおける吸光度をプロットした反応タイムコースを図１０〜１２に示した。











測定の結果、本発明試薬による測定値はＣＶ％が±２．０以内であった。またＰＬＡＣ Ｔｅｓｔによる測定値はＣＶ％が±１．０前後であった。Ｌｐ−ＰＬＡ２ ＦＳによる測定値は、ＰＬＡＣ ＣＯＮＴ−ＬがＣＶ％＝４．７と他の試料に比べて高かったが、その他の試料はＣＶ％が±１．０以内であった。
本実施例により、本発明試薬によりＰＬＡＣ Ｔｅｓｔのコントロール血清、購入した血清プール、市販の管理血清であるコンセーラを、市販されているＰＬＡＣ Ｔｅｓｔ、及びＬｐ−ＰＬＡ２ ＦＳと同程度のＣＶ（％）で測定できることが示された。
［実施例１９］
＜本発明試薬、ＰＬＡＣ Ｔｅｓｔ、及びＬｐ−ＰＬＡ２ ＦＳの共存物質の影響比較＞
干渉チェック・Ａプラス（シスメックス社製）、イントラリポス輸液１０％（大塚製薬株式会社製）又はアスコルビン酸を添加した試料を調製し、共存物質の影響を調べた。試薬組成は実施例１７と同様である。
（試料）
ビリルビン・Ｃ（Ｂｉｌ−Ｃ）（２０９ｍｇ／ｄＬ）、ビリルビン・Ｆ（Ｂｉｌ−Ｆ）（２０１ｍｇ／ｄＬ）、溶血ヘモグロビン（Ｈｂ）（５２００ｍｇ／ｄＬ）及び乳ビ（１４８００ＦＴＵ）（以上、干渉チェック・Ａプラスに含有）；イントラリポス輸液１０％；０．５ｇ／ｄＬアスコルビン酸；及び水の７種類を血清プールＪ０４２と１：９の割合（本実施例においては、７種類の物質４０μＬ＋血清プールＪ０４２ ３６０μＬ）で混合した。
（活性測定）
活性測定装置と測定パラメーター、及び活性値の算出は実施例１７と同条件で行った。
各試薬における１分間当たりの吸光度変化の値（ΔｍＡｂｓ／ｍｉｎ）と活性値（ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍＬ及びＵ／Ｌ）を表４３−４５に示した。水を添加した試料の測定値を１００％とした場合の、他の試料の測定値の割合も示した。





測定の結果、表４３及び４５より、本発明法及びＬｐ−ＰＬＡ２ ＦＳを用いた場合は、いずれの物質を含む試料も±５％以内の誤差で測定可能であった。また、表４４に示すとおり、ＰＬＡＣ Ｔｅｓｔを用いた場合、溶血ヘモグロビン（５００ｍｇ／ｄＬ）とイントラリポス輸液（１％）は、本実施例で用いた７６００−０１０Ｓ形日立自動分析装置では「吸光度オーバーエラー」となり、測定できなかった。
本実施例により、本発明法とＬｐ−ＰＬＡ２ ＦＳが溶血ヘモグロビンとイントラリポス輸液（乳ビ）の影響を受け難く、ＰＬＡＣ Ｔｅｓｔは溶血ヘモグロビンとイントラリポス輸液（乳ビ）の影響を受けることが示された。
［実施例２０］
＜本発明試薬、ＰＬＡＣ Ｔｅｓｔ、及びＬｐ−ＰＬＡ２ ＦＳの測定値の比較＞
各試料において、本発明試薬、ＰＬＡＣ Ｔｅｓｔ、及びＬｐ−ＰＬＡ２ ＦＳで測定したＬｐ−ＰＬＡ２活性値を比較した。試薬組成は実施例１７と同様である。
（試料）
血清プールＡ〜Ｃ、ヘパリン血漿プール、クエン酸血漿プール、個人血清Ｎｏ１〜２１。
（活性測定）
活性測定装置と測定パラメーター、及び活性値の算出は実施例１７と同条件で行った。
本発明試薬、ＰＬＡＣ Ｔｅｓｔ、及びＬｐ−ＰＬＡ２ ＦＳで測定した各試料のＬｐ−ＰＬＡ２活性値（ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍＬ及びＵ／Ｌ）を表４６に示した。ＰＬＡＣ Ｔｅｓｔでの活性値（ｘ軸（ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍＬ））と本発明試薬による活性値（ｙ軸（ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍＬ））を比較したものを図１３に、またＬｐ−ＰＬＡ２ ＦＳによる活性値（ｘ軸（Ｕ／Ｌ））と本発明試薬による活性値（ｙ軸（ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍＬ））を比較したものを図１４に、更にＰＬＡＣ Ｔｅｓｔでの活性値（ｘ軸（ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍＬ））とＬｐ−ＰＬＡ２ ＦＳによる活性値（ｙ軸（Ｕ／Ｌ））を比較したものを図１５に示した。なお、乳ビ検体は＋を付して示した。

測定の結果、本発明法とＬｐ−ＰＬＡ２ ＦＳによる試料の測定値の相関は、相関式
ｙ＝０．０８８５ｘ＋０．０６４３、相関係数はｒ＝０．９９６であった。Ｌｐ−ＰＬＡ２ ＦＳは煩雑な３試薬系であり、本発明法は簡便な２試薬系とすることができるという点で本発明法はＬｐ−ＰＬＡ２ ＦＳより優れている。
また本発明法とＰＬＡＣ Ｔｅｓｔによる試料の測定値の相関は相関式ｙ＝０．２６９８ｘ−７．０９０６、相関係数はｒ＝０．９９１であった。なお、特に乳ビが強い検体であった個人血清Ｎｏ１７は、ＰＬＡＣ Ｔｅｓｔでは本実施例で用いた７６００−０１０Ｓ形日立自動分析装置で「吸光度オーバーエラー」となり測定できなかった。［実施例１９］の結果と考え合わせると、ＰＬＡＣ Ｔｅｓｔは、本発明法と比較して、溶血ヘモグロビンや乳ビの影響を受けやすい。したがって本発明法はＰＬＡＣ Ｔｅｓｔより、上記実施例で示したとおり、溶血ヘモグロビンとイントラリポス輸液（乳ビ）の影響を受け難いという点で優れている。
Ｌｐ−ＰＬＡ２ ＦＳとＰＬＡＣ Ｔｅｓｔによる試料の測定値の相関は相関式ｙ＝３．０６０９ｘ−８１．６９１、相関係数はｒ＝０．８９６であった。
また、活性値の定義が異なるために、Ｌｐ−ＰＬＡ２ ＦＳ、ＰＬＡＣ Ｔｅｓｔ、及び本発明試薬により測定した活性値は異なり相関式の傾きが１では無いが、活性値の定義やキャリブレーターの値を同一にすれば相関式の傾きは１に近づくと考えられる。
［実施例２１］
＜本発明試薬とＰＬＡＣ Ｔｅｓｔ、及びＬｐ−ＰＬＡ２ ＦＳの希釈直線性＞
本発明試薬、ＰＬＡＣ Ｔｅｓｔ、及びＬｐ−ＰＬＡ２ ＦＳの希釈直線性を比較した。試薬組成は実施例１７と同様である。
（試料）
血清プールＪ０４２にｒＬｐ−ＰＬＡ２を０．０５ｍｇ／ｍＬ添加したもの（以下、血清Ｘとする）と、生理食塩液（大塚製薬株式会社製）を用いて以下の希釈系列を作製した。
血清Ｘそのもの（１）、
血清Ｘと生理食塩水を３：１で混合したもの（０．７５）、
血清Ｘと生理食塩水を１：１で混合したもの（０．５）、
血清Ｘと生理食塩水を１：３で混合したもの（０．２５）、
血清Ｘと生理食塩水を１：９で混合したもの（０．１）、及び
生理食塩液（０）の６つ。
（活性測定）
活性測定装置と測定パラメーター、及び活性値の算出は実施例１７と同条件で行った。
各試薬において、ｘ軸が希釈系列、ｙ軸が１分間当たりの吸光度変化となるようにプロットしたものを図１６〜１８に示した。
測定の結果、図１６より本発明試薬の希釈直線性は、ｙ＝４８．８５１ｘ−０．７１８６（ｒ＝０．９９９）で示された。また図１８よりＬｐ−ＰＬＡ２ ＦＳの希釈直線性は、ｙ＝６２．４８１ｘ−０．００８６（ｒ＝０．９９９）で示された。ＰＬＡＣ Ｔｅｓｔでは図１７に示すとおり、希釈直線性が示されなかった。
［実施例２２］
＜本発明試薬の４℃保存安定性試験＞
本発明試薬を試薬調製後４℃で１、２、３、４、５、６、８、１５、２９、６０、及び１２０日間保存した試薬を用い、血清プールＪ０４２のＬｐ−ＰＬＡ２の感度（ΔｍＡｂｓ／ｍｉｎ）を測定した。試薬の組成は以下のとおりである。
（本発明試薬）
＜Ｒ１試薬＞
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．８）
０．２ｍＭ ＣａＣｌ２
４Ｕ／ｍＬ ＡＳＯＭ
０．０５％ プロクリン３００
１．６μＭ フェロシアン化カリウム
０．０５％ エマルゲン１１５０Ｓ−６０
３．３Ｕ／ｍＬ 組換え体リゾＰＡＦ−ＰＬＤ
０．１ｍＭ ＥＤＴＡ
７５ｍＭ ＮａＣｌ
３％ トレハロース
１０μＭ ＦＡＤ（フラビンアデニンジヌクレオチド）
０．０２％ ＴＯＤＢ
４Ｕ／ｍＬ ペルオキシダーゼ
４Ｕ／ｍＬ 組換え体コリンオキシダーゼＩＩＩ

＜Ｒ２試薬＞
５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ（ｐＨ ７．０）
０．２ｍＭ ＣａＣｌ２
０．０５％ プロクリン３００
０．０５％ エマルゲン１１５０Ｓ−６０
０．１ｍＭ ＥＤＴＡ
０．２５％ ＫＣｌ
０．１３％ シュークロース
０．０８％ ４−ＡＡ
２ｍＭ ラセミ体ＰＡＦ（Ｃ１６）
（試料）
血清プールＪ０４２
（活性測定）
活性の測定には７１７０形日立自動分析装置を使用した。測定パラメーターを以下に示す。なお、活性値の測定は、実施例１７の本発明試薬の場合と同条件で行った。
（７１７０形日立自動分析装置測定パラメーター）
分析方法 Ｒａｔｅ Ａ
測定波長（副／主） ６６０ｎｍ／５４６ｎｍ
反応時間 １０分
測光ポイント ３０−３３
試料量 ４μＬ
Ｒ１試薬量 １６０μＬ
Ｒ２試薬量 ４０μＬ
測定の結果、血清プールＪ０４２のＬｐ−ＰＬＡ２の感度（ΔｍＡｂｓ／ｍｉｎ）及び活性値は、調製後４℃で１日保存した試薬で測定した感度及び活性値を１００％とした場合、少なくとも１２０日間は±１０％の範囲内であり、本発明のＬｐ−ＰＬＡ２活性の測定方法及び測定キットは長期間（少なくとも１２０日、４℃）で保存後の試薬でも安定して高感度かつ正確にＬｐ−ＰＬＡ２を測定できることが明らかになった。
［実施例２３］
＜本発明試薬の保存安定性試験（３７℃熱加速試験）＞
調製後４℃で１週間保存した本発明試薬を３７℃で１週間及び３７℃で２週間保存し、下記の試料のＬｐ−ＰＬＡ２の感度を測定した。試薬の組成は以下のとおりであり、活性測定は実施例２２と同様に行った。
（本発明試薬）
＜Ｒ１試薬＞
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．８）
０．２ｍＭ ＣａＣｌ２
４Ｕ／ｍＬ ＡＳＯＭ
０．０５％ プロクリン３００
１．６μＭ フェロシアン化カリウム
０．０５％ エマルゲン１１５０Ｓ−６０
３．３Ｕ／ｍＬ 組換え体リゾＰＡＦ−ＰＬＤ
０．１ｍＭ ＥＤＴＡ
７５ｍＭ ＮａＣｌ
３％ トレハロース
１０μＭ ＦＡＤ（フラビンアデニンジヌクレオチド）
０．０２％ ＴＯＤＢ
４Ｕ／ｍＬ ペルオキシダーゼ
４Ｕ／ｍＬ 組換え体コリンオキシダーゼＩＩＩ

＜Ｒ２試薬＞
５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ（ｐＨ ７．０）
０．２ｍＭ ＣａＣｌ２
０．０５％ プロクリン３００
０．０５％ エマルゲン１１５０Ｓ−６０
０．１ｍＭ ＥＤＴＡ
０．２５％ ＫＣｌ
０．１３％ シュークロース
０．０８％ ４−ＡＡ
２ｍＭ ラセミ体ＰＡＦ（Ｃ１６）または１−ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−２−ａｃｅｔｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ＰＣ
（試料）
血清プールＪ０４２、血清プールＢ〜Ｄ、０．０１７ｍｇ／ｍＬのｒＬｐ−ＰＬＡ２を含む血清プールＪ０４２溶液
基質としてラセミ体ＰＡＦ（Ｃ１６）または１−ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−２−ａｃｅｔｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ＰＣを使用した本発明試薬の保存実験において、３７℃で２週間保存した後の本発明試薬の感度及び活性値は、調製後４℃で１日保存した試薬で測定した感度及び活性値を１００％とした場合、±１０％以内であった。少なくとも２週間、３７℃で保存後の本発明試薬でも安定して高感度かつ正確にＬｐ−ＰＬＡ２活性を測定することができた。３７℃で２週間の保存安定性は、４℃で１８ヶ月の保存安定性に相当すると予測されるため、本発明試薬は、４℃で少なくとも１８ヶ月程度は安定であると考えられた。
［実施例２４］
＜保存後の試料のＬｐ−ＰＬＡ２活性測定１＞
採血直後に遠心分離して取得した個人血清Ａ〜Ｄを小分けして、採血の１時間後から３温度（４℃、−２５℃、−８０℃）で保存した。４℃保存の場合は１、２時間、１、２、３、４、７、１５、２８日、−２５及び−８０℃保存の場合は１時間、１、２、３、４日保存した個人血清Ａ〜ＤのＬｐ−ＰＬＡ２活性をｎ＝３で測定した。試薬の組成は実施例２２と同様であった。測定には７１７０形日立自動分析装置を使用し、測定パラメーターは実施例２２と同様であった。参考例１１において、Ｌｐ−ＰＬＡ２濃度２３．１（ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍＬ（Ｕ／Ｌ））と値付けされた血清プールＪ０４２−ＩＩを、キャリブレーション試薬として使用した。
上述の「Ｌｐ−ＰＬＡ２活性値の算出方法２」によりＬｐ−ＰＬＡ２濃度を測定し、キャリブレーション方法としては、キャリブレーション試薬と同時に測定した蒸留水を０（ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍＬ（Ｕ／Ｌ））とする一点検量を選択した。
測定の結果、採血の１時間後から４℃で２８日間試料を保存した場合の個人血清Ａ〜ＤのＬｐ−ＰＬＡ２活性測定値（ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍＬ（Ｕ／Ｌ））は、採血の１時間後から４℃で１時間保存した個人血清Ａ〜Ｄの測定値を１００％とした場合、いずれも±１１％の範囲内であった。また、採血の１時間後から１、２、３、４日間試料を−２５℃または−８０℃で保存した場合のＬｐ−ＰＬＡ２活性測定値（ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍＬ（Ｕ／Ｌ））は、採血の１時間後から４℃で１時間保存した場合を１００％とすると、±６％の範囲内であった。本発明法で測定可能な試料中のＬｐ−ＰＬＡ２活性測定値は、通常の検体保存温度範囲を含む−８０〜４℃の範囲で安定であり、本発明法は汎用性が高く有用であることが明らかになった。
なお、文献（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４４（２０１１），１２４７-１２５２）によれば、ＥＬＩＳＡ法においては、保存前の試料のＬｐ−ＰＬＡ２活性測定値と比較して、４℃、２日保存の試料では１５％高く、−２５℃、２日保存では３０％高い測定値が得られており、試料の保存がＬｐ−ＰＬＡ２活性測定値に与える影響が大きいことが示されている。一方で本発明法によるＬｐ−ＰＬＡ２活性の測定においては上述のとおり試料の保存が活性測定値に与える影響が小さく、本発明法の有用性が明らかである。
［実施例２５］
＜保存後の試料のＬｐ−ＰＬＡ２活性測定２＞
個人血清Ｅを０〜５回凍結融解し、Ｌｐ−ＰＬＡ２活性を測定した。試薬、測定条件などは実施例２２と同様であった。キャリブレーション試薬及びキャリブレーション方法は実施例２４と同様であった。
測定の結果、５回の凍結融解を繰り返した後の試料中のＬｐ−ＰＬＡ２活性測定値は、いずれの血清においても、凍結融解前の試料のＬｐ−ＰＬＡ２活性測定値を１００％とした場合、±４％の範囲内であった。 実施例２４及び２５の結果から、本発明法によれば、少なくとも−８０℃から４℃の範囲で保存後の試料に対しても安定して高感度かつ正確に、Ｌｐ−ＰＬＡ２活性を測定できることが明らかになった。
［実施例２６］
＜ＬＯＢ、ＬＯＤ、ＬＯＱの測定＞
Ｓｔａｎｄａｒｄ：ＣＬＳＩ ＥＰ１７（ＥＶＡＬＵＡＴＩＯＮ ＯＦ ＤＥＴＥＣＴＩＯＮ ＣＡＰＡＢＩＬＩＴＹ ＦＯＲ ＣＬＩＮＩＣＡＬ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＥＡＳＵＲＥＭＥＮＴ ＰＲＯＣＥＤＵＲＥＳ；ＡＰＰＲＯＶＥＤ ＧＵＩＤＥＬＩＮＥ（ＩＥＥＥ））の手順に従い、本発明試薬のブランク上限（ＬＯＢ：Ｌｉｍｉｔ ｏｆ Ｂｌａｎｋ）、検出限界（ＬＯＤ：Ｌｉｍｉｔ ｏｆ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）、及び定量限界（ＬＯＱ：Ｌｉｍｉｔ ｏｆ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ）を測定した。試薬の組成は実施例２２と同様であった。測定には７１７０形日立自動分析装置を使用し、測定パラメーターは実施例２２と同様であった。キャリブレーション試薬及びキャリブレーション方法は実施例２４と同様であった。
（試料）
Ｌp−ＰＬＡ２濃度が０．０、１．４、２．９、４．３、５．８、７．２、８．７、１０．１、１１．６、１３．０及び１４．５Ｕ／Ｌになるように生理的食塩水（０．９ｗ／ｖ％のＮａＣｌ）で希釈したＢＪプールを使用した。
（測定）
試料を５日間毎日測定し（ｎ＝５）、変動係数（ＣＶ％）、その平均および２ＳＤ（標準偏差の２倍）を算出した。その結果を図１９に示した。図１９中で、ＣＶ（％）の２ＳＤをエラーバーで示し、Ｌｐ−ＰＬＡ２濃度と変動係数を累乗近似し実線で示した（ｙ＝３７．６４４ｘ−１．１５５）。
（ＬＯＢ）
ＬＯＢは、Ｌｐ−ＰＬＡ２濃度が０（ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍＬ（Ｕ／Ｌ））、すなわち生理的食塩水の変動係数の平均値と、変動係数の標準偏差から、以下の式により０．３４６（ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍＬ（Ｕ／Ｌ））と算出した。
ＬＯＢ＝平均値＋１．６４５×標準偏差
＝−０．１２４７＋１．６４５×０．２８６２
＝０．３４６
（ＬＯＤ）
ＬＯＤは、ＬＯＢとＬｐ−ＰＬＡ２濃度が１．４（ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍＬ（Ｕ／Ｌ））の測定値の標準偏差（０．２８０４）から以下の式により０．８１０（ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍＬ（Ｕ／Ｌ））と算出した。
ＬＯＤ＝ＬＯＢ＋１．６５３×標準偏差
＝０．３４６＋１．６５３×０．２８０４
＝０．８１０
（ＬＯＱ）
ＬＯＱは図１９で示した、Ｌｐ−ＰＬＡ２濃度と変動係数との累乗近似式（ｙ＝３７．６４４ｘ−１．１５５）から、ＣＶ（％）が５％以下になる測定値をＬＯＱと定義して、５．７４２（ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍＬ（Ｕ／Ｌ））と算出した。
ＬＯＱ＝（５／３７．６４４）（１／−１．１５５）＝５．７４２
本実施例の結果より、本発明法において検出し得るＬｐ−ＰＬＡ２活性の最低量は約０．８１０（Ｕ／Ｌ）であり、定量結果が十分の信頼性を有する最小値は約５．７４２（Ｕ／Ｌ）であることが示され、また試薬の組成が変わっても大体同程度のＬＯＢやＬＯＱになると予想され、本発明法の実用性の高さが確認できた。
［実施例２７］
＜部位特異的変異を導入したリゾＰＡＦ−ＰＬＤ変異体のＰＬＤ活性＞
配列番号９に記載のリゾＰＡＦ−ＰＬＤの４５番目のＭ（配列番号１では７１番目のＭに相当する）をＧ、Ａ、Ｌ、またはＤに置換する部位特異的変異を導入し、リゾＰＡＦに対するＰＬＤ活性（Ｋｃａｔ／Ｋｍ（ｓ−１ｍＭ−１））を変異前後で比較した。その結果、変異前のＰＬＤ活性が１３８５（ｓ−１ｍＭ−１）であったのに対し、配列番号９の４５番目のＭをＧに変異した変異体（Ｍ４５Ｇと表記する。以下同様。）、Ｍ４５Ａ、Ｍ４５Ｌ及びＭ４５ＤのＰＬＤ活性は、それぞれ、３０５９、１１４１１、３２８４及び４５５７（ｓ−１ｍＭ−１）であった。
配列番号９に記載のリゾＰＡＦ−ＰＬＤの２５７番目のＦ（配列番号１では２８３番目のＦに相当する）をＧ、Ｅ、Ｒ、ＫまたはＷに置換する部位特異的変異を導入し、上述のＰＬＤ活性（Ｋｃａｔ／Ｋｍ（ｓ−１ｍＭ−１））を変異前後で比較した。その結果、変異前の上述のＰＬＤ活性が１３８５（ｓ−１ｍＭ−１）であったのに対し、配列番号１の２５７番目のＦをＧに変異した変異体（Ｆ２５７Ｇと表記する。以下同様。）、Ｆ２５７Ｅ、Ｆ２５７Ｒ、Ｆ２５７Ｋ及びＦ２５７ＷのＰＬＤ活性は、それぞれ、１２００、１０００，１０８０、１０２０及び１３２０であった。
部位特異的変異を導入したリゾＰＡＦ−ＰＬＤ変異体のＰＬＤ活性は以下の方法で測定した。Ｔｒｉｓ １．２１１ｇ、塩化カルシウム二水和物（和光純薬工業社製）１４．７ｍｇ、リゾＰＡＦ溶液２０ｍＬ及び１％ ＴＯＤＢ液２ｍＬを精製水６０ｍＬに溶解した後、１Ｎ ＨＣｌでｐＨ ７．５（２５oＣ）に調整し、さらに１００Ｕ／ｍＬコリンオキシダーゼ ４ｍＬ、１００Ｕ／ｍＬペルオキシダーゼ液４ｍＬ 及び１％ ４−ＡＡ液２ｍＬを加えて溶かし、精製水で全容１００ｍＬとし、リゾＰＡＦに対するＰＬＤ活性測定試薬（反応試薬混合液）とした。リゾＰＡＦ溶液は反応試薬混合液中のリゾＰＡＦ濃度が０〜５ｍＭになるように調製した。反応試薬混合液３ｍＬを３７℃で５分間予備加温し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５で適宜希釈した部位特異的変異を導入したリゾＰＡＦ−ＰＬＤ変異体液５０μＬ混和して反応開始し、反応開始後８から９分目の１分間の５４６ｎｍにおける吸光変化を測定した。キノンイミン色素の５４６ｎｍにおけるミリモル分子吸光係数を３６（ｃｍ２／μｍｏｌｅ）として活性値（μｍｏｌｅ／ｍｉｎ）を算出した。タンパク量（ｍｇ／ｍＬ）はブラッドフォード法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ法）でウシ血清アルブミンをスタンダードとして算出した。Ｋｍ及びＫｃａｔは上述の蛋白質・酵素の基礎実験法やヴォート基礎生化学(第４版)（東京化学同人）等に記載の定法に従いミカエリス・メンテンの式で算出した。なお、算出の際、酵素の分子量は３３５８３とした。
各変異体の上述のＰＬＤ活性（Ｋｃａｔ／Ｋｍ（ｓ−１ｍＭ−１））を表４７に示す。

以上のように、リゾＰＡＦ−ＰＬＤの部位特異的変異体は、野生型と同様、ＰＬＤ活性を有した。
本発明試薬及び本発明法は、汎用の生化学自動分析機を使用してＬｐ−ＰＬＡ２活性ができることから、汎用性が高く簡便な測定方法である。また、放射性同位元素等を使用せずにＬｐ−ＰＬＡ２活性を測定できることから、安全な測定方法であることが示された。また、中性条件で測定できることから、空気中の炭酸ガスに対しても安定であることが示された。また、Ｌｐ−ＰＬＡ２の本来の基質であるＰＡＦを使用することから、生体内の活性を正確に反映している可能性が示された。また、本実施例等で用いた試薬類としては、市販され容易に入手することができるものであり、容易に製造できるため、経済性が優れている。
本発明の測定方法及びキットによれば、試料のＬｐ−ＰＬＡ２活性を簡便かつ安全に高感度で測定することができる。よって、本発明は心血管疾患に代表されるＬｐ−ＰＬＡ２が関与する疾患又は状態の診断及び管理に特に有用であり、医療分野、試薬産業分野において利用することができる。
本出願は、２０１６年６月２２日に出願された日本国特許出願第２０１６−１２３７０７号に基づく優先権を主張するものであり、その内容はここに参照として組み込まれる。

Claims (20)

  1. 下記一般式Ｉで表される血小板活性化因子（ＰＡＦ）類：
    （式中、
    Ｒ1は、直鎖又は分岐の、飽和又は部分不飽和の、Ｃ １０ 以上Ｃ ３０ 以下の炭化水素基であり、
    Ｒ2はＣ １ 以上Ｃ ９ 以下の直鎖アルキル基であり、
    Ｘは−Ｃ（Ｏ）−、−ＣＨ2−又は−ＣＨ＝ＣＨ−である。）
    及び下記一般式ＩＩで表されるリゾＰＡＦ類：
    （式中、
    Ｒ1及びＸは、一般式Ｉにおいて定義したとおりである）
    の存在下、前記ＰＡＦ類を加水分解してコリンを生成する反応を行わずに、前記リゾＰＡＦ類を加水分解してコリンを生成するための酵素の使用であって、前記酵素が以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のタンパク質である、使用：
    （ａ）配列番号１又は９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質；
    （ｂ）配列番号１又は９に記載のアミノ酸配列において１〜９個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、ＰＡＦに対するホスフォリパーゼＤ様（ＰＬＤ）活性を有さず、かつ、リゾＰＡＦに対するＰＬＤ活性を有する、タンパク質；
    （ｃ）配列番号１又は９に記載のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、ＰＡＦに対するＰＬＤ活性を有さず、かつ、リゾＰＡＦに対するＰＬＤ活性を有する、タンパク質。
  2. 以下の工程（Ａ）〜工程（Ｃ）を含む、リポタンパク質関連ホスフォリパーゼＡ２（Ｌｐ−ＰＬＡ2）を含む試料中のＬｐ−ＰＬＡ2活性の測定方法：
    （Ａ）下記一般式Ｉで表される血小板活性化因子（ＰＡＦ）類：
    （式中、
    Ｒ1は、直鎖又は分岐の、飽和又は部分不飽和の、Ｃ １０ 以上Ｃ ３０ 以下の炭化水素基であり、
    Ｒ2はＣ １ 以上Ｃ ９ 以下の直鎖アルキル基であり、
    Ｘは−Ｃ（Ｏ）−、−ＣＨ2−又は−ＣＨ＝ＣＨ−である。）
    を、試料中のＬｐ−ＰＬＡ2と反応させて下記一般式ＩＩで表されるリゾＰＡＦ類：
    （式中、
    Ｒ1及びＸは、一般式Ｉにおいて定義したとおりである）
    に変換する工程：
    （Ｂ）工程（Ａ）において生じた前記リゾＰＡＦ類を、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のタンパク質である酵素により加水分解して加水分解物を得る工程：
    （ａ）配列番号１又は９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質；
    （ｂ）配列番号１又は９に記載のアミノ酸配列において１〜９個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、ＰＡＦに対するホスフォリパーゼＤ様（ＰＬＤ）活性を有さず、かつ、リゾＰＡＦに対するＰＬＤ活性を有する、タンパク質；
    （ｃ）配列番号１又は９に記載のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、ＰＡＦに対するＰＬＤ活性を有さず、かつ、リゾＰＡＦに対するＰＬＤ活性を有する、タンパク質；
    （Ｃ）工程（Ｂ）で得られた加水分解物由来の変化量を指標として試料中のＬｐ−ＰＬＡ2活性を測定する工程。
  3. 工程（Ｃ）における変化量が、加水分解物であるコリンの変化量である、請求項２に記載の方法。
  4. 工程（Ｃ）が、コリンの変化量を測定する方法として、更に下記の工程（Ｃ−１）を含む、請求項３に記載の方法：
    （Ｃ−１）コリンとコリンオキシダーゼを反応させて過酸化水素を生成する工程。
  5. 工程（Ｃ）が、更に下記の工程（Ｃ−２）を含む、請求項４に記載の方法：
    （Ｃ−２）工程（Ｃ−１）で生成した過酸化水素の量を、発色試薬を用いた比色分析法により測定する工程。
  6. 工程（Ａ）に先立って、更に下記の工程（Ｄ）を含む、請求項２〜５のいずれか一項に記載の方法：
    （Ｄ）試料中のコリンを除去する工程。
  7. 工程（Ｄ）が、コリンオキシダーゼを用いて試料中のコリンを除去する工程である、請求項６に記載の方法。
  8. Ｒ2がメチル基である、請求項２〜７のいずれか一項に記載の方法。
  9. Ｒ1が、独立して、Ｃ15及びＣ17の直鎖アルキル基から選択される、請求項２〜８のいずれか一項に記載の方法。
  10. Ｘが−ＣＨ2−である、請求項２〜９のいずれか一項に記載の方法。
  11. Ｘが−Ｃ（Ｏ）−である、請求項２〜９のいずれか一項に記載の方法。
  12. 以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のタンパク質である酵素：
    （ａ）配列番号１又は９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質；
    （ｂ）配列番号１又は９に記載のアミノ酸配列において１〜９個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、血小板活性化因子（ＰＡＦ）に対するホスフォリパーゼＤ様（ＰＬＤ）活性を有さず、かつ、リゾＰＡＦに対するＰＬＤ活性を有する、タンパク質；
    （ｃ）配列番号１又は９に記載のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、ＰＡＦに対するＰＬＤ活性を有さず、かつ、リゾＰＡＦに対するＰＬＤ活性を有する、タンパク質；
    及び下記一般式Ｉで表される、ＰＡＦ類：
    （式中、
    Ｒ1は、直鎖又は分岐の、飽和又は部分不飽和の、Ｃ １０ 以上Ｃ ３０ 以下の炭化水素基であり、
    Ｒ2はＣ １ 以上Ｃ ９ 以下の直鎖アルキル基であり、
    Ｘは−Ｃ（Ｏ）−、−ＣＨ2−又は−ＣＨ＝ＣＨ−である。）
    を含む、試料中のリポタンパク質関連ホスフォリパーゼＡ２（Ｌｐ−ＰＬＡ2）活性の測定用キット。
  13. 更にコリンオキシダーゼを含む、請求項１２に記載のキット。
  14. 更にペルオキシダーゼ、トリンダー試薬及びカップラーを含む、請求項１３に記載のキット。
  15. 前記酵素を含む第一試薬と、前記ＰＡＦ類を含む第二試薬とを含む、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載のキット。
  16. 前記第一試薬が更にコリンオキシダーゼを含む、請求項１５に記載のキット。
  17. Ｌｐ−ＰＬＡ2が関与する疾患及び／又は状態を、診断及び／又は管理する方法に用いるための、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載のキットであって、前記方法が、被検体由来の試料中のＬｐ−ＰＬＡ 2 活性を測定する工程を含む、キット。
  18. 前記Ｌｐ−ＰＬＡ2が関与する疾患及び／又は状態が、アテローム性動脈硬化に伴う心血管疾患である請求項１７に記載のキット。
  19. Ｌｐ−ＰＬＡ2が関与する疾患及び／又は状態の診断用キットである、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載のキット。
  20. 前記Ｌｐ−ＰＬＡ2が関与する疾患及び／又は状態が、アテローム性動脈硬化に伴う心血管疾患である、請求項１９に記載のキット。
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