CN109563536A - Lp-PLA2活性的测定 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于提供一种通用性高、简便、安全的Lp‑PLA2活性的测定方法。另外，目的在于提供一种准确、高灵敏度的Lp‑PLA2活性的测定方法。本发明提供一种包含Lp‑PLA2的试样中的Lp‑PLA2活性的测定方法，该测定方法包括以下的工序(A)～工序(C)：(A)使PAF类与试样中的Lp‑PLA2反应而转换为Lyso PAF类的工序；(B)利用酶(Lyso PAF‑PLD)将工序(A)中生成的上述Lyso PAF类水解而得到水解物的工序；(C)对于工序(B)中得到的水解物，以来自该水解物的变化量为指标，对试样中的Lp‑PLA2活性进行测定的工序。

Description

Lp-PLA2活性的测定
技术领域
本发明涉及Lp-PLA2活性的测定方法和测定试剂盒以及它们的利用。
背景技术
脂蛋白相关磷脂酶(Lipoprotein-Associated Phospholipase)A2(有时也被称为血小板活化因子乙酰水解酶(PAF-AH)，以下记为Lp-PLA2)是将血小板活化因子(PAF)的sn-2位的乙酰基水解而使PAF失活的酶。Lp-PLA2与血管中的破裂性斑块的形成有关，Lp-PLA2活性的测定被用作由动脉粥样硬化引起的心血管事件的风险预测标记(非专利文献1、非专利文献2)。作为冠心病(CHD)的风险诊断的手段之一，美国食品药品监督管理局(FDA)于2014年12月批准了Lp-PLA2活性测定试剂盒、PLAC Test For Lp-PLA2 Activity(用于Lp-PLA2活性的PLAC测试)(原diaDexus公司(现Diazyme公司))。除了上述试剂盒以外，作为体外诊断用途还销售有Diasys Lp-PLA2 FS(Diasys公司)。另外，作为研究用试剂销售有PAF乙酰水解酶检测试剂盒(Acetylhydrolase Assay Kit)(Cayman Chemical公司)，在研究用途中Lp-PLA2活性也具有测定需求。
Lp-PLA2被认为是与各种疾病或炎症有关的因子。另外，近年来还暗示了Lp-PLA2与癌症的相关性，因此通过测定Lp-PLA2活性，除了可确认心血管疾病、脑卒中等现有关系性，还能够进行癌症等的风险预测等(非专利文献1)。
作为Lp-PLA2活性的测定方法，已知使用经放射性同位素标记的PAF的方法(专利文献1)。除此以外，作为Lp-PLA2活性的测定方法，还已知使用具有在游离后成为显色性化合物或荧光显色性化合物的取代基的PAF衍生物的方法(专利文献2)；对由PAF衍生物游离出的取代基的量进行测定的方法(专利文献3或4)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开2005/001416号公报
专利文献2：日本特开2002-223794号公报
专利文献3：日本特开平07-59597号公报
专利文献4：日本特开平04-346797号公报
专利文献5：国际公开2014/010667号公报
非专利文献
非专利文献1：THE ENZYMES,Platelet-Activating Factor Acetylhydrolases(PAF-AH),(2015)38卷,145-179
非专利文献2：PLAC Test for Lp-PLA2 Activity(diaDexus公司、附件2015-01-15版)
非专利文献3：Diasys Lp-PLA2 FS(Diasys公司、附件2015年7月/8版)
发明内容
发明所要解决的课题
但是，对于专利文献1的方法来说，使用者和使用设施受限，通用性低，难以同时测定多个样本，缺乏便利性，而且具有安全性或放射性试剂的废弃等问题。
另外，作为专利文献2中公开的PAF衍生物之一的1-肉豆蔻酰基-2-(4-硝基苯基琥珀酰基)磷脂酰胆碱由于在中性pH下水溶性低，因此需要制成酸性的水溶液组合物(非专利文献2或非专利文献3)、或制成有机溶剂组合物(非专利文献3)。在使用酸性的水溶液组合物测定Lp-PLA2活性时，pH有可能因空气中的二氧化碳而发生变化。
专利文献4中公开的使用DTNB(5,5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸))作为SH基检测试剂的方法容易受到血清中包含的具有SH基的干扰物质的影响。并且，专利文献3和4的测定方法中，S/R比(试样/试剂比)高，或使用了大量的样品(试样)。
本发明所要解决的课题在于提供一种通用性更高、简便、安全的Lp-PLA2活性的测定方法。另外，本发明的课题在于提供一种准确的Lp-PLA2活性的测定方法。此外，本发明的课题在于提供一种灵敏度高的Lp-PLA2活性的测定方法。
用于解决课题的手段
本发明人已发现了作用于乙醇胺型Lyso缩醛磷脂的酶(专利文献5中，具有序列号2中记载的氨基酸序列的蛋白质和由序列号4的碱基序列所编码的蛋白质，记为来自热密卷菌属(Thermocrispum)sp.NITE BP-01628的lyPls ase。以下也称为“Lyso PAF-PLD”)。本发明人为了解决上述课题进行了深入研究，结果首次发现，在PAF与Lyso PAF共存的环境下，Lyso PAF-PLD针对PAF不具有PLD活性(磷脂酶D样活性)，针对Lyso PAF具有PLD活性，并发现该底物特异性对Lp-PLA2的活性测定有用，由此完成了本发明。
即，作为本发明，可以举出以下的方案。
[1’]
一种酶的应用，其用于在下述通式I所示的血小板活化因子(PAF)类和下述通式II所示的Lyso PAF类的存在下，不进行将上述PAF类水解而生成胆碱的反应，而将上述LysoPAF类水解而生成胆碱，
【化1】
(式中，
R1为直链或支链的饱和或部分不饱和的高级烃基，
R2为直链的低级烷基，
X为-C(O)-、-CH2-或-CH＝CH-。)
【化2】
(式中，
R1和X与通式I中的定义相同)
上述酶为以下的(a)～(c)中的任一者中记载的蛋白质：
(a)具有序列号1或9中记载的氨基酸序列的蛋白质；
(b)具有在序列号1或9中记载的氨基酸序列中一个或复数个氨基酸发生了缺失、置换或插入的氨基酸序列，不具有针对PAF的磷脂酶D样(PLD)活性，并且具有针对Lyso PAF的PLD活性的蛋白质；
(c)具有与序列号1或9中记载的氨基酸序列存在90％以上的序列同源性的氨基酸序列，不具有针对PAF的PLD活性，并且具有针对Lyso PAF的PLD活性的蛋白质。
[1”]
一种酶的应用，其用于在可包含下述通式I所示的血小板活化因子(PAF)类的试样中的下述通式II所示的Lyso PAF类的测定中，不进行将上述PAF类水解而生成胆碱的反应，而将上述Lyso PAF类水解而生成胆碱，
【化3】
(式中，
R1为直链或支链的饱和或部分不饱和的高级烃基，
R2为直链的低级烷基，
X为-C(O)-、-CH2-或-CH＝CH-。)
【化4】
(式中，
R1和X与通式I中的定义相同)
上述酶为以下的(a)～(c)中的任一者中记载的蛋白质：
(a)具有序列号1或9中记载的氨基酸序列的蛋白质；
(b)具有在序列号1或9中记载的氨基酸序列中一个或复数个氨基酸发生了缺失、置换或插入的氨基酸序列，不具有针对PAF的磷脂酶D样(PLD)活性，并且具有针对Lyso PAF的PLD活性的蛋白质；
(c)具有与序列号1或9中记载的氨基酸序列存在90％以上的序列同源性的氨基酸序列，不具有针对PAF的PLD活性，并且具有针对Lyso PAF的PLD活性的蛋白质。
[1”’]
一种酶的应用，其用于在将下述通式I所示的血小板活化因子(PAF)类转换为下述通式II所示的Lyso PAF类的酶的活性的测定中，不进行将可包含上述PAF类的试样中的上述PAF类水解而生成胆碱的反应，而将上述Lyso PAF类水解而生成胆碱，
【化5】
(式中，
R1为直链或支链的饱和或部分不饱和的高级烃基，
R2为直链的低级烷基，
X为-C(O)-、-CH2-或-CH＝CH-。)
【化6】
(式中，
R1和X与通式I中的定义相同)
上述酶为以下的(a)～(c)中的任一者中记载的蛋白质：
(a)具有序列号1或9中记载的氨基酸序列的蛋白质；
(b)具有在序列号1或9中记载的氨基酸序列中一个或复数个氨基酸发生了缺失、置换或插入的氨基酸序列，不具有针对PAF的磷脂酶D样(PLD)活性，并且具有针对Lyso PAF的PLD活性的蛋白质；
(c)具有与序列号1或9中记载的氨基酸序列存在90％以上的序列同源性的氨基酸序列，不具有针对PAF的PLD活性，并且具有针对Lyso PAF的PLD活性的蛋白质。
作为本发明，可以举出下述方案。需要说明的是，以下提及的[1]包括上述[1’]、[1”]和[1”’]中的任一者。
[1-1]
如[1]所述的应用，其中，上述酶为以下的(d)～(f)中的任一者中记载的蛋白质。
(d)具有由序列号2中记载的碱基序列所编码的氨基酸序列的蛋白质；
(e)具有由在序列号2中记载的碱基序列中一个或复数个碱基发生了缺失、置换或插入的碱基序列所编码的氨基酸序列的蛋白质，且该蛋白质不具有针对PAF的PLD活性、并且具有针对Lyso PAF的PLD活性；
(f)具有由与序列号2中记载的碱基序列存在90％以上的序列同源性的碱基序列所编码的氨基酸序列的蛋白质，且该蛋白质不具有针对PAF的PLD活性、并且具有针对LysoPAF的PLD活性。
[1-2]
如[1]或[1-1]所述的应用，其中，R2为甲基。
[1-3]
如[1]～[1-2]中任一项所述的应用，其中，R1独立地选自C15和C17的直链烷基。
[1-4]
如[1]～[1-3]中任一项所述的应用，其中，X为-CH2-。
[1-5]
如[1]～[1-3]中任一项所述的应用，其中，X为-C(O)-。
[1-6]
如[1]～[1-5]中任一项所述的应用，其中，关于[1]的应用，在对于怀疑混杂有该通式I所示的PAF类的该通式II所示的Lyso PAF类的测定中，使用属于该(a)～(c)中的任一者中记载的蛋白质的酶。
[2]
一种活性的测定方法，其测定包含脂蛋白相关磷脂酶A2(Lp-PLA2)的试样中的Lp-PLA2活性，该测定方法包括下述的工序(A)～工序(C)：
(A)使下述通式I所示的血小板活化因子(PAF)类与试样中的Lp-PLA2反应而转换为下述通式II所示的Lyso PAF类的工序，
【化7】
(式中，
R1为直链或支链的饱和或部分不饱和的高级烃基，
R2为直链的低级烷基，
X为-C(O)-、-CH2-或-CH＝CH-。)
【化8】
(式中，
R1和X与通式I中的定义相同)
(B)利用酶将工序(A)中生成的上述Lyso PAF类水解而得到水解物的工序，上述酶为以下的(a)～(c)中的任一者中记载的蛋白质：
(a)具有序列号1或9中记载的氨基酸序列的蛋白质，
(b)具有在序列号1或9中记载的氨基酸序列中一个或复数个氨基酸发生了缺失、置换或插入的氨基酸序列，不具有针对PAF的磷脂酶D样(PLD)活性，并且具有针对Lyso PAF的PLD活性的蛋白质，
(c)具有与序列号1或9中记载的氨基酸序列存在90％以上的序列同源性的氨基酸序列，不具有针对PAF的PLD活性，并且具有针对Lyso PAF的PLD活性的蛋白质；
(C)以来自工序(B)中得到的水解物的变化量为指标，对试样中的Lp-PLA2活性进行测定的工序。
[3]
如[2]所述的方法，其中，工序(C)中的变化量是作为水解物的胆碱的变化量。
[3-1]
如[2]所述的方法，其中，工序(C)中的变化量是作为水解物的Lyso PAF脱胆碱体类的变化量。
[4]
如[3]所述的方法，其中，作为测定胆碱的变化量的方法，工序(C)进一步包括下述的工序(C-1)：
(C-1)使胆碱与胆碱氧化酶反应而生成过氧化氢的工序。
[5]
如[4]所述的方法，其中，工序(C)进一步包括下述的工序(C-2)：
(C-2)通过使用显色试剂的比色分析法，对工序(C-1)中生成的过氧化氢的量进行测定的工序。
[6]
如[2]～[5]中任一项所述的方法，其中，在工序(A)之前进一步包括下述的工序(D)：
(D)将试样中的胆碱除去的工序。
[7]
如[6]所述的方法，其中，工序(D)是使用胆碱氧化酶将试样中的胆碱除去的工序。
[8]
如[2]～[7]中任一项所述的方法，其中，R2为甲基。
[9]
如[2]～[8]中任一项所述的方法，其中，R1独立地选自C15和C17的直链烷基。
[10]
如[2]～[9]中任一项所述的方法，其中，X为-CH2-。
[11]
如[2]～[9]中任一项所述的方法，其中，X为-C(O)-。
[12]
一种测定用试剂盒，其测定试样中的脂蛋白相关磷脂酶A2(Lp-PLA2)活性，该试剂盒包含酶和下述通式I所示的PAF类，
上述酶为以下的(a)～(c)中的任一者中记载的蛋白质：
(a)具有序列号1或9中记载的氨基酸序列的蛋白质，
(b)具有在序列号1或9中记载的氨基酸序列中一个或复数个氨基酸发生了缺失、置换或插入的氨基酸序列，不具有针对血小板活化因子(PAF)的磷脂酶D样(PLD)活性，并且具有针对Lyso PAF的PLD活性的蛋白质，
(c)具有与序列号1或9中记载的氨基酸序列存在90％以上的序列同源性的氨基酸序列，不具有针对PAF的PLD活性，并且具有针对Lyso PAF的PLD活性的蛋白质。
【化9】
(式中，
R1为直链或支链的饱和或部分不饱和的高级烃基，
R2为直链的低级烷基，
X为-C(O)-、-CH2-或-CH＝CH-。)
[13]
如[12]所述的试剂盒，其进一步包含胆碱氧化酶。
[14]
如[13]所述的试剂盒，其进一步包含过氧化物酶、Trinder’s试剂和偶联剂。
[14-1]
如[13]所述的试剂盒，其进一步包含过氧化物酶和显色试剂。
[14-2]
如[14-1]所述的试剂盒，其中，显色试剂为隐色型试剂、或偶联剂和Trinder’s型试剂。
[14-3]
如[14-1]所述的试剂盒，其中，显色试剂为偶联剂和Trinder’s型试剂。
[14-4]
如[14-3]所述的试剂盒，其中，偶联剂为4-氨基安替比林。
[15]
如[12]～[14-4]中任一项所述的试剂盒，其包含含有上述酶的第一试剂和含有上述PAF类的第二试剂。
[16]
如[15]所述的试剂盒，其中，上述第一试剂进一步包含胆碱氧化酶。
[16-1]
如[15]或[16]所述的试剂盒，其中，上述第一试剂和/或上述第二试剂进一步包含显色试剂。
[16-2]
如[12]～[16-1]中任一项所述的试剂盒，其中，内容物分开到复数个容器中进行保存。
[16-3]
如[12]～[16-2]中任一项所述的试剂盒，其中，R2为甲基。
[16-4]
如[12]～[16-3]中任一项所述的试剂盒，其中，R1为C15或C17的直链烷基。
[16-5]
如[12]～[16-4]中任一项所述的试剂盒，其中，X为-CH2-。
[16-6]
如[12]～[16-4]中任一项所述的试剂盒，其中，X为-C(O)-。
[17]
一种对Lp-PLA2参与的疾病和/或状态进行诊断和/或管理的方法，该方法包括下述工序：使用[12]～[16-6]中任一项所述的试剂盒，对来自被测体的试样中的Lp-PLA2活性进行测定。
[18]
如[17]所述的方法，其中，上述Lp-PLA2参与的疾病和/或状态为与动脉粥样硬化相伴的心血管疾病。
[19]
如[12]～[16-6]中任一项所述的试剂盒，其为Lp-PLA2参与的疾病和/或状态的诊断用试剂盒。
[20]
如[19]所述的试剂盒，其中，上述Lp-PLA2参与的疾病和/或状态为与动脉粥样硬化相伴的心血管疾病。
发明的效果
根据本发明，能够进行通用性高、简便、安全的Lp-PLA2的活性测定。进而，能够准确而难以受到干扰物质的影响地或高灵敏度地进行Lp-PLA2的活性测定。另外，本发明对于以动脉粥样硬化为代表的Lp-PLA2参与的疾病或状态的诊断和管理是有用的。
附图说明
图1是在参考例10中测定的各温度下的Lyso PAF-PLD的残存活性。
图2是在实施例1中以各种浓度的PAF为底物时的10分钟反应时间的各测光点处的吸光度变化。
图3是在实施例1中以各种浓度的Lyso PAF为底物时的10分钟反应时间的各测光点处的吸光度变化。
图4是在实施例14中向血清池J042中添加了各种浓度的rLp-PLA2后的吸光度变化。
图5是在实施例14中向血清池A中添加了各种浓度的rLp-PLA2后的吸光度变化。
图6是在实施例14中向血清池B中添加了各种浓度的rLp-PLA2后的吸光度变化。
图7是在实施例14中向血清池C中添加了各种浓度的rLp-PLA2后的吸光度变化。
图8是实施例15中利用本发明试剂和Cayman公司试剂所得到的Lp-PLA2活性的测定值的相关关系。
图9是实施例16中利用本发明试剂和R&D SYSTEMS公司ELISA试剂盒所得到的Lp-PLA2活性的测定值的相关关系。
图10是实施例18中利用本发明试剂的血清池J042的反应时间过程。
图11是实施例18中利用PLAC测试的血清池J042的反应时间过程。
图12是实施例18中利用Lp-PLA2 FS的血清池J042的反应时间过程。
图13是实施例20中利用本发明试剂和PLAC测试所得到的Lp-PLA2活性的测定值的相关关系。
图14是实施例20中利用Lp-PLA2 FS和本发明试剂所得到的Lp-PLA2活性的测定值的相关关系。
图15是实施例20中利用PLAC测试和Lp-PLA2 FS所得到的Lp-PLA2活性的测定值的相关关系。
图16是实施例21中利用本发明试剂得到的Lp-PLA2活性测定值的稀释线性。
图17是实施例21中利用PLAC测试得到的Lp-PLA2活性测定值的稀释线性。
图18是实施例21中利用Lp-PLA2 FS得到的Lp-PLA2活性测定值的稀释线性。
图19是将由实施例26中测定的Lp-PLA2浓度算出的变异系数(CV％)用白色圆表示、将2SD(标准偏差的2倍)用误差棒表示的曲线图。对Lp-PLA2浓度和变异系数进行幂近似，用实线表示(y＝37.644x-1.155)。
具体实施方式
下面，基于本发明的实施方式(也称为“本实施方式”)对本发明进行详细说明。以下的实施方式为用于说明本发明的例示，并不表示将本发明仅限定于该实施方式。
本说明书中，有时将碳原子仅表示为“C”，将氢原子仅表示为“H”，将氧原子仅表示为“O”，将氮原子仅表示为“N”，并且将磷原子仅表示为“P”。另外，有时将羰基仅表示为“-C(O)-”，将醚键仅表示为“-O-”(该情况下的“-”表示键)。另外，有时将双键仅表示为“＝”。
烃基是指从烃除去1个或2个以上氢原子后剩下的原子团，可以为直链、也可以具有支链，并且可以部分不饱和化。在本说明书和权利要求书中，“高级”和“低级”是指表示碳原子数的术语，其范围对本领域技术人员而言是能够容易理解的。例如，作为高级烃基，可例示出碳原子数为10～30的烃基，优选碳原子数为10～20的烃基，更优选碳原子数为15～17的烃基。另外，作为低级烃基，可例示出碳原子数为1～9的烃基，优选碳原子数为1～4的烃基、更优选碳原子数为1的烃基。
本说明书中，“烷基”表示为直链状或支链状的饱和烃基。
本说明书中，烃部分的碳原子的数目由“Cp”表示，即“Cp”表示具有“p”个碳原子。
在本实施方式的一个方式中，提供一种特定的酶的应用，其用于在血小板活化因子(PAF)类和Lyso PAF类的存在下，不进行将上述PAF类水解而生成胆碱的反应，而将上述Lyso PAF类水解而生成胆碱。另外，在本实施方式的一个方式中，提供一种方法，其以利用特定的酶水解Lyso PAF类而得到的水解物的变化量为指标，测定Lyso PAF类的浓度。
另外，在本实施方式的一个方式中，提供一种活性的测定方法，其测定包含脂蛋白相关磷脂酶A2(Lp-PLA2)的试样中的Lp-PLA2活性，该测定方法包括下述的工序(A)～工序(C)。
(A)使PAF类与试样中的Lp-PLA2反应而转换为Lyso PAF类的工序；
(B)利用特定的酶将工序(A)中生成的上述Lyso PAF类水解而得到水解物的工序；
(C)对于工序(B)中得到的水解物，以来自该水解物的变化量为指标，对试样中的Lp-PLA2活性进行测定的工序。
在本实施方式的一个方式中，Lp-PLA2活性测定的反应体系由下图所表示。
【化10】
在本实施方式的一个方式中，上述工序(A)例如如后述实施例所示，通过将包含Lp-PLA2的试样与包含PAF的试剂混合而实施。
在本实施方式中，“试样”是指测定对象，作为能够测定Lp-PLA2活性的“试样”，只要是包含或可包含Lp-PLA2的试样就没有特别限定。作为这样的试样，可以举出人或动物的血液、血清、血浆、尿或羊水等体液、以及人或动物的细胞、脏器或细胞和脏器的提取液等。试样优选为人来源的血液、血清、血浆。如后述的实施例24和25中记载的那样，根据本实施方式，即使在将试样于通常的样本保存温度范围(例如室温(1～30℃)和其以下的温度即低温箱(deep freezer)(～-80℃))中保存后，也能稳定地进行高灵敏度的Lp-PLA2活性测定。
在本实施方式中，Lp-PLA2(脂蛋白相关磷脂酶A2)是指至少将PAF的sn-2位的乙酰基水解而产生Lyso PAF、从而使PAF失活的酶。有时也被称为血小板活化因子乙酰水解酶(PAF-AH)。
在本实施方式中，血小板活化因子(PAF类)是指下述通式I所示的化合物。
【化11】
通式I中，R1为直链或支链的饱和或部分不饱和的高级烃基，可例示出C10以上C30以下的烃基，优选C10以上C20以下的烃基，更优选C15以上C17以下的烃基。在一个方式中，可例示出C10以上的直链烷基，优选C15的直链烷基、或C17的直链烷基，进一步优选C15的直链烷基。在一个方式中，R1也可以为部分不饱和化的烃基。在存在不饱和键的情况下，其数目优选为1个或2个，更优选为1个。作为部分不饱和化的R1，可例示出香叶基、香叶基香叶基、油烯基等。
通式I中，R2为直链的低级烷基，可例示出C1以上C9以下的烷基。通式I中的R2的分子越小，则作为Lp-PLA2的底物越优选(临床检查2012年2月56卷No.2 152页)，因而，在一个方式中，R2优选C1以上C4以下的烷基，优选甲基或丁基，更优选甲基。
通式I中，X为-C(O)-、-CH2-或-CH＝CH-，在一个方式中优选-CH2-，在另一个方式中，进一步优选-C(O)-。在一个方式中，X为-C(O)-的情况下，R1优选为C15的直链烷基(例如可例示出后述的1-棕榈酰基-2-乙酰基-sn-甘油-3-PC)，X为-CH2-的情况下，R1优选为C15或C17的直链烷基。另外，X为-CH＝CH-的情况下，可以为顺式体、也可以为反式体，优选反式体。
在本实施方式中，PAF类为以下说明的PAF和PAF类似物的统称，可以为天然存在的PAF类，也可以为人工合成的PAF类，包括立体化学为S体和R体的PAF类以及它们的任意比例的混合物形式的PAF类。在本实施方式的一个方式中，从Lp-PLA2活性的测定灵敏度的方面出发，有时优选使用光学活性体的PAF类，从制造费用等经济方面出发，有时还优选使用外消旋体的PAF类。
在本实施方式中，“PAF”是指通式I中X为-CH2-、R1为C15或C17的直链烷基、R2为甲基的化合物(分别有时也称为“PAF(C16)”或“PAF(C18)”)，可以为天然存在的PAF，也可以为人工合成的PAF，包括立体化学为S体和R体的PAF以及它们的任意比例的混合物形式的PAF。
在本实施方式中，“PAF类似物”是指通式I所定义的PAF类中的上述PAF以外的化合物，可以为天然存在的PAF类似物，也可以为人工合成的PAF类似物，包括立体化学为S体和R体的PAF类似物以及它们的任意比例的混合物形式的PAF类似物。作为“PAF类似物”的例子，可以举出缩醛磷脂(Plasmalogen)。缩醛磷脂包括天然存在的缩醛磷脂、人工合成的缩醛磷脂和具有光学活性时任意比例的其混合物形式的缩醛磷脂。作为这样的缩醛磷脂，例如可以举出Advances in Clinical Chemistry 2016年38卷109-116页中记载的缩醛磷脂。在一个方式中，PAF类为缩醛磷脂的情况下，R2优选甲基或丁基。
PAF类可以由Avanti Polar Lipids公司(美国阿拉巴马州)、Bachem公司(瑞士)等获得。光学活性体的PAF类可以利用J.Org.Chem.1995年60卷7706-7708页中公开的方法合成。外消旋体的PAF类可以以1-O-十六烷基-rac-甘油为起始原料，利用J.Org.Chem.1995年60卷7706-7708页中公开的方法进行合成。
在本实施方式的工序(A)中，作为PAF类的用量，只要是能够定量、半定量或定性地测定Lp-PLA2活性的量即可，优选为能够定量地测定的用量，作为其下限值，可例示出1mM以上、优选为5mM以上、进一步优选为7mM以上，上限值没有特别限制，优选可例示出50mM以下、进一步优选为20mM以下、特别优选为15mM以下。
在本实施方式中，“Lyso PAF类”是指通过将上述PAF类的sn-2位水解而产生的化合物，为下述通式II所示的化合物，
【化12】
式中，R1和X与通式I中的定义相同。Lyso PAF类为以下说明的Lyso PAF和LysoPAF类似物的统称。
在本实施方式中，“Lyso PAF”是指通式II中X为-CH2-、R1为C15或C17的直链烷基的化合物，可以为天然存在的Lyso PAF，也可以为人工合成的Lyso PAF，包括立体化学为S体和R体的Lyso PAF以及它们的任意比例的混合物形式的Lyso PAF。Lyso PAF可以在反应体系中生成。
在本实施方式中，“Lyso PAF类似物”是指通式II所定义的Lyso PAF类中的上述Lyso PAF以外的化合物，可以为天然存在的Lyso PAF类似物，也可以为人工合成的LysoPAF类似物，包括立体化学为S体和R体的Lyso PAF类似物以及它们的任意比例的混合物形式的Lyso PAF类似物。Lyso PAF类似物可以在反应体系中生成。
在本实施方式的一个方式中，例如可以如后述实施例中所示那样，通过使在工序(A)中利用Lp-PLA2由PAF类产生的Lyso PAF类与包含用于将该Lyso PAF类水解而生成胆碱的酶的试剂共存来实施工序(B)。
在一个方式中，工序(B)中使用的酶为以下的蛋白质。
(a)具有序列号1或9中记载的氨基酸序列的蛋白质；
(b)具有在序列号1或9中记载的氨基酸序列中一个或复数个氨基酸发生了缺失、置换或插入的氨基酸序列，不具有针对PAF的磷脂酶D样(PLD)活性，并且具有针对Lyso PAF的PLD活性的蛋白质；
(c)具有与序列号1或9中记载的氨基酸序列存在90％以上的序列同源性的氨基酸序列，不具有针对PAF的PLD活性，并且具有针对Lyso PAF的PLD活性的蛋白质。
在一个方式中，工序(B)中使用的酶可以为以下的蛋白质。
(d)具有由序列号2中记载的碱基序列所编码的氨基酸序列的蛋白质；
(e)具有由在序列号2中记载的碱基序列中一个或复数个碱基发生了缺失、置换或插入的碱基序列所编码的氨基酸序列的蛋白质，且该蛋白质不具有针对PAF的PLD活性、并且具有针对Lyso PAF的PLD活性；
(f)具有由与序列号2中记载的碱基序列存在90％以上的序列同源性的碱基序列所编码的氨基酸序列的蛋白质，且该蛋白质不具有针对PAF的PLD活性、并且具有针对LysoPAF的PLD活性。
在上述(b)的蛋白质中，“一个或复数个氨基酸发生了缺失、置换或插入的氨基酸序列”只要蛋白质具有所期望的活性就没有特别限定，例如为1个或几个、更具体而言1～9个、优选1～5个、更优选1～3个氨基酸发生了缺失等的氨基酸序列。
同样地，在上述(e)的蛋白质中，“一个或复数个碱基发生了缺失、置换或插入的碱基序列”只要所编码的蛋白质具有所期望的活性就没有特别限定，例如是指1个或几个、更具体而言1～9个、优选1～5个、更优选1～3个碱基发生了缺失等的碱基序列。
在上述(c)的蛋白质中，“与序列号1中记载的氨基酸序列存在90％以上的序列同源性的氨基酸序列”只要蛋白质具有所期望的活性就没有特别限定，例如为存在92％以上、优选95％以上、更优选98％以上、进一步优选99％以上的上述序列同源性的氨基酸序列。
同样地，在上述(f)的蛋白质中，“与序列号2中记载的碱基序列存在90％以上的序列同源性的碱基序列”只要蛋白质具有所期望的活性就没有特别限定，例如为存在92％以上、优选95％以上、更优选98％以上、进一步优选99％以上的上述序列同源性的碱基序列。
上述(a)～(f)的蛋白质可以在N端侧和/或C端侧插入有用于将本实施方式的酶输送至菌体外或周质的SEC系统或TAT系统的信号肽、用于进行高效的纯化的组氨酸标签、Strep标签、TARGET标签、FLAG标签等亲和标签、用于对所表达的蛋白质的凝集进行改善的麦芽糖结合蛋白标签、硫氧还蛋白标签、谷胱甘肽S-转移酶标签、用于增大蛋白质的表达量的TEE标签、作为标记的GFP标签等具有功能性的肽、标签和其他连接子等不具有功能的氨基酸序列构成的部分。这些氨基酸序列可以串联插入，也可以在各氨基酸序列之间等处配置数个蛋白酶识别氨基酸序列并插入。出于使本实施方式的酶的功能达到最大限度等目的，这些氨基酸序列(例如标签)可以将全部或一部分除去。在一个方式中，上述(a)～(f)的蛋白质在序列号9中记载的氨基酸序列或在序列号9中记载的氨基酸序列中一个或复数个氨基酸发生了缺失、置换或插入的氨基酸序列中插入有上述的信号肽等氨基酸序列。
在本实施方式中，作为优选的信号肽的例子，可以举出OmpT、PelB等人、J.Biol.Chem.2007年282卷8309-8316页、Recent Patents on Biotechnology 2010年4卷23-29页中记载的大肠杆菌的TAT系统和SEC系统信号肽以及序列号1的第1～25位的氨基酸序列。
在本实施方式中，有时也将上述(a)～(f)的蛋白质称为“Lyso PAF-PLD”。“LysoPAF-PLD”例如可以依照专利文献5中记载的方法来制造，具体而言，例如可以如后述参考例1～3中所示那样，利用包括下述工序的方法进行制造：在培养基中，对包含编码序列号1或9的氨基酸序列的基因或具有序列号2的碱基序列的基因的微生物、或利用包含该基因的重组载体的转化体进行培养的工序；使Lyso PAF-PLD在培养物中生成蓄积的工序；以及从该培养物中采集Lyso PAF-PLD的工序。Lyso PAF-PLD可以以混杂有原料、其他制造物等的状态使用，根据目的和用途等的不同，有时优选实质上不包含杂质，通常可以纯化至例如50％以上、70％以上或95％以上的纯度。在想要提高经济性的情况下，使用纯度低的Lyso PAF-PLD即可；在想要提高特异性的情况下，使用纯度高的Lyso PAF-PLD即可。另外，作为LysoPAF-PLD的突变体的上述(b)、(c)、(e)和(f)的蛋白质可以通过使用本领域技术人员公知的方法获得，例如，以Lyso PAF-PLD的质粒为模板，按照市售的KOD-Plus-Mutagenesis Kit(Code No.：SMK-101)的所附文件进行反向PCR来获得。
在本实施方式中，关于Lyso PAF-PLD的用量，只要能够测定Lp-PLA2活性就没有特别限定，为了进行稳定的测定，优选为0.1mg/mL以上，从经济性的方面出发，优选为0.01mg/mL～1.5mg/mL的范围，通常从两个方面出发，优选为0.1mg/mL～1.5mg/mL的范围。
在本实施方式中，“PLD活性”是指磷脂酶D(Phospholipase D)样的活性，是指例如将PAF或Lyso PAF的胆碱部位与磷酸部位之间的键合水解的酶活性。例如，在底物为PAF类的情况下，PLD活性是指催化下述反应、水解PAF类而生成PAF脱胆碱体类和胆碱的酶活性。
【化13】
同样地，在底物为Lyso PAF类的情况下，PLD活性是指水解Lyso PAF类而生成LysoPAF脱胆碱体类和胆碱的酶活性。
在本实施方式中，“Lyso PAF脱胆碱体类”是指通过将上述Lyso PAF类的胆碱部位与磷酸部位之间的键合水解而生成的磷酸衍生物。可例示出下述通式III所示的化合物。
【化14】
(式中，R1与通式I中的定义相同。)
Lyso PAF脱胆碱体类也包括作为下述通式IV所示的链状体而存在的物质。
【化15】
(式中，R1与通式I中的定义相同。)
工序(B)中使用的酶是不具有针对PAF的PLD活性、并且具有针对Lyso PAF的PLD活性的蛋白质。通过这样的特异性，只有在工序(A)中由于试样中的Lp-PLA2活性而由PAF类生成的Lyso PAF类在工序(B)中受到水解。关于酶是否具有针对PAF的PLD活性、以及酶是否具有针对Lyso PAF的PLD活性，如后述实施例1中记载的那样，可以通过使PAF或Lyso PAF与酶反应，并确认有无因PLD活性而产生的反应产物(优选胆碱)来实施。例如，在本实施方式中，提到酶“不具有针对PAF的PLD活性”时，在后述实施例1中记载的条件下使PAF与酶反应的情况下，是指PAF的95％以上未分解而残存的酶活性，优选是指PAF的98％以上、更优选PAF的99％以上未分解而残存的酶活性。
关于工序(A)和(B)中的试样(sample)与试剂(reagent)的比例、即S/R比，只要能够测定Lp-PLA2活性就可以为任意的比例，从避免试样来源的共存物质的影响的方面出发，优选1：40～1：200的范围，从以更高的灵敏度进行测定的方面出发，优选1：5～1：20的范围。在一个方式中，从上述两个方面出发，S/R比优选为1：30～1：100的范围。需要说明的是，例如在使用试样5μL、第一试剂150μL和第二试剂100μL的情况下，S/R比为1：50。
在本实施方式的一个方式中，关于在上述工序(C)中作为指标的“来自工序(B)中得到的水解物的变化量”，只要是能够以其为指标而测定试样中的Lp-PLA2活性的量就没有特别限定，可例示出胆碱量或Lyso PAF脱胆碱体类量，从测定容易性的方面出发，更优选胆碱量。
在本实施方式的一个方式中，工序(C)可以进一步包括下述的工序(C-1)：
(C-1)使胆碱与胆碱氧化酶反应而生成过氧化氢的工序。
如后述实施例所示，工序(C-1)可以通过使利用Lyso PAF-PLD由Lyso PAF生成的胆碱与包含胆碱氧化酶的试剂接触而实施。
在本实施方式的一个方式中，工序(C)可以进一步包括下述的工序(C-2)：
(C-2)通过使用显色试剂的比色分析法，对工序(C-1)中生成的过氧化氢的量进行测定的工序。
例如如后述实施例中所示那样，工序(C-2)可以通过在使工序(C-1)中生成的过氧化氢与过氧化物酶和显色试剂反应后对吸光度进行测定而实施。
在本实施方式中，作为对工序(C-1)中生成的过氧化氢的量进行测定的方法，可例示出下述方法：使用过氧化物酶等生成色素等，利用比色分析对显色进行测定，但不限于该方法，只要使用公知的测定方法即可。例如，可以利用发光、荧光等对上述过氧化氢量进行测定，并且也可以利用电化学方法进行测定。
作为来自工序(B)中得到的水解物的变化量而对胆碱量进行测定的情况下，可以直接(例如使用基于HPLC的方法、利用LC/MS的方法等)对胆碱进行测定。
在本实施方式中，所使用的胆碱氧化酶只要能够有效地作用于试样和反应体系中包含的胆碱并将胆碱氧化，就没有限定，优选分类为EC 1.1.3.17的酶。例如，可以举出来自球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)的胆碱氧化酶、或胆碱氧化酶(Choline oxidase(COD、旭化成制药株式会社(T-05))、(Ikuta,S.,Matsuura,K.,Imamura,S.,Misaki,H.andHoriuchi,Y.(1977)J.Biochem.,82,157-163))或其重组体以及东洋纺株式会社制造的胆碱氧化酶(商品名：CHO-301)等。
作为测定过氧化氢的量时的显色试剂，可以使用：在过氧化物酶的存在下，通过4-AA或3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙(MBTH)等偶联剂与苯酚等色原体的氧化缩合而生成色素的Trinder’s试剂；在过氧化物酶的存在下直接氧化、显色的隐色型试剂等。作为Trinder’s型试剂的色原体，可以使用苯酚衍生物、苯胺衍生物、甲苯胺衍生物等，作为具体例，可以举出N-乙基-N-(2-羟基-3-磺基丙基)-3-甲基苯胺,钠盐,二水合物(TOOS)、N,N-双(4-磺基丙基)-3-甲基苯胺,二钠盐(TODB)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺基丙基)-3,5-二甲氧基苯胺钠盐(DAOS)(以上为同人化学研究所制造)等同人化学研究所的第30版综合商品目录中记载的色原体。另外作为隐色型试剂的具体例，可以举出N-(羧甲基氨基羰基)-4,4-双(二甲氨基)联苯胺(DA64)、10-(羧甲基氨基羰基)-3,7-双(二甲氨基)吩噻嗪(DA67)(以上为和光纯药公司制造)等。在一个方式中，从测定灵敏度的方面出发，作为Trinder’s试剂，优选使用TOOS或TODB。
在利用荧光法测定过氧化氢的量的情况下，使用通过氧化而发出荧光的化合物、例如高香草酸、4-羟基苯基乙酸等，在利用化学发光法进行测定的情况下，使用鲁米诺、光泽精、异鲁米诺等作为催化剂，利用公知的方法进行测定。
在使用电极测定过氧化氢的量的情况下，电极只要是能够在与过氧化氢之间交换电子的材料即可，没有特别限制，例如可以举出铂、金、银或玻碳等碳材料等，作为电极测定方法，可以使用安培法、电位法、库仑法等公知的方法。此外，也可以使电子载体介于氧化酶或底物与电极之间的反应中，对所得到的氧化、还原电流或其电量进行测定。作为电子载体，可以使用具有电子传递功能的任意的物质，例如可以举出二茂铁衍生物、醌衍生物等物质。另外，也可以使电子载体介于由氧化酶反应生成的过氧化氢与电极之间，对所得到的氧化、还原电流或其电量、电位的变化进行测定。
在本实施方式中，作为“Lp-PLA2的活性测定”，可例示出测定胆碱量的方法，但不限于此，通过对Lyso PAF脱胆碱体类进行定量也能够测定Lp-PLA2活性。作为Lyso PAF脱胆碱体类的定量方法，只要使用现有的定量方法即可，例如可以通过基于HPLC的方法、使用显色试剂的方法、使用LC/MS或LC-MS/MS的方法等进行测定。
在本实施方式的一个方式中，Lp-PLA2活性的测定方法可以在工序(A)之前包括下述的工序(D)：
(D)将试样中的胆碱除去的工序。
如后述实施例中所示，工序(D)可以通过使包含胆碱的试样与包含胆碱氧化酶的试剂共存而实施。
在本实施方式中，作为“将胆碱除去的工序”，可例示出使用胆碱氧化酶将试样中的胆碱氧化并除去的工序，但不限于此，只要能够在不对本测定体系产生影响的范围内将胆碱从反应体系中除去即可，也可以通过透析、凝胶过滤、超滤等来进行。
在本实施方式中，Lp-PLA2活性的测定方法中的各工序的“温度”可例示出37℃，但不限于此，只要在所使用的酶通常发挥功能的温度范围进行测定即可，各工序的温度也可以不同。例如，工序(B)可以在Lyso PAF-PLD具有活性的任意温度下实施。如后述参考例10所示，Lyso PAF-PLD即便在20～60℃保存也不失活，因此优选在20～60℃的范围测定Lp-PLA2活性。
另外，胆碱氧化酶在20～60℃也不完全失活，因此，使用胆碱氧化酶的工序也可以在该温度范围实施。胆碱氧化酶尤其是在40℃以下稳定性高，因此特别优选在40℃以下进行测定。
在本实施方式中，作为实施Lp-PLA2活性的测定方法的“测定时间”，可例示出10分钟，但不限定于此。也可以在测定之前设置例如将PAF类和Lyso PAF-PLD进行混合的预保温的时间。也可以没有预保温的时间，只要是试样的成分与第1试剂能够充分反应的时间则更优选。预保温是指为了提高测定精度或反应性而将试样与试剂预先混合、或以试剂单独进行的预备加热工序。时间、温度可以根据预保温的目的适当变更，例如在以利用酶消除试样中或试剂原料中的不需要物质的目的进行时，可以在酶充分发挥功能的温度(例如37℃左右)实施。
另外，如后述实施例18中所示，将试样与包含Lyso PAF-PLD的第1试剂混合并预保温后，加入包含PAF的第2试剂，之后立即开始反应，因而工序(A)～(C)也可以同时开始。
在本实施方式中，试样量适当增减而使用即可，在想要高灵敏度地测定的情况下，增大试样量即可，在想要降低血红蛋白或胆红素等干扰物质的影响的情况下，减小试样量即可，在一个方式中，优选使用3μL以上。
在本实施方式的一个方式中，从维持和/或提高所使用的酶的反应性和/或稳定性的方面出发，优选使用蛋白质·酶的基础实验法(修订第2版、堀尾武一、1994年南光堂)或同人化学研究所的第30版综合商品目录中记载的“缓冲液(有时也称为缓冲剂)”。“缓冲液”只要能够保持目标pH就没有限定，可例示出Good’s pH缓冲液(MES、Bis-Tris、ADA、PIPES、ACES、BES、MOPS、TES、HEPES、DIPSO、TAPSO、POPSO、HEPPSO、EPPS、Tricine、Bicine、TAPS、CHES、CAPS等)、Tris缓冲液、二乙醇胺缓冲液、碳酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸缓冲液、磷酸缓冲液、双甘氨肽缓冲液、乙酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、琥珀酸缓冲液、马来酸缓冲液、三乙醇胺缓冲液、咪唑缓冲液等。这些缓冲液可以使用盐酸等强酸或NaOH等强碱调整到能够作为缓冲剂使用的pH范围而使用。优选HEPES、MOPS、TES、PIPES、Pi-K(磷酸钾)、Tris，更优选Tris。
关于“缓冲液”的浓度，只要能够保持目标pH就没有特别限定，作为下限值，可例示出3mM以上、优选为5mM以上、进一步优选为10mM以上，作为上限值，可例示出500mM以下、优选为200mM以下、进一步优选为100mM以下。作为更优选的浓度，可例示出25mM以上100mM以下，进一步优选50mM。
在本实施方式的一个方式中，各工序的“pH”只要是不丧失酶活性的pH就没有限定，作为下限值，可例示出pH5.0以上、优选为pH6.0以上、进一步优选为pH7.0以上，作为上限值，可例示出pH9.0以下、优选为pH8.5以下、进一步优选为pH8.0以下。在一个方式中，各工序在pH7.5条件下实施。pH可以参照所使用的各酶的最适pH而适当设定，例如，从Lp-PLA2活性的最适pH的方面出发，其pH可例示出pH6.0以上作为下限值，作为上限值可例示出pH9.0以下，优选可例示出pH7.5以上pH8.0以下，进一步优选可例示出pH7.5以上pH7.75以下。由于能够在中性附近实施测定，因而能够实施测定而不易受到空气中的二氧化碳的影响。
本实施方式的一个方式中的Lp-PLA2活性测定方法可以使用含有上述酶、缓冲剂等的组合物(试剂)来进行。在这样的组合物中，如下所述，可以进一步追加用于改善稳定性、准确性和/或特异性的酶、活化剂、盐、表面活性剂、稳定化剂、螯合剂、糖或防腐剂等通常用于酶的活性测定用组合物的物质而使用。
在本实施方式中，为了消除试样中包含的抗坏血酸，可以使用抗坏血酸氧化酶(ascorbate oxidase)。抗坏血酸氧化酶优选具有实质上消除抗坏血酸的作用的物质，更优选分类为EC 1.10.3.3的酶。例如，可以使用来自葫芦科植物的抗坏血酸氧化酶。作为优选例，从酶的稳定性高的方面出发，可以举出来自支顶孢属(Acremonium属)的抗坏血酸氧化酶(旭化成制药株式会社(T-53))，从不受到叠氮化钠的抑制的方面出发，可以举出AmanoEnzyme inc.制造的抗坏血酸氧化酶(商品名ASO-3)。抗坏血酸可以使用AAQ(抗坏血酸猝灭剂、同仁化学制造)等以化学方式消除。
在本实施方式中，为了消除过氧化氢，有时使用过氧化氢酶(catalase)。过氧化氢酶会被叠氮化钠抑制活性，优选具有实质上消除过氧化氢的作用的物质，更优选分类为EC1.11.1.6的酶，但不限定于此。过氧化氢酶的用量没有限定，通常在10～5000U/mL的范围使用。作为过氧化氢酶的优选例，从纯度高的方面出发，可以举出来自节杆菌属(Arthrobacter属)(旭化成制药株式会社)的过氧化氢酶，从容易以低成本获得的方面出发，可以举出来自动物(SIGMA(C1345等))的过氧化氢酶。
在本实施方式中，为了消除试样中包含的胆红素，有时使用亚铁氰化钾盐(K4[Fe(CN)6](抗衡离子是任意的))。亚铁氰化钾的用量没有限定，通常在1～500μM的范围使用。亚铁氰化钾引起非特异性显色等对本实施方式产生不良影响的情况下，降低其浓度、或添加后述螯合剂即可。亚铁氰化钾在水溶液中因溶解氧的影响而以与铁氰化钾的平衡状态存在是公知的。
在本实施方式中，试样中和/或试剂原料中混杂有甘磷酸胆碱(以下记为GPC)的情况下，为了消除GPC，可以使用具有甘磷酸胆碱磷酸二酯酶(glycerophosphorylcholinephosphodiesterase。以下记为GPCP)活性的酶。GPCP优选具有实质上消除GPC的作用的物质，更优选分类为EC 3.1.4.2的酶。作为市售品，可以举出来自粉红粘帚霉(Gliocladiumroseum)的GPCP(旭化成制药株式会社(T-33))。另外，分类为EC 3.1.4.46的甘油磷酸二酯磷酸二酯酶(glycerophosphodiester phosphodiesterase)也具有消除GPC的作用，可以使用。另外，也可以基于基因工程的方法制作序列已知的具有GPCP活性的酶的重组体(田村隆明(2012).基礎から学ぶ遺伝子工学(从基础学习的基因工学)等)来使用。
在本实施方式中，如上所述进行试样中的物质的消除的情况下，根据需要可以对试样和包含上述各酶中的任意一种以上的试剂进行预保温。另外，希望预先消除试剂原料中包含的物质的情况下，可以在试剂制备后根据需要进行预保温。
在本实施方式中，作为酶的活化剂，有时使用“盐”。“盐”的优选例为CaCl2，作为其他例子，可以举出使Lyso PAF-PLD和胆碱氧化酶活化的盐，例如可以举出MgCl2、NaCl、KCl、硫酸铵或NH3Cl等。另外，也可以将两种以上的盐以任意的比例混合使用。只要酶发挥作用，则构成盐的阴离子不限定于Cl-。
在本实施方式中，作为“盐”的使用浓度，只要为使Lyso PAF-PLD和胆碱氧化酶活化的量即可，作为下限值可例示出0mM以上，上限值没有特别限制，优选可例示出200mM以下、进一步优选为100mM以下、特别优选为10mM以下。另外，试样和反应体系中足量包含酶活化所需金属离子时，也可以不加入盐。
在本实施方式中，为了提高测定的稳定性、准确性以及特异性，有时使用“表面活性剂”。作为“表面活性剂”，可例示出Triton X-100(以下记为Tx-100)，但不限于此，只要能够测定Lp-PLA2活性即可。例如可以使用聚氧乙烯烷基醚类、聚氧乙烯仲烷基醚类、聚氧化烯烷基醚类、聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯类、聚氧乙烯甘油脂肪酸酯类、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯类、聚氧乙烯烷基苯基甲醛缩合物、聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯甾醇类、聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚类、聚氧乙烯羊毛脂类、聚氧乙烯烷基胺·脂肪酰胺类、聚氧乙烯烷基醚磷酸·磷酸盐类、聚氧乙烯烷基醚硫酸盐类、聚甘油脂肪酸酯类、甘油脂肪酸酯类、丙二醇脂肪酸酯类、山梨聚糖脂肪酸酯类、N酰基氨基酸盐类、烷基醚羧酸盐类、烷基磷酸盐、N酰基牛磺酸酸盐、磺酸盐、烷基硫酸、乙酸甜菜碱型两性表面活性剂、咪唑啉型两性表面活性剂、卵磷脂衍生物、聚乙二醇类、聚乙二醇月桂基醚、聚乙二醇异辛基苯基醚、聚丙二醇、聚乙烯醇等本领域技术人员公知的任意的表面活性剂。作为优选的例子，可以举出非离子型表面活性剂的醚型或酯型，作为更优选的例子，可以举出选自由HLB值为12以上19以下的聚氧乙烯衍生物、聚氧乙烯烷基醚以及聚氧乙烯烷基胺组成的组中的非离子表面活性剂，进一步优选可以举出聚氧乙烯仲烷基(7-21)醚、聚氧乙烯辛基苯基醚、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯月桂基醚、聚氧化烯烷基醚等。作为市售的表面活性剂，可例示出NIKKOL BT-7、NIKKOL BT-9、NIKKOL BT-12、NIKKOL BT-21(Nikkol Chemicals株式会社)、Tx-100、EMULGEN 709、EMULGEN 108、EMULGEN 1108、EMULGEN1118S-70、EMULGEN 1150S-60、LS-106、LS-110(花王株式会社)等。从表面活性剂的溶解性的方面出发，优选聚氧乙烯烷基苯基醚系非离子型表面活性剂。作为商品名，可例示出Tx-100、EMULGEN 909、EMULGEN 910、EMULGEN 911(花王株式会社)、NIKKOL OP-3、NIKKOL OP-10、NIKKOL OP-30(Nikkol Chemicals株式会社)、非离子HS-208、HS-210、HS-208、HS-208.5、NS210(日油株式会社)等。出于降低环境负担、防止健康损害的理由，从1990年代末时起开始广泛研究NPE的替代方法(壬基苯酚和壬基苯酚乙氧基化物的风险管理的现状与今后应有的状态独立行政法人制品评价技术基盘机构(http://www.nite.go.jp/data/000010070.pdf))，可以选择从该角度出发所开发的下述商品目录中记载的表面活性剂(花王的表面活性剂花王株式会社2012/8、产品综合商品目录Nikkol Chemicals株式会社等)，优选EMULGEN 1118S-70、EMULGEN 1150S-60。另外，也可以将两种以上的表面活性剂混合使用。
在本实施方式中，表面活性剂的使用浓度没有特别限定，可以根据所使用的表面活性剂的种类而适当设定，可例示出0.2％以下，优选0.1％以下。
在本实施方式中，为了提高测定的稳定性、准确性以及特异性，有时使用蛋白质·酶的基础实验法(修订第2版、堀尾武一、1994年南光堂)或同人化学研究所的第30版综合商品目录中记载的“螯合剂”。作为这样的“螯合剂”，可以举出EDTA、EGTA、NAT和柠檬酸或琥珀酸等有机酸等，其种类和浓度没有限定。例如含有EDTA时的浓度通常为0.05mM以上10mM以下的范围。对于螯合剂来说，在组合物内容物中混杂有将金属用于活性表达的蛋白酶的情况下，通过抑制该活性的作用，能够作为组合物中的酶的稳定化剂发挥功能。
在本实施方式中，将测定试剂制成组合物的情况下，为了提高组合物的稳定性，有时使用“稳定化剂”。作为这样的“稳定化剂”，可以使用牛白蛋白、卵白蛋白、人白蛋白、晶状体蛋白等不具有催化作用的蛋白质，其种类和浓度没有限定。例如在含有牛白蛋白的情况下，通常其含量为0.01(w/v)％以上5(w/v)％以下的范围。这些蛋白质会成为蛋白酶的底物，因此有时会成为酶的稳定化剂。另外，在将组合物冷冻干燥的情况下，能够作为赋形剂发挥功能。
在本实施方式中，将测定试剂制成组合物的情况下，为了提高组合物的稳定性，有时使用“糖”。作为这样的“糖”，可以举出甘露醇、海藻糖、环糊精等，只要其浓度在可溶解的范围内就没有限定。例如在含有蔗糖的情况下，为0.05(w/v)％以上、优选为0.1(w/v)％以上、进一步优选为0.3(w/v)％以上，上限值为30(w/v)％以下、优选为10(w/v)％以下、进一步优选为5(w/v)％以下。另外，在将组合物冷冻干燥的情况下，这些“糖”能够作为赋形剂发挥功能。
在本实施方式中，将测定试剂制成组合物的情况下，为了防止组合物的劣化和变质等，可以使用“防腐剂”，其种类和浓度没有限定。例如在使用叠氮化钠或ProClin(件号48911-U,Sigma-Aldrich)的情况下，可例示出0.005(w/v)％以上、优选为0.01(w/v)％以上、进一步优选为0.03(w/v)％以上，上限值可例示出1(w/v)％以下、优选为0.5(w/v)％以下、进一步优选为0.1(w/v)％以下。例如在使用抗生素的情况下，下限值可例示出5μg/mL以上、优选为10μg/mL以上、进一步优选为30μg/mL以上，上限值可例示出100μg/mL以下、优选为75μg/mL以下、进一步优选为60μg/mL以下。
在本实施方式的一个方式中，用于测定Lp-PLA2活性的组合物可以以液态物、液态物的冷冻物、液态物的冷冻干燥物或液态物的干燥物(基于加热干燥和/或风干和/或减压干燥等)等的形态来提供。另外，例如在用于定点照护装置的毛细管或作为酶传感器使用的情况下，各成分的浓度优选为高于通常的浓度，例如优选进行固定化、渗入纸或膜中、或制成凝胶/溶胶状检查试剂盒来使用。
对于本实施方式中的上述组合物，可以将组合物中的各成分制成单一的组合物，也可以分离为两种以上的组合物。有时也将这样的两种以上的组合物一并称为试剂盒。
本实施方式在一个方式中提供一种试剂盒，其测定试样中的Lp-PLA2活性，该试剂盒包含Lyso PAF-PLD和PAF类。
本实施方式中的试剂盒也可以制成进而与至少包含已知量的Lp-PLA2的校准试剂一起使用的试剂盒。作为上述校准试剂，例如可以举出至少包含已知量的Lp-PLA2的试剂，优选进一步包含上述的活化剂、盐、表面活性剂、稳定化剂、螯合剂、糖或防腐剂等中的一种或两种以上。例如，作为市售品，可以举出TruCal Lipid(Diasys公司制造)等。这些试剂的成分的种类或浓度等条件等可以由本领域技术人员适当决定。作为使用上述试剂的校准方法，除了单点校正以外，还可以适当选择多点校正(折线或样条曲线)或多点校正的线性回归等。
校准试剂中的Lp-PLA2的已知量没有特别限定，按照能够准确地测定试样中的Lp-PLA2的方式适当选择即可。试样为被测者的血清或血浆的情况下，校准试剂中的Lp-PLA2的已知量的下限值为5U/L以上、优选为10U/L以上、进一步优选为15U/L以上，上限值可以设为600U/L以下、优选为300U/L以下、进一步优选为150U/L以下。需要说明的是，这些值在试剂组成、温度、测定波长、副波长等测定条件或活性值的定义中有时不同。
在一个方式中，从更多试样的测定值进入校正曲线的范围内的方面出发，校准试剂中的Lp-PLA2的已知量(已知浓度)优选设定为高浓度，从提高试样测定值的准确度(accuracy)的方面出发，优选设定为试样的Lp-PLA2浓度最大概率值(例如，试样为人来源的血清或血浆时为约20U/L)附近。
作为使校准试剂中的Lp-PLA2的已知量为高浓度的方法，可例示出添加重组(重组体)Lp-PLA2的方法(WO 2015/048177)。另外，在不使用重组Lp-PLA2的情况下(例如，使用天然的人型Lp-PLA2的情况下)，可以将假定Lp-PLA2浓度高的试样(例如，人来源的血清、血浆等)直接或进行汇合，对校准试剂进行调整。关于假定Lp-PLA2浓度高的试样，可以以据报道与Lp-PLA2浓度相关性高的LDL-C(LDL胆固醇)或体重为参考来进行选择(非专利文献1)。另外，也可以将人型Lp-PLA2纯化、或通过冷冻干燥等浓缩后而使用。
在制备Lp-PLA2浓度最大概率值附近的校准试剂的情况下，使用一般的试样(人来源的血清或血浆等)或将它们汇合而使用即可。作为这样的校准试剂的一例，可以举出后述的实施例中记载的血清池J042-II。需要说明的是，校准试剂有时也称为校准液(calibrator)。另外，(U/L)有时也表示为(nmol/min/mL)。
用于这样的校准试剂的Lp-PLA2优选为人型Lp-PLA2，若反应性一致则也可以使用动物来源等。
本实施方式中的试剂盒可以为1试剂体系，也可以为2试剂体系以上，优选为2试剂体系。在制成2试剂体系的情况下，在一个方式中，从经济的方面和简化各试剂的组成、简便地进行测定条件的设定的方面出发，优选制成第一试剂包含Lyso PAF-PLD、第二试剂包含PAF类的试剂盒。此外，更优选制成第1试剂包含胆碱氧化酶的试剂盒。
在本实施方式的一个方式中，将试剂盒制成2试剂体系的情况下，Lyso PAF-PLD可以包含于第1试剂和第2试剂两者中，优选仅包含于第1试剂中。另外，Lyso PAF-PLD也可以通过包含于第2试剂而非第1试剂中来实施。此时，可以在第1试剂中进一步加入具有PLA1活性的酶和GPCP。作为具有PLA1活性的酶，只要是不作用于PAF而分解血清中的溶血磷脂(溶血磷脂酰胆碱等)的酶即可，例如可以举出MGLPII、LYPL，优选MGLPII。
需要说明的是，如后述实施例22和23中所示，在本实施方式的一个方式中，在制备第1试剂和第2试剂后，即使长时间(例如，4℃18个月、37℃2周等)保存后也能简便且高灵敏度地测定Lp-PLA2活性。
试剂盒可以进一步包含胆碱氧化酶。在本实施方式的一个方式中，胆碱氧化酶可以包含于第1试剂和第2试剂两者中，从测定灵敏度的方面出发，优选仅包含于第1试剂中。通过使第1试剂包含胆碱氧化酶，能够将试样中预先包含的胆碱除去。需要说明的是，也可以通过加入第2试剂而非第1试剂中来实施测定。
试剂盒可以进一步包含过氧化物酶和显色试剂。在本实施方式的一个方式中，过氧化物酶可以包含于第1试剂和第2试剂中的任一者中。在本实施方式的一个方式中，使用隐色型试剂作为显色试剂的情况下，可以包含于第1试剂和第2试剂中的任一者中。另外，在使用偶联剂和Trinder’s型试剂作为显色试剂的情况下，两者分开包含于第1试剂和第2试剂中即可，包含于任一者中均可。
试剂盒可以进一步追加上述缓冲液、上述活化剂、上述盐、上述表面活性剂、上述稳定化剂、上述螯合剂、上述酶、上述糖或上述防腐剂等通常用于酶的活性测定用组合物中的物质而使用。
根据本实施方式的测定方法、组合物和试剂盒，可以利用Lyso PAF-PLD的底物特异性，使用通用的生物化学自动分析仪来测定Lp-PLA2活性，并且能够以2试剂体系进行测定，因而能够提供通用性高且简便的测定方法。此外，由于能够测定Lp-PLA2活性而使用放射性同位素等，因而能够提供安全的测定方法。此外，由于该方法使用Lp-PLA2的原本的底物即PAF，测定Lp-PLA2的活性值而不是物质量，因而能够提供可准确地反映生物体内的Lp-PLA2活性的测定方法。
另外，本实施方式涉及一种Lp-PLA2参与的疾病和/或状态的诊断用试剂盒，该诊断用试剂盒包含上述组合物或试剂盒。本实施方式进一步涉及使用了上述试剂盒的Lp-PLA2参与的疾病或状态的诊断和管理。Lp-PLA2被认为是与各种疾病或炎症有关的因子，也刊登于欧美的各种准则中((1)ACCF/AHA Guideline for Assessment of CardiovascularRisk in Asymptomatic Adults(2010)、(2)AHA/ASA Guideline Guidelines for thePrimary Prevention of Stroke(2011)、(3)AACE Guideline for Management ofDyslipidemia and Prevention of Atherosclerosis(2012),(4)European Guideline oncardiovascular disease prevention in clinical practice(2012))。作为可利用本实施方式的试剂盒进行诊断和/或管理的、Lp-PLA2参与的疾病或状态，可以举出心血管疾病、炎性疾病、肾病、败血症、癌症等，作为心血管疾病，可以举出动脉粥样硬化、脑卒中等，在一个方式中，优选与动脉粥样硬化相伴的心血管疾病。
实施例
以下，通过实施例和参考例(以下有时称为“实施例等”)对本发明进行更具体的说明，但本发明的范围不限定于下述实施例等。例如，本实施例等中的“本发明试剂”不过为本发明的一个具体例，并不对本发明的范围做出任何限定。
文中的缩写表示下述含义。
PLD：磷脂酶D(Phospholipase D)
EDTA：乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraacetic acid)
Tris：2-氨基-2-羟基甲基-1,3-丙二醇(2-Amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol)
Tx-100：Triton X-100(Triton X-100)
CV：柱体积(Column Volume)
SDS：十二烷基硫酸钠(Sodium dodecyl sulfate)
PAGE：聚丙烯酰胺凝胶电泳(Poly Acrylamide Gel Electrophoresis)
ASOM：抗坏血酸氧化酶(Ascorbate Oxidase)
TODB：N,N-双(4-磺基丁基)-3-甲基苯胺二钠(N,N-Bis(4-sulfobutyl)-3-methylaniline,disodium salt)
4-AA：4-氨基安替比林(4-Aminoantipyrine)
SR比：试样(Sample)与试剂(Reagent)量之比
rLp-PLA2：重组体Lp-PLA2(recombinant Lp-PLA2)
Bis-Tris：双(2-羟基乙基)亚氨基三(羟基甲基)甲烷(Bis(2-hydroxyethyl)iminotris(hydroxymethyl)methane)
HEPES：2-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]乙烷磺酸(2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid)
MOPS：3-吗啉代丙烷磺酸(3-Morpholinopropanesulfonic acid)
TES：N-三(羟基甲基)甲基-2-氨基乙烷磺酸(N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonic acid)
PIPES：哌嗪-1,4-双(2-乙烷磺酸)(Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonicacid))
PC：磷酸胆碱(phosphocholine)
FTU：福尔马肼浊度(Formazin Turbidity Unit)
本实施例等中使用的试剂由下述制造商适当购入使用。
1)Tris(和光纯药公司制造)
2)EDTA(同仁化学研究所制造)
3)KCl(和光纯药公司制造)
4)Tx-100(和光纯药工业公司制造)
5)CaCl2(和光纯药公司制造)
6)ASOM(T-53,旭化成制药公司制造)
7)TODB(同仁化学研究所制造)
8)过氧化物酶(SIGMA公司制造)
9)4-AA(和光纯药工业公司制造)
10)胆碱氧化酶(T-05,旭化成制药公司制造)
11)C16-02：0PC(1-O-十六烷基-2-乙酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)(件号：878110P,Avanti Polar Lipids公司制造)。以下称为PAF(C16)。
12)C16Lyso PAF(1-O-十六烷基-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)(件号：878119P,Avanti Polar Lipids公司制造)。以下称为Lyso PAF(C16)。
13)C18-02：0PC(1-O-十八烷基-2-乙酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)(件号：878114P,Avanti Polar Lipids公司制造)。以下称为PAF(C18)。
14)PAF(来自Heart PC)(1-烷基-2-乙酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)(件号：840009P,Avanti Polar Lipids公司制造)。以下称为天然PAF。
15)16：0-02：0PC(1-棕榈酰-2-乙酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)(件号：880622C,Avanti Polar Lipids公司制造)
16)ProClinTM300(SIGMA-ALDRICH公司制造)
17)亚铁氰化钾(和光纯药公司制造)
18)L(+)-抗坏血酸(和光纯药公司制造)
本实施例中，试剂中使用的重组体Lyso PAF-PLD利用后述参考例1～3的方法制造。另外，来自球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)的胆碱氧化酶(T-05)的重组体(以下记为重组体胆碱氧化酶)按照本说明书和本说明书的参考文献(田村隆明(2012).基礎から学ぶ遺伝子工学)等中记载的技术进行制造。来自单孢高温放线菌(Thermoactinomycesmonosporus)(有时也称为青色糖单孢菌(Saccharomonospora glauca))的胆碱氧化酶(以下记为重组体胆碱氧化酶III)利用日本特开平5-317056中公开的方法进行制造。另外，外消旋体PAF(C16)以1-O-十六烷基-rac-甘油为起始原料，按照J.Org.Chem.1995年60卷7706-7708页中公开的方法进行合成。
本实施例中作为试样使用的血清或血浆使用由下述制造商、销售商、提供者获得的物质。公司内志愿者血清在医生、护士的协助下得到知情同意后采集。
个人血清(No1～32和78)：BizCom Japan,Inc.
血清池A～D、肝素血浆池、柠檬酸血浆池(KOHJIN BIO株式会社)和BJ池(BizComJapan,Inc.)
血清池J042、血清池J042-II：日本临床检查标准协议会(JCCLS)
个人血清A～E：公司内志愿者血清
本实施例中使用的重组体Lp-PLA2(rLp-PLA2)基于J.Biol.Chem.1995年10月27日第43号270卷25481-25487页中公开的信息，按照参考例4～6进行制造。
本实施例中的活性测定中使用了7080型日立自动分析装置、7600-010S型日立自动分析装置、或7170型日立自动分析装置(Hitachi High-Technologies株式会社)。分析法、测光点等各参数的详细信息参照了各装置的手册。
本实施例中，只要不特别声明，则使用下述的1)中记载的Lp-PLA2活性值的计算方法1。需要说明的是，本实施例中，(nmol/min/mL)有时也表示为(U/L)。
1)Lp-PLA2活性值的计算方法1(没有特别声明的情况)
由通过测光点处的吸光度算出的每1分钟的吸光度变化的值(ΔmAbs/min)、和TODB的546nm处的毫摩尔吸光系数ε＝36，通过下式算出。
Lp-PLA2活性值(nmol/min/mL)
＝{(ΔAbs/min)/TODB毫摩尔吸光系数}÷{(试样量)/(试样量+R1试剂量+R2试剂量)}×1000
＝{(ΔmAbs/min)/36}÷{(试样量)/(试样量+R1试剂量+R2试剂量)}
2)Lp-PLA2活性值的计算方法2(使用校准液的情况)
选择已知浓度的校准液、和将同时测定的蒸馏水设为0(nmol/min/mL(U/L))的单点校正(有时也称为二点校正)，由校正曲线计算出试样中的Lp-PLA2活性值(nmol/min/mL)。
[参考例1]
<产生来自热密卷菌属(Thermocrispum)sp.的Lyso PAF-PLD的转化体的制造>
利用苯酚·氯仿法，对由热密卷菌属(Thermocrispum)sp.(作为NITE BP-01628基于布达佩斯条约进行国际保藏。保藏机构：独立行政法人制品评价技术基盘机构、专利微生物保藏中心。地址：292-0818日本千叶县木更津市かずさ镰足2-5-8 122号室。保藏日：2013年5月17日)取得的染色体DNA进行提取。将序列号3中记载的碱基序列作为正义引物、将序列号4中记载的碱基序列作为反义引物，使用KOD FX(件号：KFX-101,东洋纺公司制造)进行PCR，得到约920bp的PCR产物。将所得到的PCR产物用NdeI(宝生物公司制造)和EcoRI(宝生物公司制造)消化，插入作为表达载体的pET-21a(+)载体(Novagen公司制造)的NdeI-EcoRI部位，得到Lyso PAF-PLD/pET21a(+)表达用质粒。将上述表达质粒转化到One shot BL21(DE3)Chemically Competent E.coli(Invitrogen公司制造)，得到转化体Lyso PAF-PLD/pET-21a(+)/BL21(DE3)，该转化体具有包含多核苷酸的重组载体，该多核苷酸包含编码Lyso PAF-PLD的碱基序列。
[参考例2]
<产生重组体Lyso PAF-PLD的转化体的培养和菌体的可溶化>
将参考例1中记载的转化体的1个菌落接种到包含50μg/mL氨苄西林的液体LB培养基5mL中，利用试管在25℃培养16小时，作为种子。将上述种子以1/1000量接种到包含50μg/mL氨苄西林的液体培养基(含1％甘油的Overnight ExpressTM Instant TB培养基、0.1％ADEKANOL LG-109(ADEKA公司制造))1.6L中，利用发酵罐在34℃、pH6.8、650rpm的条件下培养26小时。将培养液离心分离而集菌后，将菌体溶解于溶液A(10mM Tris-HCl(pH8.5),1mMEDTA(pH9.0),0.1％Tx-100,0.1％溶菌酶盐酸盐(制造编号：36A55K,Eisai Co.,Ltd.制造))中，在50℃反应30分钟。利用溶液A将菌体可溶化后，进行离心分离，将所得到的上清作为粗酶液。
[参考例3]
<重组体Lyso PAF-PLD的纯化>
使参考例2中得到的粗酶液吸附到利用10mM的Tris-HCl(pH8.0)溶液进行了平衡的填充有Q Sepharose Big Beads(GE Healthcare公司制造)的柱上。之后，使用10mM的Tris-HCl(pH8.0)溶液和包含0.5M KCl的10mM的Tris-HCl(pH8.0)溶液通过10CV的线性梯度进行洗脱。利用SDS-PAGE确认重组体Lyso PAF-PLD的洗脱级分后，利用笔型组件(UF)(旭化成化学公司制造)将洗脱级分的溶液浓缩至达到1/10量为止，添加3M的KCl。使添加了3MKCl的包含Lyso PAF-PLD的溶液吸附到利用包含3M KCl的10mM的Tris-HCl(pH8.5)溶液进行了平衡的填充有Phenyl Sepharose 6Fast Flow(high sub)(GE Healthcare公司制造)的柱上，使用10mM的Tris-HCl(pH8.5)溶液和包含3M KCl的10mM的Tris-HCl(pH8.5)溶液通过10CV的线性梯度进行洗脱。利用SDS-PAGE确认洗脱级分后进行回收，利用Amicon Ultra-15离心式过滤器单元(Millipore公司制造)浓缩后，利用10mM的Tris-HCl(pH8.0)溶液进行透析。使透析后的溶液吸附到利用10mM的Tris-HCl(pH8.5)溶液进行了平衡的填充有QSepharose High Performance(GE Healthcare公司制造)的柱上。之后，使用10mM的Tris-HCl(pH8.5)和包含0.5M KCl的10mM的Tris-HCl(pH8.5)溶液通过12CV的线性梯度进行洗脱。利用SDS-PAGE确认洗脱级分后进行回收，利用Amicon Ultra-15离心式过滤器单元(Millipore公司制造)浓缩后，利用PD-10柱(GE Healthcare公司制造)脱盐，由此得到序列号9中记载的重组体Lyso PAF-PLD的酶溶液。
[参考例4]
<产生人来源Lp-PLA2的转化体的制造>
基于人的Lp-PLA2基因的序列信息，合成对大肠杆菌型最佳化的(与大肠杆菌型的密码子用法匹配)基因(GenScript公司(NJ、USA))。以合成DNA为模板，将使第42位的异亮氨酸变更为起始甲硫氨酸的序列的序列号5中记载的碱基序列作为正义引物，将序列号6中记载的碱基序列作为反义引物，使用KOD FX(东洋纺公司制造)进行PCR，得到约1200bp的PCR产物。将所得到的PCR产物用NdeI(宝生物公司制造)和BamHI(宝生物公司制造)消化，插入作为表达载体的pET-19b载体(Novagen公司制造)的NdeI-BamHI部位，得到Lp-PLA2/pET-19b表达用质粒。将上述表达质粒转化到One shot BL21(DE3)Chemically CompetentE.coli中，得到转化体Lp-PLA2/pET-19b/BL21(DE3)，该转化体具有包含多核苷酸的重组载体，所述多核苷酸包含N末端插入有载体来源的组氨酸标签的编码Lp-PLA2的碱基序列。
[参考例5]
<产生重组体Lp-PLA2的转化体的培养和菌体的可溶化>
将参考例4中记载的转化体的1个菌落接种到包含50μg/mL氨苄西林的液体LB培养基5mL中，利用试管在25℃培养16小时，作为种子。将上述种子以1/1000量接种到包含50μg/mL氨苄西林的液体培养基(含1％甘油的Overnight ExpressTM Instant TB培养基)0.8L中，利用烧瓶在30℃培养24小时。将培养液离心分离而集菌后，将菌体溶解于包含0.3M NaCl的20mM的磷酸钾溶液(pH7.0)中，进行超声波破碎。利用超声波破碎将菌体可溶化后，离心分离，将所得到的上清作为粗酶液。
[参考例6]
<重组体Lp-PLA2(rLp-PLA2)的纯化>
使参考例5中得到的粗酶液吸附到利用包含0.3M NaCl的20mM的磷酸钾溶液(pH7.0)进行了平衡的填充有Chelating Sepharose FF(GE Healthcare公司制造)的柱上。之后，使用包含0.3M NaCl的20mM的磷酸钾溶液(pH7.0)、与包含400mM咪唑和0.3M NaCl的20mM的磷酸钾溶液(pH7.0)通过线性梯度进行洗脱。利用SDS-PAGE确认重组体Lp-PLA2的洗脱级分后，利用10mM的Tris-HCl(pH7.5)透析一晩，利用Amicon Ultra-15(30K)离心式过滤器单元(Millipore公司制造)浓缩至达到1/65量为止。
[参考例7]
<产生大肠杆菌来源GPCP的转化体的制造>
在大肠杆菌K株中，基于具有GPCP活性的甘油磷酰二酯磷酸二酯酶(glycerophosphoryl diester phosphodiesterase)(GlpQ)的基因的序列信息，以大肠杆菌LE392株(由国立遗传学研究所转让)为模板，将序列号7中记载的碱基序列作为正义引物，将序列号8中记载的碱基序列作为反义引物，使用KOD FX(东洋纺公司制造)进行PCR，得到约1000bp的PCR产物。将所得到的PCR产物用NheI(宝生物公司制造)和EcoRI(宝生物公司制造)消化，插入到作为表达载体的pET-21a(+)载体(Novagen公司制造)的NheI-EcoRI部位，得到GPCP/pET-21a(+)表达用质粒。将上述表达质粒转化到One shot BL21(DE3)Chemically Competent E.coli中，得到转化体GPCP/pET-21a(+)/BL21(DE3)，该转化体具有包含多核苷酸的重组载体，该多核苷酸包含编码GPCP的碱基序列。
[参考例8]
<产生重组体GPCP的转化体的培养和菌体的可溶化>
将参考例7中得到的转化体的1个菌落接种到包含50μg/mL氨苄西林的液体LB培养基5mL中，利用试管在30℃培养16小时，作为种子。将上述种子以1/1000量接种到包含50μg/mL氨苄西林的液体培养基(含1％甘油的Overnight ExpressTM Instant TB培养基)600mL中，利用烧瓶在34℃培养24小时。将培养液离心分离而集菌后，将菌体溶解于20mM Tris-HCl(pH7.5)中，进行超声波破碎。利用超声波破碎将菌体可溶化后，离心分离，将所得到的上清作为粗酶液。
[参考例9]
<重组体GPCP的纯化>
使参考例8中得到的粗酶液吸附到利用10mM的Tris-HCl(pH8.0)溶液进行了平衡的填充有Q Sepharose Fast Flow(GE Healthcare公司制造)的柱上。之后，使用10mM的Tris-HCl(pH8.0)溶液和包含0.5M KCl的10mM的Tris-HCl(pH8.0)溶液通过10CV的线性梯度进行洗脱。利用SDS-PAGE确认重组体GPCP的洗脱级分，添加18％的硫酸铵。使添加了18％硫酸铵的包含GPCP的溶液吸附到利用包含18％硫酸铵的10mM的Tris-HCl(pH8.0)溶液进行了平衡的填充有Phenyl Sepharose 6Fast Flow(high sub)的柱上，使用10mM的Tris-HCl(pH8.0)溶液和包含18％硫酸铵的10mM的Tris-HCl(pH8.0)溶液通过10CV的线性梯度进行洗脱。利用SDS-PAGE确认洗脱级分后进行回收，利用Amicon Ultra-15离心式过滤器单元(Millipore公司制造)浓缩后，利用PD-10柱脱盐，得到重组体GPCP酶溶液。
[参考例10]
<Lyso PAF-PLD的热稳定性试验>
将纯化后的Lyso PAF-PLD在20mM的Tris-HCl(pH7.5)溶液中在各温度下保温60分钟，利用下述反应液调查残存活性。使用C18(Plasm)LPC(件号：852465P,Avanti PolarLipids公司制造)作为底物。
(反应液组成)
80mM Tris-HCl(pH 8.0)
0.4mM 底物
2mM CaCl2
(显色液组成)
0.03％ 4-AA
0.02％ TODB
0.75U/mL 胆碱氧化酶(T-05,旭化成制药公司制造)
5U/mL 过氧化物酶
10mM EDTA
将50μL的反应液在37℃预保温5分钟，添加酶液5μL后，在50℃进行1分钟酶反应。其后，添加200μL的显色液并在37℃反应10分钟后，测定550nm处的吸光度。活性值由下式算出。
Lyso PAF-PLD活性值(U/mL)
＝{(ΔAbs/min)/550nm处的TODB的毫摩尔分子吸光系数}÷{(试样量)/(试样量+R1试剂量+R2试剂量)}
＝{(ΔAbs/min)/39}÷{(试样量)/(试样量+R1试剂量+R2试剂量)}
将在4℃进行保存的活性值设为100％时的各温度下的残存活性示于图1。
[参考例11]
<校准试剂的制备>
为了将血清池J042-II作为校准试剂(校准液)，以n＝5对血清池J042-II中的Lp-PLA2活性(nmol/min/mL(U/L))进行5天测定，将其平均值作为Lp-PLA2的已知量(已知浓度)。试剂组成如下所述。
(本发明试剂)
<R1试剂>
<R2试剂>
(试样)
血清池J042-II
(活性测定)
活性的测定中使用了7170型日立自动分析装置。测定参数如下所示。
(7170型日立自动分析装置测定参数)
将4μL的试样与160μL的R1试剂混合，在37℃保温5分钟后(测光点1-16)，添加40μL的R2试剂，开始反应(测光点17)。从添加R2试剂引起的反应开始后约3.6-4.5分钟(测光点30-33)的试样吸光度减去水(空白)的该测光点处的吸光度，计算出每1分钟的吸光度变化的值(ΔmAbs/min)。按照上式计算出Lp-PLA2活性值(nmol/min/mL)。
测定的结果，血清池J042-II中的Lp-PLA2量(浓度)为23.1(nmol/min/mL(U/L))(标准偏差(SD)＝0.36(nmol/min/mL(U/L))，以此作为已知量(已知浓度)。制备出使用了血清池的校准试剂(校准液)。需要说明的是，该校准试剂的实用性在实施例24等中得到了确认。
[实施例1]
<重组体Lyso PAF-PLD的特异性>
为了调查参考例3中纯化的重组体Lyso PAF-PLD的特异性，调查了针对PAF(C16)和Lyso PAF(C16)的活性。试剂的组成如下所述。
(本发明试剂)
<R1试剂>
<R2试剂>
(试样)
包含0～0.5mM的PAF(C16)或Lyso PAF(C16)的0.1％Tx-100溶液。
(活性测定)
活性的测定中使用了7080型日立自动分析装置。测定参数如下所示。
(7080型日立自动分析装置测定参数)
将分别以0、0.1、0.2、0.3、0.4或0.5mM的浓度包含PAF(C16)或Lyso PAF(C16)的5μL的试样和150μL的R1试剂在37℃保温5分钟后(测光点1-15)，添加50μL的R2试剂，使其反应5分钟(测光点16-31)。对以PAF为试样时的10分钟反应时间的各测光点处的吸光度进行作图，结果示于图2，以Lyso PAF为试样同样地作图，结果示于图3。
活性测定的结果，如图2和3所示，只有在以Lyso PAF为试样的情况下，添加R2试剂后的吸光度发生了变化。由此表明，R2试剂中的Lyso PAF-PLD将Lyso PAF水解而生成胆碱，利用胆碱的氧化中产生的过氧化氢而进行了氧化还原显色反应。因此可知，尽管PAF和LysoPAF在结构上类似，但重组体Lyso PAF-PLD对于PAF不显示PLD活性，仅对Lyso PAF显示出PLD活性。
对利用了该重组体Lyso PAF-PLD的特异性的试样中的Lp-PLA2活性的测定进行了研究。更详细而言，在试样中添加PAF，利用试样中包含的Lp-PLA2将PAF水解为Lyso PAF后，利用重组体Lyso PAF-PLD将Lyso PAF进一步水解，对所得到的水解产物进行测定，基于该原理，对试样中的Lp-PLA2活性的测定进行了研究。
在下述实施例2～10中进行了Lp-PLA2活性测定试剂的基本组成成分的研究。本实施例中，为高灵敏度是指：根据所添加的试剂成分的条件，试剂中的酶的反应顺利地进行，并且每1分钟的吸光度变化(灵敏度)(ΔmAbs/min)的值高，计算出的Lp-PLA2活性值(nmol/min/mL)升高。
[实施例2]
<Lp-PLA2活性测定试剂的pH研究1(pH6.0～9.0)>
为了研究Lp-PLA2活性测定试剂中的pH的影响，使用Tris和Bis-Tris(同仁化学研究所制造)在6.0～9.0以0.5间隔调整试剂的pH，测定试样中的Lp-PLA2活性。试剂的组成如下所述。
(本发明试剂)
<R1试剂>
<R2试剂>
(试样)
个人血清No16、个人血清No78。
(活性测定)
活性的测定中使用了7080型日立自动分析装置。测定参数如下所示。
(7080型日立自动分析装置测定参数)
将3μL的试样与150μL的R1试剂混合，在37℃保温5分钟后(测光点1-15)，添加100μL的R2试剂，开始反应(测光点16)。从添加R2试剂引起的反应开始后约2-3分钟(测光点23-26)的试样吸光度减去水(空白)的该测光点处的吸光度，计算出每1分钟的吸光度变化的值(ΔmAbs/min)。按照上式计算出Lp-PLA2活性值(nmol/min/mL)。将各pH下的每1分钟的吸光度变化的值(灵敏度)(ΔmAbs/min)和Lp-PLA2活性值(nmol/min/mL)示于表1和2。
【表1】
·个人血清16
【表2】
·个人血清78
测定的结果，由表1、2可知，在pH6.0～9.0的全部范围能够测定Lp-PLA2活性。另外，在pH7.5～8.0附近能够以更高的灵敏度测定Lp-PLA2活性。
[实施例3]
<Lp-PLA2活性测定试剂的pH研究2(pH7.25～7.75)>
由实施例2可知，在试剂的pH为7.5附近，能够以最高的灵敏度测定Lp-PLA2活性，因此，为了更详细地调查pH7.5左右条件下的pH的影响，将试剂的pH用Tris-HCl缓冲液调整为7.25、7.5和7.75，测定了试样中的Lp-PLA2活性。试剂的组成如下所述。
(本发明试剂)
<R1试剂>
<R2试剂>
(试样和活性测定)
试样种类、测定装置与测定参数以及活性值的计算在与实施例2相同的条件下进行。将各pH下的每1分钟的吸光度变化的值(灵敏度)(ΔmAbs/min)和Lp-PLA2活性值(nmol/min/mL)示于表3和4。
【表3】
·个人血清16
【表4】
·个人血清78
测定的结果，由表3和4可知，在试剂的pH为7.5和7.75的情况下，能够以更高的灵敏度测定Lp-PLA2活性。
[实施例4]
<Lp-PLA2活性测定试剂的缓冲液的研究>
为了研究Lp-PLA2活性测定试剂中的缓冲液差异的影响，将试剂的pH固定为7.5，改变缓冲液的种类，测定试样中的Lp-PLA2活性。缓冲液使用了作为Good’s缓冲液的HEPES(同仁化学研究所制造)、MOPS(同仁化学研究所制造)、TES(同仁化学研究所制造)、PIPES(同仁化学研究所制造)、磷酸钾(PI-K)和Tris(和光纯药公司制造)共计6种。磷酸钾的pH利用磷酸氢二钾(和光纯药公司制造)和磷酸二氢钾(和光纯药公司制造)进行了调整。试剂的组成如下所述。
(本发明试剂)
<R1试剂>
<R2试剂>
(试样和活性测定)
试样种类、活性测定装置与测定参数以及活性值的计算在与实施例2相同的条件下进行。将使用各缓冲液时的每1分钟的吸光度变化的值(灵敏度)(ΔmAbs/min)和Lp-PLA2活性值(nmol/min/mL)示于表5和6。
【表5】
·个人血清16
【表6】
·个人血清78
测定的结果，由表5和6可知，在使用6种中的任一种缓冲液的情况下均能够测定Lp-PLA2活性。在本实施例中的50mM的缓冲液浓度下，使用Tris作为试剂的缓冲液时，能够以最高的灵敏度测定Lp-PLA2活性。
[实施例5]
<Lp-PLA2活性测定试剂的Tris-HCl(pH7.5)浓度的研究>
为了研究Lp-PLA2活性测定试剂中的Tris-HCl(pH7.5)浓度的影响，将试剂的Tris-HCl(pH7.5)浓度调整为25mM、50mM或100mM，测定了试样中的Lp-PLA2活性。试剂组成如下所述。
(本发明试剂)
<R1试剂>
<R2试剂>
(试样和活性测定)
试样种类、活性测定装置与测定参数以及活性值的计算在与实施例2相同的条件下进行。将各缓冲液中的每1分钟的吸光度变化的值(灵敏度)(ΔmAbs/min)和Lp-PLA2活性值(nmol/min/mL)示于表7和8。
【表7】
·个人血清16
【表8】
·个人血清78
测定的结果，由表7和8可知，在试剂的Tris-HCl(pH7.5)的浓度为25、50和100mM的全部情况下，能够测定Lp-PLA2活性。使试剂的Tris-HCl(pH7.5)的浓度为50mM时，能够以更高的灵敏度测定Lp-PLA2活性。
[实施例6]
<Lp-PLA2活性测定试剂的CaCl2浓度>
为了研究Lp-PLA2活性测定试剂中的CaCl2浓度的影响，将试剂的CaCl2浓度调整为0(无添加)、0.25、0.5、0.75、1、2.5、5或10mM，测定了试样中的Lp-PLA2活性。试剂组成如下所述。
(本发明试剂)
<R1试剂>
<R2试剂>
(试样和活性测定)
试样种类、活性测定装置与测定参数以及活性值的计算在与实施例2相同的条件下进行。将各缓冲液中的每1分钟的吸光度变化的值(灵敏度)(ΔmAbs/min)和Lp-PLA2活性值(nmol/min/mL)示于表9和10。
【表9】
·个人血清16
【表10】
·个人血清78
测定的结果，由表9和10可知，试剂的CaCl2的浓度在0～10mM的任一情况下均能够测定Lp-PLA2活性。在全部浓度下Lp-PLA2活性值没有差异，本实施例中，认为在来自试样的CaCl2浓度下试剂中的酶充分发挥出了功能。
[实施例7]
<Lp-PLA2活性测定试剂的表面活性剂的筛选>
为了研究Lp-PLA2活性测定试剂中的表面活性剂的影响，将表面活性剂的浓度固定为R1试剂为0.1％、R2试剂为0.1％或0.5％，改变添加到试剂中的表面活性剂的种类，测定试样中的Lp-PLA2活性。试剂组成如下所述。
(本发明试剂)
<R1试剂>
<R2试剂>
(所使用的表面活性剂)
研究中使用的表面活性剂的详细情况示于表11。
【表11】
No. 商品名 化学名 HLB
1 Tx-100 POE辛基苯基醚 13.5
2 BT-7 POE(7)仲烷基醚 12.0
3 BT-9 POE(9)仲烷基醚 13.5
4 BT-12 POE(12)仲烷基醚 14.5
5 BL-21 POE(21)月桂醚 19.0
6 EMULGEN 108 POE月桂醚 12.1
7 EMULGEN 709 POE烷基醚 13.3
8 LS-106 聚氧化烯烷基醚 12.5
9 LS-110 聚氧化烯烷基醚 13.4
10 EMULGEN 1108 POE烷基醚 13.4
11 EMULGEN 1118S-70 POE烷基醚 16.4
12 EMULGEN 1150S-60 POE烷基醚 18.5
在上述表面活性剂中，No.1的Tx-100以在R2试剂中的添加浓度为0.1％和0.5％的两种进行了研究。另外，No.2～9以在R2试剂中的添加浓度为0.5％进行了研究，No.10～12以在R2试剂中的添加浓度为0.1％进行了研究。
(试样和活性测定)
试样种类、活性测定装置与测定参数以及活性值的计算在与实施例2相同的条件下进行。将各缓冲液中的每1分钟的吸光度变化的值(灵敏度)(ΔmAbs/min)和Lp-PLA2活性值(nmol/min/mL)、以及将Tx-100中的Lp-PLA2活性值设为100时的各表面活性剂中的相对活性示于表12～表15。
【表12】
·个人血清16(R2试剂的表面活性剂浓度0.5％)
【表13】
·个人血清78(R2试剂的表面活性剂浓度0.5％)
【表14】
·个人血清16(R2试剂的表面活性剂浓度0.1％)
【表15】
·个人血清78(R2试剂的表面活性剂浓度0.1％)
测定的结果，由表12至表15可知，在使用任一种表面活性剂的情况下均能够测定Lp-PLA2活性。在使用Tx-100、EMULGEN 1118S-70和EMULGEN 1150S-60时，能够以更高的灵敏度测定Lp-PLA2活性。
[实施例8]
<Lp-PLA2测定试剂的表面活性剂浓度的研究>
为了研究Lp-PLA2活性测定试剂中的表面活性剂浓度的影响，使用EMULGEN1118S-70作为表面活性剂，将试剂的EMULGEN 1118S-70浓度调整为0～0.2％，测定试样中的Lp-PLA2活性。试剂组成如下所述。
(本发明试剂)
<R1试剂>
<R2试剂>
试样种类、活性测定装置与测定参数以及活性值的计算在与实施例2相同的条件下进行。将各缓冲液中的每1分钟的吸光度变化的值(灵敏度)(ΔmAbs/min)和Lp-PLA2活性值(nmol/min/mL)示于表16～表18。
【表16】
·个人血清16
【表17】
·个人血清78
【表18】
·血清池J042
测定的结果，由表16～表18可知，在使用任一浓度的表面活性剂的情况下均能够测定Lp-PLA2活性。表面活性剂的浓度为0.1％以下时，能够以更高的灵敏度测定Lp-PLA2活性。
[实施例9]
<使用各种底物的Lp-PLA2活性的测定>
作为底物，使用作为光学活性体的合成底物的PAF(C16)和PAF(C18)、外消旋体PAF(C16)和天然PAF、作为PAF类似物的1-棕榈酰基-2-乙酰基-sn-甘油-3-PC，测定试样中的Lp-PLA2活性。试剂的组成如下所述。
(本发明试剂)
·以外消旋体PAF(C16)以外为底物时的试剂组成
<R1试剂>
<R2试剂>
·以外消旋体PAF(C16)为底物时的试剂组成
<R1试剂>
<R2试剂>
(试样)
血清池J042、血清池C、个人血清16、肝素血浆池、柠檬酸血浆池、rLp-PLA2(0.017mg/mL)。
(活性测定)
活性的测定中使用了7080型日立自动分析装置。测定参数如下所示。
(7080型日立自动分析装置测定参数)
将5μL的试样与150μL的R1试剂混合，在37℃保温5分钟后(测光点1-15)，添加100μL的R2试剂，开始反应(测光点16)。从添加R2试剂引起的反应开始后约3.5-4.5分钟(测光点27-30)的试样吸光度减去水(空白)的该测光点处的吸光度，计算出每1分钟的吸光度变化的值(ΔmAbs/min)。按照上式计算出Lp-PLA2活性值(nmol/min/mL)。将每1分钟的吸光度变化的值(灵敏度)(ΔmAbs/min)和Lp-PLA2活性值(nmol/min/mL)、以及将对于PAF(C16)的Lp-PLA2活性值设为100时的对于各底物的相对活性示于表19～表24。
【表19】
·血清池J042
【表20】
·血清池C
【表21】
·个人血清16
【表22】
·肝素血浆池
【表23】
·柠檬酸血浆池
【表24】
rLp-PLA2(0.017mg/mL)
测定的结果，由表19～表24可知，使用任一种底物的情况下均能够测定Lp-PLA2活性。天然PAF的主要成分为C16，通过使用C16的光学活性体作为底物，能够以更高的灵敏度测定Lp-PLA2活性。
[实施例10]
<Trinder’s试剂的研究>
为了研究在作为显色试剂的TODB与4-AA以外的组合中也能够测定Lp-PLA2活性，对Trinder’s试剂的种类进行了研究。作为TODB以外的Trinder’s试剂，使用了TOOS(件号：OC13,同仁化学研究所制造)、DAOS(件号：OC06,同仁化学研究所制造)这两种。作为比较，还使用TODB进行了测定。试剂组成如下所述。
(本发明试剂)
<R1试剂>
<R2试剂>
(试样)
个人血清No16、个人血清No78、血清池J042。
(活性测定)
在使用TOOS、TODB的测定中，试样量为3μL，除此以外的测定参数、活性测定装置、活性值的计算在与实施例9相同的条件下进行。在使用DAOS的测定中，试样量为3μL，测定波长(副/主)设为700nm/600nm，除此以外的测定参数、活性测定装置、活性值的计算在与实施例9相同的条件下进行。将使用各Trinder’s试剂的活性测定的每1分钟的吸光度变化的值(灵敏度)(ΔmAbs/min)和Lp-PLA2活性值(nmol/min/mL)示于表25。
【表25】
测定的结果，在任一组合中均能够进行测定。其中使用TOOS和TODB时的吸光度变化的值(灵敏度)为使用DAOS时的约2倍，能够以更高的灵敏度进行测定。
[实施例11]
<试剂组成研究1(Lyso PAF-PLD R2试剂配方)>
为了消除认为在血清中以几百μM的浓度所包含的酰基型溶血磷脂，向R1试剂中加入分解磷脂的1位酰基的具有PLA1活性的酶和水解由此生成的GPC的GPCP以及胆碱氧化酶，研究在包含Lyso PAF-PLD的R2试剂存在下是否能够测定Lp-PLA2活性。作为具有PLA1活性的酶，使用MGLPII(T-117,旭化成制药公司制造)和LYPL(T-32,旭化成制药公司制造)。R1试剂中使用的大肠杆菌来源GPCP使用了参考例7～9中制作的物质。试剂的组成如下所述。
(本发明试剂)
<R1试剂>
<R2试剂>
(试样和活性测定)
试样种类在与实施例10相同的条件下进行，活性测定装置和测定参数以及活性值的计算在与实施例9相同的条件下进行。测定结果示于表26。
【表26】
由表26所示的测定结果、和在R1试剂中混配有Lyso PAF-PLD的表25的TODB的结果可知，仅在R2试剂中包含Lyso PAF-PLD的情况下，也与在R1试剂中添加了MGLPII和GPCP的情况、在R1试剂中包含Lyso PAF-PLD的情况同样地能够测定Lp-PLA2活性。另外，在R1试剂中添加了LYPL和GPCP的情况下也能够测定。
[实施例12]
<试剂组成研究2(胆碱氧化酶R2配方研究)>
对于在不包括预先消除试样中的胆碱的过程的情况下、即R2试剂中包含胆碱氧化酶的情况下能否测定Lp-PLA2活性进行了研究。试剂的组成如下所述。
(本发明试剂)
<R1试剂>
<R2试剂>
(试样和活性测定)
试样种类在与实施例10相同的条件下进行，活性测定装置和测定参数以及活性值的计算在与实施例9相同的条件下进行。测定结果示于表27。
【表27】
由表27所示的测定结果可知，即使仅在R2试剂中包含胆碱氧化酶，也能够测定Lp-PLA2活性。但是，与在R1试剂和R2试剂中包含胆碱氧化酶的表25的TODB的结果相比，测定值高。认为试样中残存的胆碱产生了影响。
[实施例13]
<Lp-PLA2测定中的SR比的研究>
为了研究本发明试剂中的SR比，改变试样量，测定Lp-PLA2活性。试剂的组成如下所述。
(本发明试剂)
<R1试剂>
<R2试剂>
(试样)
血清池J042。
(活性测定)
活性的测定中使用了7080型日立自动分析装置。测定参数如下所示。
(7080型日立自动分析装置测定参数)
将各试样与160μL的R1试剂混合，在37℃保温5分钟后(测光点1-15)，添加40μL的R2试剂，开始反应(测光点16)。从添加R2试剂引起的反应开始后约3.5-4.5分钟(测光点27-30)的试样吸光度减去水(空白)的该测光点处的吸光度，计算出每1分钟的吸光度变化的值(ΔmAbs/min)。按照上式计算出Lp-PLA2活性值(nmol/min/mL)。将每1分钟的吸光度变化的值(灵敏度)(ΔmAbs/min)和Lp-PLA2活性值(nmol/min/mL)示于表28。
【表28】
试样量 ΔmAbs/min nmol/min/mL
2μL 10.0 28.1
4μL 21.2 30.0
6μL 34.8 33.2
在试样量为2μL(S∶R＝1∶100)、试样量为4μL(S∶R＝1∶50)、试样量为6μL(S∶R＝1∶33)的全部情况下均能够测定。
[实施例14]
<血清中的Lp-PLA2添加回收试验>
使用显示出Lp-PLA2活性的血清试样与不显示出Lp-PLA2活性的血清试样，在各试样中添加0～33.2μg/mL的rLp-PLA2，进行活性测定，求出回收率。试剂组成与实施例13相同。
(试样)
在血清池J042和血清池A～C这4种中分别添加0、3.3、6.6、13.3、16.6和33.2μg/mL的rLp-PLA2。需要说明的是，血清池A为不显示Lp-PLA2活性的血清试样。
(活性测定)
试样量为4μL，活性测定装置和试样量以外的测定参数以及活性值的计算在与实施例13相同的条件下进行。回收率利用下式算出。
回收率(％)
＝{(添加了rLp-PLA2的血清的活性值)-(血清本身的活性值)}÷(添加了rLp-PLA2的血清池A(不显示Lp-PLA2活性的血清)的活性值)×100
＝(所添加的rLp-PLA2的活性值)÷(添加到血清池A中的rLp-PLA2的活性值)×100
将各试样中的每1分钟的吸光度变化(ΔmAbs/min)、添加了各浓度的rLp-PLA2时的活性值(nmol/min/mL)、所添加的rLp-PLA2的活性值(nmol/min/mL)以及回收率(％)示于表29～31。另外，按照x轴为所添加的rLp-PLA2浓度(μg/mL)、y轴为每1分钟的吸光度变化的方式作图，将其示于图4～7。
【表29】
·血清池J042
【表30】
·血清池B
【表31】
·血清池C
测定的结果，由图4～7可知，观察到依赖于所添加的rLp-PLA2浓度的吸光度变化，由表29～31可知，大致能够在100％±10％以内回收。
[实施例15]
<Cayman Chemical公司的PAF乙酰水解酶检测试剂盒(Acetylhydrolase AssayKit)和本发明试剂的测定值的比较>
使用本发明试剂和Cayman Chemical公司的PAF乙酰水解酶检测试剂盒，测定Lp-PLA2活性。利用Cayman公司的试剂进行的活性测定按照试剂盒的所附文件进行，活性值按照所附文件算出。试剂组成如下所述。
(本发明试剂)
<R1试剂>
<R2试剂>
(试样)
个人血清No1～32。
(活性测定)
利用Cayman公司试剂的活性测定中使用了SpectraMax M3(Molecular DeviceJapan公司制造)酶标仪。另外，利用本发明方法的活性测定中使用了7600-010S型日立自动分析装置。测定参数如下所示。
(7600-010S型日立自动分析装置测定参数)
将3μL的试样与150μL的R1试剂混合，在37℃保温5分钟后(测光点1-16)，添加100μL的R2试剂，开始反应(测光点17)。从添加R2试剂引起的反应开始后约2-3分钟(测光点25-28)的试样吸光度减去水(空白)的该测光点处的吸光度，计算出每1分钟的吸光度变化的值(ΔmAbs/min)。按照上式计算出Lp-PLA2活性值(nmol/min/mL)。将本发明方法和利用Cayman公司试剂的Lp-PLA2活性值(nmol/min/mL)示于表32(需要说明的是，乳糜样本附以+来表示，+的数目越多则表示乳糜越强)。将利用Cayman公司试剂的活性值(x轴(nmol/min/mL))和利用本发明方法的活性值(y轴(nmol/min/mL))比较示于图8。
【表32】
测定的结果，关于利用Cayman公司试剂和本发明试剂测定上述试样的测定值(nmol/min/mL)的相关关系，以相关公式y＝2.254x+3.4656、相关系数r＝0.805表示(图8)。
由本实施例表明，能够利用本发明试剂与Cayman公司试剂以r＝0.805的相关测定个人血清的Lp-PLA2活性。相较于使用96孔板的Cayman公司试剂，可以说使用通用自动分析仪的本发明试剂作为诊断药的实用性更高。
由于活性值的定义不同，因此利用Cayman公司试剂和本发明试剂测定的活性值不同，相关公式的斜率不为1，但认为若使活性值的定义、校准液的值相同，则相关公式的斜率会接近1。
[实施例16]
<利用R&D SYSTEMS公司的Human PLA2G7/PAF-AH/Lp-PLA2Quantikine ELISA Kit和本发明试剂对试样所测得的测定值的比较>
使用R&D SYSTEMS公司的Human PLA2G7/PAF-AH/Lp-PLA2Quantikine ELISA Kit，按照试剂盒的所附文件，对Lp-PLA2的物质量进行定量。
(活性测定)
利用R&D SYSTEMS公司试剂盒的定量中使用了SpectraMax M3(Molecular DeviceJapan公司制造)酶标仪。将实施例15中测定的利用本发明试剂的Lp-PLA2活性值(nmol/min/mL)与利用R&D SYSTEMS公司试剂盒的Lp-PLA2量(ng/mL)示于表33。将利用R&DSYSTEMS公司试剂盒的定量值(x轴(ng/mL))与利用本发明试剂的活性值(y轴(nmol/min/mL))比较示于图9。
【表33】
测定的结果，关于利用R&D SYSTEMS公司的Human PLA2G7/PAF-AH/Lp-PLA2Quantikine ELISA Kit的测定值(ng/mL)与利用本发明方法的测定值(nmol/min/mL)的相关关系，以相关公式y＝0.2917x+18.582、相关系数r＝0.800表示(图9)。
由本实施例表明，能够利用本发明试剂与利用R&D SYSTEMS公司的Human PLA2G7/PAF-AH/Lp-PLA2 Quantikine ELISA Kit的测定值以r＝0.800的相关测定个人血清。利用R&D SYSTEMS公司的Human PLA2G7/PAF-AH/Lp-PLA2 Quantikine ELISA Kit的测定值为Lp-PLA2的量，不是活性值，这点与利用本发明试剂的测定值是不同的。
[实施例17]
<本发明试剂的吸光度变化的值和Lp-PLA2活性值的测定>
测定本发明试剂的每1分钟的吸光度变化的值(灵敏度)(ΔmAbs/min)和Lp-PLA2活性值(nmol/min/mL)。
需要说明的是，为了进行参考，还使用diaDexus公司的PLAC Test For Lp-PLA2Activity(PLAC测试)以及Diasys公司的Diasys Lp-PLA2 FS(Lp-PLA2 FS)测定了Lp-PLA2活性。PLAC测试和Lp-PLA2 FS的测定波长为415nm。本发明方法中使用的试剂组成如下所述。
(本发明试剂)
<R1试剂>
<R2试剂>
(试样)
水、PLAC测试的校准液5个(0nmol/min/mL(校准液1)、50nmol/min/mL(校准液2)、100nmol/min/mL(校准液3)、250nmol/min/mL(校准液4)、400nmol/min/mL(校准液5))、另外出售的Lp-PLA2 FS用校准液(TruCal Lipid,447U/L)。
(活性测定)
活性的测定中使用了7600-010S型日立自动分析装置。各试剂中的测定参数如下所示。
(7600-010S型日立自动分析装置测定参数)
(本发明试剂的活性测定用参数)
关于利用本发明试剂的活性测定，将5μL的试样与150μL的R1试剂混合，在37℃保温5分钟后(测光点1-16)，添加100μL的R2试剂，开始反应(测光点17)。从添加R2试剂引起的反应开始后约3.5-4.5分钟(测光点29-32)的试样吸光度减去水(空白)的该测光点处的吸光度，计算出每1分钟的吸光度变化的值(ΔmAbs/min)。Lp-PLA2活性值(nmol/min/mL)按照上式算出。
(PLAC测试测定用参数)
利用PLAC测试的活性测定中，将30μL的试样与120μL的R1试剂混合，在37℃保温5分钟后(测光点1-16)，添加30μL的R2试剂，开始反应(测光点17)。从添加R2试剂引起的反应开始后约0.5-2分钟(测光点19-22)的试样吸光度减去水(空白)的该测光点处的吸光度，计算出每1分钟的吸光度变化的值(ΔmAbs/min)。关于Lp-PLA2活性值(nmol/min/mL)，以PLAC测试的5个校准液的每1分钟的吸光度变化的值作为x轴、活性值作为y轴而作图，由导出的下式算出。
y＝0.0013x2+0.5292x-0.3213
(Lp-PLA2 FS测定用参数)
关于利用Lp-PLA2 FS的活性测定，将2μL的试样与200μL的R1试剂混合，在37℃保温5分钟后(测光点1-16)，添加50μL的R2试剂，开始反应(测光点17)。从添加R2试剂引起的反应开始后约2-4分钟(测光点22-30)的试样吸光度减去水(空白)的该测光点处的吸光度，计算出每1分钟的吸光度变化的值(ΔmAbs/min)。Lp-PLA2活性值(U/L)按照Lp-PLA2 FS的所附文件由下式算出。
Lp-PLA2活性值(U/L)
＝{(ΔAbs/min.Sample)/(ΔAbs/min.Cal.)}×Conc.Cal.(U/L)
＝{(每1分钟的试样的吸光度变化)/(每1分钟的校准液的吸光度变化)}×校准液浓度(447U/L)
将各试剂中的每1分钟的吸光度变化的值(ΔmAbs/min)和活性值(nmol/min/mL和U/L)示于表34～36。
【表34】
·本发明试剂
【表35】
·PLAC测试
【表36】
·Lp-PLA2 FS
由本实施例表明，能够利用本发明试剂测定PLAC测试校准液1至5以及Lp-PLA2 FS用校准液(TruCal Lipid)。
[实施例18]
<本发明试剂、PLAC测试以及Lp-PLA2 FS的同时再现性的比较>
为了对本发明试剂与PLAC测试以及Lp-PLA2 FS的同时再现性进行比较，以n＝5测定了Lp-PLA2活性。试剂组成与实施例17相同。
(试样)
PLAC测试的CONTROL LOW(平均：118.8nmol/min/mL)(以下记为PLAC CONT-L)和CONTROL HIGH(平均：298.3nmol/min/mL)(以下记为PLAC CONT-H)、血清池J042、Consera(日水制药公司制造)。
(活性测定)
活性测定装置和测定参数以及活性值的计算在与实施例17相同的条件下进行。
将各试剂中的每1分钟的吸光度变化的值(灵敏度)(ΔmAbs/min)和平均值(AVE)、标准偏差(SD)、变异系数(CV％)、活性值(nmol/min/mL和U/L)示于表37～42。另外，在各试剂中，对以血清池J042为试样时的10分钟反应时间的各测光点处的吸光度进行作图，将所得到的反应时间过程示于图10～12。
【表37】
·本发明试剂
【表38】
·本发明试剂
【表39】
·PLAC测试
【表40】
·PLAC测试
【表41】
·Lp-PLA2 FS
【表42】
·Lp-PLA2 FS
测定的结果，利用本发明试剂的测定值中CV％为±2.0以内。另外，利用PLAC测试的测定值中CV％为±1.0左右。利用Lp-PLA2 FS的测定值中PLAC CONT-L为CV％＝4.7，相较于其他试样更高，其他的试样中CV％为±1.0以内。
由本实施例表明，利用本发明试剂能够与市售的PLAC测试和Lp-PLA2 FS以相同程度的CV(％)对PLAC测试的控制血清、购入的血清池、市售的管理血清Consera进行测定。
[实施例19]
<本发明试剂、PLAC测试以及Lp-PLA2 FS的共存物质的影响比较>
制备添加有Interference Check A Plus(Sysmex公司制造)、Intralipos输液10％(大塚制药株式会社制造)或抗坏血酸的试样，调查共存物质的影响。试剂组成与实施例17相同。
(试样)
将胆红素C(Bil-C)(209mg/dL)、胆红素F(Bil-F)(201mg/dL)、溶血血红蛋白(Hb)(5200mg/dL)和乳糜(14800FTU)(以上含有于Interference Check A Plus)；Intralipos输液10％；0.5g/dL抗坏血酸；和水这7种与血清池J042以1：9的比例(本实施例中，7种物质40μL+血清池J042 360μL)进行混合。
(活性测定)
活性测定装置和测定参数以及活性值的计算在与实施例17相同的条件下进行。
将各试剂中的每1分钟的吸光度变化的值(ΔmAbs/min)和活性值(nmol/min/mL和U/L)示于表43-45。还示出将添加有水的试样的测定值设为100％时的其他试样的测定值的比例。
【表43】
·本发明试剂
【表44】
·PLAC测试
【表45】
·Lp-PLA2 FS
测定的结果，由表43和45可知，在使用本发明方法和Lp-PLA2 FS的情况下，包含任一物质的试样均能够以±5％以内的误差进行测定。另外，如表44所示，在使用PLAC测试的情况下，溶血血红蛋白(500mg/dL)和Intralipos输液(1％)在本实施例中使用的7600-010S型日立自动分析装置中成为“吸光度超过错误”，无法测定。
由本实施例表明，本发明方法和Lp-PLA2 FS难以受到溶血血红蛋白和Intralipos输液(乳糜)的影响，PLAC测试会受到溶血血红蛋白和Intralipos输液(乳糜)的影响。
[实施例20]
<本发明试剂、PLAC测试以及Lp-PLA2 FS的测定值的比较>
在各试样中，对利用本发明试剂、PLAC测试以及Lp-PLA2 FS测定的Lp-PLA2活性值进行比较。试剂组成与实施例17相同。
(试样)
血清池A～C、肝素血浆池、柠檬酸血浆池、个人血清No1～21。
(活性测定)
活性测定装置和测定参数以及活性值的计算在与实施例17相同的条件下进行。
将利用本发明试剂、PLAC测试以及Lp-PLA2 FS测定的各试样的Lp-PLA2活性值(nmol/min/mL和U/L)示于表46。将利用PLAC测试的活性值(x轴(nmol/min/mL))与利用本发明试剂的活性值(y轴(nmol/min/mL))进行比较，示于图13；另外将利用Lp-PLA2 FS的活性值(x轴(U/L))与利用本发明试剂的活性值(y轴(nmol/min/mL))进行比较，示于图14；进而将利用PLAC测试的活性值(x轴(nmol/min/mL))与利用Lp-PLA2 FS的活性值(y轴(U/L))进行比较，示于图15。需要说明的是，乳糜样本附以+来表示。
【表46】
测定的结果，关于利用本发明方法与Lp-PLA2 FS的试样的测定值的相关关系，为相关公式y＝0.0885x+0.0643、相关系数r＝0.996。Lp-PLA2 FS为繁杂的3试剂体系，本发明方法可形成简便的2试剂体系，在这点上本发明方法优于Lp-PLA2 FS。
另外，利用本发明方法和PLAC测试的试样的测定值的相关关系为相关公式y＝0.2698x－7.0906、相关系数r＝0.991。需要说明的是，特别是对于乳糜严重的样本、即个人血清No17，在PLAC测试中、在本实施例中使用的7600-010S型日立自动分析装置中成为“吸光度超过错误”，无法测定。结合[实施例19]的结果考虑，PLAC测试相较于本发明方法容易受到溶血血红蛋白或乳糜的影响。因此，如上述实施例中所示，本发明方法通过PLAC测试而难以受到溶血血红蛋白和Intralipos输液(乳糜)的影响，在这点上是优异的。
利用Lp-PLA2 FS和PLAC测试的试样的测定值的相关关系为相关公式y＝3.0609x－81.691、相关系数r＝0.896。
另外，由于活性值的定义不同，因此利用Lp-PLA2 FS、PLAC测试以及本发明试剂测定的活性值不同，相关公式的斜率不为1，但认为若使活性值的定义、校准液的值相同，则相关公式的斜率会接近1。
[实施例21]
<本发明试剂和PLAC测试以及Lp-PLA2 FS的稀释线性>
对本发明试剂、PLAC测试以及Lp-PLA2 FS的稀释线性进行了比较。试剂组成与实施例17相同。
(试样)
使用在血清池J042中添加了0.05mg/mL rLp-PLA2的血清(以下记为血清X)和生理盐水(大塚制药株式会社制造)，制作出下述稀释系列。
血清X本身(1)、
血清X与生理盐水以3：1混合而成的物质(0.75)、
血清X与生理盐水以1：1混合而成的物质(0.5)、
血清X与生理盐水以1：3混合而成的物质(0.25)、
血清X与生理盐水以1：9混合而成的物质(0.1)以及
生理盐水(0)这6种。
(活性测定)
活性测定装置和测定参数以及活性值的计算在与实施例17相同的条件下进行。
各试剂中，按照x轴为稀释系列、y轴为每1分钟的吸光度变化的方式进行作图，示于图16～18。
测定的结果，由图16可知，本发明试剂的稀释线性由y＝48.851x－0.7186(r＝0.999)表示。另外，由图18可知，Lp-PLA2 FS的稀释线性由y＝62.481x－0.0086(r＝0.999)表示。在PLAC测试的情况下，如图17所示，未示出稀释线性。
[实施例22]
<本发明试剂的4℃保存稳定性试验>
使用将本发明试剂在试剂制备后于4℃保存1、2、3、4、5、6、8、15、29、60以及120天后的试剂，测定血清池J042的Lp-PLA2的灵敏度(ΔmAbs/min)。试剂的组成如下所述。
(本发明试剂)
<R1试剂>
<R2试剂>
(试样)
血清池J042
(活性测定)
活性的测定中使用了7170型日立自动分析装置。测定参数如下所示。需要说明的是，活性值的测定在与实施例17的本发明试剂的情况相同的条件下进行。
(7170型日立自动分析装置测定参数)
测定的结果，关于血清池J042的Lp-PLA2的灵敏度(ΔmAbs/min)和活性值，将利用制备后在4℃保存1天的试剂所测定的灵敏度和活性值设为100％时，至少120天为±10％的范围内，可知本发明的Lp-PLA2活性的测定方法和测定试剂盒即使以长时间(至少120天、4℃)保存后的试剂也能稳定、高灵敏度且准确地测定Lp-PLA2。
[实施例23]
<本发明试剂的保存稳定性试验(37℃热加速试验)>
将制备后于4℃保存了1周的本发明试剂在37℃保存1周、以及在37℃保存2周，测定下述试样的Lp-PLA2的灵敏度。试剂的组成如下所述，活性测定与实施例22同样地进行。
(本发明试剂)
<R1试剂>
<R2试剂>
(试样)
血清池J042、血清池B～D、包含0.017mg/mL rLp-PLA2的血清池J042溶液
在使用外消旋体PAF(C16)或1-棕榈酰基-2-乙酰基-sn-甘油-3-PC作为底物的本发明试剂的保存实验中，将利用制备后于4℃保存1天的试剂所测定的灵敏度和活性值设为100％的情况下，在37℃保存2周后的本发明试剂的灵敏度和活性值为±10％以内。至少在37℃保存2周后的本发明试剂也能稳定、高灵敏度且准确地测定Lp-PLA2活性。在37℃保存2周的保存稳定性预测与在4℃保存18个月的保存稳定性相当，因此，认为本发明试剂在4℃至少18个月左右是稳定的。
[实施例24]
<保存后的试样的Lp-PLA2活性测定1>
将在刚采血后离心分离而取得的个人血清A～D分成小份，采血1小时后在3个温度(4℃、-25℃、-80℃)下进行保存。在4℃保存的情况下，以n＝3对保存1小时、2小时、1天、2天、3天、4天、7天、15天、28天的个人血清A～D的Lp-PLA2活性进行测定，在-25℃和-80℃保存的情况下，以n＝3对保存1小时、1天、2天、3天、4天的个人血清A～D的Lp-PLA2活性进行测定。试剂的组成与实施例22相同。测定中使用7170型日立自动分析装置，测定参数与实施例22相同。参考例11中，将Lp-PLA2浓度为23.1(nmol/min/mL(U/L))的血清池J042-II用作校准试剂。
通过上述的“Lp-PLA2活性值的计算方法2”测定Lp-PLA2浓度，作为校准方法，选择将与校准试剂同时测定的蒸馏水作为0(nmol/min/mL(U/L))的单点校正。
测定的结果，将从采血1小时后在4℃保存1小时的个人血清A～D的测定值设为100％的情况下，从采血1小时后在4℃保存28天时的个人血清A～D的Lp-PLA2活性测定值(nmol/min/mL(U/L))均为±11％的范围内。另外，将从采血1小时后在4℃保存1小时的情况设为100％时，从采血1小时后将试样在-25℃或-80℃保存1天、2天、3天、4天时的Lp-PLA2活性测定值(nmol/min/mL(U/L))为±6％的范围内。可知：利用本发明方法能够测定的试样中的Lp-PLA2活性测定值在包括通常的样本保存温度范围的-80℃～4℃的范围是稳定的，本发明方法的通用性高、是有用的。
需要说明的是，根据文献(Clinical Biochemistry 44(2011),1247–1252)记载，在ELISA法中，与保存前的试样的Lp-PLA2活性测定值相比，在4℃保存2天的试样得到了高15％的测定值，在-25℃保存2天的试样得到了高30％的测定值，表明试样的保存对Lp-PLA2活性测定值所产生的影响大。另一方面，在利用本发明方法的Lp-PLA2活性的测定中，如上所述，试样的保存对活性测定值所产生的影响小，本发明方法的有用性明显。
[实施例25]
<保存后的试样的Lp-PLA2活性测定2>
将个人血清E冻融0～5次，测定Lp-PLA2活性。试剂、测定条件等与实施例22相同。校准试剂和校准方法与实施例24相同。
测定的结果，将冻融前的试样的Lp-PLA2活性测定值设为100％时，重复5次冻融后的试样中的Lp-PLA2活性测定值在任一种血清的情况下均为±4％的范围内。由实施例24和25的结果可知，根据本发明方法，对于至少在-80℃至4℃的范围保存后的试样也能稳定、高灵敏度且准确地测定Lp-PLA2活性。
[实施例26]
<LOB、LOD、LOQ的测定>
按照标准：CLSI EP17(EVALUATION OF DETECTION CAPABILITY FOR CLINICALLABORATORY MEASUREMENT PROCEDURES；APPROVED GUIDELINE(临床实验室测量程序检测能力评价；批准指南)(IEEE))的步骤，测定了本发明试剂的空白上限(LOB：Limit of Blank)、检测限(LOD：Limit of Detection)以及定量限(LOQ：Limit of Quantitation)。试剂的组成与实施例22相同。测定中使用7170型日立自动分析装置，测定参数与实施例22相同。校准试剂和校准方法与实施例24相同。
(试样)
使用按照Lp-PLA2浓度为0.0、1.4、2.9、4.3、5.8、7.2、8.7、10.1、11.6、13.0和14.5U/L的方式用生理盐水(0.9w/v％的NaCl)稀释的BJ池。
(测定)
5天中每天测定试样(n＝5)，计算出变异系数(CV％)、其平均和2SD(标准偏差的2倍)。将其结果示于图19。在图19中，CV(％)的2SD用误差棒表示，对Lp-PLA2浓度和变异系数进行幂近似，用实线表示(y＝37.644x-1.155)。
(LOB)
关于LOB，由Lp-PLA2浓度为0(nmol/min/mL(U/L))、即生理盐水的变异系数的平均值和变异系数的标准偏差，通过下式计算出为0.346(nmol/min/mL(U/L))。
LOB＝平均值+1.645×标准偏差
＝-0.1247+1.645×0.2862
＝0.346
(LOD)
关于LOD，由LOB和Lp-PLA2浓度为1.4(nmol/min/mL(U/L))的测定值的标准偏差(0.2804)，通过下式计算出为0.810(nmol/min/mL(U/L))。
LOD＝LOB+1.653×标准偏差
＝0.346+1.653×0.2804
＝0.810
(LOQ)
关于LOQ，由图19所示的Lp-PLA2浓度与变异系数的幂近似公式(y＝37.644x-1.155)，将CV(％)达到5％以下的测定值定义为LOQ，计算出5.742(nmol/min/mL(U/L))。
LOQ＝(5/37.644)(1/-1.155)＝5.742
由本实施例的结果表明，在本发明方法中能够检测出的Lp-PLA2活性的最低量为约0.810(U/L)，定量结果具有充分的可靠性的最小值为约5.742(U/L)，并且预测即使试剂的组成发生变化也为大体相同程度的LOB、LOQ，确认到本发明方法的实用性的高度。
[实施例27]
<导入了定点突变的Lyso PAF-PLD突变体的PLD活性>
导入将序列号9中记载的Lyso PAF-PLD的第45位的M(在序列号1中相当于第71位的M)置换为G、A、L、或D的定点突变，在突变前后比较针对Lyso PAF的PLD活性(Kcat/Km(s- 1mM-1))。其结果，突变前的PLD活性为1385(s-1mM-1)，与此相对，将序列号9的第45位的M突变为G的突变体(记为M45G。以下相同)、M45A、M45L和M45D的PLD活性分别为3059、11411、3284和4557(s-1mM-1)。
导入将序列号9中记载的Lyso PAF-PLD的第257位的F(在序列号1中相当于第283位的F)置换为G、E、R、K或W的定点突变，在突变前后比较上述的PLD活性(Kcat/Km(s-1mM-1))。其结果，突变前的上述PLD活性为1385(s-1mM-1)，与此相对，将序列号1的第257位的F突变为G的突变体(记为F257G。以下相同)、F257E、F257R、F257K和F257W的PLD活性分别为1200、1000,1080、1020和1320。
导入了定点突变的Lyso PAF-PLD突变体的PLD活性利用下述方法进行测定。将Tris 1.211g、氯化钙二水合物(和光纯药工业公司制造)14.7mg、Lyso PAF溶液20mL和1％TODB液2mL溶解于纯净水60mL中后，利用1N HCl调整为pH 7.5(25℃)，进而加入100U/mL胆碱氧化酶4mL、100U/mL过氧化物酶液4mL和1％4-AA液2mL进行溶解，用纯净水定容为100mL，作为针对Lyso PAF的PLD活性测定试剂(反应试剂混合液)。Lyso PAF溶液按照反应试剂混合液中的Lyso PAF浓度为0～5mM的方式进行制备。将反应试剂混合液3mL在37℃预加热5分钟，混合用10mM Tris-HCl pH7.5适当稀释的导入有定点突变的Lyso PAF-PLD突变体液50μL，开始反应，测定反应开始后第8至第9分钟的1分钟的546nm处的吸光变化。将醌亚胺色素的546nm处的毫摩尔分子吸光系数设为36(cm2/μmole)，计算出活性值(μmole/min)。蛋白量(mg/mL)利用Bradford法以牛血清白蛋白为标准进行计算。Km和Kcat根据上述的蛋白质·酶的基础实验法或ヴォート基礎生化学(Voet基础生物化学)(第4版)(东京化学同人)等中记载的通用方法、利用米氏方程算出。需要说明的是，在计算时酶的分子量设为33583。
将各突变体的上述PLD活性(Kcat/Km(s-1mM-1))示于表47。
【表47】
如上所述，Lyso PAF-PLD的定点突变体与野生型同样地具有PLD活性。
本发明试剂和本发明方法能够使用通用的生物化学自动分析仪测定Lp-PLA2活性，因而是通用性高、简便的测定方法。另外，由于能够不使用放射性同位素等来测定Lp-PLA2活性，因而表明为安全的测定方法。另外，由于能够在中性条件下进行测定，因而表明对于空气中的二氧化碳也是稳定的。另外，由于使用Lp-PLA2的原本的底物即PAF，因而表明准确地反映了生物体内的活性。另外，作为本实施例等中使用的试剂类，其被市售、能够容易地获得，能够容易地制造，因而经济性优异。
工业实用性
根据本发明的测定方法和试剂盒，能够简便且安全地以高灵敏度测定试样的Lp-PLA2活性。由此，本发明对于以心血管疾病为代表的Lp-PLA2参与的疾病或状态的诊断和管理特别有用，能够在医疗领域、试剂产业领域中利用。
本申请要求基于2016年6月22日提交的日本专利申请第2016-123707号的优先权，将其内容以参考的形式引入本说明书中。
序列表
<110> 旭化成制药株式会社
国立大学法人福岛大学
<120> LP-PLA2活性的测定
<130> 160928JP01
<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 334
<212> PRT
<213> 热密卷菌属 NITE BP-01628
<400> 1
Val His Pro Met Arg Arg Ala Val Val Leu Val Val Thr Val Ala Leu
1 5 10 15
Val Leu Ala Phe Pro Gly Pro Ala Ala Gly Glu Thr Thr Arg Thr Thr
20 25 30
Asp Asn Pro Trp Leu Asp Ala Arg Val Leu Asn Met Ala His Ala Gly
35 40 45
Gly Glu Asn Glu Ala Pro Ala Asn Thr Leu Tyr Ala Phe Lys Arg Ala
50 55 60
Val Lys Leu Gly Ala Asn Met Leu Glu Leu Asp Val Gln Ser Thr Lys
65 70 75 80
Asp Asp Gln Leu Val Val Ile His Asn Ala Thr Val Asp Gln Thr Thr
85 90 95
Asp Gly Thr Gly Lys Val Arg Asp Leu Thr Phe Glu Gln Val His Glu
100 105 110
Leu Asp Ala Ala Tyr Asn Phe Ile Pro Gly Arg His Ala Val Pro Gly
115 120 125
Glu Pro Pro Glu Ser Tyr Pro Leu Arg Gly Val Arg Thr Gly Glu Lys
130 135 140
Lys Pro Pro Pro Gly Tyr Gln Pro Ser Asp Phe Ala Ile Pro Lys Leu
145 150 155 160
Ala Asp Val Leu Glu Ala Phe Pro Arg Thr Pro Ile Asn Ile Glu Ile
165 170 175
Lys Gly Thr Ser Asp Ala Asp Ile Pro Ser Phe Leu His Asn Ala Lys
180 185 190
Leu Leu Ala Arg Leu Leu Lys Lys Thr Gly Arg Thr Asp Phe Ile Val
195 200 205
Thr Ser Phe Asn Asp Leu Ala Val Ala Lys Phe His Leu Leu Ala Pro
210 215 220
Asp Ile Pro Ile Ala Pro Gly Met Ala Gly Leu Ala Ala Tyr Phe Leu
225 230 235 240
Leu Gly Val Lys Pro Met His Gly Thr Val Ala Leu Gln Ile Pro Val
245 250 255
Arg Tyr Gln Gly Leu Glu Ile Ala Thr Pro Glu Phe Ile Arg Arg Ala
260 265 270
His Ala Asp Gly Tyr Ala Val His Val Trp Phe Ser Gly Thr Ala Pro
275 280 285
Asp Asp Glu Ala Thr Tyr Asn Arg Ile Ile Asp Ser Cys Ala Asp Gly
290 295 300
Leu Met Pro Ala Tyr Pro Ala Leu Leu Glu Arg Ile Leu Asp Glu Arg
305 310 315 320
Gly Ile Glu Arg Pro Gly Arg Pro Gly Val Asp Pro Cys Gly
325 330
<210> 2
<211> 1005
<212> DNA
<213> 热密卷菌属 NITE BP-01628
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1005)
<400> 2
gtg cac ccc atg cgc aga gcc gtt gtg ctg gtc gtc aca gtc gcg ttg 48
Val His Pro Met Arg Arg Ala Val Val Leu Val Val Thr Val Ala Leu
1 5 10 15
gta ctg gca ttt cct ggg ccg gcc gcg ggg gaa acc acc aga acg aca 96
Val Leu Ala Phe Pro Gly Pro Ala Ala Gly Glu Thr Thr Arg Thr Thr
20 25 30
gac aat ccg tgg ctg gac gcg agg gtg ctc aac atg gcc cac gcc ggc 144
Asp Asn Pro Trp Leu Asp Ala Arg Val Leu Asn Met Ala His Ala Gly
35 40 45
gga gaa aat gaa gcg cca gcg aac acg cta tac gcc ttc aag cgc gcg 192
Gly Glu Asn Glu Ala Pro Ala Asn Thr Leu Tyr Ala Phe Lys Arg Ala
50 55 60
gta aag ctc ggt gcg aac atg ctc gag ctg gat gtc caa tcc acc aag 240
Val Lys Leu Gly Ala Asn Met Leu Glu Leu Asp Val Gln Ser Thr Lys
65 70 75 80
gac gac cag ctg gtg gtc atc cac aac gcc acc gtc gac cag acc acc 288
Asp Asp Gln Leu Val Val Ile His Asn Ala Thr Val Asp Gln Thr Thr
85 90 95
gac ggc acc ggc aag gtg cgc gac ctg acg ttc gag caa gtg cac gag 336
Asp Gly Thr Gly Lys Val Arg Asp Leu Thr Phe Glu Gln Val His Glu
100 105 110
ctc gac gcg gcg tac aac ttc atc ccc ggc agg cat gcg gtg ccc ggt 384
Leu Asp Ala Ala Tyr Asn Phe Ile Pro Gly Arg His Ala Val Pro Gly
115 120 125
gag ccg ccg gag tcg tat cca ctg cgc ggt gtg cgg acc ggg gaa aag 432
Glu Pro Pro Glu Ser Tyr Pro Leu Arg Gly Val Arg Thr Gly Glu Lys
130 135 140
aag ccg ccg ccg ggc tac cag ccg tcg gat ttc gcg atc ccg aaa ctg 480
Lys Pro Pro Pro Gly Tyr Gln Pro Ser Asp Phe Ala Ile Pro Lys Leu
145 150 155 160
gcc gat gtg ctc gag gcc ttc ccg cga acg ccg atc aac atc gaa atc 528
Ala Asp Val Leu Glu Ala Phe Pro Arg Thr Pro Ile Asn Ile Glu Ile
165 170 175
aaa ggc acc agc gac gcg gac att cct tcg ttc ctg cac aac gcg aag 576
Lys Gly Thr Ser Asp Ala Asp Ile Pro Ser Phe Leu His Asn Ala Lys
180 185 190
ctg ttg gcc cgc ctg ttg aaa aag acc ggc cgc acg gac ttc atc gtg 624
Leu Leu Ala Arg Leu Leu Lys Lys Thr Gly Arg Thr Asp Phe Ile Val
195 200 205
acg tcg ttc aac gac ctc gcg gtg gcc aag ttc cat ctg ctg gcg ccc 672
Thr Ser Phe Asn Asp Leu Ala Val Ala Lys Phe His Leu Leu Ala Pro
210 215 220
gac atc ccc atc gcg cct gga atg gcc ggg ctc gcc gcg tac ttc ctg 720
Asp Ile Pro Ile Ala Pro Gly Met Ala Gly Leu Ala Ala Tyr Phe Leu
225 230 235 240
ctc ggc gtc aaa ccg atg cac ggc act gtc gcg ctg caa att ccg gtg 768
Leu Gly Val Lys Pro Met His Gly Thr Val Ala Leu Gln Ile Pro Val
245 250 255
cgg tat cag ggc ttg gaa atc gcc acg ccg gag ttc atc cgc cgg gcg 816
Arg Tyr Gln Gly Leu Glu Ile Ala Thr Pro Glu Phe Ile Arg Arg Ala
260 265 270
cac gcc gac ggc tac gcg gtg cac gtg tgg ttc agc gga acg gcg ccg 864
His Ala Asp Gly Tyr Ala Val His Val Trp Phe Ser Gly Thr Ala Pro
275 280 285
gac gac gaa gcg acg tac aac cgg atc atc gac tcg tgc gcc gac ggc 912
Asp Asp Glu Ala Thr Tyr Asn Arg Ile Ile Asp Ser Cys Ala Asp Gly
290 295 300
ctg atg ccc gcc tac ccg gcg ctg ctg gag cgg atc ctc gac gag cgt 960
Leu Met Pro Ala Tyr Pro Ala Leu Leu Glu Arg Ile Leu Asp Glu Arg
305 310 315 320
ggc atc gag cgt ccg ggc agg ccg ggc gtc gat ccg tgc gga tga 1005
Gly Ile Glu Arg Pro Gly Arg Pro Gly Val Asp Pro Cys Gly
325 330 335
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸: PCR正义引物
<400> 3
ttcatatgac caccagaacg acagacaatc 30
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸: PCR反义引物
<400> 4
ttgaattctc atccgcacgg atcgacgccc 30
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸: PCR正义引物
<400> 5
tttcatatgc aggtcctgat ggcggc 26
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸: PCR反义引物
<400> 6
tggatcctca gttgtatttt tcgatacccg 30
<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸: PCR正义引物
<400> 7
ttgctagcat ggcggcggac agcaacg 27
<210> 8
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸: PCR反义引物
<400> 8
gaattcttac tctttattaa gaaattttac tgcc 34
<210> 9
<211> 308
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 热密卷菌属 NITE BP-01628 起始于Met的衍生序列
<400> 9
Met Thr Thr Arg Thr Thr Asp Asn Pro Trp Leu Asp Ala Arg Val Leu
1 5 10 15
Asn Met Ala His Ala Gly Gly Glu Asn Glu Ala Pro Ala Asn Thr Leu
20 25 30
Tyr Ala Phe Lys Arg Ala Val Lys Leu Gly Ala Asn Met Leu Glu Leu
35 40 45
Asp Val Gln Ser Thr Lys Asp Asp Gln Leu Val Val Ile His Asn Ala
50 55 60
Thr Val Asp Gln Thr Thr Asp Gly Thr Gly Lys Val Arg Asp Leu Thr
65 70 75 80
Phe Glu Gln Val His Glu Leu Asp Ala Ala Tyr Asn Phe Ile Pro Gly
85 90 95
Arg His Ala Val Pro Gly Glu Pro Pro Glu Ser Tyr Pro Leu Arg Gly
100 105 110
Val Arg Thr Gly Glu Lys Lys Pro Pro Pro Gly Tyr Gln Pro Ser Asp
115 120 125
Phe Ala Ile Pro Lys Leu Ala Asp Val Leu Glu Ala Phe Pro Arg Thr
130 135 140
Pro Ile Asn Ile Glu Ile Lys Gly Thr Ser Asp Ala Asp Ile Pro Ser
145 150 155 160
Phe Leu His Asn Ala Lys Leu Leu Ala Arg Leu Leu Lys Lys Thr Gly
165 170 175
Arg Thr Asp Phe Ile Val Thr Ser Phe Asn Asp Leu Ala Val Ala Lys
180 185 190
Phe His Leu Leu Ala Pro Asp Ile Pro Ile Ala Pro Gly Met Ala Gly
195 200 205
Leu Ala Ala Tyr Phe Leu Leu Gly Val Lys Pro Met His Gly Thr Val
210 215 220
Ala Leu Gln Ile Pro Val Arg Tyr Gln Gly Leu Glu Ile Ala Thr Pro
225 230 235 240
Glu Phe Ile Arg Arg Ala His Ala Asp Gly Tyr Ala Val His Val Trp
245 250 255
Phe Ser Gly Thr Ala Pro Asp Asp Glu Ala Thr Tyr Asn Arg Ile Ile
260 265 270
Asp Ser Cys Ala Asp Gly Leu Met Pro Ala Tyr Pro Ala Leu Leu Glu
275 280 285
Arg Ile Leu Asp Glu Arg Gly Ile Glu Arg Pro Gly Arg Pro Gly Val
290 295 300
Asp Pro Cys Gly
305

Claims (20)

1.一种酶的应用，其用于在下述通式I所示的血小板活化因子类即PAF类和下述通式II所示的Lyso PAF类的存在下，不进行将所述PAF类水解而生成胆碱的反应，而将所述LysoPAF类水解而生成胆碱，
【化1】
式I中，
R1为直链或支链的饱和或部分不饱和的高级烃基，
R2为直链的低级烷基，
X为-C(O)-、-CH2-或-CH＝CH-，
【化2】
式II中，
R1和X与通式I中的定义相同，
所述酶为以下的(a)～(c)中的任一者中记载的蛋白质：
(a)具有序列号1或9中记载的氨基酸序列的蛋白质；
(b)具有在序列号1或9中记载的氨基酸序列中一个或复数个氨基酸发生了缺失、置换或插入的氨基酸序列，不具有针对PAF的磷脂酶D样活性即PLD活性，并且具有针对Lyso PAF的PLD活性的蛋白质；
(c)具有与序列号1或9中记载的氨基酸序列存在90％以上的序列同源性的氨基酸序列，不具有针对PAF的PLD活性，并且具有针对Lyso PAF的PLD活性的蛋白质。
2.一种活性的测定方法，其测定包含脂蛋白相关磷脂酶A2即Lp-PLA2的试样中的Lp-PLA2活性，该测定方法包括以下的工序(A)～工序(C)：
(A)使下述通式I所示的血小板活化因子类即PAF类与试样中的Lp-PLA2反应而转换为下述通式II所示的Lyso PAF类的工序，
【化3】
式I中，
R1为直链或支链的饱和或部分不饱和的高级烃基，
R2为直链的低级烷基，
X为-C(O)-、-CH2-或-CH＝CH-，
【化4】
式II中，
R1和X与通式I中的定义相同；
(B)利用酶将工序(A)中生成的所述Lyso PAF类水解而得到水解物的工序，所述酶为以下的(a)～(c)中的任一者中记载的蛋白质：
(a)具有序列号1或9中记载的氨基酸序列的蛋白质，
(b)具有在序列号1或9中记载的氨基酸序列中一个或复数个氨基酸发生了缺失、置换或插入的氨基酸序列，不具有针对PAF的磷脂酶D样活性即PLD活性，并且具有针对Lyso PAF的PLD活性的蛋白质，
(c)具有与序列号1或9中记载的氨基酸序列存在90％以上的序列同源性的氨基酸序列，不具有针对PAF的PLD活性，并且具有针对Lyso PAF的PLD活性的蛋白质；
(C)对于工序(B)中得到的水解物，以来自该水解物的变化量为指标，对试样中的Lp-PLA2活性进行测定的工序。
3.如权利要求2所述的方法，其中，工序(C)中的变化量是作为水解物的胆碱的变化量。
4.如权利要求3所述的方法，其中，作为测定胆碱的变化量的方法，工序(C)进一步包括下述的工序(C-1)：
(C-1)使胆碱与胆碱氧化酶反应而生成过氧化氢的工序。
5.如权利要求4所述的方法，其中，工序(C)进一步包括下述的工序(C-2)：
(C-2)通过使用显色试剂的比色分析法，对工序(C-1)中生成的过氧化氢的量进行测定的工序。
6.如权利要求2～5中任一项所述的方法，其中，在工序(A)之前进一步包括下述的工序(D)：
(D)将试样中的胆碱除去的工序。
7.如权利要求6所述的方法，其中，工序(D)是使用胆碱氧化酶将试样中的胆碱除去的工序。
8.如权利要求2～7中任一项所述的方法，其中，R2为甲基。
9.如权利要求2～8中任一项所述的方法，其中，R1独立地选自C15和C17的直链烷基。
10.如权利要求2～9中任一项所述的方法，其中，X为-CH2-。
11.如权利要求2～9中任一项所述的方法，其中，X为-C(O)-。
12.一种测定用试剂盒，其测定试样中的脂蛋白相关磷脂酶A2即Lp-PLA2活性，该试剂盒包含酶和下述通式I所示的PAF类，
所述酶为以下的(a)～(c)中的任一者中记载的蛋白质：
(a)具有序列号1或9中记载的氨基酸序列的蛋白质，
(b)具有在序列号1或9中记载的氨基酸序列中一个或复数个氨基酸发生了缺失、置换或插入的氨基酸序列，不具有针对血小板活化因子即PAF的磷脂酶D样活性即PLD活性，并且具有针对Lyso PAF的PLD活性的蛋白质，
(c)具有与序列号1或9中记载的氨基酸序列存在90％以上的序列同源性的氨基酸序列，不具有针对PAF的PLD活性，并且具有针对Lyso PAF的PLD活性的蛋白质，
【化5】
式I中，
R1为直链或支链的饱和或部分不饱和的高级烃基，
R2为直链的低级烷基，
X为-C(O)-、-CH2-或-CH＝CH-。
13.如权利要求12所述的试剂盒，其进一步包含胆碱氧化酶。
14.如权利要求13所述的试剂盒，其进一步包含过氧化物酶、Trinder’s试剂和偶联剂。
15.如权利要求12～14中任一项所述的试剂盒，其包含含有所述酶的第一试剂和含有所述PAF类的第二试剂。
16.如权利要求15所述的试剂盒，其中，所述第一试剂进一步包含胆碱氧化酶。
17.一种对Lp-PLA2参与的疾病和/或状态进行诊断和/或管理的方法，该方法包括下述工序：使用权利要求12～16中任一项所述的试剂盒，对来自被测体的试样中的Lp-PLA2活性进行测定。
18.如权利要求17所述的方法，其中，所述Lp-PLA2参与的疾病和/或状态为与动脉粥样硬化相伴的心血管疾病。
19.如权利要求12～16中任一项所述的试剂盒，其为Lp-PLA2参与的疾病和/或状态的诊断用试剂盒。
20.如权利要求19所述的试剂盒，其中，所述Lp-PLA2参与的疾病和/或状态为与动脉粥样硬化相伴的心血管疾病。
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