DE112017003142T5 - Messung der Aktivität der LP-PLA2 - Google Patents

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Abstract

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein sehr vielseitiges, einfaches und sicheres Verfahren zum Messen der Aktivität der Lp-PLAbereit zu stellen. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein genaues und hochempfindliches Verfahren zum Messen der Lp- PLA- Aktivität bereit zu stellen. Es wird ein Verfahren zur Messung der Aktivität der Lipoprotein- assoziierten Phospholipase A2 (Lp-PLA2) in einer Probe bereit gestellt, die Lp-PLAenthält, wobei das Verfahren die folgenden Schritte (A) bis (C) umfasst:(A) das Umwandeln von PAFs in Lyso- PAFs, indem die PAFs in der Probe mit Lp- PLAzur Reaktion gebracht werden;(B) das Hydrolysieren der Lyso- PAFs, die in Schritt (A) hergestellt wurden, mit einem Enzym (Lyso- PAF- PLD), um ein Hydrolysat zu erhalten; und(C) das Messen der Aktivität der Lp- PLAin der Probe, indem eine quantitative Änderung als Indikator verwendet wird, wobei die quantitative Änderung dem Hydrolysat, das in Schritt (B) erhalten wurde, zuordenbar ist.

Description

  • Technisches Gebiet
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Messverfahren und einen Kit zum Messen der Aktivität der Lp- PLA2 sowie eine Verwendung des Verfahrens und des Kits.
  • Stand der Technik
  • Die Lipoprotein- assoziierte Phospholipase A2 (auch bekannt als Plättchen-Aktivierungsfaktor- Acetylhydrolase (PAF-AH); im Folgenden als Lp- PLA2 bezeichnet) ist ein Enzym, das den Plättchen- aktivierenden Faktor (PAF) inaktiviert, indem es die Acetylgruppe an der Position sn-2 von PAF hydrolysiert. Lp- PLA2 ist an der Bildung von instabilen Plaques in Blutgefäßen beteiligt, und die Aktivät der Lp- PLA2 wurde als ein Marker für die Vorhersage des Risikos für kardiovaskuläre Ereignisse, die durch Atherosklerose verursacht werden (Nicht- Patentdokument 1 und 2), verwendet. Im Dezember 2014 wurde ein Kit zur Messung der Aktivität der Lp- PLA2, bezeichnet als der PLAC- Test für Lp- PLA2- Aktivität (Diazyme Laboratories, ehemals diaDexus Inc.) von der US-amerikanischen Lebens- und Arzneimittelbehörde (FDA) als ein Mittel zur Diagnose des Risikos für eine koronare Herzkrankheit (KHK) zugelassen. Neben diesem Kit ist auch Diasys Lp- PLA2 FS (Diasys) für die in vitro Diagnose im Handel erhältlich. Darüber hinaus bestehen Nachfragen für die Messung der Aktiviät der Lp- PLA2 für Forschungszwecke, und der PAF- Acetylhydrolase Assay- Kit (Cayman Chemical Company) ist im Handel als ein Forschungsreagens erhältlich.
  • Es wird angenommen, dass Lp- PLA2 bei verschiedenen Erkrankungen und Entzündungen eine Rolle spielt. Kürzlich wurde eine Verbindung zwischen Lp- PLA2 und Krebs vorgeschlagen, und somit könnte die Aktivität der Lp-PLA2, abgesehen von ihrer üblichen bekannten Verbindung mit einer Herz- Kreislauf- Erkrankung, Schlaganfall und dergleichen, auch dafür gemessen werden, um das Risiko für Krebs und dergleichen vorherzusagen (Nicht- Patentdokument 1).
  • Verfahren, bei denen ein mit einem radioaktiven Isotop markierter PAF verwendet wird, sind bekannt als Verfahren zum Messen der Aktivität der Lp- PLA2 (Patentdokument 1). Andere Verfahren zum Messen der Aktivität der Lp- PLA2 beinhalten ein Verfahren unter Verwendung eines PAF- Derivats, das einen Substituenten aufweist, der bei Freisetzung eine chromogene Verbindung oder eine fluoreszierende chromogene Verbindung bildet (Patentdokument 2), und Verfahren zum Messen der Mengen von Substituenten, die aus PAF- Derivaten freigesetzt wurden (Patentdokumente 3 und 4).
  • Verzeichnis der Literaturstellen
  • Patentdokument
    • Patentdokument 1: WO 2005/001416
    • Patentdokument 2: Offenlegungsschrift JP- A- 2002-223794
    • Patentdokument 3: Offenlegungsschrift JP- A- H07-59597
    • Patentdokument 4: Offenlegungsschrift JP- A- H04-346797
    • Patentdokument 5: WO 2014/010667
  • Nicht- Patentdokument
    • Nicht- Patentdokument 1: THE ENZYMES, Platelet-Activating Factor Acetylhydrolases (PAF-AH), (2015) Vol. 38, 145-179
    • Nicht- Patentdokument 2: PLAC- Test für Lp- PLA2- Aktivität (diaDexus Co., Packungsbeilage Ver. 2015-01-15)
    • Nicht- Patentdokument 3: Diasys Lp- PLA2 FS (Diasys, Packungsbeilage, Ver. Juli 2015/8)
  • Zusammenfassung
  • Aufgabe der Erfindung
  • Dem Verfahren aus Patentdokument 1 fehlt es jedoch an Vielseitigkeit und es wird nur von einer begrenzten Anzahl von Benutzern und Einrichtungen eingesetzt. Weiterhin ist es mit diesem Verfahren schwierig, mehrere Proben gleichzeitig zu messen, und es gibt Probleme in Bezug auf die Sicherheit oder die Entsorgung der radioaktiver Reagenzien und dergleichen.
  • Darüber hinaus ist eines der in Patentdokument 2 offenbarten PAF- Derivate 1-Myristoyl-2-(4-nitrophenylsuccinyl) phosphatidylcholin, das bei neutralen pH- Werten eine schlechte Wasserlöslichkeit aufweist und deshalb als Zusammensetzung in einer sauren wässrigen Lösung (Nicht- Patentdokument 2 oder 3) oder einer organischen Lösungsmittelzusammensetzung (Nicht- Patentdokument 3) hergestellt werden muss. Wenn die Aktivität der Lp-PLA2 unter Verwendung der Zusammensetzung in einer sauren wässrigen Lösung gemessen wird, kann der pH- Wert aufgrund von in der Luft enthaltenem Kohlendioxidgas variieren.
  • Das Verfahren, das in Patentdokument 4 offenbart ist, verwendet DTNB (5,5'-Dithiobis (2-nitrobenzoesäure)) als Nachweismittel für eine SH-Gruppe, und weist deshalb eine geringe Spezifität auf, da Interferenzen mit Substanzen, die im Serum enthalten sind und SH-Gruppen aufweisen, auftreten. Die Messverfahren aus den Patentdokumenten 3 und 4 weisen ferner ein hohes Verhältnis von Probe zu Reagenz (S/R ratio) auf oder verwenden Proben mit einem großen Volumen.
  • Ein Problem, das durch die vorliegende Erfindung gelöst werden soll, besteht darin, ein vielseitigeres, einfaches und sicheres Verfahren zum Messen der Aktivität der Lp- PLA2 bereitzustellen. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein genaues Verfahren zum Messen der Aktivität der Lp- PLA2 bereitzustellen. Noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein hochempfindliches Verfahren zum Messen der Aktivität der Lp- PLA2 bereitzustellen.
  • Lösung der Aufgabe
  • Im Vorfeld haben die Erfinder ein Enzym entdeckt, das mit Ethanolamin- Lyso-Plasmalogen (ein Protein, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die durch SEQ ID NO: 2 dargestellt ist, und ein Protein, das codiert wird durch die Nucleotidsequenz der SEQ ID NO: 4 in Patentdokument 5, beschrieben als IyPIs ase aus Thermocrispum sp. NITE BP- 01628; im Folgenden auch als „Lyso- PAF- PLD“ bezeichnet) wechselwirkt. Als ein Ergebnis von intensiver Forschungsarbeit, die auf die Lösung der vorstehend genannten Probleme gerichtet war, haben die Erfinder auch entdeckt, dass Lyso- PAF- PLD eine PLD-Aktivität für Lyso- PAF besitzt, aber keine PLD- Aktivität (Phospholipase D- artige Aktivität) für PAF in Umgebungen, die sowohl PAF als auch Lyso- PAF enthalten, und dass diese Substratspezifität zum Messen der Aktivität der Lp-PLA2 nützlich ist, wodurch sie die vorliegende Erfindung erzielen konnten.
  • Das heißt, die vorliegende Erfindung beinhaltet das Folgende.
  • [1'] Verwendung eines Enzyms in der Gegenwart von Plättchen- aktivierenden Faktoren (PAFs), die durch die nachstehende Allgemeine Formel I dargestellt sind:
    Figure DE112017003142T5_0001
    Figure DE112017003142T5_0002
    wobei:
    • R1 eine lineare oder verzweigte, gesättigte oder teilweise ungesättigte höhere Kohlenwasserstoffgruppe ist;
    • R2 eine lineare niedere Alkylgruppe ist; und
    • X -C(O)-, -CH2- oder -CH=CH- ist, und
    • Lyso- PAFs, die durch die nachstehende Allgemeine Formel II dargestellt sind:
      Figure DE112017003142T5_0003
    • wobei R1 und X wie in der Allgemeinen Formel I definiert sind,
    • um dadurch mit Hilfe der Hydrolyse der Lyso- PAFs Cholin herzustellen, ohne Cholin durch Hydrolyse der PAFs zu erzeugen, wobei
    • das Enzym ein Protein gemäß einem der nachstehend genannten Punkte (a) bis (c) ist:
      1. (a) ein Protein, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die durch SEQ ID NO: 1 oder 9 dargestellt ist;
      2. (b) ein Protein, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die durch SEQ ID NO: 1 oder 9 dargestellt ist, wobei eine oder mehrere Aminosäuren darin entfernt, substituiert oder hinzugefügt sind; und eine Phospholipase D (PLD)- artige Aktivität für Lyso- PAF, aber keine PLD- Aktivität für PAF, besitzt; oder
      3. (c) ein Protein, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die mindestens 90% Sequenzidentität mit einer Aminosäuresequenz aufweist, die durch SEQ ID NO: 1 oder 9 dargestellt ist; und eine PLD- Aktivität für Lyso- PAF, aber keine PLD- Aktivität für PAF, besitzt.
  • [1"] Verwendung eines Enzyms bei der Messung von Lyso- Plättchen-Aktivierungsfaktoren (Lyso- PAFs) in einer Probe, die PAFs, welche durch die nachstehende Allgemeine Formel I dargestellt sind:
    Figure DE112017003142T5_0004
    wobei:
    • R1 eine lineare oder verzweigte, gesättigte oder teilweise ungesättigte höhere Kohlenwasserstoffgruppe ist;
    • R2 eine lineare niedere Alkylgruppe ist; und
    • X -C(O)-, -CH2- oder -CH=CH- ist, enthalten kann,
    • und die Lyso- PAFs durch die nachstehende Allgemeine Formel II dargestellt sind:
      Figure DE112017003142T5_0005
    • wobei R1 und X wie in der Allgemeinen Formel I definiert sind,

    um dadurch mit Hilfe der Hydrolyse der Lyso- PAFs Cholin herzustellen, ohne Cholin durch Hydrolyse der PAFs zu erzeugen, wobei das Enzym ein Protein gemäß einem der nachstehend genannten Punkte (a) bis (c) ist:
    1. (a) ein Protein, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die durch SEQ ID NO: 1 oder 9 dargestellt ist;
    2. (b) ein Protein, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die durch SEQ ID NO: 1 oder 9 dargestellt ist, wobei eine oder mehrere Aminosäuren darin entfernt, substituiert oder hinzugefügt sind; und eine Phospholipase D (PLD)- artige Aktivität für Lyso- PAF, aber keine PLD- Aktivität für PAF, besitzt; oder
    3. (c) ein Protein, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die mindestens 90% Sequenzidentität mit einer Aminosäuresequenz aufweist, die durch SEQ ID NO: 1 oder 9 dargestellt ist; und eine PLD- Aktivität für Lyso- PAF, aber keine PLD- Aktivität für PAF, besitzt.
  • [1"'] Verwendung eines Enzyms, um die Aktivität eines Enzyms zu messen, das Plättchen- aktivierende Faktoren (PAFs), welche durch die nachstehende Allgemeine Formel I dargestellt sind:
    Figure DE112017003142T5_0006
    wobei:
    • R1 eine lineare oder verzweigte, gesättigte oder teilweise ungesättigte höhere Kohlenwasserstoffgruppe ist;
    • R2 eine lineare niedere Alkylgruppe ist; und
    • X -C(O)-, -CH2- oder -CH=CH- ist,
    enthalten kann,
    • in Lyso- PAFs, die durch die nachstehende Allgemeine Formel II dargestellt sind:
      Figure DE112017003142T5_0007
    • wobei R1 und X wie in der Allgemeinen Formel I definiert sind,
    umwandelt,
    • um dadurch mit Hilfe der Hydrolyse der Lyso- PAFs Cholin herzustellen, ohne Cholin durch Hydrolyse der PAFs zu erzeugen,
    • in einer Probe, die PAFs enthalten kann,
    • wobei das verwendete Enzym ein Protein gemäß einem der nachstehend genannten Punkte (a) bis (c) ist:
      1. (a) ein Protein, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die durch SEQ ID NO: 1 oder 9 dargestellt ist;
      2. (b) ein Protein, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die durch SEQ ID NO: 1 oder 9 dargestellt ist, wobei eine oder mehrere Aminosäuren darin entfernt, substituiert oder hinzugefügt sind; und eine Phospholipase D (PLD)- artige Aktivität für Lyso- PAF, aber keine PLD- Aktivität für PAF, besitzt; oder
      3. (c) ein Protein, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die mindestens 90% Sequenzidentität mit einer Aminosäuresequenz aufweist, die durch SEQ ID NO: 1 oder 9 dargestellt ist; und eine PLD- Aktivität für Lyso- PAF, aber keine PLD- Aktivität für PAF, besitzt.
  • Die vorliegende Erfindung beinhaltet ferner das Folgende. Wie nachstehend verwendet, umfasst [1] alle vorstehend genannten Ausführungsformen [1'], [1''] und [1'''].
  • [1-1] Die Verwendung gemäß [1], wobei das Enzym ein Protein gemäß einem der nachstehend genannten Punkte (d) bis (f) ist:
    • (d) ein Protein, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die durch die Nucleotidsequenz mit der SEQ ID NO: 2 codiert wird;
    • (e) ein Protein, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die durch die Nucleotidsequenz mit der SEQ ID NO: 2 codiert wird, wobei ein oder mehrere Nucleotide darin entfernt, substituiert oder hinzugefügt sind; und eine PLD- Aktivität für Lyso- PAF, aber keine PLD- Aktivität für PAF, besitzt; oder
    • (f) ein Protein, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die von einer Nucleotidsequenz codiert wird, welche mindestens 90% Sequenzidentität zu der Nucleotidsequenz mit der SEQ ID NO: 2 aufweist; und eine PLD- Aktivität für Lyso- PAF, aber keine PLD- Aktivität für PAF, besitzt.
  • [1-2] Die Verwendung gemäß [1] oder [1-1], wobei R2 eine Methylgruppe ist.
  • [1-3] Die Verwendung gemäß einem der Punkte [1] bis [1-2], wobei R1 unabhängig ausgewählt ist aus linearen C15 - und C17 - Alkylgruppen.
  • [1-4] Die Verwendung nach einem der Punkte [1] bis [1-3], wobei X -CH2- ist.
  • [1-5] Die Verwendung nach einem der Punkte [1] bis [1-3], wobei X -C(O)- ist.
  • [1-6] Die Verwendung nach einem der Punkte [1] bis [1-5], wobei die Verwendung gemäß [1] die Verwendung eines Enzyms ist, das ein Protein gemäß einem der Punkte (a) bis (c) ist, um die Lyso- PAFs, die durch die Allgemeine Formel II dargestellt sind, zu messen, wenn eine Kontamination durch die PAFs, die durch die Allgemeine Formel I dargestellt sind, möglich ist.
  • [2] Verfahren zum Messen der Aktivität der Lipoprotein-assoziierten Phospholipase A2 (Lp-PLA2) in einer Probe, die Lp-PLA2 enthält, wobei das Verfahren die folgenden Schritte (A) bis (C) beinhaltet:
    1. (A) das Umwandeln von Plättchen- aktivierenden Faktoren (PAFs), die durch die nachstehende Allgemeine Formel I dargestellt sind:
      Figure DE112017003142T5_0008
      wobei:
      • R1 eine lineare oder verzweigte, gesättigte oder teilweise ungesättigte höhere Kohlenwasserstoffgruppe ist;
      • R2 eine lineare niedere Alkylgruppe ist; und
      • X -C (O)-, -CH2- oder -CH=CH- ist, in Lyso- PAFs, die durch die nachstehende Allgemeine Formel II dargestellt sind:
        Figure DE112017003142T5_0009
      • wobei R1 und X wie in der Allgemeinen Formel I definiert sind,
      indem die PAFs mit der Lp-PLA2 in der Probe zur Reaktion gebracht werden;
    2. (B) das Hydrolysieren der Lyso- PAFs, die in Schritt (A) hergestellt worden sind, mit einem Enzym, das ein Protein gemäß einem der nachstehend genannten Punkte (a) bis (c) ist:
      1. (a) ein Protein, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die durch SEQ ID NO: 1 oder 9 dargestellt ist;
      2. (b) ein Protein, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die durch SEQ ID NO: 1 oder 9 dargestellt ist, wobei eine oder mehrere Aminosäuren darin entfernt, substituiert oder hinzugefügt sind; und eine Phospholipase D (PLD)- artige- Aktivität für Lyso- PAF, aber keine PLD- Aktivität für PAF, besitzt; oder
      3. (c) ein Protein, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die mindestens 90% Sequenzidentität mit einer Aminosäuresequenz aufweist, die durch SEQ ID NO: 1 oder 9 dargestellt ist; und eine PLD- Aktivität für Lyso- PAF, aber keine PLD- Aktivität für PAF, besitzt;
      um ein Hydrolysat zu erhalten; und
    3. (C) das Messen der Aktivität der Lp- PLA2 in der Probe unter Verwendung einer quantitativen Änderung als Indikator, wobei die quantitative Änderung dem Hydrolysat, das in Schritt (B) erhalten wurde, zuordenbar ist.
  • [3] Das Verfahren nach [2], wobei die quantitative Änderung in Schritt (C) eine Änderung der Menge des Cholins im Hydrolysat ist.
  • [3-1] Das Verfahren nach [2], wobei bei der quantitativen Änderung in Schritt (C) eine Änderung bei der Menge an Lyso- PAF Decholinaten erfolgt, die Hydrolysate sind.
  • [4] Das Verfahren nach [3], wobei der Schritt (C) ferner den folgenden Schritt (C-1) als ein Verfahren zum Messen der Änderung bei der Menge des Cholins umfasst:
    • (C-1) das Umsetzen von Cholin mit Cholinoxidase zur Erzeugung von Wasserstoffperoxid.
  • [5] Das Verfahren nach [4], wobei der Schritt (C) ferner den folgenden Schritt (C-2) umfasst:
    • (C-2) das Messen der Menge an Wasserstoffperoxid, die in Schritt (C-1) erzeugt wurde, mit Hilfe eines kolorimetrischen Verfahrens unter Verwendung eines chromogenen Reagens.
  • [6] Das Verfahren nach einem der Punkte [2] bis [5], welches ferner den folgenden Schritt (D) vor dem Schritt (A) umfasst:
    • (D) das Entfernen von Cholin in der Probe.
  • [7] Das Verfahren nach [6], wobei der Schritt (D) das Entfernen von Cholin in der Probe unter Verwendung von Cholinoxidase ist.
  • [8] Das Verfahren nach einem der Punkte [2] bis [7], wobei R2 eine Methylgruppe ist.
  • [9] Das Verfahren nach einem der Punkte [2] bis [8], wobei R1 unabhängig aus linearen C15 - und C17 - Alkylgruppen ausgewählt ist.
  • [10] Das Verfahren nach einem der Punkte [2] bis [9], wobei X -CH2- ist.
  • [11] Das Verfahren nach einem der Punkte [2] bis [9], wobei X -C(O)- ist.
  • [12] Kit zur Messung der Aktivität der Lipoprotein-assoziierten Phospholipase A2 (Lp- PLA2) in einer Probe,
    wobei der Kit umfasst:
    • ein Enzym, das ein Protein gemäß einem der nachstehend genannten Punkte (a) bis (c) ist:
      1. (a) ein Protein, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die durch SEQ ID NO: 1 oder 9 dargestellt ist;
      2. (b) ein Protein, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die durch SEQ ID NO: 1 oder 9 dargestellt ist, wobei eine oder mehrere Aminosäuren darin entfernt, substituiert oder hinzugefügt sind; und eine Phospholipase D (PLD)- artige- Aktivität für Lyso- PAF, aber keine PLD- Aktivität für PAF, besitzt; oder
      3. (c) ein Protein, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die mindestens 90% Sequenzidentität mit einer Aminosäuresequenz aufweist, die durch SEQ ID NO: 1 oder 9 dargestellt ist; und eine PLD- Aktivität für Lyso- PAF, aber keine PLD- Aktivität für PAF, besitzt;

    und
    PAFs, die durch die nachstehende Allgemeine Formel I dargestellt sind:
    Figure DE112017003142T5_0010
    wobei:
    • R1 eine lineare oder verzweigte, gesättigte oder teilweise ungesättigte höhere Kohlenwasserstoffgruppe ist;
    • R2 eine lineare niedere Alkylgruppe ist; und
    • X -C(O)-, -CH2- oder -CH=CH- ist.
  • [13] Der Kit nach [12], welcher ferner eine Cholinoxidase umfasst.
  • [14] Der Kit nach [13], welcher ferner eine Peroxidase, ein Trinder- Reagens und einen Kuppler umfasst.
  • [14-1] Der Kit gemäß [13], welcher ferner eine Peroxidase und ein chromogenes Reagens umfasst.
  • [14-2] Der Kit gemäß [14-1], wobei das chromogene Reagens entweder ein Reagens vom Typ Leuko ist oder ein Kuppler und ein Trinder- Reagens ist.
  • [14-3] Der Kit gemäß [14-1], wobei das chromogene Reagens ein Kuppler und ein Trinder- Reagens ist.
  • [14-4] Der Kit gemäß [14-3], wobei der Kuppler 4-Aminoantipyrin ist.
  • [15] Der Kit nach einem der Punkte [12] bis [14-4], welcher umfasst: ein erstes Reagens, das das Enzym umfasst; und ein zweites Reagens, das die PAFs umfasst.
  • [16] Der Kit nach [15], wobei das erste Reagens ferner eine Cholinoxidase umfasst.
  • [16-1] Der Kit nach [15] oder [16], wobei das erste Reagens und / oder das zweite Reagens ferner ein chromogenes Reagens umfasst.
  • [16-2] Der Kit nach einem der Punkte von [12] bis [16-1], wobei die Inhaltsstoffe getrennt in mehreren Behältern gelagert sind.
  • [16-3] Der Kit nach einem der Punkte von [12] bis [16-2], wobei R2 eine Methylgruppe ist.
  • [16-4] Der Kit nach einem der Punkte von [12] bis [16- 3], wobei R1 unabhängig aus linearen C15 - oder C17 - Alkylgruppen ausgewählt ist.
  • [16-5] Der Kit nach einem der Punkte von [12] bis [16-4], wobei X -CH2- ist.
  • [16-6] Der Kit nach einem der Punkte von [12] bis [16-4], wobei X -C(O)- ist.
  • [17] Verfahren zum Diagnostizieren und / oder Managen einer Krankheit und / oder eines Zustands, die / der mit Lp- PLA2 in Verbindung steht, wobei das Verfahren das Messen der Aktivität der Lp- PLA2 in einer Probe von einem Subjekt unter Verwendung des Kits gemäß einem der Punkte [12] bis [16-6] umfasst.
  • [18] Das Verfahren nach [17], wobei die Krankheit und / oder der Zustand, die / der mit Lp- PLA2 In Verbindung steht, eine kardiovaskuläre Erkrankung ist, die mit Atherosklerose in Beziehung steht.
  • [19] Der Kit nach einem der Punkte von [12] bis [16-6], welcher ein Kit zum Diagnostizieren einer Krankheit und / oder eines Zustands ist, die / der mit Lp- PLA2 in Verbindung steht.
  • [20] Der Kit nach [19], wobei die Krankheit und / oder der Zustand, die / der mit Lp-PLA2 in Verbindung steht, eine kardiovaskuläre Erkrankung ist, die mit Atherosklerose in Beziehung steht.
  • Vorteilhafte Wirkungen der Erfindung
  • Mit der vorliegenden Erfindung ist eine einfache, sichere und vielseitigere Messung der Aktivität der Lp- PLA2 möglich. Ferner kann die Aktivität der Lp- PLA2 genau oder mit einer hohen Empfindlichkeit gemessen werden, während die Auswirkungen von Interferenzen minimiert werden. Die vorliegende Erfindung ist auch nützlich zum Diagnostizieren und Managen von Krankheiten oder Zuständen, die mit Lp- PLA2 in Verbindung stehen, wie, zum Beispiel, Atherosklerose.
  • Figurenliste
    • 1 zeigt die Restaktivität der Lyso- PAF- PLD bei verschiedenen Temperaturen, wie bestimmt in Referenzbeispiel 10.
    • 2 zeigt Änderungen der Absorption bei jedem Messpunkt während einer 10 Minuten langen Umsetzung unter Verwendung von verschiedenen Konzentrationen von PAF als Substrat aus Beispiel 1.
    • 3 zeigt Änderungen der Absorption bei jedem Messpunkt während einer 10 Minuten langen Umsetzung unter Verwendung von verschiedenen Konzentrationen von Lyso- PAF als Substrat aus Beispiel 1.
    • 4 zeigt Änderungen der Absorption nach Zugabe von verschiedenen Konzentrationen von rLp- PLA2 zu gepooltem Serum J042 aus Beispiel 14.
    • 5 zeigt Änderungen der Absorption nach Zugabe von verschiedenen Konzentrationen von rLp- PLA2 zu gepooltem Serum A aus Beispiel 14.
    • 6 zeigt Änderungen der Absorption nach Zugabe von verschiedenen Konzentrationen von rLp- PLA2 zu gepooltem Serum B aus Beispiel 14.
    • 7 zeigt Änderungen der Absorption nach Zugabe von verschiedenen Konzentrationen von rLp- PLA2 zu gepooltem Serum C aus Beispiel 14.
    • 8 zeigt eine Korrelation zwischen den Messungen der Aktivität der Lp-PLA2, die in Beispiel 15 mit den erfindungsgemäßen Reagenzien und einem Reagenz der Cayman Chemical Company erhalten wurden.
    • 9 zeigt eine Korrelation zwischen den Messungen der Aktivität der Lp-PLA2, die in Beispiel 16 mit den erfindungsgemäßen Reagenzien und einem ELISA Kit von R & D Systems erhalten wurden.
    • 10 zeigt den Zeitverlauf einer Umsetzung des gepoolten Serums J042 mit den erfindungsgemäßen Reagenzien aus Beispiel 18.
    • 11 zeigt den Zeitverlauf einer Umsetzung des gepoolten Serums J042 mit dem PLAC- Test aus Beispiel 18.
    • 12 zeigt den Zeitverlauf einer Umsetzung des gepoolten Serums J042 mit Lp-PLA2 FS aus Beispiel 18.
    • 13 zeigt eine Korrelation zwischen den Messungen der Aktivität der Lp-PLA2, die in Beispiel 20 mit den erfindungsgemäßen Reagenzien und dem PLAC- Test erhalten wurden.
    • 14 zeigt eine Korrelation zwischen den Messungen der Aktivität der Lp-PLA2, die in Beispiel 20 mit Lp- PLA2 FS und den erfindungsgemäßen Reagenzien erhalten wurden.
    • 15 zeigt eine Korrelation zwischen den Messungen der Aktivität der Lp-PLA2, die in Beispiel 20 mit dem PLAC- Test und Lp- PLA2 FS erhalten wurden.
    • 16 zeigt eine Linearität der Aktivität der Lp-PLA2, die In Beispiel 21 bei der Messung einer Verdünnungsreihe mit den erfindungsgemäßen Reagenzien erhalten wurden.
    • 17 zeigt eine Linearität der Aktivität der Lp-PLA2, die In Beispiel 21 bei der Messung einer Verdünnungsreihe mit dem PLAC- Test erhalten wurden.
    • 18 zeigt eine Linearität der Aktivität der Lp-PLA2, die In Beispiel 21 bei der Messung einer Verdünnungsreihe mit Lp-PLA2 FS erhalten wurde.
    • 19 ist ein Diagramm, das Variationskoeffizienten (CV %), die aus den in Beispiel 26 gemessenen Konzentrationen von Lp-PLA2 berechnet wurden, als weiße Kreise zeigt, und die 2SDs (2-fache Standardabweichung) als Fehlerbalken; und die Konzentrationen von Lp-PLA2 sowie die Variationskoeffizienten sind statistisch gewichtet (power-approximated) und als eine durchgezogene Linie gezeigt (y = 37,644 ×-1,155).
  • Beschreibung von Ausführungsformen
  • Die vorliegende Erfindung wird nachstehend auf der Grundlage von Ausführungsformen der Erfindung (im Folgenden manchmal als „die vorliegende Ausführungsform“ bezeichnet) im Detail ausführlich erläutert. Die vorliegenden Ausführungsformen, die nachstehend angegeben sind, sollen die Erfindung beispielhaft veranschaulichen und ihren Geltungsbereich nicht einschränken.
  • Wie hierin verwendet, kann ein Kohlenstoffatom einfach als „C“, ein Wasserstoffatom als „H“, ein Sauerstoffatom als „O“, ein Stickstoffatom als „N“ und ein Phosphoratom als „P“ dargestellt werden. Eine Carbonylgruppe kann auf ähnliche Weise einfach als „-C(O)-“, und eine Etherbindung als „-O-“ dargestellt werden, wobei „-“ darin eine Bindung darstellt. Eine Doppelbindung kann einfach als „=“ dargestellt werden.
  • Eine Kohlenwasserstoffgruppe ist eine molekulare Gruppe, die nach der Entfernung von einem Wasserstoffatom, oder zwei oder mehreren Wasserstoffatomen, aus einem Kohlenwasserstoff zurückbleibt, und sie kann entweder linear oder verzweigt sein, und kann außerdem teilweise ungesättigt sein. In der Beschreibung und den Ansprüchen beziehen sich die Ausdrücke „höher“ und „nieder“ auf die Anzahl der Kohlenstoffatome, und die Bereiche derselben können von einem Fachmann leicht verstanden werden. Eine höhere Kohlenwasserstoffgruppe kann beispielsweise 10 bis 30, oder vorzugsweise 10 bis 20, oder stärker bevorzugt 15 bis 17 Kohlenstoffatome aufweisen. Ein niederer Kohlenwasserstoff kann 1 bis 9 oder vorzugsweise 1 bis 4 Kohlenstoffatome, oder stärker bevorzugt 1 Kohlenstoffatom aufweisen.
  • Ein „Alkyl“, wie hierin verwendet, ist eine lineare oder verzweigte gesättigte Kohlenwasserstoffgruppe.
  • Wie hierin verwendet, wird die Anzahl der Kohlenstoffatome in einer Kohlenwasserstoffeinheit als „Cp“ dargestellt, was bedeutet, dass die Anzahl der Kohlenstoffatome „p“ ist.
  • Eine Ausführung der vorliegenden Ausführungsformen stellt die Verwendung eines spezifischen Enzyms in Gegenwart von Plättchen- aktivierenden Faktoren (PAFs) und Lyso-PAFs bereit, um Cholin durch Hydrolyse der Lyso- PAFs zu erzeugen, ohne eine Reaktion zur Herstellung von Cholin durch eine Hydrolyse der PAFs durchzuführen. Darüber hinaus stellt eine Ausführung der vorliegenden Ausführungsformen ein Verfahren zum Messen der Konzentration von Lyso- PAFs bereit, wobei eine Änderung bei der Menge des Hydrolysats, das durch das Hydrolysieren der Lyso- PAFs mit einem spezifischen Enzym erhalten wird, als ein Indikator verwendet wird.
  • Ferner stellt eine Ausführung der vorliegenden Ausführungsformen ein Verfahren zum Messen der Aktivität der Lipoprotein- assoziierten Phospholipase A2 (Lp- PLA2) in einer Probe, die Lp- PLA2 enthält, bereit, welches die folgenden Schritte (A) bis (C) umfasst:
    1. (A) das Umwandeln von PAFs in Lyso- PAFs, indem die PAFs mit Lp- PLA2 in der Probe zur Reaktion gebracht werden;
    2. (B) das Hydrolysieren der Lyso- PAFs, die in Schritt (A) hergestellt wurden, mit einem spezifischen Enzym, um das Hydrolysat zu erhalten; und
    3. (C) das Messen der Aktivität der Lp- PLA2 in der Probe unter Verwendung einer quantitativen Änderung als Indikator, wobei die quantitative Änderung dem Hydrolysat, das in Schritt (B) erhalten wurde, zuordenbar ist.
  • In einer Ausführung der vorliegenden Ausführungsformen wird das Reaktionssystem zur Messung der Aktivität der Lp- PLA2 durch das folgende Schema dargestellt.
    Figure DE112017003142T5_0011
  • In einer Ausführung der vorliegenden Ausführungsformen kann der Schritt (A) zum Beispiel durchgeführt werden, indem eine Probe, die Lp- PLA2 enthält, mit einem Reagens, das PAF enthält, gemischt wird, wie in den folgenden Beispielen gezeigt.
  • In der vorliegenden Ausführungsform ist eine „Probe“ ein Messobjekt, und eine „Probe“, in der dieAktivität der Lp-PLA2 gemessen werden kann, kann ohne spezielle Einschränkungen alles sein, was Lp-PLA2 enthält oder enthalten kann. Beispiele für solche Proben umfassen Körperflüssigkeiten, wie, zum Beispiel, Blut, Serum, Plasma, Urin oder Fruchtwasser von Menschen oder Tieren, und Zellen, Organe, oder Extrakte von Zellen und Organen von Menschen oder Tieren. Eine bevorzugte Probe ist Blut, Serum oder Plasma von einem Menschen. Wie in den nachstehenden Beispielen 24 und 25 beschrieben, ist es mit der vorliegenden Ausführungsform möglich, die Aktivität der Lp- PLA2 stabil und mit hoher Empfindlichkeit zu messen, selbst wenn eine Probe in einem normalen Temperaturbereich zur Lagerung von Proben (wie, z. B., Raumtemperatur (1 °C bis 30 °C)) oder in einem Tiefkühlschrank bei einer niedrigeren Temperatur (bis hinunter zu -80 °C)) gelagert wurde.
  • In der vorliegenden Ausführungsform ist Lp- PLA2 (Lipoprotein- assoziierte Phospholipase A2) ein Enzym, das mindestens die Acetylgruppe an der sn-2- Position eines PAF hydrolysiert, um dadurch Lyso- PAF zu erzeugen und PAF zu inaktivieren. Es wird auch als Plättchen- Aktivierungsfaktor- Acetylhydrolase (PAF- AH) bezeichnet.
  • In der vorliegenden Ausführungsform werden die Plättchen- aktivierenden Faktoren (PAFs) durch die folgende Allgemeine Formel I dargestellt.
    Figure DE112017003142T5_0012
  • In der Allgemeinen Formel I ist R1 eine lineare oder verzweigte, gesättigte oder teilweise ungesättigte höhere Kohlenwasserstoffgruppe, und kann eine C10-30-Kohlenwasserstoffgruppe, oder bevorzugt eine C10-20- Kohlenwasserstoffgruppe, oder stärker bevorzugt eine C15-17- Kohlenwasserstoffgruppe sein. In einer Ausführungsform kann es eine lineare C10- oder höhere Alkylgruppe, oder bevorzugt eine lineare C15- Alkylgruppe oder eine lineare C17- Alkylgruppe, oder stärker bevorzugt eine lineare C15- Alkylgruppe sein. In einer Ausführungsform kann R1 eine teilweise ungesättigte Kohlenwasserstoffgruppe sein. Wenn ungesättigte Bindungen vorhanden sind, beträgt die Anzahl derselben vorzugsweise 1 oder 2, stärker bevorzugt 1. Beispiele für teilweise ungesättigte Gruppen für R1 beinhalten Geranyl-, Geranylgeranyl- und Oleylgruppen und dergleichen.
  • R2 in der Allgemeinen Formel I ist eine lineare niedere Alkylgruppe, wie, z. B., eine C1-9- Alkylgruppe. Je kleiner das Molekül von R2 in der Allgemeinen Formel I ist, desto besser ist es als Substrat für Lp- PLA2 (Journal of Clinical Laboratory Medicine, Februar 2012, Bd. 56, Nr. 2, S. 152); entsprechend ist R2 in einer Ausführungsform bevorzugt eine C1-4-Alkylgruppe, oder stärker bevorzugt eine Methylgruppe oder Butylgruppe, oder noch stärker bevorzugt eine Methylgruppe.
  • In der Allgemeinen Formel I steht X für -C(O)-, -CH2- oder -CH=CH-, und ist in einer Ausführungsform vorzugsweise -CH2-, und noch stärker bevorzugt -C(O)- in einer anderen Ausführungsform. Wenn X in einer Ausführungsform -C(O)- ist, ist R1 vorzugsweise ein lineares C15- Alkyl (wie, z. B., 1-Palmitoyl-2- acetyl- sn-glycero-3-PC, nachstehend beschrieben), wohingegen in einer Ausführungsform, bei der X für -CH2- steht, ist R1 vorzugsweise ein lineares C15- oder C17- Alkyl. Wenn X -CH=CH- ist, kann es entweder die cis-Form oder die trans-Form annehmen, und die trans-Form ist bevorzugt.
  • In der vorliegenden Ausführungsform ist „PAFs“ eine allgemeine Bezeichnung für PAF und PAF-Analoga, die nachstehend erklärt werden, und kann sich auf natürlich vorkommende PAFs oder künstlich synthetisierte PAFs beziehen, einschließlich PAFs, deren Stereochemie die S-Konfiguration, die R-Konfiguration, oder eine Mischung derselben in beliebigen Verhältnissen aufweist. In einer Ausführung der vorliegenden Ausführungsform kann eine optisch aktive Form von PAFs unter dem Gesichtspunkt der Sensitivität der Messung der Aktivität der Lp- PLA2 wünschenswert sein, während in anderen Fällen racemische PAFs aus wirtschaftlichen Gründen, wie beispielsweise Herstellungskosten, wünschenswert sein können.
  • In der vorliegenden Ausführungsform ist ein „PAF“ eine Verbindung der Allgemeinen Formel I, in der X für -CH2- steht, R1 eine lineare C15- oder C17- Alkylgruppe ist, und R2 eine Methylgruppe ist (diese werden manchmal als „PAF (C16)“ bzw. „PAF (C18)“ bezeichnet), und es kann ein natürlich vorkommender PAF oder ein künstlich synthetisierter PAF sein, einschließlich einem PAF, der eine Stereochemie mit einer S-Konfiguration, einer R-Konfiguration, oder einer Mischung derselben in beliebigen Anteilen besitzt.
  • In der vorliegenden Ausführungsform sind „PAF- Analoga“ PAFs, wie in der Allgemeinen Formel I definiert, aber von dem vorstehend beschriebenen PAF verschieden, und können ein natürlich vorkommendes PAF- Analogon oder ein künstlich synthetisiertes PAF- Analogon sein, einschließlich einem PAF- Analogon, dessen Stereochemie eine S-Konfiguration, eine R-Konfiguration, oder eine Mischung derselben in beliebigen Verhältnissen aufweist. Ein Beispiel für ein „PAF- Analogon“ ist ein Plasmalogen. Ein Plasmalogen kann ein natürlich vorkommendes Plasmalogen oder ein künstlich synthetisiertes Plasmalogen sein, einschließlich Mischungen von optisch aktiven Formen in beliebigen Verhältnissen, sofern solche existieren. Ein Beispiel für ein derartiges Plasmalogen ist, zum Beispiel, das Plasmalogen, das in Advances in Clinical Chemistry 2016, Bd. 38, S. 109-116 beschrieben ist. In einer Ausführungsform, in der die PAFs Plasmalogene sind, ist R2 vorzugsweise eine Methylgruppe oder Butylgruppe.
  • PAFs können zum Beispiel von Avanti Polar Lipids, Inc. (Alabama, USA) und Bachem (Schweiz) bezogen werden. Optisch aktive Formen von PAFs können mit Hilfe der Verfahren, die in J. Org. Chem. 1995, Bd. 60, 7706-7708 offenbart sind, synthetisiert werden. Racemische PAFs können unter Verwendung von 1-O-Hexadecyl-rac-glycerol als Ausgangsmaterial mit Hilfe der Verfahren, die in J. Org. Chem. 1995, Bd. 60, 7706-7708, offenbart sind, synthetisiert werden.
  • In dem Schritt (A) der vorliegenden Ausführungsform kann die Menge der PAFs, die verwendet wird, jede beliebige Menge sein, die es erlaubt, die Aktivität der Lp- PLA2 quantitativ, semiquantitativ oder qualitativ zu messen, und bevorzugt ist es eine Menge, die eine quantitative Messung erlaubt. Die Untergrenze kann mindestens 1 mM, oder vorzugsweise mindestens 5 mM, oder stärker bevorzugt mindestens 7 mM betragen, und die Obergrenze ist nicht speziell eingeschränkt, beträgt aber vorzugsweise nicht mehr als 50 mM, oder stärker bevorzugt nicht mehr als 20 mM, oder insbesondere nicht mehr als 15 mM.
  • In der vorliegenden Ausführungsform sind „Lyso- PAFs“ Verbindungen, die durch eine Hydrolyse der vorstehend beschriebenen PAFs an der Position sn-2 hergestellt werden, und sind Verbindungen, die durch die folgende Allgemeine Formel II dargestellt sind:
    Figure DE112017003142T5_0013
    Figure DE112017003142T5_0014
    wobei R1 und X wie in der Allgemeinen Formel I definiert sind. „Lyso- PAFs“ ist eine allgemeine Bezeichnung für das Lyso-PAF und Lyso- PAF- Analoga, die nachfolgend erklärt werden.
  • In der vorliegenden Ausführungsform ist ein „Lyso- PAF“ eine Verbindung der Allgemeinen Formel II, in der X -CH2- ist und R1 eine lineare C15- oder C17- Alkylgruppe ist, und es kann sich entweder um ein natürlich vorkommendes Lyso- PAF handeln oder um einen künstlich synthetisierten Lyso- PAF, einschließlich einem Lyso-PAF, dessen Stereochemie eine S-Konfiguration, eine R-Konfiguration, oder eine Mischung derselben in beliebigen Anteilen aufweist. Der Lyso- PAF kann auch innerhalb eines Reaktionssystems hergestellt werden.
  • In der vorliegenden Ausführungsform sind „Lyso- PAF- Analoga“ Lyso- PAFs, wie in der Allgemeinen Formel II definiert, aber von dem vorstehend beschriebenen Lyso- PAF verschieden, und können natürlich vorkommende Lyso- PAF- Analoga oder künstlich synthetisierte Lyso- PAF- Analoga sein, einschließlich Lyso- PAF- Analoga, deren Stereochemie eine S-Konfiguration, eine R-Konfiguration, oder eine Mischung derselben in beliebigen Verhältnissen aufweist. Die Lyso- PAF- Analoga können auch innerhalb eines Reaktionssystems hergestellt werden.
  • In einer Ausführung der vorliegenden Ausführungsform kann der Schritt (B), wie beispielsweise in den folgenden Beispielen gezeigt, durchgeführt werden, indem die Lyso-PAFs, die mit Hilfe der Lp- PLA2 aus PAFs in Schritt (A) erzeugt wurden, und ein Reagens, das ein Enzym zur Herstellung von Cholin durch Hydrolyse dieser Lyso- PAFs enthält, zusammengebracht werden.
  • In einer Ausführung ist das Enzym, das in dem Schritt (B) verwendet wird, eines der folgenden Proteine:
    1. (a) ein Protein, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die durch SEQ ID NO: 1 oder 9 dargestellt ist;
    2. (b) ein Protein, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die durch SEQ ID NO: 1 oder 9 dargestellt ist, wobei eine oder mehrere Aminosäuren darin entfernt, substituiert oder hinzugefügt sind; und eine Phospholipase D (PLD)- artige Aktivität für Lyso- PAF, aber keine PLD- Aktivität für PAF, besitzt; oder
    3. (c) ein Protein, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die mindestens 90% Sequenzidentität mit einer Aminosäuresequenz aufweist, die durch SEQ ID NO: 1 oder 9 dargestellt ist; und eine PLD- Aktivität für Lyso- PAF, aber keine PLD- Aktivität für PAF, besitzt.
  • In einer Ausführung kann das Enzym, das in dem Schritt (B) verwendet wird, ferner auch eines der folgenden Proteine sein:
    • (d) ein Protein, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die durch die Nucleotidsequenz mit der SEQ ID NO: 2 codiert wird;
    • (e) ein Protein, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die durch die Nucleotidsequenz mit der SEQ ID NO: 2 codiert wird, wobei ein oder mehrere Nucleotide darin entfernt, substituiert oder hinzugefügt sind; und eine PLD- Aktivität für Lyso- PAF, aber keine PLD- Aktivität für PAF, besitzt; oder
    • (f) ein Protein, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die von einer Nucleotidsequenz codiert wird, welche mindestens 90% Sequenzidentität zu der Nucleotidsequenz mit der SEQ ID NO: 2 aufweist; und eine PLD- Aktivität für Lyso- PAF, aber keine PLD- Aktivität für PAF, besitzt.
  • In dem vorstehend in (b) genannten Protein ist die „Aminosäuresequenz ... mit einer oder mehreren darin entfernten (deletierten), substituierten oder hinzugefügten Aminosäuren“ nicht speziell eingeschränkt, solange das Protein die gewünschte Aktivität besitzt, und kann, z. B., eine Aminosäuresequenz sein, aus der 1 oder mehr, oder genauer gesagt 1 bis 9, oder vorzugsweise 1 bis 5, oder stärker bevorzugt 1 bis 3 Aminosäuren oder dergleichen entfernt worden sind.
  • Gleichermaßen ist bei dem vorstehend in (e) genannten Protein die „Nucleotidsequenz ... mit einem oder mehreren darin entfernten, substituierten oder hinzugefügten Nucleotiden“ nicht speziell eingeschränkt, solange das codierte Protein die gewünschte Aktivität besitzt, und kann, z. B., eine Nucleotidsequenz sein, aus der 1 oder mehr, oder genauer gesagt 1 bis 9, oder vorzugsweise 1 bis 5, oder stärker bevorzugt 1 bis 3 Nucleotide oder dergleichen entfernt worden sind.
  • In dem vorstehend in (c) genannten Protein ist die „Aminosäuresequenz, die mindestens 90% Sequenzidentität mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1 aufweist“ nicht speziell eingeschränkt, solange das Protein die gewünschte Aktivität besitzt, und kann, z. B. eine Aminosäuresequenz sei, die mindestens 92%, oder vorzugsweise mindestens 95%, oder stärker bevorzugt mindestens 98%, oder noch stärker bevorzugt mindestens 99% Sequenzidentität aufweist.
  • Gleichermaßen ist bei dem vorstehend in (f) genannten Protein die „Nucleotidsequenz, die mindestens 90% Sequenzidentität zu der Nucleotidsequenz mit der SEQ ID NO: 2 aufweist“ nicht speziell eingeschränkt, solange das codierte Protein die gewünschte Aktivität besitzt, und kann, z. B., eine Nucleotidsequenz sein, die mindestens 92%, oder vorzugsweise mindestens 95%, oder stärker bevorzugt mindestens 98%, oder noch stärker bevorzugt mindestens 99% Sequenzidentität aufweist.
  • Ein Protein gemäß den vorstehenden Punkten (a) bis (f) kann auch einen N-terminal und / oder C-terminal hinzugefügten Teil aufweisen, der eine nicht- funktionelle Aminosäuresequenz umfasst, wie, z. B., einen Linker zusammen mit einem funktionellen Peptid oder Tag, wie, z. B.: ein SEC- oder TAT-Signalpeptid zum extrazellulären Transport des Enzyms der vorliegenden Ausführungsform, oder für den Transport zum Periplasma; einen Histidin-Tag zur effizienten Reinigung; ein Affinitäts-Tag, wie, z. B., einen Strep-Tag, ein TARGET-Tag oder FLAG-Tag; ein Maltosebindungsprotein-Tag, einen Thioredoxin-Protein-Tag oder einen Glutathion-S-Transferase-Tag zum Vermeiden der Aggregation des exprimierten Proteins; ein TEE-Tag zur Erhöhung der exprimierten Menge des Proteins; oder einen GFP-Tag oder dergleichen als einen Marker. Diese Aminosäuresequenzen können seriell hinzugefügt werden, oder dadurch hinzugefügt werden, dass mehrere Aminosäuresequenzen, die von Proteasen erkannt werden, zwischen den jeweiligen Aminosäuresequenzen angeordnet werden, oder dergleichen. Zum Zweck der Maximierung der Funktion des Enzyms der vorliegenden Ausführungsform oder dergleichen können diese Aminosäuresequenzen (Tags zum Beispiel) vollständig oder zum Teil deletiert sein. In einer Ausführungsform werden die Proteine gemäß den vorstehenden Punkten (a) bis (f) erhalten, indem die Aminosäuresequenzen der zuvor genannten Signalpeptide und dergleichen zu der Aminosäuresequenz mit der SEQ ID NO: 9 hinzugefügt werden, oder eine Aminosäuresequenz wird erhalten, indem eine oder mehrere Aminosäuren in der Aminosäuresequenz mit der SEQ ID NO: 9 deletiert, substituiert, oder hinzugefügt werden.
  • Beispiele für bevorzugte Signalpeptide in der vorliegenden Ausführungsform umfassen OmpT und PelB und dergleichen, die E. coli TAT- und SEC- Signalpeptide, die in J. Biol. Chem. 2007, Bd. 282, S. 8309-8316 und Recent Patents on Biotechnology 2010, Bd. 4, S. 23-29 beschrieben sind, und die Sequenz der Aminosäuren an den Positionen 1 bis 25 in SEQ ID NO: 1.
  • In der vorliegenden Ausführungsform werden die Proteine gemäß den vorstehenden Punkten (a) bis (f) manchmal als „Lyso- PAF- PLDs“ bezeichnet. Ein „Lyso- PAF- PLD“ kann zum Beispiel gemäß den Verfahren, die in Patentdokument 5 beschrieben sind, hergestellt werden, und insbesondere kann es, wie beispielsweise in den nachfolgenden Referenzbeispielen 1 bis 3 gezeigt, durch ein Verfahren hergestellt werden, das einen Schritt des Kultivierens von einem Mikroorganismus, der ein Gen enthält, das für die Aminosäuresequenz mit der SEQ ID NO: 1 oder 9 codiert, oder ein Gen, das die Nucleotidsequenz mit der SEQ ID NO: 2 aufweist, oder von einem Transformanten, der mit einem dieses Gen enthaltenden rekombinanten Vektor transformiert ist, in einem Medium; einen Schritt zur Herstellung und Anreicherung der Lyso- PAF- PLD in der Kultur; und einen Schritt des Gewinnens der Lyso- PAF- PLD aus der Kultur beinhaltet. Der Lyso- PAF- PLD kann so wie er ist in einer Mischung mit den Ausgangsstoffen und anderen Produkten und dergleichen verwendet werden, aber für einige Zwecke und Anwendungen ist es wünschenswert, alle Verunreinigungen wirksam zu entfernen, und normalerweise kann der Lyso- PAF- PLD bis zu einer Reinheit von mindestens 50%, oder mindestens 70%, oder mindestens 95% gereinigt werden. Ein Lyso- PAF- PLD mit geringer Reinheit kann aus wirtschaftlichen Gründen verwendet werden, während ein hochreiner Lyso- PAF- PLD verwendet werden kann, um die Spezifität zu erhöhen. Die Proteine gemäß den vorstehenden Punkten (b), (c), (e) und (f) sind mutierte Formen der Lyso- PAF- PLD, und können auch durch Verfahren erhalten werden, die Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind, zum Beispiel, indem unter Verwendung eines Lyso- PAF- PLD- Plasmids als Template eine Inverse PCR gemäß der Gebrauchsanweisung des im Handel erhältlichen KOD-Plus-Mutagenese-Kits (Code-Nr. SMK-101) durchgeführt wird.
  • Die Menge an Lyso- PAF- PLD, die in der vorliegenden Ausführungsform verwendet wird, ist nicht speziell eingeschränkt, solange die Aktivität der Lp-PLA2 gemessen werden kann, aber zum Zweck einer stabilen Messung beträgt sie vorzugsweise mindestens 0,1 mg / ml, während unter dem Gesichtspunkt der Wirtschaftlichkeit ein Bereich von 0,01 mg/ml bis 1,5 mg/ml bevorzugt ist, und unter diesen beiden Gesichtspunkten normalerweise ein Bereich von 0,1 mg/ml bis 1,5 mg/ml bevorzugt ist.
  • In der vorliegenden Ausführungsform bedeutet „PLD- Aktivität“ eine Phospholipase D-artige Aktivität, wie, z. B., die Enzymaktivität zum Hydrolysieren der Bindung zwischen dem Cholinteil und der Phosphorsäureeinheit eines PAF oder beispielsweise eines Lyso-PAF. Wenn die Substrate beispielsweise PAFs sind, bedeutet PLD- Aktivität die Enzymaktivität zum Katalysieren der folgenden Reaktion, um dadurch die PAFs zu hydrolysieren und PAF- Decholinate und Cholin zu erzeugen.
    Figure DE112017003142T5_0015
  • Gleichermaßen bedeutet PLD- Aktivität die Enzymaktivität zum Hydrolysieren der Lyso- PAFs, um dadurch Lyso- PAF- Decholinate und Cholin zu erzeugen, wenn das Substrat Lyso-PAFs sind.
  • In der vorliegenden Ausführungsform sind „Lyso- PAF- Decholinate“ Phosphorsäurederivate, die durch das Hydrolysieren der Bindungen zwischen den Cholinteilen und den Phosphorsäureeinheiten der Lyso- PAFs hergestellt werden. Ein Beispiel ist eine Verbindung, die durch die folgende Allgemeine Formel III dargestellt ist:
    Figure DE112017003142T5_0016
    (wobei R1 wie in der Allgemeinen Formel I definiert ist).
  • Lyso- PAF- Decholinate beinhalten jene, die in der Kettenform, die durch die nachstehende Allgemeine Formel IV dargestellt ist, vorliegen:
    Figure DE112017003142T5_0017
    Figure DE112017003142T5_0018
    (wobei R1 wie in der Allgemeinen Formel I definiert ist).
  • Das Enzym, das in dem Schritt (B) verwendet wird, ist ein Protein, das eine PLD-Aktivität für Lyso- PAF aufweist, aber keine PLD- Aktivität für PAF. Diese Spezifität bedeutet, dass in der Probe nur Lyso- PAFs, die aus PAFs durch die Aktivität der Lp-PLA2 in Schritt (A) erzeugt wurden, in dem Schritt (B) hydrolysiert werden. Um zu bestätigen, ob das Enzym PLD-Aktivität für PAF aufweist oder nicht, und ob es PLD-Aktivität für Lyso- PAF aufweist oder nicht, kann das Enzym mit PAF oder Lyso- PAF zur Reaktion gebracht werden, und das Vorhandensein oder die Abwesenheit eines Reaktionsprodukts (vorzugsweise Cholin), erzeugt durch die PLD-Aktivität, kann wie in Beispiel 1 beschrieben verifiziert werden. Wenn beispielsweise gesagt wird, dass ein Enzym „keine PLD- Aktivität für PAF“ aufweist, bedeutet dies, dass die Enzymaktivität mindestens 95% des PAF, oder vorzugsweise mindestens 98% des PAF, oder stärker bevorzugt mindestens 99% des PAF unzersetzt übrig lässt, wenn der PAF und das Enzym unter den Bedingungen, die im nachfolgenden Beispiel 1 beschrieben sind, zur Reaktion gebracht werden.
  • Das Verhältnis zwischen der Probe und den Reagenzien (S / R- Verhältnis) kann in den Schritten (A) und (B) jedes sein, das die Messung der Aktivität der Lp- PLA2-Aktivität ermöglicht, aber unter dem Gesichtspunkt des Vermeidens der Wirkungen von koexistierenden Substanzen, die aus der Probe herrühren, ist der Bereich vorzugsweise 1 : 40 bis 1 : 200, während unter dem Gesichtspunkt des Messens mit hoher Empfindlichkeit der Bereich vorzugsweise 1 : 5 bis 1 : 20 ist. Aus diesen beiden Blickwinkeln ist das S / R- Verhältnis in einer Ausführungsform vorzugsweise in dem Bereich von 1 : 30 bis 1 : 100. Wenn, zum Beispiel, 5 µl Probe, 150 µl des ersten Reagens und 100 µl des zweiten Reagens verwendet werden, bedeutet dies, dass das S / R- Verhältnis 1 : 50 beträgt.
  • In einer Ausführung der vorliegenden Ausführungsform ist die in dem Schritt (C) beschriebene „quantitative Änderung, die dem in Schritt (B) erhaltenen Hydrolysat zuordenbar ist“, nicht speziell eingeschränkt, solange es eine Änderung ist, die als ein Indikator zur Messung der Aktivität der Lp- PLA2 in einer Probe verwendet werden kann. Beispiele beinhalten eine Änderung bei der Menge an Cholin und eine Änderung bei der Menge an Lyso- PAF- Decholinaten, und die Menge an Cholin ist zur einfacheren Messbarkeit bevorzugt.
  • In einer Ausführung der vorliegenden Ausführungsform beinhaltet der Schritt (C) ferner den folgenden Schritt (C-1):
    • (C-1) das Umsetzen von Cholin mit einer Cholinoxidase zur Erzeugung von Wasserstoffperoxid.
    Wie in den folgenden Beispielen gezeigt, wird der Schritt (C-1) durchgeführt, indem das Cholin, das aus einem Lyso- PAF durch Einwirkung von Lyso-PAF-PLD erzeugt wurde, mit einem Reagens, das eine Cholinoxidase enthält, in Kontakt gebracht wird.
  • In einer Ausführung der vorliegenden Ausführungsform beinhaltet der Schritt (C) auch den folgenden Schritt (C-2):
    • (C-2) das Messen der Menge an Wasserstoffperoxid, die in Schritt (C-1) erzeugt wurde, mit Hilfe eines kolorimetrischen Verfahrens unter Verwendung eines chromogenen Reagens.
  • Wie in den folgenden Beispielen gezeigt, wird der Schritt (C-2) zum Beispiel durchgeführt, indem die Absorption gemessen wird, nachdem das in Schritt (C-1) erzeugte Wasserstoffperoxid mit einer Peroxidase und einem chromogenen Reagens zur Reaktion gebracht wurde.
  • Die Menge an Wasserstoffperoxid, die in Schritt (C-1) der vorliegenden Ausführungsform erzeugt wurde, kann zum Beispiel gemessen werden, indem eine Peroxidase oder dergleichen verwendet wird, um einen Farbstoff oder dergleichen herzustellen, und dann die resultierende Farbe mit Hilfe einer kolorimetrischen Analyse gemessen wird, ohne Einschränkung, und jedes bekannte Messverfahren kann verwendet werden. Das oben erwähnte Wasserstoffperoxid kann, zum Beispiel, mit Hilfe von Lumineszenz, Fluoreszenz oder dergleichen, oder mit Hilfe von elektrochemischen Mitteln gemessen werden.
  • Wenn eine Änderung der Cholinmenge als die quantitative Änderung gemessen wird, die dem in Schritt (B) erhaltenen Hydrolysat zuordenbar ist, kann das Cholin beispielsweise direkt durch ein Verfahren unter Verwendung von HPLC gemessen werden, oder durch ein Verfahren unter Verwendung von LC / MS oder dergleichen.
  • Die in der vorliegenden Ausführungsform verwendete Cholinoxidase ist nicht speziell eingeschränkt, solange sie wirksam auf das in der Probe und im Reaktionssystem enthaltene Cholin so einwirken kann, um das Cholin zu oxidieren, aber ein als EC 1.1.3.17 klassifiziertes Enzym ist bevorzugt. Beispiele beinhalten Cholinoxidase (COD) aus Arthrobacter globiformis (Asahi Kasei Pharma Corporation, Produkt-Nr. T-05) (Ikuta, S., Matsuura, K., Imamura, S., Misaki, H. und Horiuchi, Y. (1977)), J. Biochem. 82, 157 - 163)) oder Rekombinanten derselben, und Cholinoxidase, hergestellt von Toyobo Co., Ltd. (Produktbezeichnung: CHO - 301).
  • Das chromogene Reagens, das bei der Messung der Menge an Wasserstoffperoxid verwendet wird, kann ein Trinder- Reagens sein, welches in Gegenwart einer Peroxidase mittels oxidativer Kondensation zwischen einem Chromogen, wie, z. B., Phenol, und einem Kuppler, wie, z. B., 4-AA oder 3-Methyl- 2-benzothiazolinonhydrazon (MBTH) einen Farbstoff erzeugt, oder ein Reagens vom Typ Leuko, das oxidiert wird und direkt in der Gegenwart einer Peroxidase oder dergleichen eine Färbung entwickelt. Ein Phenolderivat, ein Anilinderivat, ein Toluidinderivat oder dergleichen kann als Chromogen für das Trinder-Reagens verwendet werden, und spezifische Beispiele beinhalten Chromogene, die in der 30. Auflage des Gesamtkatalogs von Dojindo Laboratories beschrieben sind, wie, z. B., N-Ethyl-N- (2-Hydroxy- 3-sulfopropyl)- 3-methylanilin, Natriumsalz, Dihydrat (TOOS); N,N-Bis (4-sulfopropyl)- 3-methylanilin, Dinatriumsalz (TODB); und N-Ethyl- N-(2-Hydroxy- 3-sulfopropyl)- 3,5-dimethoxyanilin Natriumsalz (DAOS) (alle hergestellt von Dojindo Laboratories). Spezifische Beispiele für Leuko- Reagenzien beinhalten N-(Carboxymethylaminocarbonyl)- 4,4-bis(dimethylamino) biphenylamin (DA64) und 10-(Carboxymethylaminocarbonyl)- 3,7-bis(dimethylamino) phenothiazin (DA67) (beide hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) und dergleichen. In einer Ausführungsform wird aus Gründen der Messempfindlichkeit vorzugsweise TOOS oder TODB für das Trinder-Reagens verwendet.
  • Die Menge an Wasserstoffperoxid kann durch bekannte Verfahren unter Verwendung einer Verbindung, wie, z. B. Homovanillinsäure oder 4-Hydroxyphenylessigsäure, die bei einer Oxidation Fluoreszenz emittiert, gemessen werden, wenn die Messung mit Hilfe von Fluoreszenzverfahren durchgeführt wird, oder einem Katalysator, wie, z. B., Luminol, Lucigenin oder Isoluminol, wenn die Messung mit Hilfe von Chemilumineszenzverfahren durchgeführt.
  • Wenn eine Elektrode verwendet wird, um die Menge an Wasserstoffperoxid zu messen, ist die Elektrode nicht speziell eingeschränkt, solange sie aus einem Material besteht, das in der Lage ist, Elektronen auf und von Wasserstoffperoxid zu übertragen, wie, z. B., Platin, Gold, Silber oder ein Kohlenstoffmaterial, wie, z. B. Glaskohlenstoff, oder dergleichen. Ein bekanntes Verfahren, wie, z. B., Amperometrie, Potentiometrie, Coulometrie oder dergleichen, kann als Elektrodenmessverfahren verwendet werden. Es kann auch ein Elektronenträger in die Reaktion zwischen der Oxidase oder dem Substrat und der Elektrode eingefügt werden, und der Oxidations- / Reduktionsstrom oder die elektrische Größe desselben kann gemessen werden. Als Elektronenträger kann jede Substanz verwendet werden, die Elektronentransferfähigkeit aufweist, und Beispiele beinhalten Ferrocenderivate, Chinonderivate und dergleichen. Es kann auch ein Elektronenträger zwischen der Elektrode und dem durch die Oxidase- Reaktion erzeugten Wasserstoffperoxid eingefügt werden, und Änderungen in dem resultierenden Oxidations- / Reduktionsstrom, der elektrischen Größe oder des Potentials können gemessen werden.
  • In der vorliegenden Ausführungsform kann die „Messung der Aktivität der Lp- PLA2“ beispielsweise durch das Messen der Menge an Cholin erreicht werden, ohne Einschränkung, und ferner kann die Aktivität der Lp- PLA2 durch die Analyse der Lyso- PAF-Decholinate gemessen werden. Ein vorhandenes Testverfahren kann als Verfahren zum Analysieren der Lyso- PAF- Decholinate verwendet werden, und Beispiele beinhalten HPLC-Verfahren, Verfahren unter Verwendung chromogener Reagenzien und Verfahren unter Verwendung von LC / MS oder LC-MS / MS und dergleichen.
  • In einer Ausführung der vorliegenden Ausführungsform umfasst das Verfahren zum Messen der Aktivität der Lp- PLA2 den folgenden Schritt (D) vor dem Schritt (A):
    • (D) das Entfernen von Cholin in der Probe.
  • Wie in den folgenden Beispielen gezeigt, wird der Schritt (D) durchgeführt, indem eine Probe, die Cholin enthält, und ein Reagens, das Cholinoxidase enthält, zusammengebracht werden.
  • In der vorliegenden Ausführungsform kann der Schritt des „Entfernens von Cholin“ beispielsweise ein Schritt sein, bei dem eine Cholinoxidase verwendet wird, um das Cholin in einer Probe zu oxidieren und zu entfernen, ohne Einschränkung, und das Cholin kann auf jede Weise, die das Messsystem nicht beeinflusst, aus dem Reaktionssystem entfernt werden, wie, z. B., durch Dialyse, Gelfiltration, Ultrafiltration oder dergleichen.
  • In der vorliegenden Ausführungsform beträgt die „Temperatur“ bei jedem Schritt des Verfahrens zum Messen der Aktivität der Lp-PLA2 beispielsweise 37 °C, ohne Einschränkung, und die Messung kann bei jeder beliebigen Temperatur in einem Temperaturbereich durchgeführt werden, bei dem das Enzym normal arbeiten kann, und die Temperatur muss nicht bei jedem Schritt gleich sein. Beispielsweise kann Schritt (B) bei jeder Temperatur durchgeführt werden, bei der Lyso- PAF- PLD aktiv ist. Wie in dem nachstehenden Referenzbeispiel 10 gezeigt, wird die Lp-PLA2-Aktivität vorzugsweise in einem Temperaturbereich von 20 °C bis 60 °C gemessen, da Lyso- PAF- PLD durch eine Lagerung bei 20 bis 60 °C nicht inaktiviert wird.
  • Auch Cholinoxidase ist bei 20 °C bis 60 °C nicht vollständig inaktiviert, und daher kann der Schritt, bei dem Cholinoxidase eingesetzt wird, auch innerhalb dieses Temperaturbereichs durchgeführt werden. Da Cholinoxidase insbesondere bei 40 °C oder weniger sehr stabil ist, ist eine Messung bei 40 °C oder weniger besonders wünschenswert.
  • In der vorliegenden Ausführungsform wird die „Messzeit“ zum Messen der Aktivität der Lp- PLA2 beispielsweise mit 10 Minuten angegeben, ohne Einschränkung. Eine Vorinkubationszeit während der die PAFs und Lyso- PAF- PLD gemischt und vorinkubiert werden, kann vor der Messung ebenfalls bereitgestellt werden. Die Vorinkubationszeit kann ausgelassen werden, bietet vorzugsweise aber ausreichend Zeit für die Bestandteile der Probe, um ausreichend mit dem ersten Reagens reagieren zu können. Die Vorinkubation ist ein Vorheizschritt, der entweder mit dem Reagens allein oder nach dem Vormischen der Probe mit einem Reagens durchgeführt wird, um die Messgenauigkeit und die Reaktivität zu verbessern. Die Zeit und die Temperatur können entsprechend dem Zweck der Vorinkubation in geeigneter Weise variiert werden, und die Temperatur kann, zum Beispiel, eine sein, bei der das Enzym gut arbeitet (wie, z.B., etwa 37 °C), wenn bezweckt ist, ein Enzym zu verwenden, um unerwünschte Substanzen in der Probe und den Reagensmaterialien zu eliminieren.
  • Wie in dem nachstehenden Beispiel 18 gezeigt, können die Schritte (A) bis (C) darüber hinaus auch gleichzeitig gestartet werden, da die Reaktion sofort startet, sobald das zweite Reagens, das PAF enthält, zugegeben wird, nachdem die Probe mit dem ersten Reagens, das Lyso- PAF- PLD enthält, gemischt und vorinkubiert worden ist.
  • Das Probenvolumen kann in der vorliegenden Ausführungsform in geeigneter Weise erhöht oder verringert werden. Das Probenvolumen kann für die Zwecke einer hochempfindlichen Messung erhöht werden, oder verringert werden, um die Auswirkungen von Interferenzen, wie, z. B., Hämoglobin und Bilirubin, zu reduzieren, und vorzugsweise werden in einer Ausführungsform 3 µl oder mehr verwendet.
  • In einer Ausführung der vorliegenden Ausführungsform wird vorzugsweise ein „Puffer (auch als Puffermittel bezeichnet)“, beschrieben in Theorie und Praxis von Enzymen und anderen Proteinen [Tanpakushitsu / Kouso no kiso jikkenhou] (überarbeitete zweite Ausgabe, Takeichi Horio, 1994), Nankodo) und der 30. Ausgabe des Gesamtkatalogs von Dojindo Laboratories, verwendet, um die Reaktivität und / oder die Stabilität des verwendeten Enzyms aufrechtzuerhalten und / oder zu erhöhen. Der „Puffer“ ist nicht eingeschränkt solange er den angestrebten pH (Ziel-pH) aufrechterhalten kann, und es kann beispielsweise ein Good pH-Puffer (MES, Bis-Tris, ADA, PIPES, ACES, BES, MOPS, TES, HEPES, DIPSO, TAPSO, POPSO, HEPPSO, EPPS, Tricin, Bicin, TAPS, CHES, CAPS oder dergleichen), Tris-Puffer, Diethanolaminpuffer, Carbonatpuffer, Glycinpuffer, Borsäurepuffer, Phosphatpuffer, Glycylglycinpuffer, Acetatpuffer, Citratpuffer, Succinatpuffer, Maleatpuffer, Tris-Ethanolaminpuffer, Imidazolpuffer oder dergleichen verwendet werden. Diese Puffer können mit einer starken Säure, wie, z. B., Salzsäure, oder einer starken Lauge, wie, z. B., NaOH, auf einen für einen Puffer geeigneten pH-Bereich eingestellt werden. HEPES, MOPS, TES, PIPES, Pi-K (Kaliumphosphat) oder Tris sind bevorzugt, und Tris ist stärker bevorzugt.
  • Die Konzentration des „Puffers“ ist nicht speziell eingeschränkt, solange er den Ziel-pH aufrechterhalten kann, und die Untergrenze kann mindestens 3 mM, oder vorzugsweise mindestens 5 mM, oder stärker bevorzugt mindestens 10 mM betragen, während die Obergrenze nicht mehr als 500 mM, oder vorzugsweise nicht mehr als 200 mM, oder stärker bevorzugt nicht mehr als 100 mM betragen soll. Eine Konzentration von mindestens 25 mM und nicht mehr als 100 mM ist, zum Beispiel, stärker bevorzugt, und 50 mM ist besonders bevorzugt.
  • In einer Ausführung der vorliegenden Ausführungsform ist der „pH“ bei jedem Schritt nicht eingeschränkt, solange das Enzym dadurch nicht inaktiviert wird, und die Untergrenze kann mindestens pH 5,0, oder vorzugsweise mindestens pH 6,0, oder noch stärker bevorzugt mindestens pH 7,0 sein, während die Obergrenze nicht mehr als pH 9,0, oder vorzugsweise nicht mehr als pH 8,5, oder noch stärker bevorzugt nicht mehr als pH 8,0 sein kann. In einer Ausführungsform werden alle Schritte bei pH 7,5 durchgeführt. Nach Abstimmung der optimalen pH-Werte für jedes verwendete Enzym, und unter Berücksichtigung des optimalen pH-Werts für die Lp-PLA2-Aktivität, kann der PH, zum Beispiel, in geeigneter Weise eingestellt werden, und beispielsweise kann die Untergrenze mindestens pH 6,0 und die Obergrenze nicht mehr als pH 9,0 sein, oder vorzugsweise ist der pH mindestens pH 7,5 und nicht mehr als pH 8,0, oder noch stärker bevorzugt ist der pH mindestens pH 7,5 und nicht mehr als pH 7,75. Dies bedeutet, dass die Messungen nicht leicht durch Kohlendioxid aus der Luft beeinflusst werden, da sie bei einem pH nahe dem neutralen pH-Wert durchgeführt werden können.
  • In einer Ausführung der Erfindung kann das Verfahren zur Messung der Aktivität der Lp- PLA2 unter Verwendung einer Zusammensetzung (Reagens), enthaltend das Enzym, Puffer und dergleichen, vorstehend beschrieben, implementiert werden. Wie nachstehend beschrieben, können auch andere Komponenten, die üblicherweise zur Verbesserung der Stabilität, der Genauigkeit und / oder der Spezifität in enzymatischen Zusammensetzungen zur Messung der Aktivität verwendet werden, wie, z. B., Enzyme, Aktivatoren, Salze, Tenside, Stabilisatoren, Chelatbildner, Zucker oder Konservierungsmittel, hinzugefügt und verwendet werden in einer derartigen Zusammensetzung.
  • In der vorliegenden Ausführungsform kann eine Ascorbatoxidase verwendet werden, um in einer Probe enthaltene Ascorbinsäure zu eliminieren. Die Ascorbatoxidase ist vorzugsweise eine, die so wirkt, dass sie Ascorbinsäure effektiv eliminiert, und ein als EC 1.10.3.3 klassifiziertes Enzym ist stärker bevorzugt. Beispielsweise kann eine Ascorbatoxidase aus einer Kürbispflanze verwendet werden. Bevorzugte Beispiele beinhalten eine Ascorbatoxidase aus der Gattung Acremonium (Asahi Kasei Pharma Corporation (T-53)), weil sie eine hohe Enzymstabilität aufweist, und eine Ascorbatoxidase, die von Amano Enzyme Inc. (Handelsname ASO-3) hergestellt wird, weil sie durch Natriumazid nicht inhibiert wird. Ascorbinsäure kann unter Verwendung von AAQ (Ascorbinsäure-Quencher, Dojindo Laboratories) oder dergleichen auch chemisch entfernt werden.
  • In der vorliegenden Ausführungsform wird in einigen Fällen eine Katalase verwendet, um Wasserstoffperoxid zu entfernen. Die Katalase ist, ohne Einschränkung, vorzugsweise eine, deren Aktivität durch Natriumazid inhibiert wird, und die im Wesentlichen so wirkt, dass sie Wasserstoffperoxid eliminiert, und ein als EC 1.11.1.6 klassifiziertes Enzym ist stärker bevorzugt. Die Menge an Katalase, die eingesetzt wird, ist nicht eingeschränkt, liegt jedoch normalerweise in dem Bereich von 10 bis 5000 U/ml. Bevorzugte Beispiele für Katalasen beinhalten Arthrobacter Katalase (Asahi Kasei Pharma Corporation), wegen ihrer hohen Reinheit, und Tier-Katalasen (Sigma, C1345 und dergleichen), da sie kostengünstig und leicht erhältlich sind.
  • In der vorliegenden Ausführungsform wird in einigen Fällen Kaliumferrocyanid (K4[Fe(CN)6], jedes Gegenion ist optional) verwendet, um das in der Probe enthaltene Bilirubin zu eliminieren. Die Menge an Kaliumferrocyanid, die eingesetzt wird, ist nicht eingeschränkt, liegt jedoch normalerweise in dem Bereich von 1 bis 500 µM. In Fällen, in denen Kaliumferrocyanid die Ausführungsform negativ beeinträchtigt, indem es eine unspezifische Färbung oder dergleichen verursacht, kann die Konzentration verringert werden oder es kann der unten beschriebene Chelatbildner zugegeben werden. Es ist bekannt, dass Kaliumferrocyanid in einer wässrigen Lösung unter dem Einfluss von gelöstem Sauerstoff in einem Gleichgewicht mit Kaliumferricyanid vorliegt.
  • Wenn Glycerophosphocholin (nachstehend GPC) in der vorliegenden Ausführungsform der Probe und / oder den Ausgangsmaterialien des Reagens untergemischt ist, kann ein Enzym verwendet werden, das Glycerophosphorylcholin-Phosphodiesterase (GPCP)- Aktivität besitzt, um das GPC zu eliminieren. Die GPCP ist vorzugsweise eine, die im Wesentlichen so wirkt, dass sie GPC eliminiert, und stärker bevorzugt eine, die als EC 3.1.4.2 klassifiziert ist. Ein im Handel erhältliches Beispiel für eine GPCP ist GPCP aus Gliocladium roseum (Asahi Kasei Pharma Corporation (T-33)). Glycerophosphodiester- Phosphodiesterase, klassifiziert als EC 3.1.4.46, kann ebenfalls verwendet werden, da es die Wirkung besitzt, GPC zu eliminieren. Rekombinante Formen von Enzymen mit bekannten Sequenzen, die GPCP- Aktivität aufweisen, können auch auf der Grundlage von gentechnologischen Verfahren (Takaaki Tamura (2012), Grundlagen der Gentechnologie [Kiso kara manabu idenshi kougaku], usw.) hergestellt und verwendet werden.
  • Wenn in der vorliegenden Ausführungsform Substanzen in der Probe wie oben beschrieben eliminiert werden, kann die Probe erforderlichenfalls auch mit Reagenzien vorinkubiert werden, die eines oder mehrerer der oben beschriebenen Enzyme beinhalten. Wenn das Ziel darin besteht, Substanzen, die in den Ausgangsmaterialien des Reagens enthalten sind, im Vorfeld zu eliminieren, kann eine Vorinkubation erforderlichenfalls auch nach der Herstellung der Reagenzien durchgeführt werden.
  • In einigen Fällen kann in der vorliegenden Ausführungsform auch ein „Salz“ als ein Enzymaktivator verwendet werden. Ein bevorzugtes Beispiel für ein „Salz“ ist CaCl2, und andere Beispiele beinhalten Salze, die Lyso- PAF- PLD und Cholinoxidase aktivieren, wie, z. B., wie MgCl2, NaCl, KCl, Ammoniumsulfat und NH3Cl. Es können auch mehrere Arten von Salzen gemischt werden und in beliebigen Verhältnissen verwendet werden. Das negative Ion, welches das Salz formt, ist nicht auf Cl- beschränkt, solange das Enzym wirkt.
  • In der vorliegenden Ausführungsform kann die Konzentration, in der das „Salz“ eingesetzt wird, jede beliebige Menge sein, die Lyso- PAF- PLD und Cholinoxidase aktiviert, und die Untergrenze kann 0 mM oder mehr sein, während die Obergrenze nicht speziell eingeschränkt ist, vorzugsweise jedoch nicht mehr als 200 mM, oder stärker bevorzugt nicht mehr als 100 mM, oder insbesondere nicht mehr als 10 mM beträgt. In Fällen, in denen bereits ausreichend Metallionen zur Aktivierung des Enzyms in der Probe und im Reaktionssystem enthalten sind, muss kein Salz zugegeben werden.
  • In der vorliegenden Ausführungsform wird für die Stabilität, die Genauigkeit und die Spezifität der Messung manchmal ein „Tensid“ verwendet. Ein Beispiel für ein „Tensid“, ohne Einschränkung, ist Triton X-100 (im Folgenden als Tx-100 bezeichnet), und das Tensid kann jedes sein, das die Messung von Lp-PLA2 ermöglicht. Beispiele beinhalten Polyoxyethylenalkylether, sekundäre Polyoxyethylenalkylether, Polyoxyalkylenalkylether, Polyoxyethylensorbitan- Fettsäureester, Polyoxyethylenglycerin- Fettsäureester, Polyoxyethylensorbit- Fettsäureester, Polyoxyethylenalkylphenylformaldehydkondensat, Polyoxyethylen- Rizinusöl, Polyoxyethylensterole, Polyoxyethylen- polyoxypropylenalkylether, Polyoxyethylenlanoline, Polyoxyethylenalkylamine / Fettsäureamide, Polyoxyethylenalkyletherphosphate / Phosphatsalze, Polyoxyethylenalkylethersulfatsalze, Polyglycerinfettsäureester, Glycerinfettsäureester, Propylenglycolfettsäureester, Sorbitanfettsäureester, N-Acylaminosäuresalze Alkylethercarboxylatsalze, Alkylphosphatsalze, N-Acyltauratsalze, Sulfonatsalze, Alkylsulfate, amphoterische Betainacetat- Tenside, amphoterische Imidazolin- Tenside, Lecithinderivate, Polyethylenglykole, Polyethylenglycol- Laurylether, Polyethylenglycol- Isooctylphenylether, Polypropylenglycol, Polyvinylalkohol und dergleichen, und jedes dem Fachmann auf dem Gebiet bekannte Tensid kann verwendet werden. Bevorzugte Beispiele beinhalten Ether- oder Esterformen von nicht- ionischen Tensiden, und stärker bevorzugte Beispiele beinhalten nicht- ionische Tenside, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus den Polyoxyethylenderivaten, den Polyoxyethylenalkylethern und Polyoxyethylenalkylamin mit HLB- Werten von 12 bis 19 besteht. Noch stärker bevorzugte Beispiele beinhalten sekundären Polyoxyethylen-alkyl(7-21) ether, Polyoxyethylenoctylphenylether, Polyoxyethylenalkylether, Polyoxyethylenlaurylether, Polyoxyalkylenalkylether und dergleichen. Beispiele für im Handel erhältliche Tenside beinhalten NIKKOL BT-7, NIKKOL BT-9, NIKKOL BT-12, NIKKOL BT-21 (Nikko Chemicals Co., Ltd.), Tx-100, EMULGEN 709, EMULGEN 108, EMULGEN 1108, EMULGEN 1118S-70, EMULGEN 1150S-60, LS-106, LS-110 (Kao Corporation) und dergleichen. Unter dem Gesichtspunkt der Löslichkeit des Tensids ist ein nicht- ionisches Tensid vom Polyoxyethylenalkylphenylether- Typ bevorzugt. Die Handelsnamen beinhalten Tx-100, EMULGEN 909, EMULGEN 910, EMULGEN 911 (Kao Corporation), NIKKOL OP-3, NIKKOL OP-10, NIKKOL OP-30 (Nikko Chemicals Co., Ltd.) und Nonion HS-208, HS-210, HS-208, HS-208.5, NS-210 (NOF Corporation) und dergleichen. Seit Ende der 1990er Jahre wurden NPE-Alternativen umfassend untersucht, um Belastungen für die Umwelt zu verringern und Gesundheitsschäden zu vermeiden (aktueller Stand und Zukunft des Risikomanagements für Nonylphenole und Nonylphenolethoxylate, Nationales Institut für Technologie und Bewertung (http://www.nite.go.jp/data/000010070.pdf)). Die in den folgenden Katalogen beschriebenen Tenside (Kao Surfactants, Kao Corporation, 2012/8; Allgemeiner Produktkatalog, Nikko Chemicals Co., Ltd., usw.), die in diesem Zusammenhang entwickelt wurden, können ausgewählt werden, und EMULGEN 1118S-70 und EMULGEN 1150S -60 sind bevorzugt. Es können auch mehrere Arten von Tensiden gemischt werden und verwendet werden.
  • In der vorliegenden Ausführungsform ist die Konzentration des Tensids, das eingesetzt wird, nicht speziell eingeschränkt, und kann entsprechend der Art des verwendeten Tensids geeignet eingestellt werden, sollte jedoch, zum Beispiel, nicht mehr als 0,2% betragen, oder vorzugsweise nicht mehr als 0,1%.
  • In einigen Fällen wird in der vorliegenden Ausführungsform wird ein „Chelatbildner“, beschrieben in Theorie und Praxis von Enzymen und anderen Proteinen [Tanpakushitsu / Kouso no kiso jikkenhou] (überarbeitete zweite Ausgabe, Takeichi Horio, 1994), Nankodo) und der 30. Ausgabe des Gesamtkatalogs von Dojindo Laboratories, verwendet, um die Messstabilität, die Genauigkeit und die Spezifität zu verbessern. Beispiele für solche „Chelatbildner“ beinhalten EDTA, EGTA, NAT, organische Säuren, wie, z. B., Zitronensäure und Bernsteinsäure und dergleichen, ohne Einschränkungen hinsichtlich des Typs oder der Konzentration. Wenn beispielsweise EDTA verwendet wird, beträgt dessen Konzentration normalerweise mindestens 0,05 mM und nicht mehr als 10 mM. Wenn eine Protease, die zur Ausübung ihrer Aktivität ein Metall benötigt, in der Zusammensetzung koexistiert, kann der Chelatbildner als Enzymstabilisator in der Zusammensetzung wirken, indem er die Aktivität der Protease hemmt.
  • In der vorliegenden Ausführungsform kann ein „Stabilisator“ verwendet werden, um die Stabilität der Zusammensetzung zu erhöhen, wenn die Messreagenzien in Form einer Zusammensetzung vorliegen. Ein Protein, wie, z. B., Rinderalbumin, Eialbumin, Humanalbumin oder Kristallin, das keine katalytische Wirkung hat, kann als ein solcher „Stabilisator“ verwendet werden, ohne Einschränkungen hinsichtlich des Typs oder der Konzentration. Wenn beispielsweise Rinderalbumin eingefügt wird, beträgt dessen Gehalt normalerweise mindestens 0,01% (Gew. / Vol.) und nicht mehr als 5% (Gew. / Vol.). Da diese Proteine Substrate für Proteasen sind, können sie auch als Enzymstabilisatoren dienen. Darüber hinaus können sie auch als Hilfsstoffe dienen, wenn die Zusammensetzung gefriergetrocknet wird.
  • Wenn in der vorliegenden Ausführungsform die Messreagenzien in Form einer Zusammensetzung vorliegen, kann ein „Zucker“ verwendet werden, um die Stabilität der Zusammensetzung zu erhöhen. Beispiele für diesen „Zucker“ beinhalten Mannitrol, Trehalose, Cyclodextrin und dergleichen, mit einer beliebigen Konzentration innerhalb des löslichen Bereichs. Wenn beispielsweise Sucrose eingefügt wird, beträgt deren Konzentration mindestens 0,05% (Gew. / Vol.), oder vorzugsweise mindestens 0,1% (Gew./Vol.), oder stärker bevorzugt mindestens 0,3% (Gew./Vol.), mit einer Obergrenze von nicht mehr als 30% (Gew. / Vol.), oder vorzugsweise nicht mehr als 10% (Gew./Vol.), oder noch stärker bevorzugt nicht mehr als 5% (Gew. / Vol.). Diese „Zucker“ können auch als Hilfsstoffe dienen, wenn die Zusammensetzung gefriergetrocknet wird.
  • Wenn in der vorliegenden Ausführungsform die Messreagenzien in Form einer Zusammensetzung vorliegen, kann ein „Konservierungsmittel“ verwendet werden, um eine Verschlechterung oder eine Denaturierung der Zusammensetzung zu verhindern, ohne Einschränkungen hinsichtlich des Typs oder der Konzentration. Wenn beispielsweise Natriumazid oder ProClin (Produkt Nr. 48911-U, Sigma-Aldrich) verwendet wird, kann die Konzentration mindestens 0,005% (Gew. / Vol.), oder vorzugsweise mindestens 0,01% (Gew. / Vol.), oder stärker bevorzugt mindestens 0,03% (Gew. / Vol.) betragen, und die Obergrenze soll nicht mehr als 1% (Gew. / Vol.), oder vorzugsweise nicht mehr als 0,5% (Gew. / Vol.), oder stärker bevorzugt nicht mehr als 0,1% (Gew. / Vol.) betragen. Wenn beispielsweise ein Antibiotikum verwendet wird, kann die Untergrenze mindestens 5 µg / ml, oder vorzugsweise mindestens 10 µg / ml, oder stärker bevorzugt mindestens 30 µg / ml betragen, und die Obergrenze soll nicht mehr als 100 µg / ml, oder vorzugsweise nicht mehr als 75 µg / ml, oder stärker bevorzugt nicht mehr als 60 µg / ml betragen.
  • In einer Ausführung der vorliegenden Ausführungsform kann die Zusammensetzung zum Messen der Aktivität der Lp- PLA2 in der Form eines Produkts einer Flüssigkeit, eines Produkts einer gefrorenen Flüssigkeit, eines Produkts einer gefriergetrockneten Flüssigkeit oder eines Produkts einer getrockneten Flüssigkeit (hitzegetrocknet und / oder Luft getrocknet und / oder vakuumgetrocknet, usw.)) bereit gestellt werden. Für die Kapillaranwendung in Vorrichtungen zur patientennahen Eigendiagnostik (point-of-care equipment) oder für die Verwendung als Enzymsensor sind die Konzentrationen jeder Komponente vorzugsweise höher als üblich, und, zum Beispiel, ist die Zusammensetzung in diesem Fall vorzugsweise immobilisiert, oder mit einem Papier oder einer Folie beschichtet, oder zu einem Gel-Sol-Testreagens- Kit verarbeitet.
  • In der Zusammensetzung in der vorliegenden Ausführungsform können alle Komponenten zu einer einzigen Zusammensetzung verarbeitet werden, oder sie können in zwei oder mehr Zusammensetzungen aufgetrennt werden. Diese zwei oder mehr Zusammensetzungen können zusammen als Kit bezeichnet werden.
  • Eine Ausführung der vorliegenden Ausführungsform stellt einen Kit zum Messen der Aktivität der Lp-PLA2 in einer Probe bereit, der Lyso- PAF- PLD und PAFs enthält.
  • Der Kit der vorliegenden Ausführungsform kann ferner in Kombination mit einem Kalibrierungsreagens, das mindestens eine bekannte Menge an Lp-PLA2 enthält, verwendet werden. Dieses Kalibrierungsreagens kann ein Reagens sein, das beispielsweise mindestens eine bekannte Menge an Lp-PLA2 enthält, und vorzugsweise zusätzlich ein oder mehrere der oben beschriebenen Aktivatoren, Salze, Tenside, Stabilisatoren, Chelatbildner, Zucker, Konservierungsmittel oder dergleichen enthält. Ein Beispiel für ein im Handel erhältliches Produkt ist TruCal Lipid (Diasys). Die Beschaffenheiten, wie, z. B., die Arten und Konzentrationen der Komponenten von diesem Reagens können von einem Fachmann auf dem Gebiet in geeigneter Weise bestimmt werden. Das Kalibrierungsverfahren unter Verwendung von diesem Reagens kann eine Einpunktkalibrierung oder eine Mehrpunktkalibrierung (Polygonzug oder Spline), oder eine lineare Regression der Mehrpunktkalibrierung sein.
  • Die bekannte Menge an Lp-PLA2 in dem Kalibrierungsreagens ist nicht speziell eingeschränkt und kann in geeigneter Weise ausgewählt werden, um eine genaue Messung der Lp-PLA2 in einer Probe zu ermöglichen. Wenn es sich bei der Probe um Serum oder Plasma von einem Subjekt handelt, kann die Untergrenze der bekannten Menge an Lp-PLA2 im Kalibrierungsreagens mindestens 5 U / L, oder vorzugsweise mindestens 10 U / L, oder stärker bevorzugt mindestens 15 U / L betragen, und die Obergrenze soll nicht mehr als 600 U / L, oder vorzugsweise nicht mehr als 300 U / L, oder stärker bevorzugt nicht mehr als 150 U / L betragen. Abhängig von der Zusammensetzung des Reagens, den Messbedingungen, wie, z. B., Temperatur, Messwellenlänge und Sub- Wellenlänge, und der Definition des Aktivitätswerts, können diese Werte unterschiedlich sein.
  • In einer Ausführungsform wird die bekannte Menge (bekannte Konzentration) der Lp-PLA2 in dem Kalibrierungsreagens vorzugsweise auf einen hohen Wert eingestellt, so dass mehr Probenmesswerte in den Bereich der Kalibrierungskurve fallen, und unter dem Gesichtspunkt der Erhöhung der Genauigkeit der Probenmesswerte, wird die Menge vorzugsweise so eingestellt, dass sie nah an der Konzentration der Lp-PLA2 in der Probe ist (wie, z. B., etwa 20 U / L, wenn die Probe humanes Serum oder Plasma ist).
  • Eine Möglichkeit dafür zu sorgen, dass die bekannte Menge an Lp-PLA2 in dem Kalibrierungsreagens eine hohe Konzentration ist, besteht darin, rekombinantes Lp-PLA2 ( WO 2015/048177 ) zuzugeben. Wenn kein rekombinantes Lp-PLA2 verwendet wird (z. B. bei Verwendung von einem natürlichen humanen Lp-PLA2), kann eine Probe (wie, z. B., ein aus dem Menschen stammendes Serum oder Plasma), von der angenommen wird, dass sie eine hohe Lp-PLA2- Konzentration aufweist, als solche verwendet werden, oder gepoolt werden, um ein Kalibrierungsreagens herzustellen. Eine Probe, von der angenommen wird, dass sie eine hohe Lp-PLA2-Konzentration aufweist, kann unter Bezugnahme auf Faktoren, wie, z. B. LDL-C (LDL- Cholesterin) und Körpergewicht, von denen berichtet wird, dass sie stark mit der Lp-PLA2-Konzentration korrelieren (Nicht-Patentdokument 1), ausgewählt werden. Für diese Verwendung kann humanes Lp-PLA2 auch gereinigt werden oder mit Hilfe von durch Gefriertrocknung konzentriert werden.
  • Es kann eine gewöhnliche Probe (wie, z. B., ein aus dem Menschen stammendes Serum oder Plasma) oder ein Pool von derartigen Proben verwendet werden, wenn ein Kalibrierungsreagens hergestellt wird, dessen Lp-PLA2-Konzentration nah an der Konzentration der Lp-PLA2 in der Probe ist. Ein Beispiel für ein derartiges Kalibrierungsreagens ist das gepoolte Serum J042-II, das in den folgenden Beispielen beschrieben ist. Manchmal wird ein Kalibrierungsreagens auch als Eichlösung bezeichnet. Darüber hinaus wird (U / L) manchmal als (nmol / min / ml) ausgedrückt.
  • Die Lp-PLA2, die in einem solchen Kalibrierungsreagens verwendet wird, ist vorzugsweise humane Lp-PLA2, aber tierische Lp-PLA2 oder dergleichen kann auch verwendet werden, solange die Reaktivität übereinstimmt.
  • Der Kit in der vorliegenden Ausführungsform kann ein System mit einem Reagens, oder ein System mit zwei oder mehr Reagenzien sein, und ein System mit zwei Reagenzien ist bevorzugt. Im Falle eines Systems mit zwei Reagenzien enthält eine Ausführung des Kits aus wirtschaftlichen Gründen und ferner zur Vereinfachung der Zusammensetzungen von jedem Reagens und der Einstellungen der Messbedingungen vorzugsweise Lyso- PAF- PLD in einem ersten Reagens und PAFs in einem zweiten Reagens. Ein Kit, der eine Cholinoxidase im ersten Reagens enthält, ist stärker bevorzugt.
  • In einer Ausführung der vorliegenden Ausführungsform kann die Lyso- PAF- PLD sowohl in dem ersten Reagens als auch in dem zweiten Reagens enthalten sein, wenn der Kit ein Systems mit zwei Reagenzien ist, aber vorzugsweise ist sie nur in dem ersten Reagens enthalten. Statt im ersten Reagens kann die Lyso- PAF- PLD jedoch auch im zweiten Reagenz enthalten sein. In diesem Fall können ferner GPCP und ein Enzym, das PLA1- Aktivität aufweist, zu dem ersten Reagens hinzugefügt werden. Das Enzym, das PLA1-Aktivität aufweist, kann jedes beliebige Enzym sein, das in einem Serum Lysophospholipide (Lysophosphatidylcholin, usw.) abbaut, ohne mit PAF zu reagieren. Beispiele beinhalten MGLP II und LYPL, und MGLP II ist bevorzugt.
  • Wie in den nachfolgenden Beispielen 22 und 23 gezeigt, kann in einer Ausführung der vorliegenden Ausführungsform die Aktivität der Lp-PLA2 leicht und mit hoher Empfindlichkeit gemessen werden, obwohl das erste Reagens und das zweite Reagens nach der Herstellung für einen langen Zeitraum (wie, z. B., für 18 Monate bei 4 °C; 2 Wochen bei 37 °C oder dergleichen) gelagert wurden.
  • Der Kit kann auch eine Cholinoxidase enthalten. In einer Ausführung der vorliegenden Ausführungsform kann die Cholinoxidase sowohl im ersten Reagens als auch im zweiten Reagens enthalten sein, aber unter dem Gesichtspunkt der Messempfindlichkeit ist sie bevorzugt nur im ersten Reagens enthalten. Es ist möglich, das endogene Cholin in der Probe zu eliminieren, indem eine Cholinoxidase in das erste Reagens aufgenommen wird. Die Messung kann jedoch auch durchgeführt werden, wenn sie statt dem ersten Reagens zu dem zweiten Reagens zugefügt wird.
  • Ferner können in dem Kit eine Peroxidase und ein chromogenes Reagens enthalten sein. In einer Ausführung der vorliegenden Ausführungsform kann die Peroxidase entweder in dem ersten Reagens oder in dem zweiten Reagens enthalten sein. In einer Ausführung der vorliegenden Ausführungsform kann sie entweder in dem ersten Reagens oder dem zweiten Reagens enthalten sein, wenn ein Leuko- Reagens als chromogenes Reagens verwendet wird. Wenn ein Kuppler und ein Trinder- Reagens als das chromogene Reagens verwendet werden, kann jedes von diesen beiden entweder in dem ersten Reagens oder dem zweiten Reagens enthalten sein, solange sie in getrennten Reagenzien enthalten sind.
  • Die zuvor genannten Puffer, Aktivatoren, Salze, Tenside, Stabilisatoren, Chelatbildner, Enzyme, Zucker oder Konservierungsmittel sowie die anderen Komponenten, die üblicherweise in Zusammensetzungen zur Messung der Enzymaktivität verwendet werden, können dem Kit ebenfalls hinzugefügt werden.
  • Durch die Ausnutzung der Substratspezifität von Lyso- PAF- PLD ist es möglich, mit dem Messverfahren, der Zusammensetzung und dem Kit der vorliegenden Ausführungsformen ein Messverfahren bereitzustellen, mit dem die Lp-PLA2- Aktivität unter Verwendung eines automatischen Allzweckanalysators gemessen werden kann. Dieses Messverfahren ist außerdem sehr vielseitig und einfach, da die Aktivität mit einem System mit zwei Reagenzien gemessen werden kann. Darüber hinaus kann ein sicheres Messverfahren bereitgestellt werden, da die Aktivität der Lp- PLA2 ohne Verwendung von irgendwelchen radioaktiven Isotopen oder dergleichen gemessen werden kann. Weiterhin kann ein Messverfahren bereitgestellt werden, das in der Lage ist, die in vivo Aktivität der Lp-PLA2 genau widerzuspiegeln, da bei diesem Verfahren ein PAF (ein endogenes Substrat der Lp- PLA2) verwendet wird, um die Aktivität der Lp-PLA2 und nicht deren physische Menge zu messen.
  • Die vorliegenden Ausführungsformen betreffen auch einen Diagnose- Kit, der die zuvor genannte Zusammensetzung oder den Kit enthält, zur Verwendung bei der Diagnose einer Krankheit und / oder eines Zustands, die / der mit Lp-PLA2 in Verbindung steht. Die vorliegenden Ausführungsformen betreffen auch die Diagnose und das Management von Krankheiten oder Zuständen, die mit Lp-PLA2 in Verbindung stehen, unter Verwendung dieses Kits. Es wird angenommen, dass Lp- PLA2 ein Faktor bei einer Vielzahl von Krankheiten und Entzündungen ist, wie verschiedenen Richtlinien aus den USA und Europa ((1) ACCF/AHA Guideline for Assessment of Cardiovascular Risk in Asymptomatic Adults [Richtlinie zur Beurteilung des kardiovaskulären Risikos bei asymptomatischen Erwachsenen] (2010), (2) AHA/ASA Guidelines for the Primary Prevention of Stroke [Richtlinien zur primären Prävention von Schlaganfällen] (2011), (3) AACE Guideline for Management of Dyslipidemia and Prevention of Atherosclerosis [Richtlinie zum Management von Dyslipidämie und zur Prävention von Atherosklerose] (2012), (4) European Guideline on cardiovascular disease prevention in clinical practice [Europäische Leitlinie zur Prävention von Herz- Kreislauf- Erkrankungen in der klinischen Praxis] (2012)) zu entnehmen ist. Beispiele für Krankheiten oder Zustände, die mit Lp-PLA2 in Verbindung stehen, und mit dem Kit von diesen Ausführungsformen diagnostiziert und / oder gemanagt werden können, beinhalten Herz- Kreislauf- Erkrankungen, entzündliche Erkrankungen, Nierenerkrankungen, Sepsis, Krebs und dergleichen. Beispiele für kardiovaskuläre (Herz- Kreislauf) Erkrankungen umfassen Atherosklerose und Schlaganfall, und in einer Ausführung ist eine kardiovaskuläre Erkrankung, die mit Atherosklerose in Beziehung steht, bevorzugt.
  • Beispiele
  • Die vorliegende Erfindung wird im Folgenden unter Bezugnahme auf Beispiele und Referenzbeispiele (nachstehend manchmal als „Beispiele und dergleichen“ bezeichnet) ausführlicher erklärt, aber der Schutzbereich der vorliegenden Erfindung ist nicht auf diese Beispiele und dergleichen beschränkt. In den Beispielen und dergleichen stellt ein „erfindungsgemäßes Reagens“ beispielsweise nur ein spezifisches Beispiel für die Erfindung dar und schränkt den Schutzbereich der Erfindung nicht ein.
  • Die Abkürzungen im Text sind wie folgt definiert.
    • PLD:
    Phospholipase D
    EDTA:
    Ethylendiamintetraessigsäure
    Tris:
    2-Amino- 2-hydroxymethyl- 1,3-propandiol
    Tx-100:
    Triton X-100
    CV:
    Säulenvolumen
    SDS:
    Natriumdodecylsulfat
    PAGE:
    Polyacrylamidgelelektrophorese
    ASOM:
    Ascorbatoxidase
    TODB:
    N,N-Bis (4-sulfobutyl)- 3-methylanilin, Dinatriumsalz
    4-AA:
    4-Aminoantipyrin
    SR Verhältnis:
    Verhältnis zwischen dem Volumen der Probe und dem Volumen des Reagens
    rLp-PLA2:
    rekombinante Lp- PLA2
    Bis-Tris:
    Bis(2-hydroxyethyl) iminotris(hydroxymethyl) methan
    HEPES:
    2-[4-(2-Hydroxyethyl)- 1-piperazinyl] ethansulfonsäure
    MOPS:
    3-Morpholinopropansulfonsäure
    TES:
    N-Tris(hydroxymethyl) methyl- 2-aminoethansulfonsäure
    PIPES:
    Piperazin- 1,4-bis(2-ethansulfonsäure)
    PC:
    Phosphocholin
    FTU:
    Formazin Trübungseinheit
  • Die Reagenzien, die in diesen Beispielen und dergleichen verwendet wurden, wurden nach Bedarf von den folgenden Herstellern erworben.
    1. 1) Tris (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
    2. 2) EDTA (Dojindo Laboratories)
    3. 3) KCl (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
    4. 4) Tx-100 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
    5. 5) CaCl2 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
    6. 6) ASOM (T-53, Asahi Kasei Pharma Corporation)
    7. 7) TODB (Dojindo Laboratories)
    8. 8) Peroxidase (Sigma)
    9. 9) 4-AA (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
    10. 10) Cholinoxidase (T-05, Asahi Kasei Pharma Corporation)
    11. 11) C16-02: 0 PC (1-O-Hexadecyl- 2-acetyl- sn-glycero- 3-phosphocholin) (Produkt Nr. 878110P, Avanti Polar Lipids, Inc.). Im Folgenden als PAF(C16) bezeichnet.
    12. 12) C16 Lyso-PAF (1-O-Hexadecyl- 2-hydroxy- sn-glycero- 3-phosphocholin) (Produkt Nr. 878119P, Avanti Polar Lipids, Inc.). Im Folgenden als Lyso- PAF(C16) bezeichnet.
    13. 13) C18-02:0 PC (1-O-Octadecyl- 2-acetyl- sn-glycero- 3-phosphocholin) (Produkt Nr. 878114P, Avanti Polar Lipids, Inc.). Im Folgenden als PAF(C18) bezeichnet.
    14. 14) PAF (von Heart PC) (1-Alkyl- 2-acetoyl- sn-glycero- 3-phosphocholin) (Produkt Nr. 840009P, Avanti Polar Lipids, Inc.). im Folgenden als natürliches PAF bezeichnet.
    15. 15) 16:0-02:0 PC (1-Palmitoyl- 2-acetyl- sn-glycero- 3-phosphocholin) (Produkt Nr. 880622C, Avanti Polar Lipids, Inc.).
    16. 16) ProClin® 300 (Sigma-Aldrich)
    17. 17) Kaliumferrocyanid (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
    18. 18) L(+) - Ascorbinsäure (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
  • Das in diesen Beispielen in den Reagenzien verwendete rekombinante Lyso- PAF-PLD wurde durch die in den nachstehenden Referenzbeispielen 1 bis 3 beschriebenen Verfahren hergestellt. Die rekombinante Form der Cholinoxidase (T-05) aus Arthrobacter globiformis (im Folgenden als rekombinante Cholinoxidase bezeichnet) wurde gemäß den Verfahren, die hierin und in der referenzierten Literatur (Takaaki Tamura (2012), Grundlagen der Gentechnologie [Kiso kara Manabu Idenshi Kougaku]) und dergleichen beschrieben sind, hergestellt. Die Cholinoxidase (im Folgenden als rekombinante Cholinoxidase III bezeichnet) aus Thermoactinomyces monosporus (auch als Saccharomonospora glauca bezeichnet) wurde durch die in der Offenlegungsschrift JP- A- H05-317056 offenbarten Verfahren hergestellt. Der racemische PAF(C16) wurde nach den Verfahren, die in J. Org. Chem. 1995, Bd. 60, S. 7706-7708 offenbart sind, unter Verwendung von 1-O-Hexadecyl-rac-glycerol als Ausgangsmaterial synthetisiert.
  • Das Serum und das Plasma, das in diesen Beispielen als Proben verwendet wurde, wurde von den folgenden Herstellern, Lieferanten und Anbietern erhalten. Seren von internen Freiwilligen wurden mit Zustimmung nach Aufklärung in Zusammenarbeit mit Ärzten und Krankenschwestern gesammelt.
    Einzelserum (Nrn. 1 bis 32 und 78): BizCom Japan
    Gepoolte Seren A bis D, gepooltes Heparin- Plasma, gepooltes Citrat- Plasma (Kohjin Bio Co., Ltd.) und BJ pool (BizCom Japan)
    Gepooltes Serum J042, gepooltes Serum J042-II: Japanisches Komitee für klinische Laborstandards (JCCLS)
    Einzelserum A bis E: Serum von internen Freiwilligen
  • Die rekombinante Lp- PLA2 (rLp-PLA2), die in diesen Beispielen verwendet wurde, wurde gemäß den Referenzbeispielen 4 bis 6 auf der Grundlage der Information, die in J. Biol. Chem., 27. Oktober 1995, Nr. 43, Bd. 270, S. 25481-25487 offenbart ist, hergestellt.
  • Ein automatischer Analysator Hitachi 7080, ein automatischer Analysator Hitachi 7600-010S und ein automatischer Analysator Hitachi 7170 (Hitachi High-Technologies Corporation) wurden zur Messung der Aktivität in diesen Beispielen verwendet. Eine ausführliche Information in Bezug auf die Analysemethoden, die Messpunkte und andere Parameter können den Handbüchern der einzelnen Geräte entnommen werden.
  • Sofern nichts anderes angegeben ist, wird in diesen Beispielen das nachstehend unter 1) beschriebene Verfahren 1 zur Berechnung der Werte der Lp- PLA2- Aktivität verwendet. In diesen Beispielen wird (nmol / min / ml) manchmal als (U / L) ausgedrückt.
  • Verfahren 1 zur Berechnung des Werts der Aktivität der Lp- PLA2 (sofern nichts anderes angegeben ist)
  • Die Berechnung erfolgt gemäß der folgenden Formel, basierend auf der Absorptionsänderung pro Minute (ΔmAbs / min), wie berechnet aus der Absorption bei den Messpunkten und dem millimolaren Extinktionskoeffizienten (ε = 36) von TODB bei 546 nm. Activitätswert der Lp-PLA 2 ( nmol / min / ml ) = { Δ Abs / min ) / milimolarer Extinktionskoeffizient von  TODB } / { ( Probenvolumen ) / ( Probenvolumen + Volumen Reagens R1 + Volumen Reagens R2 ) } × 1000 = { ( Δ mAbs / min ) / 36 } / { ( Probenvolumen ) / ( Probenvolumen + Volumen Reagens R1 + Volumen Reagens R2 ) }
    Figure DE112017003142T5_0019
  • Verfahren 2 zur Berechnung des Werts der Aktivität der Lp- PLA2 (Methode unter Verwendung eines Kalibrierungsreagens)
  • Es wird eine Einpunktkalibrierung unter Verwendung eines Kalibrierungsreagens mit bekannter Konzentration ausgewählt, wobei gleichzeitig mit destilliertem Wasser zum Zeitpunkt 0 (nmol / min / ml (U / L)) (auch als Zweipunktkalibrierung bezeichnet) gemessen wird, und der Wert der Aktivität der Lp- PLA2 (nmol / min / ml) in einer Probe wird aus der Kalibrierungskurve berechnet.
  • [Referenzbeispiel 1]
  • <Herstellung einer Transformante, die Lyso- PAF- PLD aus Thermocrispum sp. Produziert>
  • Chromosomale DNA, erhalten aus Thermocrispum sp. (international hinterlegt unter dem Budapester Vertrag als NITE BP-01628; Behörde für Hinterlegung: Nationales Institut für Technologie und Bewertung, Hinterlegungsstelle für Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren; Anschrift: # 122, 2-5-8 Kazusa-Kamatari, Kisarazu-shi, Chiba 292-0818, Japan, Hinterlegungsdatum: 17. Mai 2013) wurde mit Hilfe des Phenol-Chloroform-Verfahrens extrahiert. Unter Verwendung der Nucleotidsequenz mit der SEQ ID NO: 3 als Sense-Primer (Primer mit einer zum codierenden Strang komplementären Sequenz) und der Nucleotidsequenz mit der SEQ ID NO: 4 als Antisense-Primer (Primer mit einer zum nichtcodierenden Strang komplementären Sequenz) wurde die PCR mit KOD FX (Produkt Nr. KFX-101, Toyobo Co., Ltd.) durchgeführt, um ein PCR-Produkt mit etwa 920 bp zu erhalten. Das resultierende PCR-Produkt wurde mit Ndel (Takara Bio Inc.) und EcoRI (Takara Bio Inc.) verdaut und in die Ndel-EcoRI Schnittstelle eines pET-21a(+) Expressionsvektors (Novagen) eingesetzt, um ein Lyso-PAF-PLD / pET21a(+) Expressionsplasmid zu erhalten. Dieses Expressionsplasmid wurde in chemisch kompetente One Shot BL21 (DE3) E. coli (Invitrogen) transformiert, um eine Transformante zu erhalten, die einen rekombinanten Vektor, welcher ein Polynucleotid, bestehend aus einer für Lyso- PAF- PLD codierenden Nucleotidsequenz, enthält, aufweist; der Vektor wird als Lyso-PAF-PLD / pET-21a(+)/ BL21 (DE3) bezeichnet.
  • [Referenzbeispiel 2]
  • <Kultivierung der Transformante zur Herstellung von rekombinanter Lyso- PAF-PLD; und Solubilisierung von Bakterienzellen>
  • 1 Kolonie der Transformante, die in Referenzbeispiel 1 beschrieben ist, wurde in 5 ml flüssigem LB-Medium, das 50 µg / ml Ampicillin enthielt, inokuliert und bei 25 °C 16 Stunden lang in einem Reagenzglas kultiviert, um als Vorkultur verwendet zu werden. Die Vorkultur wurde mit 1/1000 Volumen in 1,6 I flüssigem Medium (Overnight Express® Instant TB Medium mit 1% Glycerin, 0,1% Adekanol LG-109 (ADEKA CORPORATION)), das 50 µg / ml Ampicillin enthielt, inokuliert, und bei 34 °C, pH 6,8, 650 UpM für 26 Stunden in einem Glasfermenter kultiviert. Die Kulturlösung wurde zentrifugiert, um die Bakterienzellen zu ernten, die dann in einer Lösung A (10 mM Tris-HCI (pH 8,5), 1 mM EDTA (pH 9,0), 0,1% Tx-100, 0,1% Lysozymhydrochlorid, Produkt Nr. 36A55K, Eizai)) gelöst und für 30 Minuten bei 50 °C zur Reaktion gebracht wurden. Nachdem die Bakterienzellen durch die Lösung A solubilisiert waren, wurde zentrifugiert und der resultierende Überstand wurde als Rohenzymlösung verwendet.
  • [Referenzbeispiel 3]
  • <Reinigung der rekombinanten Lyso-PAF-PLD>
  • Die im Referenzbeispiel 2 erhaltene Rohenzymlösung wurde an Q Sepharose Big Beads (GE Healthcare) adsorbiert, die in eine mit einer 10 mM Tris-HCI (pH 8,0) Lösung äquilibrierte Säule gepackt waren. Diese wurde dann mit 10 CV eluiert, linearer Gradient unter Verwendung einer 10 mM Tris-HCI (pH 8,0)- Lösung und einer 10 mM Tris-HCl (pH 8,0)- Lösung, die 0,5 M KCl enthielt. Nachdem mit Hilfe von SDS-PAGE bestätigt worden war, das eine eluierte Fraktion rekombinantes Lyso-PAF-PLD enthielt, wurde die eluierte Fraktion mit Hilfe eines Moduls vom Stift-Typ (UF, pencil-type) (Asahi Kasei Chemical) auf 1/10 Volumen konzentriert, und durch Zugabe von KCl auf 3 M eingestellt. Die Lösung, die Lyso- PAF- PLD enthielt, wurde dann an Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (High Sub) (GE Healthcare) adsorbiert, die in eine Säule gepackt war, die mit 10 mM Tris-HCI (pH 8,5)-Lösung, die 3 M KCl enthielt, äquilibriert worden war, und dann mit 10 CV eluiert, linearer Gradient unter Verwendung einer 10 mM Tris-HCI (pH 8,5)- Lösung und einer 10 mM Tris-HCI (pH 8,5)- Lösung, die 3 M KCl enthielt. Die eluierte Fraktion wurde mit Hilfe von SDS-PAGE bestätigt, gesammelt, und mit einer Amicon Ultra-15 Zentrifugalfiltereinheit (Millipore) konzentriert, und mit einer 10 mM Tris-HCI (pH 8,0)-Lösung dialysiert. Die dialysierte Lösung wurde an Q Sepharose High Performance (GE Healthcare) adsorbiert, die in eine mit 10 mM Tris-HCI (pH 8,5)- Lösung äquilibrierte Säule gepackt war. Diese wurde dann mit 12 CV eluiert, linearer Gradient unter Verwendung von 10 mM Tris-HCI (pH 8,5) und einer 10 mM Tris-HCI (pH 8,5)- Lösung, die 0,5 M KCl enthielt. Die eluierte Fraktion wurde mit Hilfe von SDS-PAGE bestätigt, gesammelt, und mit einer Amicon Ultra-15 Zentrifugalfiltereinheit (Millipore) konzentriert, und mit einer PD-10 Säule (GE Healthcare) entsalzt, um eine Enzymlösung der rekombinanten Lyso-PAF-PLD mit der SEQ ID NO: 9 zu erhalten.
  • [Referenzbeispiel 4]
  • <Herstellung einer Rekombinante zur Herstellung von humanem Lp- PLA2>
  • Ein für E. coli optimiertes Gen (abgestimmt auf die Verwendung von Codons in E. coli) wurde auf der Grundlage der Sequenzdaten für ein menschliches Lp-PLA2 Gen synthetisiert (GenScript (NJ, USA)). Unter Verwendung der synthetisierten DNA als Templat wurde eine PCR unter Verwendung von KOD FX (Toyobo Co., Ltd.) durchgeführt, um ein PCR-Produkt mit etwa 1200 bp zu erhalten, wobei die Nucleotidsequenz mit der SEQ ID NO: 5, in der das 42. Isoleucin in der Sequenz zu dem ursprünglichen Methionin geändert wurde, als Sense-Primer verwendet wurde, und die Nucleotidsequenz mit der SEQ ID NO: 6 als Antisense-Primer. Das resultierende PCR-Produkt wurde mit Ndel (Takara Bio Inc.) und BamHI (Takara Bio Inc.) verdaut, und in die Ndel-BamHI Schnittstelle des Expressionsvektors pET-19b (Novagen) eingesetzt, um ein Lp-PLA2 / pET- 19b Expressionsplasmid zu erhalten. Dieses Expressionsplasmid wurde in chemisch kompetente One Shot BL21 (DE3) E. coli transformiert, um eine Transformante zu erhalten, die als Lp-PLA2 / pET-19b / BL21 (DE3) bezeichnet wird, und einen rekombinanten Vektor, enthaltend ein Polynucleotid, bestehend aus einer Nucleotidsequenz, die für Lp-PLA2 mit einem am N-Terminus aus dem Vektor hinzugefügten Histidin-Tag codiert, umfasst.
  • [Referenzbeispiel 5]
  • <Kultivierung der Transformante zur Herstellung von rekombinanter Lyso- PAF-PLD; und Solubilisierung von Bakterienzellen>
  • 1 Kolonie der Transformante, die in Referenzbeispiel 4 beschrieben ist, wurde in 5 ml flüssigem LB-Medium, das 50 µg / ml Ampicillin enthielt, inokuliert und bei 25 °C 16 Stunden lang in einem Reagenzglas kultiviert, um als Vorkultur verwendet zu werden. Die Vorkultur wurde mit einem Volumenverhältnis von 1/1000 in 0,8 I flüssigem Medium (Overnight Express® Instant TB Medium mit 1% Glycerin), das 50 µg / ml Ampicillin enthielt, inokuliert, und bei 30 °C für 24 Stunden in einer Flasche kultiviert. Die Kulturlösung wurde zentrifugiert, um die Bakterienzellen zu ernten, die dann in einer 20 mM Kaliumphosphatlösung (pH 7,0), die 0,3 M NaCl enthielt, gelöst und mit Ultraschall behandelt wurden. Nach der Solubilisierung der Bakterienzellen durch Ultraschallbehandlung wurde zentrifugiert und der resultierende Überstand wurde als Rohenzymlösung verwendet.
  • [Referenzbeispiel 6]
  • <Reinigung der rekombinanten Lp-PLA2 (rLp-PLA2)>
  • Die im Referenzbeispiel 5 erhaltene Rohenzymlösung wurde an Chelating Sepharose FF (GE Healthcare) adsorbiert, die in eine Säule gepackt war, die mit 20 mM Kaliumphosphatlösung (pH 7,0), die 0,3 M NaCl enthielt, äquilibriert war. Diese wurde dann mit einem linearen Gradienten unter Verwendung einer 20 mM Kaliumphosphatlösung (pH 7,0), die 0,3 M NaCl enthielt, und einer 20 mM Kaliumphosphatlösung (pH 7,0), die 400 mM Imidazol und 0,3 M NaCl enthielt, eluiert. in einer eluierten Fraktion wurde rekombinante Lp-PLA2 mit Hilfe von SDS-PAGE nachgewiesen, und die Fraktion wurde über Nacht mit 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) dialysiert, und mit einer Amicon Ultra-15 (30K) Zentrifugalfiltereinheit (Millipore) auf 1/65 Volumen konzentriert.
  • [Referenzbeispiel 7]
  • <Herstellung einer Transformante zur Herstellung von GPCP aus E. coli>
  • Auf der Grundlage der Gensequenzdaten für Glycerophosphoryldiester- Phosphodiesterase (GlpQ), die GPCP-Aktivität im E. coli Stamm K aufweist, wurde mit dem E. coli-Stamm LE 392 (bezogen vom Nationalen Institut für Genetik) als Templat eine PCR unter Verwendung von KOD FX (Toyobo Co., Ltd.) durchgeführt, um ein PCR-Produkt mit etwa 1000 bp zu erhalten, wobei die Nucleotidsequenz mit der SEQ ID NO: 7 als Sense-Primer verwendet wurde, und die Nucleotidsequenz mit der SEQ ID NO: 8 als Antisense-Primer. Das resultierende PCR- Produkt wurde mit Nhel (Takara Bio Inc.) und EcoRI (Takara Bio Inc.) verdaut und in die Nhel-EcoRI Schnittstelle des Expressionsvektors pET-21a (+) (Novagen) eingesetzt, um ein GPCP / pET- 21a (+) Expressionsplasmid zu erhalten. Dieses Expressionsplasmid wurde in chemisch kompetente One Shot BL21 (DE3) E. coli transformiert, um eine Transformante zu erhalten, die als GPCP / pET-21a (+) / BL21 (DE3) bezeichnet wird, und einen rekombinanten Vektor, enthaltend ein Polynucleotid, bestehend aus einer Nucleotidsequenz, die für GPCP codiert, umfasst.
  • [Referenzbeispiel 8]
  • <Kultivierung der Transformanten zur Herstellung von rekombinanter GPCP; und Solubilisierung von Bakterienzellen>
  • 1 Kolonie der Transformante, die in Referenzbeispiel 7 beschrieben ist, wurde in 5 ml flüssigem LB-Medium, das 50 µg / ml Ampicillin enthielt, inokuliert und bei 30 °C 16 Stunden lang in einem Reagenzglas kultiviert, um als Vorkultur verwendet zu werden. Die Vorkultur wurde in 600 ml flüssigem Medium, enthaltend 50 µg / ml Ampicillin (Overnight Express® Instant TB Medium mit 1% Glycerin), in einem Volumenverhältnis von 1/1000 inokuliert, und bei 34 °C für 24 Stunden in einer Flasche kultiviert. Die Kulturlösung wurde zentrifugiert, um die Bakterienzellen zu ernten, die dann in 20 mM Tris-HCI (pH 7,5) gelöst und mit Ultraschall behandelt wurden. Nach der Solubilisierung der Bakterienzellen durch Ultraschallbehandlung wurde zentrifugiert und der resultierende Überstand wurde als Rohenzymlösung verwendet.
  • [Referenzbeispiel 9]
  • <Reinigung der rekombinanten GPCP>
  • Die im Referenzbeispiel 8 erhaltene Rohenzymlösung wurde an Q Sepharose Fast Flow (GE Healthcare) adsorbiert, die in eine Säule gepackt war, die mit 10 mM Tris-HCI (pH 8,0) äquilibriert war. Diese wurde dann mit 10 CV eluiert, linearer Gradient unter Verwendung einer 10 mM Tris-HCI (pH 8,0)- Lösung und einer 10 mM Tris-HCI (pH 8,0)- Lösung, die 0,5 M KCl enthielt. In einer eluierten Fraktion wurde rekombinante GPCP mit Hilfe von SDS-PAGE bestätigt, und zu der Fraktion wurde 18% iges Ammoniumsulfat zugegeben. Die GPCP enthaltende Lösung mit dem zugesetzten 18% igen Ammoniumsulfat wurde an Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (High Sub) adsorbiert, die in eine Säule gepackt war, die mit 10 mM Tris-HCI (pH 8,0)- Lösung, die 18% Ammoniumsulfat enthielt, äquilibriert war. Die Elution erfolgte mit 10 CV, linearer Gradient unter Verwendung einer 10 mM Tris-HCI (pH 8,0)- Lösung und einer 10 mM Tris-HCI (pH 8,0)- Lösung, die 18% Ammoniumsulfat enthielt. Die eluierte Fraktion wurde mit Hilfe von SDS-PAGE bestätigt, gesammelt, und mit einer Amicon Ultra-15 Zentrifugalfiltereinheit (Millipore) konzentriert, und mit einer PD-10 Säule entsalzt, um eine Enzymlösung der rekombinanten GPCP zu erhalten.
  • [Referenzbeispiel 10]
  • <Test der Temperaturstabilität der Lyso- PAF- PLD>
  • Die gereinigte Lyso- PAF- PLD wurde bei verschiedenen Temperaturen 60 Minuten lang in einer 20 mM Tris-HCI (pH 7,5)- Lösung inkubiert, und die Restaktivität wurde mit der folgenden Reaktionslösung untersucht. Als Substrat wurde C18(Plasm)LPC (Produkt Nr. 852465P, Avanti Polar Lipids, Inc.) verwendet.
  • (Zusammensetzung der Reaktionslösung)
  • 80 mM Tris-HCI (pH 8,0)
    0,4 mM Substrat
    2 mM CaCl2
  • (Zusammensetzung der Farbentwicklungslösung)
  • 0,03% 4-AA
    0,02% TODB
    0,75 U / ml Cholinoxidase (T-05, Asahi Kasei Pharma Corporation)
    5 U / ml Peroxidase
    10 mM EDTA
  • 50 µl der Reaktionslösung wurden bei 37 °C für 5 Minuten vorinkubiert, 5 µl der Enzymlösung wurden zugegeben, und eine Enzymreaktion wurde für 1 Minute bei 50 °C durchgeführt. Dann wurden 200 µl der Farbentwicklungslösung zugegeben, und für 10 Minuten bei 37 °C zur Reaktion gebracht; danach wurde die Extinktion bei 550 nm gemessen. Der Aktivitätswert wurde gemäß der folgenden Formel berechnet. Activitätswert der Lyso-PAF-PLD ( U / ml ) = { Δ Abs / min ) / milimolarer Extinktionskoeffizient von  TODB bei 550 nm } / { ( Probe nvolumen ) / ( Probenvolumen + Vol umen Reagens R1 + Volumen Reagens R2 ) } = { ( Δ Abs / min ) / 39 } / { ( Probenvolumen ) / ( Probenvolumen + Volumen Reagens R1 + Volumen Reagens R2 ) }
    Figure DE112017003142T5_0020
  • 1 zeigt die Restaktivität bei jeder Temperatur, wobei 100 % als Aktivitätswert angenommen werden, wenn sie bei 4 °C gelagert wird.
  • [Referenzbeispiel 11]
  • <Herstellung des Kalibrierungsreagens>
  • Um das gepoolte Serum J042-II als Kalibrierungsreagens (Kalibrator) zu verwenden, wurde 5 Tage lang (n = 5) die Lp-PLA2-Aktivität (nmol / min / ml (U / I)) in dem gepoolten Serum J042-II gemessen, und der Durchschnittswert wurde als die bekannte Menge (bekannte Konzentration) an Lp-PLA2 festgesetzt. Die Zusammensetzung des Reagens ist wie folgt.
  • (Reagenzien der Erfindung)
  • <Reagens R1>
  • 50 mM Tris-HCl (pH 7,8)
    0,2 mM CaCl2
    4 U / ml ASOM
    0,05% ProClin 300
    1,6 µM Kaliumferrocyanid
    0,05% EMULGEN 1150S-60
    3,3 U / ml rekombinante Lyso- PAF- PLD
    0,1 mM EDTA
    75 mM NaCl
    3% Trehalose
    10µM FAD (Flavin-Adenin- Dinucleotid)
    0,02% TODB
    4 U / ml Peroxidase
    4 U / ml rekombinante Cholinoxidase III
  • <Reagens R2>
  • 50 mM PIPES (pH 7,0)
    0,2 mM CaCl2
    0,05% ProClin 300
    0,05% EMULGEN 1150S-60
    0,1 mM EDTA
    0,25% KCl
    0,13% Saccharose
    0,08% 4-AA
    2 mM racemischer PAF (C16)
  • (Probe)
  • Gepooltes Serum J042-II
  • (Aktivitätsmessung)
  • Zur Messung der Aktivität wurde ein automatischer Analysator Hitachi 7170 verwendet. Die Messparameter sind unten aufgeführt.
  • (Messparameter für den automatischen Analysator 7170 von Hitachi)
  • Analysemethode Rate A
    Messwellenlänge (sub / dominant) 660 nm / 546 nm
    Reaktionszeit 10 Minuten
    Messpunkte 30 bis 33
    Probenvolumen 4 µl
    Volumen Reagens R1 160 µl
    Volumen Reagens R2 40 µl
  • 4 µl der Probe wurden mit 160 µl Reagens R1 gemischt und 5 Minuten lang bei 37 °C (Messpunkte 1 bis 16) inkubiert, anschließend wurden 40 µl des Reagens R2 zugegeben, um eine Reaktion zu initiieren (Messpunkt 17). Die Absorption von Wasser (Blindprobe) bei denselben Messpunkten wurde von der Absorption der Probe abgezogen, etwa 3,6 bis 4,5 Minuten nachdem die Reaktion durch Zugabe des Reagens R2 gestartet worden war (Messpunkte 30 bis 33), um die Änderung der Absorption pro Minute (ΔmAbs / min) zu berechnen, und der Aktivitätswert der Lp-PLA2 (nmol / min / ml) wurde gemäß der vorstehenden Formel berechnet.
  • Mit den erhaltenen Messergebnissen wurde für das gepoolte Serum J042-II die Menge (Konzentration) an Lp-PLA2 mit 23,1 (nmol / min / ml (U / I)) (Standardabweichung (SD) = 0,36 (nmol / min / ml (U / L)) festgesetzt, (bekannte Menge (Konzentration)). Ein Kalibrierungsreagens (Kalibrator) könnte unter Verwendung des gepoolten Serums hergestellt werden. Die Ausführbarkeit für dieses Kalibrierungsreagens wurde in Beispiel 24 und dergleichen verifiziert.
  • [Beispiel 1]
  • <Spezifität der rekombinanten Lyso- PAF- PLD>
  • Um die Spezifität der rekombinanten Lyso- PAF- PLD, die in Referenzbeispiel 3 gereinigt wurde, zu untersuchen, wurde die Aktivität gegenüber PAF(C16) und Lyso- PAF(C16) geprüft. Die Zusammensetzungen der Reagenzien sind wie folgt.
  • (Reagenzien der Erfindung)
  • <Reagens R1>
  • 50 mM Tris-HCl (pH 7.5)
    1 mM CaCl2
    4 U / ml ASOM
    0,1% Tx-100
    0,03% TODB
    4 U / ml Peroxidase
    5 U / ml rekombinante Cholinoxidase
  • <Reagens R2>
  • 50 mM Tris-HCI (pH 7.5)
    1 mM CaCl2
    0,04% 4-AA
    0,1% Tx-100
    0,13 mg / ml rekombinante Lyso- PAF- PLD
  • (Proben)
  • 0,1% Tx-100 Lösungen, enthaltend 0 bis 0,5 mM PAF(C16) oder Lyso- PAF(C16)
  • (Aktivitätsmessung)
  • Zur Messung der Aktivität wurde ein automatischer Analysator Hitachi 7080 verwendet. Die Messparameter sind unten aufgeführt.
  • (Messparameter für den automatischen Analysator 7080 von Hitachi)
  • Analysemethode 2-Punkt Ende
    Messwellenlänge (sub / dominant) 660 nm / 546 nm
    Reaktionszeit 10 Minuten
    Messpunkte 16 bis 31
    Probenvolumen 5 µl
    Volumen Reagens R1 150 µl
    Volumen Reagens R2 50 µl
  • 5 µl Proben, enthaltend PAF(C16) oder Lyso- PAF(C16) mit Konzentrationen von 0, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 oder 0,5 mM, wurden jeweils 5 Minuten lang bei 37 °C mit 150 µl Reagens R1 inkubiert (Messpunkte 1 bis 15), und anschließend wurden 50 µl Reagens R2 zugegeben, und dann wurde 5 Minuten lang reagieren gelassen (Messpunkte 16 bis 31). Die Absorption bei jedem Messpunkt während der 10-minütigen Reaktionszeit mit den PAF-Proben wurde aufgetragen, wie in 2 gezeigt. Die Ergebnisse für die Lyso- PAF Proben wurden auf dieselbe Weise, wie in 3 dargestellt, aufgetragen.
  • Wie aus den 2 und 3 ersichtlich, zeigen die Ergebnisse der Aktivitätsmessungen der Lyso- PAF Proben, dass sich die Absorption nur in dem Fall ändert, nachdem Reagens R2 zugegeben wurde. Dies belegt, dass die Lyso- PAF- PLD in dem Reagens R2 Lyso-PAF unter Bildung von Cholin hydrolysierte, und das Wasserstoffperoxid, das durch die Oxidation von Cholin erzeugt wurde, bewirkte eine Redoxreaktion des Chromogens. Folglich ist klar, dass die rekombinante Lyso- PAF- PLD nur gegenüber Lyso- PAF und nicht gegenüber PAF PLD- Aktivität zeigt, obwohl PAF und Lyso- PAF strukturell ähnlich sind.
  • Die Nutzung dieser Spezifität der rekombinanten Lyso- PAF- PLD zur Messung der Aktivität der Lp-PLA2 in Proben wurde untersucht. Insbesondere wurde die Messung der Lp-PLA2- Aktivität in Proben auf der Grundlage des Prinzips der Zugabe von PAF zu einer Probe, des Hydrolysierens des PAF zu Lyso- PAF mit in der Probe enthaltener Lp-PLA2, und daran anschließender Hydrolyse der Lyso- PAF mit rekombinanter Lyso- PAF- PLD, und Messen der resultierenden Hydrolyseprodukte untersucht.
  • In den nachstehenden Beispielen 2 bis 10 wurden die grundlegenden Eigenschaften [Komponenten] der Reagenzien zur Messung der Aktivität der Lp- PLA2 untersucht. In diesen Beispielen waren die Kriterien für eine hohe Empfindlichkeit (Sensitivität), dass eine Enzymreaktion in einer Probe problemloser verläuft, der Wert der Absorptionsänderung pro Minute (Empfindlichkeit) (ΔmAbs / min) höher ist, und der berechnete Aktivitätswert der Lp-PLA2 (nmol / min / ml) aufgrund der Art der hinzugefügten Reagenzbestandteile höher ist.
  • [Beispiel 2]
  • <Untersuchung des pH von Reagens 1 (pH 6,0 bis 9,0) zur Messung der Aktivität der Lp-PLA2>
  • Um die Wirkung des pH- Werts der Reagenzien bei der Messung der Aktivität der Lp- PLA2 zu untersuchen, wurden die pH- Werte der Reagenzien unter Verwendung von Tris und Bis-Tris (Dojindo Laboratories) in Schritten von 0,5 zwischen pH 6,0 und 9,0 eingestellt, und die Lp- PLA2- Aktivität in den Proben wurde gemessen. Die Zusammensetzungen der Reagenzien sind wie folgt.
  • (Reagenzien der Erfindung)
  • <Reagens R1>
  • 50 mM Tris-HCl (jeweiliger pH)
    1 mM CaCl2
    4 U / ml ASOM
    0,1% Tx-100
    0,13 mg / ml rekombinante Lyso- PAF- PLD
    0,03% TODB
    4 U / ml Peroxidase
    5 U / ml rekombinante Cholinoxidase
  • <Reagens R2>
  • 50 mM Tris-HCl (jeweiliger pH)
    1 mM CaCl2
    0,04% 4-AA
    0,5% Tx-100
    10 mM PAF(C16)
  • (Proben)
  • Einzelserum Nr. 16, Einzelserum Nr. 78.
  • (Aktivitätsmessung)
  • Zur Messung der Aktivität wurde ein automatischer Analysator Hitachi 7080 verwendet. Die Messparameter sind unten aufgeführt.
  • (Messparameter für den automatischen Analysator 7080 von Hitachi)
  • Analysemethode Rate A
    Messwellenlänge (sub / dominant) 660 nm / 546 nm
    Reaktionszeit 10 Minuten
    Messpunkte 23 bis 26
    Probenvolumen 3 µl
    Volumen Reagens R1 150 µl
    Volumen Reagens R2 100 µl
  • 3 µl der Probe wurden mit 150 µl Reagens R1 gemischt und 5 Minuten lang bei 37 °C (Messpunkte 1 bis 15) inkubiert, daran anschließend wurden 100 µl des Reagens R2 zugegeben, um eine Reaktion zu initiieren (Messpunkt 16). Die Absorption von Wasser (Blindprobe) bei denselben Messpunkten wurde von der Absorption der Probe abgezogen, etwa 2 bis 3 Minuten nachdem die Reaktion durch Zugabe des Reagens R2 gestartet worden war (Messpunkte 23 bis 26), um die Änderung der Absorption pro Minute (ΔmAbs / min) zu berechnen, und der Aktivitätswert der Lp-PLA2 (nmol / min / ml) wurde gemäß der vorstehenden Formel berechnet. Die Werte für die Änderung der Absorption pro Minute (Sensitivität) (ΔmAbs / min) und die Aktivitätswerte der Lp-PLA2 (nmol / min / ml) bei dem jeweiligen pH sind in den Tabellen 1 und 2 gezeigt.
  • [Tabelle 1]
    • Einzelserum 16
    pH ΔmAbs / min Aktivitätswert (nmol/ min/ ml)
    6,0 8,4 19,7
    6,5 11,2 26,2
    7,0 22,4 52,5
    7,5 43,0 100,7
    8,0 40,9 95,8
    8,5 38,3 89,7
    9,0 31,8 74,5
    [Tabelle 2]
    • Einzelserum 78
    pH ΔmAbs / min Aktivitätswert (nmol/ min/ ml)
    6,0 3,9 9,1
    6,5 3,3 7,7
    7,0 7,4 17,3
    7,5 18,6 43,6
    8,0 17,1 40,1
    8,5 15,8 37,0
    9,0 13,7 32,1
  • Die Messergebnisse in den Tabellen 1 und 2 zeigen, dass die Lp- PLA2- Aktivität bei allen pH-Werten im Bereich von pH 6,0 bis 9,0 gemessen werden konnte. Darüber hinaus konnte die Aktivität der Lp-PLA2 bei einem pH im Bereich von 7,5 bis etwa 8,0 mit einer höheren Empfindlichkeit gemessen werden.
  • [Beispiel 3]
  • <Untersuchung des pH von Reagens 1 (pH 7,25 bis 7,75) zur Messung der Aktivität der Lp-PLA2>
  • Da Beispiel 2 zeigte, dass die Aktivität der Lp-PLA2 mit der höchsten Empfindlichkeit gemessen werden konnte, wenn der pH-Wert der Reagenzien nahe 7,5 lag, wurde die Wirkung des pH-Werts im Bereich von pH 7,5 im Detail untersucht. Der pH-Wert der Reagenzien wurde mit Tris-HCl Puffer auf 7,25, 7,5 und 7,75 eingestellt, und die Lp-PLA2-Aktivität wurde in den Proben gemessen. Die Zusammensetzungen der Reagenzien sind wie folgt.
  • (Reagenzien der Erfindung)
  • <Reagens R1>
  • 50 mM Tris-HCl (pH 7.25, 7.5, 7.75)
    1 mM CaCl2
    4 U /ml ASOM
    0,1% Tx-100
    0,13 mg / ml rekombinante Lyso- PAF- PLD
    0,03% TODB
    4 U / ml Peroxidase
    5 U / ml rekombinante Cholinoxidase
  • <Reagens R2>
  • 50 mM Tris-HCI (pH 7.25, 7.5, 7.75)
    1 mM CaCl2
    0,04% 4-AA
    0,5% Tx-100
    10 mM PAF (C16)
  • (Proben und Aktivitätsmessung)
  • Die Probentypen, die Messausrüstung, die Messparameter und die Berechnungen der Aktivitätswerte waren die gleichen wie in Beispiel 2. Die Werte für die Änderung der Absorption pro Minute (Sensitivität) (ΔmAbs / min) und die Aktivitätswerte der Lp-PLA2 (nmol / min / ml) bei dem jeweiligen pH sind in den Tabellen 3 und 4 gezeigt.
  • [Tabelle 3]
    • Einzelserum 16
    pH ΔmAbs / min Aktivitätswert (nmol/ min/ ml)
    7,25 29,8 69,8
    7,5 41,2 96,5
    7,75 41,6 97,5
    [Tabelle 4]
    • Einzelserum 78
    pH ΔmAbs / min Aktivitätswert (nmol/ min/ ml)
    7,25 12,8 30,0
    7,5 18,0 42,2
    7,75 17,8 41,7
  • Die Messergebnisse in den Tabellen 3 und 4 zeigen, dass die Aktivität der Lp-PLA2 mit einer höheren Empfindlichkeit gemessen werden konnte, wenn der pH der Reagenzien 7,5 oder 7,75 war.
  • [Beispiel 4]
  • <Untersuchung der Pufferlösung in den Reagenzien zur Messung der Aktivität der Lp- PLA2>
  • Um die Auswirkungen von verschiedenen Pufferlösungen in den Reagenzien zur Messung der Aktivität der Lp- PLA2 zu untersuchen, wurde der pH-Wert der Reagenzien auf 7,5 eingestellt, der Typ der Pufferlösung variiert, und die Lp-PLA2-Aktivität in den Proben gemessen. Es wurden insgesamt 6 Puffer verwendet - die Good- Puffer HEPES (Dojindo Laboratories), MOPS (Dojindo Laboratories), TES (Dojindo Laboratories) und PIPES (Dojindo Laboratories), Kaliumphosphat (Pi-K) und Tris (Wako Pure Chemical) Industries, Ltd.). Der pH-Wert des Kaliumphosphats wurde mit Dikaliumhydrogenphosphat (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) und Kaliumdihydrogenphosphat (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) eingestellt. Die Zusammensetzungen der Reagenzien sind nachstehend angegeben.
  • (Reagenzien der Erfindung)
  • <Reagens R1>
  • 50 mM jeweiliger Puffer (pH 7.5)
    1 mM CaCl2
    4 U / ml ASOM
    0,1% Tx-100
    0,13 mg / ml rekombinante Lyso- PAF- PLD
    0,03% TODB
    4 U / ml Peroxidase
    5 U / ml rekombinante Cholinoxidase
  • <Reagens R2>
  • 50 mM jeweiliger Puffer (pH 7.5)
    1 mM CaCl2
    0,04% 4-AA
    0,5% Tx-100
    10 mM PAF (C16)
  • (Proben und Aktivitätsmessung)
  • Die Probentypen, die Messausrüstung, die Messparameter und die Berechnungen der Aktivitätswerte waren die gleichen wie in Beispiel 2. Die Werte für die Änderung der Absorption pro Minute (Sensitivität) (ΔmAbs / min) und die Aktivitätswerte der Lp-PLA2 (nmol / min / ml) unter Verwendung des jeweiligen Puffers sind in den Tabellen 5 und 6 gezeigt.
  • [Tabelle 5] • Einzelserum 16
    Pufferlösung ΔmAbs / min Aktivitätswert (nmol/ min/ ml)
    HEPES 32,6 76,4
    MOPS 34,7 81,3
    TES 32,3 75,7
    PIPES 38,2 89,5
    Pi-K 36,0 84,3
    Tris 42,3 99,1
    [Tabelle 6] • Einzelserum 78
    Pufferlösung ΔmAbs / min Aktivitätswert (nmol/ min/ ml)
    HEPES 15,6 36,5
    MOPS 16,8 39,4
    TES 16,0 37,5
    PIPES 18,4 43,1
    Pi-K 16,0 37,5
    Tris 19,1 44,7
  • Die Messergebnisse in den Tabellen 5 und 6 zeigen, dass die Lp- PLA2- Aktivität unter Verwendung von allen 6 Arten von Pufferlösungen gemessen werden konnte. Bei der in diesem Beispiel verwendeten Pufferkonzentration von 50 mM konnte die Aktivität der Lp-PLA2 unter Verwendung von Tris als Pufferlösung in den Reagenzien mit der höchsten Empfindlichkeit gemessen werden.
  • [Beispiel 5]
  • <Untersuchung der Konzentration von Tris- HCl (pH 7,5) in den Reagenzien zur Messung der Aktivität der Lp- PLA2>
  • Um die Wirkung der Konzentration von Tris- HCl (pH 7,5) in den Reagenzien zur Messung der Aktivität der Lp- PLA2 zu untersuchen, wurden Konzentrationen von Tris-HCI (pH 7,5) in den Reagenzien auf 25 mM, 50 mM und 100 mM eingestellt, und die Aktivität der Lp- PLA2 in den Proben gemessen. Die Zusammensetzungen der Reagenzien sind nachstehend angegeben.
  • (Reagenzien der Erfindung)
  • <Reagens R1>
  • 25 bis 100 mM Tris-HCl (pH 7.5)
    1 mM CaCl2
    4 U / ml ASOM
    0,1% Tx-100
    0,13 mg / ml rekombinante Lyso- PAF- PLD
    0,03% TODB
    4 U / ml Peroxidase
    5 U / ml rekombinante Cholinoxidase
  • <Reagens R2>
  • 25 bis 100 mM Tris-HCl (pH 7.5)
    1 mM CaCl2
    0,04% 4-AA
    0,5% Tx-100
    10 mM PAF (C16)
  • (Proben und Aktivitätsmessung)
  • Die Probentypen, die Messausrüstung, die Messparameter und die Berechnungen der Aktivitätswerte waren die gleichen wie in Beispiel 2. Die Werte für die Änderung der Absorption pro Minute (Sensitivität) (ΔmAbs / min) und die Aktivitätswerte der Lp-PLA2 (nmol / min / ml) unter Verwendung der jeweiligen Pufferlösung sind in den Tabellen 7 und 8 gezeigt.
  • [Tabelle 7] • Einzelserum 16
    Konzentration (mM) ΔmAbs / min Aktivitätswert (nmol/ min/ ml)
    25 42,8 100,3
    50 43,5 101,9
    100 40,3 94,4
    [Tabelle 8] • Einzelserum 78
    Konzentration (mM) ΔmAbs / min Aktivitätswert (nmol/ min/ ml)
    25 18,9 44,3
    50 19,5 45,7
    100 18,0 42,2
  • Die Messergebnisse in den Tabellen 7 und 8 zeigen, dass die Lp- PLA2- Aktivität bei allen von den Konzentrationen 25 mM, 50 mM und 100 mM von Tris-HCI (pH 7,5) gemessen werden konnte. Wenn die Konzentration von Tris-HCI (pH 7,5) in den Reagenzien 50 mM betrug, konnte die Aktivität der Lp- PLA2 mit einer höheren Empfindlichkeit gemessen werden.
  • [Beispiel 6]
  • <Die Wirkung der Konzentration von CaCl2 in den Reagenzien zur Messung der Aktivität der Lp- PLA2>
  • Um die Auswirkungen der Konzentration von CaCl2 in den Reagenzien zur Messung der Aktivität der Lp- PLA2 zu prüfen, wurden die Konzentrationen von CaCl2 in den Reagenzien auf 0 (keine Zugabe), 0,25, 0,5, 0,75, 1, 2,5, 5 10 mM eingestellt, und die Aktivität der Lp-PLA2 in den Proben gemessen. Die Zusammensetzungen der Reagenzien sind nachstehend angegeben.
  • (Reagenzien der Erfindung)
  • <Reagens R1>
  • 50 mM Tris-HCl (pH 7.5)
    0 bis 10 mM CaCl2
    4 U / ml ASOM
    0,1% Tx-100
    0,13 mg / ml rekombinante Lyso- PAF- PLD
    0,03% TODB
    4 U / ml Peroxidase
    5 U / ml rekombinante Cholinoxidase
  • <Reagens R2>
  • 50 mM Tris-HCl (pH 7.5)
    0 bis 10 mM CaCl2
    0,04% 4-AA
    0,5% Tx-100
    10 mM PAF (C16)
  • (Proben und Aktivitätsmessung)
  • Die Probentypen, die Messausrüstung, die Messparameter und die Berechnungen der Aktivitätswerte waren die gleichen wie in Beispiel 2. Die Werte für die Änderung der Absorption pro Minute (Sensitivität) (ΔmAbs / min) und die Aktivitätswerte der Lp-PLA2 (nmol / min / ml) unter Verwendung der jeweiligen Pufferlösung sind in den Tabellen 9 und 10 gezeigt.
  • [Tabelle 9]
    • Einzelserum 16
    Konzentration (mM) ΔmAbs / min Aktivitätswert (nmol/ min/ ml)
    0 41,4 97,0
    0,25 42,5 99,6
    0,5 43,3 101,4
    0,75 43,1 101,0
    1 42,9 100,5
    2,5 42,8 100,3
    5 41,9 98,2
    10 43,0 100,7
    [Tabelle 10]
    • Einzelserum 78
    Konzentration (mM) ΔmAbs / min Aktivitätswert (nmol/ min/ ml)
    0 18,9 44,3
    0,25 19,3 45,2
    0,5 19,1 44,7
    0,75 19,0 44,5
    1 19,1 44,7
    2,5 19,0 44,5
    5 18,9 44,3
    10 18,9 44,3
  • Die Messergebnisse in den Tabellen 9 und 10 zeigen, dass die Konzentration von CaCl2 im Bereich von 0 bis 10 mM keinen Einfluss auf die Messung der Lp- PLA2- Aktivität hatte. Bei keiner Konzentration gab es einen Unterschied bei den Aktivitätswerten der Lp- PLA2, und diese Beispiel legt nahe, dass das Enzym in dem Reagens ausreichend arbeitet, wenn nur das CaCl2 aus der Probe vorhanden ist.
  • [Beispiel 7]
  • <Screening von Tensiden für die Reagenzien zur Messung der Aktivität der Lp- PLA2>
  • Um die Auswirkungen von Tensiden in den Reagenzien zur Messung der Aktivität der Lp-PLA2 zu untersuchen, wurde die Art des Tensids, das den Reagenzien zugesetzt wurde, variiert, wobei die Konzentration im Reagens R1 auf 0,1% eingestellt wurde um im Reagens R2 auf 0,1% oder 0,5%, und die Aktivität der Lp- PLA2 wurde in den Proben gemessen. Die Zusammensetzungen der Reagenzien sind nachstehend angegeben.
  • (Reagenzien der Erfindung)
  • <Reagens R1>
  • 50 mM Tris-HCl (pH 7.5)
    1 mM CaCl2
    4 U / ml ASOM
    0,1% jeweiliges Tensid
    0,13 mg / ml rekombinante Lyso- PAF- PLD
    0,03% TODB
    4 U / ml Peroxidase
    5 U / ml rekombinante Cholinoxidase
  • <Reagens R2>
  • 50 mM Tris-HCI (pH 7.5)
    1 mM CaCl2
    0,04% 4-AA
    0,1% oder 0,5% jeweiliges Tensid
    10 mM PAF
  • (verwendete Tenside)
  • Die in dieser Untersuchung verwendeten Tenside sind in der Tabelle 11 im Detail angegeben. [Tabelle 11]
    Nr. Produktbezeichnung Chemischer Name HLB
    1 Tx-100 POE octylphenylether 13,5
    2 BT-7 POE(7) sekundärer Alkylether 12,0
    3 BT-9 POE(9) sekundärer Alkylether 13,5
    4 BT-12 POE(12) sekundärer Alkylether 14,5
    5 BL-21 POE(21) Laurylether 19,0
    6 EMULGEN108 POE Laurylether 12,1
    7 EMULGEN709 POE Alkylether 13,3
    8 LS-106 Polyoxyalkylen- Alkylether 12,5
    9 LS-110 Polyoxyalkylen- Alkylether 13,4
    10 EMULGEN1108 POE Alkylether 13,4
    11 EMULGEN1118S-70 POE Alkylether 16,4
    12 EMULGEN1150S-60 POE Alkylether 18,5
  • Von diesen Tensiden wurde Nr. 1 (Tx-100) in den zwei Konzentrationen von 0,1% und 0,5% zu Reagens R2 zugefügt und untersucht. Die Tenside Nr. 2 bis 9 wurden in einer Konzentration von 0,5% zu Reagens R2 zugegeben, während die Nrn. 10 bis 12 in einer Konzentration von 0,1% zu Reagens R2 zugegeben wurden.
  • (Proben und Aktivitätsmessung)
  • Die Probentypen, die Messausrüstung, die Messparameter und die Berechnungen der Aktivitätswerte waren die gleichen wie in Beispiel 2. Die Werte für die Änderung der Absorption pro Minute (Sensitivität) (ΔmAbs / min) und die Aktivitätswerte der Lp-PLA2 (nmol / min / ml) unter Verwendung der jeweiligen Pufferlösung sind in den Tabellen 12 bis 15 gezeigt, zusammen mit den relativen Aktivitätswerten für jedes Tensid, wobei 100 als der Aktivitätswert der Lp-PLA2 unter Verwendung von Tx-100 angenommen wurde.
  • [Tabelle 12]
    • Einzelserum 16 (Tensidkonzentration in Reagens R2: 0,5%)
    Tensid ΔmAbs/ min Aktivitätswert (nmol/ min/ ml) Relative Aktivität (%)
    Tx-100 42,1 98,6 100
    BT-7 31,8 74,5 76
    BT-9 32,4 75,9 77
    BT-12 33,8 79,2 80
    BL-21 31,8 74,5 76
    EMULGEN108 20,6 48,3 49
    EMULGEN709 31,9 74,7 76
    LS-106 22,0 51,5 52
    LS-110 23,1 54,1 55
    [Tabelle 13]
    • Einzelserum 78 (Tensidkonzentration in Reagens R2: 0,5%)
    Tensid ΔmAbs/ min Aktivitätswert (nmol/ min/ ml) Relative Aktivität (%)
    Tx-100 19,2 45,0 100
    BT-7 14,1 33,0 73
    BT-9 15,0 35,1 78
    BT-12 15,2 35,6 79
    BL-21 14,4 33,7 75
    EMULGEN108 9,4 22,0 49
    EMULGEN709 14,3 33,5 74
    LS-106 10,5 24,6 55
    LS-110 10,5 24,6 55
    [Tabelle 14]
    • Einzelserum 16 (Tensidkonzentration in Reagens R2: 0,1%)
    Tensid ΔmAbs/ min Aktivitätswert (nmol/ min/ ml) Relative Aktivität (%)
    Tx-100 33,2 77,8 100
    EMULGEN1108 27,9 65,4 84
    EMULGEN1118S-70 33,8 79,2 102
    EMULGEN1150S-60 32,4 75,9 98
    [Tabelle 15]
    • Einzelserum 78 (Tensidkonzentration in Reagens R2: 0,1%)
    Tensid ΔmAbs/ min Aktivitätswert (nmol/ min/ ml) Relative Aktivität (%)
    Tx-100 12,4 29,0 100
    EMULGEN1108 10,5 24,6 85
    EMULGEN 1118S-70 13,4 31,4 108
    EMULGEN 1150S-60 13,3 31,2 107
  • Die Messergebnisse in den Tabellen 12 bis 15 zeigen, dass die Lp- PLA2- Aktivität unabhängig von dem verwendeten Tensid gemessen werden konnte. Bei Verwendung von Tx-100, EMULGEN 1118S-70 und EMULGEN 1150S-60 konnte die Aktivität der Lp-PLA2 mit größerer Sensibilität gemessen werden.
  • [Beispiel 8]
  • <Untersuchung der Tensidkonzentration in den Reagenzien zur Messung der Aktivität der Lp- PLA2>
  • Um die Wirkung der Tensidkonzentration in den Reagenzien zur Messung der Aktivität der Lp- PLA2 zu prüfen, wurde EMULGEN 1118S-70 als Tensid verwendet, und die Konzentrationen von EMULGEN 1118S-70 in den Reagenzien auf 0 und 0,2% eingestellt, und die Aktivität der Lp- PLA2 in den Proben wurde gemessen. Die Zusammensetzungen der Reagenzien sind nachstehend angegeben.
  • (Reagenzien der Erfindung)
  • <Reagens R1>
  • 50 mM Tris-HCl (pH 7.5)
    1 mM CaCl2
    4 U / ml ASOM
    0% bis 0,2% EMULGEN 1118S-70
    0,13 mg / ml rekombinante Lyso- PAF- PLD
    0,03% TODB
    4 U / ml Peroxidase
    5 U / ml rekombinante Cholinoxidase III
  • <Reagens R2>
  • 50 mM Tris-HCl (pH 7.5)
    1 mM CaCl2
    0,04% 4-AA
    0% bis 0,2% EMULGEN 1118S-70
    10 mM racemischer PAF (C16)
  • Die Probentypen, die Messausrüstung, die Messparameter und die Berechnungen der Aktivitätswerte waren die gleichen wie in Beispiel 2. Die Werte für die Änderung der Absorption pro Minute (Sensitivität) (ΔmAbs / min) und die Aktivitätswerte der Lp-PLA2 (nmol / min / ml) unter Verwendung der jeweiligen Pufferlösung sind in den Tabellen 16 bis 18 gezeigt
  • [Tabelle 16]
    • Einzelserum 16
    Konzentration (mM) ΔmAbs / min Aktivitätswert (nmol/ min/ ml)
    0 50,0 117,1
    0,05 51,0 119,5
    0,1 51,0 119,5
    0,2 47,3 110,8
    [Tabelle 17]
    • Einzelserum 78
    Konzentration (mM) ΔmAbs / min Aktivitätswert (nmol/ min/ ml)
    0 22,1 51,8
    0,05 22,4 52,5
    0,1 21,8 51,1
    0,2 20,3 47,6
    [Tabelle 18]
    • gepooltes Serum J042
    Konzentration (mM) ΔmAbs / min Aktivitätswert (nmol/ min/ ml)
    0 23,3 54,6
    0,05 24,1 56,5
    0,1 24,3 56,9
    0,2 21,9 51,3
  • Die Messergebnisse in den Tabellen 16 bis 18 zeigen, dass die Aktivität der Lp- PLA2 bei allen Tensidkonzentrationen gemessen werden konnte. Bei Verwendung einer Tensidkonzentration von 0,1% oder weniger konnte die Aktivität der Lp-PLA2 mit höherer Empfindlichkeit gemessen werden.
  • [Beispiel 9]
  • <Messung der Aktivität der Lp- PLA2 unter Verwendung von verschiedenen Substraten>
  • Die Aktivität der Lp- PLA2 in den Proben wurde unter Verwendung optisch aktiver Formen der synthetischen Substrate PAF(C16) und PAF(C18), eines racemischen PAF(C16), eines nativen PAF und dem PAF-Analogon 1-Palmitoyl- 2-acetyl- sn-glycero- 3-PC gemessen.
  • Die Zusammensetzungen der Reagenzien sind nachstehend angegeben.
  • (Reagenzien der Erfindung)
  • • Zusammensetzungen der Reagenzien unter Verwendung von anderen Substraten als racemischem PAF(C16)
  • <Reagens R1>
  • 50 mM Tris-HCl (pH 7.5)
    1 mM CaCl2
    4 U / ml ASOM
    0,05% EMULGEN 1150S-60
    0,13 mg / ml rekombinante Lyso- PAF- PLD
    0,03% TODB
    4 U / ml Peroxidase
    5 U / ml rekombinante Cholinoxidase III
  • <Reagens R2>
  • 50 mM Tris-HCl (pH 7.5)
    1 mM CaCl2
    0,04% 4-AA
    0,05% EMULGEN 1150S-60
    10 mM jeweiliges Substrat
  • • Zusammensetzungen der Reagenzien unter Verwendung von racemischem PAF(C16) als Substrat
  • <Reagens R1>
  • 50 mM Tris-HCl (pH 7.5)
    1 mM CaCl2
    4 U / ml ASOM
    0,05% EMULGEN 1150S-60
    0,13 mg / ml rekombinante Lyso- PAF- PLD
    0,03% TODB
    4 U / ml Peroxidase
    5 U / ml rekombinante Cholinoxidase III
  • <Reagens R2>
  • 50 mM Tris-HCl (pH 7.5)
    1 mM CaCl2
    0,04% 4-AA
    0,05% EMULGEN 1150S-60
    0,13 mg / ml rekombinante Lyso- PAF- PLD
    4 U / ml Peroxidase
    5 U / ml rekombinante Cholinoxidase III
    10 mM racemischer PAF(C16)
  • (Proben)
  • Gepooltes Serum J042, gepooltes Serum C, Einzelserum 16, gepooltes Heparin- Plasma, gepooltes Citrat- Plasma, rLp- PLA2 (0,017 mg / ml).
  • (Aktivitätsmessung)
  • Zur Messung der Aktivität wurde ein automatischer Analysator Hitachi 7080 verwendet. Die Messparameter sind unten aufgeführt.
  • (Messparameter für den automatischen Analysator 7080 von Hitachi)
  • Analysemethode Rate A
    Messwellenlänge (sub / dominant) 660 nm / 546 nm
    Reaktionszeit 10 Minuten
    Messpunkte 27 bis 30
    Probenvolumen 5 µl
    Volumen Reagens R1 150 µl
    Volumen Reagens R2 100 µl
  • 5 µl Probe wurden 5 Minuten lang bei 37 °C mit 150 µl Reagens R1 inkubiert (Messpunkte 1 bis 15), und anschließend wurden 100 µl Reagens R2 zugegeben, um die Reaktion zu starten (Messpunkt 16). Die Absorption von Wasser (Blindprobe) bei denselben Messpunkten wurde von der Absorption der Probe abgezogen, etwa 3,5 bis 4,5 Minuten nachdem die Reaktion durch Zugabe des Reagens R2 gestartet worden war (Messpunkte 27 bis 30), um die Änderung der Absorption pro Minute (ΔmAbs / min) zu berechnen, und der Aktivitätswert der Lp-PLA2 (nmol / min / ml) wurde gemäß der vorstehenden Formel berechnet. Die Werte für die Änderung der Absorption pro Minute (Sensitivität) (ΔmAbs / min) und die Aktivität der Lp-PLA2 (nmol / min / ml) sowie die relative Aktivität für jedes Substrat, wobei 100 als der Aktivitätswert der Lp-PLA2 für PAF(C16) angenommen wurde, sind in den Tabellen 19 bis 24 gezeigt. [Tabelle 19]
    • gepooltes Serum J042
    Substrat ΔmAbs/ min Aktivitätswert (nmol/ min/ ml) Relative Aktivität (%)
    PAF(C16) 28,8 40,8 100
    PAF(C18) 25,0 35,4 87
    Racemischer PAF(C16) 20,3 28,8 71
    Nativer PAF 28,3 40,1 98
    1-Palmitoyl-2-acetyl-sn-glycero-PC 31,9 45,2 111
    [Tabelle 20]
    • gepooltes Serum C
    Substrat ΔmAbs/ min Aktivitätswert (nmol/ min/ ml) Relative Aktivität (%)
    PAF(C16) 28,8 40,8 100
    PAF(C18) 25,1 35,6 87
    Racemischer PAF(C16) 20,2 28,6 70
    Nativer PAF 28,5 40,4 99
    1-Palmitoyl-2-acetyl-sn-glycero-PC 31,7 44,9 110
    [Tabelle 21]
    • Einzelserum 16
    Substrat ΔmAbs/ min Aktivitätswert (nmol/ min/ ml) Relative Aktivität (%)
    PAF(C16) 66,9 94,8 100
    PAF(C18) 56,0 79,3 84
    Racemischer PAF(C16) 47,7 67,6 71
    Nativer PAF 63,3 89,7 95
    1-Palmitoyl-2-acetyl-sn-glycero-PC 58,1 82,3 87
    [Tabelle 22]
    • gepooltes Heparin- Plasma
    Substrat ΔmAbs/ min Aktivitätswert (nmol/ min/ ml) Relative Aktivität (%)
    PAF(C16) 31,3 44,3 100
    PAF(C18) 27,3 38,7 87
    Racemischer PAF(C16) 22,2 31,5 71
    Nativer PAF 30,8 43,6 98
    1-Palmitoyl-2-acetyl-sn-glycero-PC 31,1 44,1 99
    [Tabelle 23]
    • gepooltes Citrat- Plasma
    Substrat ΔmAbs/ min Aktivitätswert (nmol/ min/ ml) Relative Aktivität (%)
    PAF(C16) 23,5 33,3 100
    PAF(C18) 19,6 27,8 83
    Racemischer PAF(C16) 15,9 22,5 68
    Nativer PAF 22,9 32,4 97
    1-Palmitoyl-2-acetyl-sn-glycero-PC 24,3 34,4 103
    [Tabelle 24]
    • rLp- PLA2 (0,017 mg /ml)
    Substrat ΔmAbs/ min Aktivitätswert (nmol/ min/ ml) Relative Aktivität (%)
    PAF(C16) 93,4 132,3 100
    PAF(C18) 52,3 74,1 56
    Racemischer PAF(C16) 65,7 93,1 70
    Nativer PAF 86,1 122,0 92
    1-Palmitoyl-2-acetyl-sn-glycero-PC 69,7 98,7 75
  • Die Messergebnisse in den Tabellen 19 bis 24 zeigen, dass die Aktivität der Lp- PLA2 unter Verwendung von allen Substraten gemessen werden konnte. Der Hauptbestandteil des nativen PAF ist C16, und die Aktivität der Lp- PLA2 konnte unter Verwendung der optisch aktiven Form von C16 als Sustrat mit höherer Empfindlichkeit gemessen werden.
  • [Beispiel 10]
  • Untersuchung der Trinder Reagenzien>
  • Arten von Trinder- Reagenzien wurden geprüft, um zu untersuchen, ob die Lp- PLA2-Aktivität unter Verwendung von anderen Kombinationen als TODB und 4-AA für das chromogene Reagens gemessen werden konnte. Es wurden zwei andere Arten von Trinder-Reagenzien als TODB verwendet: TOOS (Produkt Nr. OC13, Dojindo Laboratories) und DAOS (Produkt-Nr. OC06, Dojindo Laboratories). Zu Vergleichszwecken wurde auch eine Messung mit TODB durchgeführt.
  • Die Zusammensetzungen der Reagenzien sind nachstehend angegeben.
  • (Reagenzien der Erfindung)
  • <Reagens R1>
  • 50 mM Tris-HCl (pH 7.5)
    1 mM CaCl2
    4 U / ml ASOM
    0,1% Tx-100
    0,13 mg / ml rekombinante Lyso- PAF- PLD
    0,03% Trinder- Reagenz
    4 U / ml Peroxidase
    5 U / ml rekombinante Cholinoxidase III
  • <Reagens R2>
  • 50 mM Tris-HCl (pH 7.5)
    1 mM CaCl2
    0,04% 4-AA
    0,1% Tx-100
    0,13 mg / ml rekombinante Lyso- PAF- PLD
    4 U / ml Peroxidase
    5 U / ml rekombinante Cholinoxidase III
    10 mM racemische PAF (C16)
  • (Proben)
  • Einzelserum 16, Einzelserum 78, gepooltes Serum J042.
  • (Aktivitätsmessung)
  • Die Messparameter, die Messausrüstung und die Berechnungen der Aktivitätswerte waren alle die gleichen wie in Beispiel 9, außer, dass das Probenvolumen bei den Messungen unter Verwendung von TOOS und TODB 3 µl betrug. Bei den Messungen unter Verwendung von DAOS waren die Messparameter, die Messausrüstung und die Berechnungen der Aktivitätswerte waren alle die gleichen wie in Beispiel 9, außer, dass das Probenvolumen 3 µl betrug und die Messwellenlänge (sub / dominant) 700 nm / 600 nm betrug. Die Werte für die Änderung der Absorption pro Minute (Sensitivität) (ΔmAbs / min) und die Aktivität der Lp-PLA2 (nmol / min / ml) bei der Aktivitätsmessung unter Verwendung des jeweiligen Trinder- Reagens sind in der Tabelle 25 gezeigt.
  • [Tabelle 25]
    Probe DAOS TOOS TODB
    ΔmAbs/min nmol/min/ml ΔmAbs/min nmol/min/ml ΔmAbs/min nmol/min/ml
    Einzelserum Nr. 16 14,4 33,7 29,6 69,3 30,3 71,0
    Einzelserum Nr. 78 6,2 14,5 12,0 28,1 12,8 30,0
    gepooltes Serum J042 6,0 14,1 13,2 30,9 13,6 31,9
  • Die Messergebnisse zeigen, dass die Messung mit jeder Kombination möglich war. Unter Verwendung von TOOS und TODB waren die Werte für die Absorptionsänderung (Empfindlichkeit) etwa doppelt so hoch wie jene, die mit DAOS erhalten wurden, und die Proben konnten mit größerer Sensitivität gemessen werden.
  • [Beispiel 11]
  • <Reagens der Testzusammensetzung 1 (Formulierung des Reagens R2 mit Lyso- PAF-PLD)>
  • Um die Acyl- Lysophospholipide, von denen angenommen wird, dass sie in Konzentrationen von einigen Hundert µM im Serum enthalten sind, zu entfernen, wurden Enzyme, die PLA1-Aktivität aufweisen, zum Abbau der Acylgruppen an der ersten Position von Phospholipiden, und GPCP zum Hydrolysieren des resultierenden GPC, zusammen mit Cholinoxidase zu Reagens R1 zugefügt, und die Möglichkeit der Messung der Aktivität der Lp-PLA2 in Gegenwart des Reagens R2, welches Lyso- PAF- PLD enthielt, wurde untersucht. MGLPII (T-117, Asahi Kasei Pharma Corporation) und LYPL (T-32, Asahi Kasei Pharma Corporation) wurden als Enzyme verwendet, die PLA1-Aktivität aufweisen. Das in den Referenzbeispielen 7 bis 9 hergestellte GPCP wurde in dem Reagens R1 als das aus E. coli stammende GPCP verwendet. Die Zusammensetzungen der Reagenzien sind wie folgt.
  • (Reagenzien der Erfindung)
  • <Reagens R1 >
  • 50 mM Tris-HCl (pH 7.5)
    1 mM CaCl2
    4 U / ml ASOM
    0,1% Tx-100
    50 U / ml MGLPII oder 10 U / ml LYPL
    0,19 mg / ml rekombinante aus E. coli stammende GPCP
    0,03% TODB
    4 U / ml Peroxidase
    5 U / ml rekombinante Cholinoxidase III
  • <Reagens R2>
  • 50 mM Tris-HCl (pH 7.5)
    1 mM CaCl2
    0,13 mg / ml Lyso- PAF- PLD
    0,04% 4-AA
    0,1% Tx-100
    4 U / ml Peroxidase
    5 U / ml rekombinante Cholinoxidase III
    10 mM racemischer PAF (C16)
  • (Proben und Aktivitätsmessung)
  • Die Probentypen waren wie in Beispiel 10, und die Messausrüstung, die Messparameter und die Berechnungen der Aktivitätswerte waren wie in Beispiel 9. Die Messergebnisse sind in Tabelle 26 gezeigt.
  • [Tabelle 26]
    Probe MGLPII LYPL
    ΔmAbs/min nmol/min/ml ΔmAbs/min nmol/min/ml
    Einzelserum Nr. 16 30,7 71,9 25,3 59,3
    Einzelserum Nr. 78 13,9 32,6 12,2 28,6
    gepooltes Serum J042 14,6 34,2 12,7 29,8
  • Die Messergebnisse in Tabelle 26 und die Ergebnisse für TODB in Tabelle 25, wobei die Formulierung des Reagens R1 mit Lyso- PAF- PLD ist, zeigen, dass die Lp-PLA2-Aktivität auf gleiche Weise gemessen werden kann, wenn Lyso- PAF- PLD nur in dem Reagens R2 enthalten ist, wie wenn Lyso- PAF- PLD in Reagens R1 enthalten wäre, wenn MGLPII und GPCP zu Reagens zugegeben werden. Eine Messung war auch möglich, wenn LYPL und GPCP zu Reagens R1 zugegeben wurden.
  • [Beispiel 12]
  • <Reagens der Testzusammensetzung 2 (Formulierung von R2 mit Cholinoxidase)>
  • Wir untersuchten, ob die Aktivität der Lp-PLA2 ohne einen vorbereitenden Schritt zur Eliminierung (Entfernung) von Cholin aus der Probe, oder anders gesagt mit einem Reagens R2, das Cholinoxidase enthält, gemessen werden könnte. Die Zusammensetzungen der Reagenzien sind wie folgt.
  • (Reagenzien der Erfindung)
  • <Reagens R1>
  • 50 mM Tris-HCl (pH 7.5)
    1 mM CaCl2
    4 U / ml ASOM
    0,1% Tx-100
    0,13 mg / ml Lyso- PAF- PLD
    0,03% TODB
    4 U / ml Peroxidase
  • <Reagens R2>
  • 50 mM Tris-HCl (pH 7.5)
    1 mM CaCl2
    0,1% Tx-100
    0,04% 4-AA
    4 U / ml Peroxidase
    0,13 mg / ml Lyso- PAF- PLD
    5 U / ml rekombinante Cholinoxidase III
    10 mM racemischer PAF (C16)
  • (Proben und Aktivitätsmessung)
  • Die Probentypen waren wie in Beispiel 10, und die Messausrüstung, die Messparameter und die Berechnungen der Aktivitätswerte waren wie in Beispiel 9. Die Messergebnisse sind in Tabelle 27 gezeigt.
  • [Tabelle 27]
    Probe ΔmAbs/min nmol/min/ml
    Einzelserum Nr. 16 36,8 86,2
    Einzelserum Nr. 78 13,4 31,4
    gepooltes Serum J042 16,3 38,2
  • Die Messergebnisse in Tabelle 27 zeigen, dass die Lp-PLA2-Aktivität sogar gemessen werden konnte, wenn Cholinoxidase nur in dem Reagens R2 enthalten war. Die Messwerte waren jedoch höher bei den Ergebnissen mit TODB in Tabelle 25, bei denen Cholinoxidase in dem Reagens R1 und dem Reagens R2 enthalten war. Dies könnte auf die Wirkung von Rückständen an Cholin in der Probe zurückzuführen sein.
  • [Beispiel 13]
  • <Untersuchung des S/R- Verhältnisses bei der Messung von Lp- PLA2>
  • Die Aktivität der Lp- PLA2 wurde mit unterschiedlichen Probenvolumen gemessen, um das S/R- Verhältnis bei den erfindungsgemäßen Reagenzien zu untersuchen. Die Zusammensetzungen der Reagenzien sind nachstehend angegeben.
  • (Reagenzien der Erfindung)
  • <Reagens R1>
  • 50 mM Tris-HCl (pH 7,8)
    1 mM CaCl2
    3 U / ml ASOM
    0,1% Tx-100
    0,13 mg / ml rekombinante Lyso- PAF- PLD
    0,0225% TODB
    4 U / ml Peroxidase
    5 U / ml rekombinante Cholinoxidase III
  • <Reagens R2>
  • 50 mM PIPES (pH 7,0)
    1 mM CaCl2
    0,08% 4-AA
    0,1% Tx-100
    0,26 mg / ml rekombinante Lyso- PAF- PLD
    4 U / ml Peroxidase
    5 U / ml rekombinante Cholinoxidase III
    20 mM racemischer PAF (C16)
  • (Proben)
  • Gepooltes Serum J042.
  • (Aktivitätsmessung)
  • Zur Messung der Aktivität wurde ein automatischer Analysator Hitachi 7080 verwendet. Die Messparameter sind unten aufgeführt.
  • (Messparameter für den automatischen Analysator 7080 von Hitachi)
  • Analysemethode Rate A
    Messwellenlänge (sub / dominant) 660 nm / 546 nm
    Reaktionszeit 10 Minuten
    Messpunkte 27 bis 30
    Probenvolumen 2, 4, 6 µl
    Volumen Reagens R1 160 µl
    Volumen Reagens R2 40 µl
  • Jede Probe wurde mit 160 µl Reagens R1 gemischt und 5 Minuten lang bei 37 °C inkubiert, (Messpunkte 1 bis 15), daran anschließend wurden 40 µl des Reagens R2 zugegeben, um die Reaktion zu starten (Messpunkt 16). Die Absorption von Wasser (Blindprobe) bei denselben Messpunkten wurde von der Absorption der Probe abgezogen, etwa 3,5 bis 4,5 Minuten nachdem die Reaktion durch Zugabe des Reagens R2 gestartet worden war (Messpunkte 27 bis 30), um die Änderung der Absorption pro Minute (ΔmAbs / min) zu berechnen, und der Aktivitätswert der Lp-PLA2 (nmol / min / ml) wurde gemäß der vorstehenden Formel berechnet. Die Werte für die Änderung der Absorption pro Minute (Sensitivität) (ΔmAbs / min) und die Aktivitätswerte der Lp-PLA2 (nmol / min / ml) sind in Tabelle 28 gezeigt.
  • [Tabelle 28]
    Probenvolumen ΔmAbs / min nmol/ min/ ml
    2 µL 10,0 28,1
    4 µL 21,2 30,0
    6 µL 34,8 33,2
  • Die Messung war mit einem Probenvolumen von 2 µl (S : R = 1 : 100), einem Probenvolumen von 4 µl (S : R = 1 : 50) oder einem Probenvolumen von 6 µl (S : R = 1 : 33) möglich.
  • [Beispiel 14]
  • <Lp-PLA2-Spitze (Lp-PLA2-Spike) und Test der Rückgewinnung in Serum>
  • Unter Verwendung von Serumproben, die eine Lp- PLA2- Aktivität zeigten, und einer Serumprobe, die keine Lp- PLA2- Aktivität zeigte, wurde die Aktivität gemessen, wobei jeder Probe 0 bis 33,2 µg/ml rLp- PLA2 zugesetzt wurde, und es wurde die Rückgewinnungsrate bestimmt. Die Zusammensetzungen der Reagenzien sind wie in Beispiel 13.
  • (Proben)
  • Für die Proben wurden jeweils 0, 3,3, 6,6, 13,3, 16,6 und 33,2 µg/ml rLp- PLA2 zu 4 Arten von Pools, d.h. dem gepoolten Serum J042 und zu den gepoolten Seren A, B und C, zugegeben. Das gepoolte Serum A ist eine Serumprobe, die keine Lp- PLA2- Aktivität zeigt.
  • (Aktivitätsmessung)
  • Das Probenvolumen betrug 4 µl, und die Messausrüstung, die vom Probenvolumen verschiedenen Messparameter, und die Berechnungen der Aktivitätswerte waren wie in Beispiel 13. Die Rückgewinnungsrate wurde mit der folgenden Formel berechnet. Rückgewinnungsrate ( % ) = { ( Activitätswert des Serum mit zugesetzter rLP − PLA 2 ) − ( Activitätswert des Serums allein ) } / ( Activitätswert des gepoolten Serums A ( Serum , das keine Lp-PLA 2 − Activität zeigt ) mit hizugefügtem rLP − PLA 2 ) × 100 = ( Activitätswert der zugefügten rLP − PLA 2 ) / ( Activitätswert der zu gepooltem Serum A zugefügten rLP − PLA 2 ) × 100
    Figure DE112017003142T5_0021
  • Die Absorptionsänderung pro Minute bei jeder Probe (ΔmAbs / min); der Aktivitätswert bei jeder Konzentration nach Zugabe von rLp-PLA2 (nmol / min / ml); der Aktivitätswert der zugefügten rLp- PLA2 (nmol / min / ml) ); und die Rückgewinnungsrate (%) sind in den Tabellen 29 bis 31 gezeigt. Die 4 bis 7 zeigen die Konzentration der zugefügten rLp-PLA2 (µg/ml), aufgetragen auf der x-Achse, und die Absorptionsänderung pro Minute auf der y-Achse.
  • [Tabelle 29]
    • Gepooltes Serum J042
    Zugefügte Konzentration an rLp- PLA2 (µg / ml) Absorptionsänderung (ΔmAbs/min) Aktivitätswert mit dem Serum zugefügter rLp-PLA2 (nmol/min/ml) Aktivitätswert der zugefügten rLp- PLA2 (nmol/min/ml) Rückgewinnungsrate (%)
    0 20,0 28,3
    3,3 29,9 42,4 14,0 96,1
    6,6 40,0 56,7 28,3 94,3
    13,2 61,7 87,4 59,1 101,0
    16,6 76,2 108,0 79,6 110,6
    33,2 123,8 175,4 147,1 101,3
    [Table 30]
    • Gepooltes Serum B
    Zugefügte Konzentration an rLp- PLA2 (µg/ml) Absorptionsänderung (ΔmAbs/min) Aktivitätswert mit dem Serum zugefügter rLp-PLA2 (nmol/min/ml) Aktivitätswert der zugefügten rLp- PLA2 (nmol/min/ml) Rückgewinnungsrate (%)
    0 20,3 28,8
    3,3 29,7 42,1 13,3 91,3
    6,6 42,1 59,6 30,9 102,8
    13,2 61,3 86,8 58,1 99,3
    16,6 72,4 102,6 73,8 102,6
    33,2 123,9 175,5 146,8 101,1
    [Table 31]
    • Gepooltes Serum C
    Zugefügte Konzentration an rLp- PLA2 (µg/ml) Absorptionsänderung (ΔmAbs/min) Aktivitätswert mit dem Serum zugefügter rLp-PLA2 (nmol/min/ml) Aktivitätswert der zugefügten rLp- PLA2 (nmol/min/ml) Rückgewinnungsrate (%)
    0 19,8 28,1
    3,3 29,6 41,9 13,9 95,1
    6,6 40,0 56,7 28,6 95,3
    13,2 60,5 85,7 57,7 98,5
    16,6 72,4 102,6 74,5 103,5
    33,2 123,4 174,8 146,8 101,1
  • Die Messergebnisse in den 4 bis 7 zeigen, dass die Absorptionsänderungen von der Konzentration an rLp- PLA2 abhängig sind, und die Tabellen 29 bis 31 zeigen eine Rückgewinnung von ungefähr 100 % ± 10%.
  • [Beispiel 15]
  • <Vergleich zwischen den Messwerten mit dem PAF Acetylhydrolase Assay Kit der Firma Cayman Chemical Company und mit den erfindungsgemäßen Reagenzien>
  • Die Aktivität der Lp- PLA2 wurde unter Verwendung der erfindungsgemäßen Reagenzien und eines PAF- Acetylhydrolase Assay- Kits der Firma Cayman Chemical Company gemessen. Die Aktivitätsmessung mit dem Reagens von Cayman Co. wurde gemäß der Gebrauchsanweisung in der Packung durchgeführt, und die Aktivitätswerte wurden ebenfalls gemäß der Gebrauchsanweisung in der Packung berechnet. Die Zusammensetzungen der Reagenzien sind wie folgt.
  • (Reagenzien der Erfindung)
  • <Reagens R1>
  • 50 mM Tris-HCl (pH 7,5)
    1 mM CaCl2
    4 U / ml ASOM
    0,1% Tx-100
    0,26 mg / ml rekombinante Lyso- PAF- PLD
    0,03% TODB
    4 U / ml Peroxidase
    5 U / ml rekombinante Cholinoxidase
  • <Reagens R2>
  • 50 mM Tris-HCl (pH 7,5)
    1 mM CaCl2
    0,04% 4-AA
    0,1% Tx-100
    10 mM PAF (C16)
  • (Proben)
  • Einzelseren Nrn. 1 bis 32.
  • (Aktivitätsmessung)
  • Ein SpectraMax M3 (Molecular Devices, LLC.) Mikroplatten- Leser wurde zur Messung der Aktivität mit den Reagenzien von Cayman Co. verwendet. Ein automatischer Analysator Hitachi 7600-010S wurde verwendet, um die Aktivität nach dem erfindungsgemäßen Verfahren zu messen. Die Messparameter sind unten aufgeführt.
    Analysemethode Rate A
    Messwellenlänge (sub / dominant) 660 nm / 546 nm
    Reaktionszeit 10 Minuten
    Messpunkte 25 bis 28
    Probenvolumen 3 µl
    Volumen Reagens R1 150 µl
    Volumen Reagens R2 100 µl
  • 3 µl Probe wurden mit 150 µl Reagens R1 gemischt und 5 Minuten lang bei 37 °C inkubiert (Messpunkte 1 bis 16), daran anschließend wurden 100 µl des Reagens R2 zugegeben, um die Reaktion zu starten (Messpunkt 17). Die Absorption von Wasser (Blindprobe) bei denselben Messpunkten wurde von der Absorption der Probe abgezogen, etwa 2 bis 3 Minuten nachdem die Reaktion durch Zugabe des Reagens R2 gestartet worden war (Messpunkte 25 bis 28), um die Änderung der Absorption pro Minute (ΔmAbs / min) zu berechnen, und der Aktivitätswert der Lp-PLA2 (nmol / min / ml) wurde gemäß der vorstehenden Formel berechnet. Die Lp- PLA2- Aktivitätswerte (nmol / min / ml) für das erfindungsgemäße Verfahren und die Reagenzien von Cayman Co. sind in Tabelle 32 gezeigt (Chylus (Darmlymphe) Proben sind mit + gekennzeichnet, und der Grad der milchigen Chylus- Trübung (chyle degree) ist durch die Anzahl der „+“- Zeichen angegeben). Die mit den Reagenzien von Cayman Co. erhaltenen Aktivitätswerte (x-Achse (nmol / min / ml)) und die gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Aktivitätswerte (y-Achse (nmol / min / ml)) werden in 8 verglichen.
  • [Tabelle 32]
    Probe Chylus Cayman Reagenzien (nmol/min/ml) erfindungsgemäße Reagenzien (nmol/min/ml)
    Einzelserum Nr. 1 ++ 28,7 43,2
    Einzelserum Nr. 2 + 27,6 42,2
    Einzelserum Nr. 3 + 20,5 54,0
    Einzelserum Nr. 4 + 24,4 61,7
    Einzelserum Nr. 5 + 21,5 48,4
    Einzelserum Nr. 6 + 18,2 42,8
    Einzelserum Nr. 7 + 11,4 24,3
    Einzelserum Nr. 8 + 20,0 50,6
    Einzelserum Nr. 9 + 25,3 65,0
    Einzelserum Nr. 10 + 23,2 57,0
    Einzelserum Nr. 11 + 20,7 55,9
    Einzelserum Nr. 12 19,6 49,1
    Einzelserum Nr. 13 + 25,2 73,4
    Einzelserum Nr. 14 + 17,0 46,3
    Einzelserum Nr. 15 + 18,9 47,8
    Einzelserum Nr. 16 ++ 36,8 99,0
    Einzelserum Nr. 17 +++ 13,2 52,5
    Einzelserum Nr. 18 + 21,2 52,7
    Einzelserum Nr. 19 + 19,6 28,6
    Einzelserum Nr. 20 19,0 46,7
    Einzelserum Nr. 21 + 15,0 36,1
    Einzelserum Nr. 22 + 27,6 68,6
    Einzelserum Nr. 23 + 27,5 63,9
    Einzelserum Nr. 24 20,7 55,1
    Einzelserum Nr. 25 24,3 59,2
    Einzelserum Nr. 26 + 27,8 77,4
    Einzelserum Nr. 27 + 25,5 64,3
    Einzelserum Nr. 28 + 34,5 84,5
    Einzelserum Nr. 29 + 16,6 40,2
    Einzelserum Nr. 30 + 14,3 31,4
    Einzelserum Nr. 31 20,2 43,0
    Einzelserum Nr. 32 + 23,5 45,0
  • Basierend auf diesen Messergebnissen kann die Korrelation zwischen den Messwerten (nmol/min/ml), die bei diesen Proben mit den Reagenzien von Cayman Co. und den erfindungsgemäßen Reagenzien gemessen wurden, als eine Korrelationsgleichung dargestellt werden: y = 2,254x + 3,4656, Korrelationskoeffizient r = 0,805 (8).
  • Dieses Beispiel zeigt, dass die Aktivität der Lp-PLA2 in einem Einzelserum mit den erfindungsgemäßen Reagenzien und Reagenzien von Cayman Co. gemessen werden kann, wobei die Korrelation zwischen den erfindungsgemäßen Reagenzien und den Reagenzien von Cayman Co. r = 0,805 beträgt. Da die erfindungsgemäßen Reagenzien mit einem automatischen Allzweckanalysator verwendet werden, scheinen sie als diagnostische Mittel praktischer zu sein als die Reagenzien von Cayman Co., die mit 96-Well Platten verwendet werden.
  • Da die Aktivitätswerte unterschiedlich definiert sind, unterscheiden sich die gemessenen Aktivitätswerte zwischen den Reagenzien von Cayman Co. und den erfindungsgemäßen Reagenzien, und die Steigung der Korrelationsgleichung ist nicht 1, aber es wird angenommen, dass sich die Steigung der Korrelationsgleichung 1 annähern würde, wenn die Definitionen der Aktivitätswerte und Kalibratorwerte identisch wären.
  • [Beispiel 16]
  • <Vergleich zwischen den Messwerten, die durch Messen von Proben mit dem Human-PLA2G7/PAF-AH/Lp-PLA2 Quantikine-ELISA Kit von R & D Systems und den erfindungsgemäßen Reagenzien erhalten wurden>
  • Die Substanzmenge an Lp- PLA2 wurde unter Verwendung eines Human-PLA2G7/PAF-AH/Lp-PLA2 Quantikine-ELISA Kits von R & D Systems gemäß der Gebrauchsanweisung in der Packung untersucht.
  • (Aktivitätsmessung)
  • Ein SpectraMax M3 (Molecular Device Japan) Mikroplatten- Leser wurde zur Messung mit Assay- Kit von R & D Systems verwendet. Die in Beispiel 15 mit den erfindungsgemäßen Reagenzien gemessenen Lp- PLA2- Aktivitätswerte (nmol/min/ml) und die Mengen an Lp-PLA2 (ng / ml), die mit dem Kit von R & D Systems gemessen wurden, sind in Tabelle 33 gezeigt. 9 zeigt einen Vergleich zwischen den Werten, die mit dem Assay- Kit von R & D Systems erhalten wurden (x- Achse (ng / ml)), und den Aktivitätswerten, die mit den erfindungsgemäßen Reagenzien erhalten wurden (y-Achse (nmol/min/ml)).
  • [Tabelle 33]
    Probe Chylus R & D Systems Kit (ng / /ml) erfindungsgemäße Reagenzien (nmol/min/ml)
    Einzelserum Nr. 1 ++ 137,3 43,2
    Einzelserum Nr. 2 + 129,7 42,2
    Einzelserum Nr. 3 + 140,6 54,0
    Einzelserum Nr. 4 + 157,0 61,7
    Einzelserum Nr. 5 + 116,9 48,4
    Einzelserum Nr. 6 + 115,2 42,8
    Einzelserum Nr. 7 + 63,8 24,3
    Einzelserum Nr. 8 + 132,2 50,6
    Einzelserum Nr. 9 + 150,1 65,0
    Einzelserum Nr. 10 + 134,7 57,0
    Einzelserum Nr. 11 + 138,7 55,9
    Einzelserum Nr. 12 91,0 49,1
    Einzelserum Nr. 13 + 174,0 73,4
    Einzelserum Nr. 14 + 86,8 46,3
    Einzelserum Nr. 15 + 120,6 47,8
    Einzelserum Nr. 16 ++ 249,4 99,0
    Einzelserum Nr. 17 +++ 119,5 52,5
    Einzelserum Nr. 18 + 111,7 52,7
    Einzelserum Nr. 19 + 118,6 28,6
    Einzelserum Nr. 20 99,8 46,7
    Einzelserum Nr. 21 + 12,0 36,1
    Einzelserum Nr. 22 + 141,1 68,6
    Einzelserum Nr. 23 + 139,8 63,9
    Einzelserum Nr. 24 121,9 55,1
    Einzelserum Nr. 25 128,0 59,2
    Einzelserum Nr. 26 + 133,2 77,4
    Einzelserum Nr. 27 + 71,8 64,3
    Einzelserum Nr. 28 + 183,6 84,5
    Einzelserum Nr. 29 + 73,7 40,2
    Einzelserum Nr. 30 + 67,8 31,4
    Einzelserum Nr. 31 75,4 43,0
    Einzelserum Nr. 32 + 87,0 45,0
  • Basierend auf diesen Messergebnissen kann die Korrelation zwischen den Messwerten (ng / ml), die mit dem Human PLA2G7/PAF-AH/Lp-PLA2 Quantikine ELISA Kit von R&D Systems erhalten wurden, und die Messwerte (nmol/ min/ ml), die mit den erfindungsgemäßen Reagenzien erhalten wurden, als eine Korrelationsgleichung dargestellt werden: y = 0,2917x + 18,582, Korrelationskoeffizient r = 0,800 (9).
  • Dieses Beispiel zeigt, dass ein Einzelserum mit dem erfindungsgemäßen Reagens gemessen werden kann, wobei die Korrelation mit den Messwerten, die mit einem Human PLA2G7/PAF-AH/Lp-PLA2 Quantikine ELISA Kit von R&D Systems erhalten wurden, r = 0,800 beträgt. Die Messwerte, die mit dem Human PLA2G7/PAF-AH/Lp-PLA2 Quantikine ELISA Kit von R&D Systems erhalten wurden, sind Mengen von Lp- PLA2, und unterscheiden sich somit von den Messwerten, die mit den erfindungsgemäßen Reagenzien erhalten wurden, da es keine Aktivitätswerte sind.
  • [Beispiel 17]
  • <Messung der Werte der Absorptionsänderung und der Lp- PLA2- Aktivitätswerte der erfindungsgemäßen Reagenzien>
  • Die Werte der Absorptionsänderung pro Minute (Empfindlichkeit, ΔmAbs / min) und der Lp-PLA2- Aktivitätswerte (nmol/ min/ ml) der erfindungsgemäßen Reagenzien wurden gemessen.
  • Zu Vergleichszwecken wurde die Aktivität der Lp- PLA2 auch unter Verwendung des diaDexus PLAC- Tests für Lp- PLA2- Aktivität (PLAC- Test) und des Diasys Lp- PLA2 FS von Diasys Co. (Lp-PLA2 FS) gemessen. Die Messwellenlängen bei dem PLAC- Test und dem Lp- PLA2 FS waren 415 nm. Die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Zusammensetzungen der Reagenzien waren wie folgt.
  • (Reagenzien der Erfindung)
  • (Reagenzien der Erfindung)
  • <Reagens R1 >
  • 50 mM Tris-HCl (pH 7,5)
    1 mM CaCl2
    4 U / ml ASOM
    0,05% EMULGEN 1150S-60
    0,13 mg/ ml rekombinante Lyso- PAF- PLD
    25 µM Kaliumferrocyanid
    0,05% ProClin 300
    0,03% TODB
    4 U / ml Peroxidase
    5 U / ml rekombinante Cholinoxidase III
  • <Reagens R2>
  • 50 mM Tris-HCl (pH 7,5)
    1 mM CaCl2
    0,05% EMULGEN 1150S-60
    0,13 mg/ ml rekombinante Lyso- PAF- PLD
    0,05% ProClin 300
    4 U / ml Peroxidase
    5 U / ml rekombinante Cholinoxidase III
    0,04% 4-AA
    10 mM racemischer PAF (C16)
  • (Proben)
  • Wasser, 5 PLAC- Test Kalibratoren (0 nmol/ min/ ml (Kalib 1), 50 nmol/ min/ ml (Kalib 2), 100 nmol/ min/ ml (Kalib 3), 250 nmol/ min/ ml (Kalib 4) und 400 nmol/ min/ ml (Kalib 5)), separat verkaufter Lp- PLA2 FS Kalibrator (TruCal Lipid, 447 U / l) .
  • (Aktivitätsmessung)
  • Zur Messung der Aktivität wurde ein automatischer Analysator Hitachi 7600-010S verwendet. Die Messparameter für jedes Reagens waren wie folgt.
  • (Messparameter für den automatischen Analysator 7600-01 0S von Hitachi)
  • (Parameter für die Messung der Aktivität mit den erfindungsgemäßen Reagenzien)
  • Analysemethode Rate A
    Messwellenlänge (sub / dominant) 660 nm / 546 nm
    Reaktionszeit 10 Minuten
    Messpunkte 29 bis 32
    Probenvolumen 5 µl
    Volumen Reagens R1 150 µl
    Volumen Reagens R2 50 µl
  • Um die Aktivität mit den erfindungsgemäßen Reagenzien zu messen, wurden 5 µl der Probe mit 150 µl Reagens R1 gemischt und 5 Minuten lang bei 37 °C (Messpunkte 1 bis 16) inkubiert, daran anschließend wurden 50 [100] µl des Reagens R2 zugegeben, um eine Reaktion zu starten (Messpunkt 17). Die Absorption von Wasser (Blindprobe) bei denselben Messpunkten wurde von der Absorption der Probe abgezogen, etwa 3,5 bis 4,5 Minuten nachdem die Reaktion durch Zugabe des Reagens R2 gestartet worden war (Messpunkte 29 bis 32), um die Änderung der Absorption pro Minute (ΔmAbs / min) zu berechnen, und der Aktivitätswert der Lp-PLA2 (nmol/ min/ ml) wurde gemäß der vorstehenden Formel berechnet.
  • (Parameter für die Messung mit dem PLAC- Test)
  • Analysemethode Rate A
    Messwellenlänge (sub / dominant) 505 nm / 415 nm
    Reaktionszeit 10 Minuten
    Messpunkte 19 bis 22
    Probenvolumen 30 µl
    Volumen Reagens R1 120 µl
    Volumen Reagens R2 30 µl
  • Um die Aktivität mit dem PLAC- Test zu messen, wurden 30 µl der Probe mit 120 µl Reagens R1 gemischt und 5 Minuten lang bei 37 °C inkubiert (Messpunkte 1 bis 16), daran anschließend wurden 30 µl des Reagens R2 zugegeben, um eine Reaktion zu starten (Messpunkt 17). Die Absorption von Wasser (Blindprobe) bei denselben Messpunkten wurde von der Absorption der Probe abgezogen, etwa 0,5 bis 2 Minuten nachdem die Reaktion durch Zugabe des Reagens R2 gestartet worden war (Messpunkte19 bis 22), um die Änderung der Absorption pro Minute (ΔmAbs / min) zu berechnen. Die Aktivitätswerte der Lp-PLA2 (nmol/ min/ ml) wurden gemäß der folgenden Formel berechnet, die dadurch abgeleitet wurde, indem die Werte für die Änderung der Absorption pro Minute von den 5 PLAC- Test Kalibratoren auf der x-Achse und die Aktivitätswerte auf der y-Achse aufgetragen wurden. y = 0,0013 x 2 + 0,5292 x-0 ,3213
    Figure DE112017003142T5_0022
  • (Parameter für die Messung mit Lp- PLA2 FS)
  • Analysemethode Rate A
    Messwellenlänge (sub / dominant) 505 nm / 415 nm
    Reaktionszeit 10 Minuten
    Messpunkte 22 bis 30
    Probenvolumen 2 µl
    Volumen Reagens R1 200 µl
    Volumen Reagens R2 50 µl
  • Um die Aktivität mit Lp- PLA2 FS zu messen, wurden 2 µl der Probe mit 200 µl Reagens R1 gemischt und 5 Minuten lang bei 37 °C inkubiert (Messpunkte 1 bis 16), daran anschließend wurden 50 µl des Reagens R2 zugegeben, um eine Reaktion zu starten (Messpunkt 17). Die Absorption von Wasser (Blindprobe) bei denselben Messpunkten wurde von der Absorption der Probe abgezogen, etwa 2 bis 4 Minuten nachdem die Reaktion durch Zugabe des Reagens R2 gestartet worden war (Messpunkte 22 bis 30), um die Änderung der Absorption pro Minute (ΔmAbs / min) zu berechnen. Die Aktivitätswerte der Lp-PLA2 (U / l) wurden nach der folgenden Formel gemäß der Lp- PLA2 FS Gebrauchsanweisung in der Packung berechnet. Activitätswert der Lp − PLA 2 ( U / l ) = { ( Δ Abs / min . Probe ) / Δ Abs / min . Kal . ) } × Konz . Kal .  ( U / l )   = { ( Änderung der Absorption der Probe pro Minute ) / ( Änderung der Absorption des Kalibrators pro Minute ) } × Konzentration des Kalibrators ( 447  U / l )
    Figure DE112017003142T5_0023
  • Die Werte für die Änderung der Absorption pro Minute (ΔmAbs / min) und die Aktivitätswerte (nmol/ min/ ml und U/ l) bei jeder Probe sind in den Tabellen 34 bis 36 gezeigt.
  • [Tabelle 34]
    • erfindungsgemäße Reagenzien
    Probe ΔmAbs/min nmol/ min/ ml
    PLAC- Test Kalib 1 0,7 1,0
    PLAC- Test Kalib 2 3,0 4,3
    PLAC- Test Kalib 3 6,2 8,8
    PLAC- Test Kalib 4 15,8 22,4
    PLAC- Test Kalib 5 26,3 37,3
    TruCal Lipid 83,1 118
    [Tabelle 35]
    • PLAC- Test
    Probe ΔmAbs/min nmol/ min/ ml
    PLAC- Test Kalib 1 6,3 0(vorgegebener Wert)
    PLAC- Test Kalib 2 75,2 50(vorgegebener Wert)
    PLAC- Test Kalib 3 136,9 100(vorgegebener Wert)
    PLAC- Test Kalib 4 284,4 250(vorgegebener Wert)
    PLAC- Test Kalib 5 384,6 400(vorgegebener Wert)
    TruCal Lipid 183,0 140
    [Tabelle 36]
    • Lp- PLA2 FS
    Probe ΔmAbs/min nmol/ min/ ml
    PLAC- Test Kalib 1 0,7 8,5
    PLAC- Test Kalib 2 5,3 64,0
    PLAC- Test Kalib 3 9,8 118
    PLAC- Test Kalib 4 23,0 278
    PLAC- Test Kalib 5 36,5 441
    TruCal Lipid 37,0 447(vorgegebener Wert)
  • Dieses Beispiel zeigt, dass die Kalibratoren 1 bis 5 des PLAC- Tests und der Lp- PLA2 FS Kalibrator (TruCal Lipid) mit den erfindungsgemäßen Reagenzien gemessen werden konnten.
  • [Beispiel 18]
  • <Vergleich der Reproduzierbarkeit zwischen den erfindungsgemäßen Reagenzien, dem PLAC- Test und Lp-PLA2 FS innerhalb eines Laufs>
  • Um die Reproduzierbarkeit zwischen den erfindungsgemäßen Reagenzien, dem PLAC- Test und Lp-PLA2 FS innerhalb eines Laufs zu vergleichen, wurden die Aktivität der Lp- PLA2 mit n = 5 gemessen. Die Zusammensetzungen der Reagenzien waren die gleichen wie in Beispiel 17.
  • (Proben)
  • PLAC- Test CONTROL LOW (Durchschnitt: 118,8 nmol / min / ml) (im Folgenden als PLAC CONT-L bezeichnet) und CONTROL HIGH (Durchschnitt: 298,3 nmol / min / ml) (im Folgenden als PLAC CONT-H bezeichnet), gepooltes Serum J042, Consera ( Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.).
  • (Aktivitätsmessung)
  • Die Ausrüstung für die Messung der Aktivität, die Messparameter und die Berechnungen der Aktivitätswerte waren die gleichen wie in Beispiel 17.
  • Die Werte für die Änderung der Absorption pro Minute (Sensitivität) (ΔmAbs / min), die Durchschnittswerte (AVE), die Standardabweichungen (SD), die Variationskoeffizienten (CV%) und die Aktivitätswerte (nmol/ min/ ml und U/ l) unter Verwendung der verschiedenen Reagenzien sind in den Tabellen 37 bis 42 gezeigt. Die 10 bis 12 zeigen Zeitverläufe der Reaktion, die erhalten wurden, indem die Absorption bei jedem Messpunkt während der 10-minütigen Reaktionszeit aufgetragen wurde, wobei das gepoolte Serum J042 als Probe verwendet wurde.
  • [Tabelle 37]
    • erfindungsgemäße Reagenzien
    Probe ΔmAbs / min
    n= 1 n= 2 n= 3 n= 4 n= 5
    PLAC CONT-L 7,4 7,4 7,3 7,1 7,4
    PLAC CONT-H 19,1 19,2 18,7 19,4 19,0
    Gepooltes Serum J042 23,8 24,8 24,7 24,5 24,6
    Consera 19,5 19,8 20,0 20,2 19,8
    [Tabelle 38]
    • erfindungsgemäße Reagenzien
    Probe SD AVE CV% nmol/ min/ ml
    PLAC CONT-L 0,1 7,3 1,8 10,4
    PLAC CONT-H 0,3 19,1 1,4 27,0
    Gepooltes Serum J042 0,4 24,5 1,6 34,7
    Consera 0,3 19,9 1,3 28,1
    [Tabelle 39]
    • PLAC- Test
    Probe ΔmAbs / min
    n= 1 n= 2 n= 3 n= 4 n= 5
    PLAC CONT-L 152,4 151,9 151,8 153,1 152,8
    PLAC CONT-H 325,5 323,1 321,8 323,5 321,9
    Gepooltes Serum J042 189,7 186,5 188,1 189,8 191,9
    Consera 174,8 176,2 175,4 177,0 177,0
    [Tabelle 40]
    • PLAC- Test
    Probe SD AVE CV% nmol/ min/ ml
    PLAC CONT-L 0,6 152,4 0,4 110,5
    PLAC CONT-H 1,5 323,2 0,5 306,5
    Gepooltes Serum J042 2,0 189,2 1,1 146,3
    Consera 1,0 176,1 0,6 133,2
    [Tabelle 41]
    • Lp- PLA2 FS
    Probe ΔmAbs / min
    n= 1 n= 2 n= 3 n= 4 n= 5
    PLAC CONT-L 10,6 10,2 11,2 10,5 11,4
    PLAC CONT-H 26,7 26,5 27,2 26,8 26,6
    Gepooltes Serum J042 32,3 32,3 32,5 32,5 32,5
    Consera 26,5 26,5 26,4 26,7 26,6
    [Tabelle 42]
    • Lp- PLA2 FS
    Probe SD AVE CV% U/l
    PLAC CONT-L 0,5 10,8 4,7 130,2
    PLAC CONT-H 0,3 26,8 1,0 323,3
    Gepooltes Serum J042 0,1 32,4 0,3 391,7
    Consera 0,1 26,5 0,4 320,6
  • Die Messergebnisse zeigen, dass der CV% der Messwerte bei den erfindungsgemäßen Reagenzien innerhalb von ± 2,0 war. Beim PLAC- Test war der CV% der Messwerte bei etwa ± 1,0. Mit Lp- PLA2 FS betrug der CV% im Fall von PLAC CONT-L 4,7, was höher war als bei den anderen Proben, aber der CV% der anderen Proben war innerhalb von ± 1,0.
  • Dieses Beispiel zeigt, dass Kontrollserum des PLAC- Tests, ein erworbenes gepooltes Serum und ein kommerzielles kontrolliertes Serum (Consera) mit den erfindungsgemäßen Reagenzien mit einem CV(%) gemessen werden konnte, der äquivalent ist zu dem, der mit dem PLAC- Test und Lp- PLA2 FS erhalten wurde.
  • [Beispiel 19]
  • <Vergleich der Auswirkungen von koexistierenden Substanzen auf die erfindungsgemäßen Reagenzien, den PLAC- Test und Lp-PLA2 FS>
  • Proben wurden hergestellt, wobei Interference Check A Plus (Sysmex Corporation), Intralipos Infusion 10% (Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) oder Ascorbinsäure mit hinzugefügt wurden, und die Auswirkungen von koexistierenden Substanzen untersucht. Die Zusammensetzungen der Reagenzien waren die gleichen wie in Beispiel 17.
  • (Proben)
  • Bilirubin-C (Bil-C) (209 mg/ dl), Bilirubin-F (Bil-F) (201 mg/ dl), hämolytisches Hämoglobin (Hb) (5200 mg/ dl) und Chylus (14800 FTU) (alle in Interference Check A Plus enthalten); Intralipos-Infusion 10%; 0,5 g/ dl Ascorbinsäure; und Wasser (insgesamt 7) wurden in einem Verhältnis von 1 : 9 mit gepooltem Serum J042 gemischt (in diesem Beispiel 40 µl der 7 Substanzen + 360 µl gepooltes Serum J042).
  • (Aktivitätsmessung)
  • Die Ausrüstung für die Messung der Aktivität, die Messparameter und die Berechnungen der Aktivitätswerte waren die gleichen wie in Beispiel 17.
  • Die Werte für die Änderung der Absorption pro Minute (ΔmAbs / min) und die Aktivitätswerte (nmol/ min/ ml und U/ l) für jede Art von Reagens sind in den Tabellen 43 bis 45 angegeben. Der Messwert der Probe mit dem hinzugefügten Wasser wurde als 100% angenommen, und die Messwerte für die anderen Proben sind als prozentualer Anteil angegeben.
    [Tabelle 43]
    • erfindungsgemäße Reagenzien
    Probe ΔmAbs / min nmol/ min/ ml %
    J042 + Wasser 21,8 30,9 100
    J042 + Bil-C (20 mg/ dl) 21,8 30,9 100
    J042 + Bil-F (20 mg/ dl) 22,1 31,3 101
    J042 + hämolytisches Hb (500 mg/ dl) 22,3 31,6 102
    J042 + Chylus (1400 FTU) 22,9 32,4 105
    J042 + Intralipos (1%) 22,5 31,9 103
    J042 + Ascorbinsäure (50 mg/ dl) 20,9 29,6 96
    [Tabelle 44]
    • PLAC- Test
    Probe ΔmAbs / min nmol /min / ml %
    J042 + Wasser 182,1 139,2 100
    J042 + Bil-C (20 mg/ dl) 181,1 138,2 99
    J042 + Bil-F (20 mg/ dl) 188,4 145,5 105
    J042 + hämolytisches Hb (500 mg/ dl) ND ND ND
    J042 + Chylus (1400 FTU) 176,9 134,0 96
    J042 + Intralipos (1%) ND ND ND
    J042 + Ascorbinsäure (50 mg/ dl) 181,0 138,1 99
    [Tabelle 45]
    • Lp- PLA2 FS
    Probe ΔmAbs / min U/l %
    J042 + Wasser 28,8 343,5 100
    J042 + Bil-C (20 mg/ dl) 28,9 344,7 100
    J042 + Bil-F (20 mg/ dl) 29,4 351,0 102
    J042 + hämolytisches Hb (500 mg/ dl) 27,8 330,8 96
    J042 + Chylus (1400 FTU) 30,0 358,6 104
    J042 + Intralipos (1%) 29,5 352,3 103
    J042 + Ascorbinsäure (50 mg/ dl) 28,8 343,5 100
  • Die Messergebnisse in den Tabellen 43 und 45 zeigen, dass alle Proben, die unterschiedliche Substanzen enthielten, sowohl unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens als auch von Lp- PLA2 FS innerhalb eines Fehlerbereichs von ± 5% gemessen werden konnten. Darüber hinaus konnten, wie in Tabelle 44 gezeigt, Proben mit hämolytischem Hämoglobin (500 mg/ dl) und Intralipos- Infusion (1%) nicht mit dem PLAC-Test gemessen werden; das in Beispiel verwendete Gerät Hitachi 7600-01 0S zeigte „Absorptionsfehler (aufgrund der Überschreitung der oberen Grenze)“ an.
  • Diese Beispiele zeigen, dass das erfindungsgemäße Verfahren und Lp-PLA2 FS durch hämolytisches Hämoglobin und Intralipos (Chylus) nicht beeinflusst werden, während der PLAC- Test durch hämolytisches Hämoglobin und Intralipos (Chylus) beeinflusst wurde.
  • [Beispiel 20]
  • <Vergleich der Messwerte zwischen den erfindungsgemäßen Reagenzien, dem PLAC- Test und Lp- PLA2 FS>
  • Die Aktivitätswerte der Lp-PLA2, die bei jeder Probe mit den erfindungsgemäßen Reagenzien, dem PLAC- Test und Lp- PLA2 FS gemessen wurden, wurden verglichen. Die Zusammensetzungen der Reagenzien waren die gleichen wie in Beispiel 17.
  • (Proben)
  • Gepoolte Seren A bis C, gepooltes Heparin- Plasma, gepooltes Citrat- Plasma, Einzelseren Nrn. 1 bis 21.
  • (Aktivitätsmessung)
  • Die Ausrüstung für die Messung der Aktivität, die Messparameter und die Berechnungen der Aktivitätswerte waren die gleichen wie in Beispiel 17.
  • Tabelle 46 zeigt die Aktivitätswerte der Lp- PLA2 (nmol/ min/ ml und U/I), wie sie für jede Probe mit den erfindungsgemäßen Reagenzien, dem PLAC- Test und Lp- PLA2 FS gemessen wurden. 13 zeigt einen Vergleich zwischen den Aktivitätswerten des PLAC-Tests (x-Achse (nmol/ min/ ml)) und den Aktivitätswerten, die mit den erfindungsgemäßen Reagenzien erhalten wurden (y-Achse (nmol/ min/ ml)). 14 zeigt einen Vergleich zwischen den Aktivitätswerten, die mit Lp- PLA2 FS erhalten wurden (x-Achse (U /I)), und den Aktivitätswerten, die mit den erfindungsgemäßen Reagenzien erhalten wurden (y-Achse (nmol/ min/ ml)); und 15 zeigt einen Vergleich zwischen den Aktivitätswerten des PLAC-Tests (x-Achse (nmol/ min/ ml)) und den Aktivitätswerten, die mit Lp- PLA2 FS erhalten wurden (y-Achse (U /I)). Chylus ist durch „+“ angegeben.
    [Tabelle 46]
    Probe Chylus Erfindungsgemäße Reagenzien (nmol/ min/ ml) PLAC- Test (nmol/ min/ ml) Lp- PLA2 FS (U/I)
    gepooltes Serum A 1,1 4,5 10,9
    gepooltes Serum B + 33,4 147,4 384,2
    gepooltes Serum C + 32,2 155,9 374,5
    gepooltes Heparin-Plasma + 26,1 122,2 304,4
    gepooltes CitratPlasma + 25,8 142,0 309,3
    Einzelserum Nr. 1 ++ 32,7 154,9 360,0
    Einzelserum Nr.2 + 32,2 168,0 369,7
    Einzelserum Nr.3 + 42,1 179,7 468,7
    Einzelserum Nr.4 + 46,0 198,0 517,1
    Einzelserum Nr.5 + 36,3 161,4 396,3
    Einzelserum Nr.6 + 33,0 169,1 373,3
    Einzelserum Nr.7 + 18,3 90,9 201,8
    Einzelserum Nr.8 + 37,4 155,6 443,4
    Einzelserum Nr.9 + 47,9 203,1 543,6
    Einzelserum Nr.10 + 43,5 208,6 491,7
    Einzelserum Nr.11 + 41,8 170,4 472,4
    Einzelserum Nr.12 33,2 180,5 378,1
    Einzelserum Nr.13 + 52,8 193,7 594,4
    Einzelserum Nr.14 + 32,9 142,8 370,9
    Einzelserum Nr.15 + 33,9 167,7 391,4
    Einzelserum Nr.16 ++ 75,9 226,7 849,3
    Einzelserum Nr.17 +++ 39,4 ND 412,0
    Einzelserum Nr.18 + 37,4 172,4 416,8
    Einzelserum Nr.19 + 38,3 163,6 444,6
    Einzelserum Nr.20 32,0 165,6 362,4
    Einzelserum Nr.21 + 25,5 117,0 254,9
  • Basierend auf diesen Messergebnissen kann die Korrelation zwischen den Messwerten, die mit den erfindungsgemäßen Reagenzien und Lp- PLA2 FS erhalten wurden, durch eine Korrelationsgleichung dargestellt werden: y = 0,0885x + 0,0643, Korrelationskoeffizient r = 0,996. Das erfindungsgemäße Verfahren ist gegenüber Lp-PLA2 FS dadurch überlegen, dass Lp- PLA2 FS ein kompliziertes Drei- Reagens- System ist, wohingegen das erfindungsgemäße Verfahren ein einfaches Zwei- Reagens- System verwendet.
  • Darüber hinaus kann die Korrelation zwischen den Messwerten der Proben, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren und dem PLAC- Test erhalten wurden, durch die Korrelationsgleichung: y = 0,2698x - 7,0906, Korrelationskoeffizient r = 0,991, dargestellt werden. Im Fall des Einzelserums Nr. 17, das besonders viel Chylus aufwies, war die Messung mit dem PLAC- Test nicht möglich, und bei dem in diesem Beispiel verwendeten Hitachi 7600-010S erschien die Meldung „Fehler Absorption überschritten“. Wenn man dies zusammen mit den Ergebnissen aus Beispiel 19 betrachtet, zeigt dies, dass der PLAC- Test anfälliger gegenüber Wirkungen von hämolytischem Hämoglobin und Chylus ist als das erfindungsgemäße Verfahren. Entsprechend ist das erfindungsgemäße Verfahren, wie in diesen Beispielen gezeigt, dem PLAC- Test überlegen, da es gegenüber den Wirkungen von hämolytischem Hämoglobin und Intralipos Infusion (Chylus) resistent ist.
  • Die Korrelation zwischen den Messwerten, die mit Lp-PLA2 FS und dem PLAC- Test erhalten wurden, kann durch die Korrelationsgleichung: y = 3,0609x - 81,691, Korrelationskoeffizienten r = 0,896, dargestellt werden.
  • Da die Aktivitätswerte unterschiedlich definiert sind, sind die Aktivitätswerte, die mit Lp-PLA2 FS, dem PLAC- Test und den erfindungsgemäßen Reagenzien gemessen wurden, unterschiedlich, und die Steigung der Korrelationsgleichung ist nicht 1, aber es wird angenommen, dass sich die Steigung der Korrelationsgleichung 1 annähern würde, wenn die Definitionen der Aktivitätswerte und Kalibratorwerte identisch wären.
  • [Beispiel 21]
  • <Prüfung der Linearität mit Verdünnungen der erfindungsgemäßen Reagenzien, dem PLAC-Test und Lp- PLA2 FS>
  • Die Linearität von Verdünnungen der erfindungsgemäßen Reagenzien, des PLAC- Tests und Lp-PLA2 FS wurde verglichen. Die Zusammensetzungen der Reagenzien waren die gleichen wie in Beispiel 17.
  • (Proben)
  • Die folgende Verdünnungsreihe (insgesamt 6 Verdünnungen) wurde aus gepooltem Serum J042, versetzt mit 0,05 mg / ml rLp- PLA2 (im Folgenden als Serum X bezeichnet), und physiologischer Kochsalzlösung (Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) hergestellt:
    • Serum X allein (1),
    • Serum X: Kochsalzlösung = 3 : 1 (0,75)
    • Serum X: Kochsalzlösung = 1 : 1 (0,5)
    • Serum X: Kochsalzlösung = 1 : 3 (0,25)
    • Serum X: Kochsalzlösung = 1 : 9 (0,1) und
    • Kochsalzlösung allein (0).
  • (Aktivitätsmessung)
  • Die Ausrüstung für die Messung der Aktivität, die Messparameter und die Berechnungen der Aktivitätswerte waren die gleichen wie in Beispiel 17.
  • In den 16 bis 18 ist für jedes Reagens die Verdünnungsreihe auf der x-Achse und die Änderung der Absorption pro Minute auf der y-Achse aufgetragen.
  • Die Messergebnisse in 16 zeigen, dass die Linearität der Verdünnungen der erfindungsgemäßen Reagenzien y = 48,851 x - 0,7186 (r = 0,999) ist. In 18 beträgt die Linearität der Verdünnung von Lp-PLA2 FS y = 62,481x - 0,0086 (r = 0,999). Wie 17 zu entnehmen ist, zeigte der PLAC- Test keine Linearität der Verdünnung.
  • [Beispiel 22]
  • <Test der Lagerstabilität der erfindungsgemäßen Reagenzien bei 4 °C>
  • Die erfindungsgemäßen Reagenzien wurden nach der Herstellung des Reagens für 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 15, 29, 60 und 120 Tage bei 4 °C gelagert, und verwendet, um die Lp- PLA2-Empfindlichkeit (ΔmAbs / min) des gepoolten Serums J042 zu messen. Die Zusammensetzungen der Reagenzien waren wie folgt.
  • (Reagenzien der Erfindung)
  • <Reagens R1>
  • 50 mM Tris-HCl (pH 7,8)
    0,2 mM CaCl2
    4 U / ml ASOM
    0,05% ProClin 300
    1,6 µM Kaliumferrocyanid
    0,05% EMULGEN 1150S-60
    3,3 U / ml rekombinante Lyso- PAF- PLD
    0,1 mM EDTA
    75 mM NaCl
    3% Trehalose
    10µM FAD (Flavin-Adenin- Dinucleotid)
    0,02% TODB
    4 U / ml Peroxidase
    4 U / ml rekombinante Cholinoxidase III
  • <Reagens R2>
  • 50 mM PIPES (pH 7,0)
    0,2 mM CaCl2
    0,05% ProClin 300
    0,05% EMULGEN 1150S-60
    0,1 mM EDTA
    0,25% KCl
    0,13% Saccharose
    0,08% 4-AA
    2 mM racemischer PAF (C16)
  • (Proben)
  • Gepooltes Serum J042.
  • (Aktivitätsmessung)
  • Zur Messung der Aktivität wurde ein automatischer Analysator Hitachi 7170 verwendet. Die Messparameter sind unten aufgeführt. Die Aktivitätswerte wurden unter den gleichen Bedingungen, wie denen, die in Beispiel 17 für die erfindungsgemäßen Reagenzien verwendet wurden, gemessen.
  • (Messparameter für den automatischen Analysator 7170 von Hitachi)
  • Analysemethode Rate A
    Messwellenlänge (sub / dominant) 660 nm / 546 nm
    Reaktionszeit 10 Minuten
    Messpunkte 30 bis 33
    Probenvolumen 4 µl
    Volumen Reagens R1 160 µl
    Volumen Reagens R2 40 µl
  • Bei den Messergebnissen wurde für den Sensitivitäts- und Aktivitätswert 100% der Wert festgesetzt, der mit dem Reagens gemessen wurde, das nach der Herstellung 1 Tag bei 4 °C gelagert wurde. Die Lp- PLA2- Sensitivität (ΔmAbs / min) und die Aktivitätswerte für das gepoolte Serum J042 blieben für mindestens 120 Tage innerhalb von etwa ± 10%, was deutlich zeigt, dass das erfindungsgemäße Verfahren zur Messung der Aktivität der Lp-PLA2 und der Messkit der vorliegenden Erfindung Lp-PLA2 stabil, mit hoher Empfindlichkeit und genau messen können, selbst wenn die Reagenzien für einen langen Zeitraum (mindestens 120 Tage bei 4 °C) gelagert wurden.
  • [Beispiel 23]
  • <Test der Lagerstabilität der erfindungsgemäßen Reagenzien: Hitzealterungstest (heat acceleration test) bei 37 °C>
  • Die erfindungsgemäßen Reagenzien, die nach der Herstellung für 1 Woche bei 4 °C gelagert worden waren, wurden im Anschluss daran für 1 Woche bei 37 °C, und für 2 Woche bei 37 °C gelagert, und in den folgenden Beispielen wurde die Sensitivität für Lp- PLA2 gemessen. Die Zusammensetzungen der Reagenzien waren wie folgt, und die Messung der Aktivität wurde wie in Beispiel 22 durchgeführt.
  • (Reagenzien der Erfindung)
  • <Reagens R1>
  • 50 mM Tris-HCl (pH 7,8)
    0,2 mM CaCl2
    4 U / ml ASOM
    0,05% ProClin 300
    1,6 µM Kaliumferrocyanid
    0,05% EMULGEN 1150S-60
    3,3 U / ml rekombinante Lyso- PAF- PLD
    0,1 mM EDTA
    75 mM NaCl
    3% Trehalose
    10µM FAD (Flavin-Adenin- Dinucleotid)
    0,02% TODB
    4 U / ml Peroxidase
    4 U / ml rekombinante Cholinoxidase III
  • <Reagens R2>
  • 50 mM PIPES (pH 7,0)
    0,2 mM CaCl2
    0,05% ProClin 300
    0,05% EMULGEN 1150S-60
    0,1 mM EDTA
    0,25% KCl
    0,13% Saccharose
    0,08% 4-AA
    2 mM racemischer PAF (C16) oder .1-Palmitoyl- 2-acetyl- sn-glycero- 3-PC
  • (Proben)
  • Gepooltes Serum J042; gepoolte Seren B bis D; Lösung des gepoolten Serums J042, enthaltend 0,017 mg/ ml rLp- PLA2
  • Bei den Tests zur Lagerung der erfindungsgemäßen Reagenzien unter Verwendung von racemischem PAF(C16) oder 1-Palmitoyl- 2-acetyl- sn-glycero- 3-PC als Substrat waren die Empfindlichkeits- und Aktivitätswerte der erfindungsgemäßen Reagenzien nach 2-wöchiger Lagerung bei 37 °C innerhalb von ± 10%, wobei die Sensitivitäts- und Aktivitätswerte, die mit dem Reagens gemessen wurden, das nach der Herstellung 1 Tag bei 4 °C gelagert wurde, als 100% festgesetzt wurden. Die Aktivität der Lp- PLA2 konnte mit den erfindungsgemäßen Reagenzien, die mindestens 2 Wochen lang bei 37 °C gelagert worden waren, stabil, empfindlich und genau gemessen werden. Da für die Lagerstabilität nach 2 Wochen bei 37 °C prognostiziert wird, dass sie der Lagerstabilität nach 18 Monaten bei 4 °C entspricht, sollten die erfindungsgemäßen Reagenzien mindestens 18 Monate lang bei 4 °C stabil sein.
  • [Beispiel 24]
  • <Messung der Lp- PLA2- Aktivität der gelagerten Probe 1>
  • Einzelseren A bis D, die unmittelbar nach der Blutentnahme durch Zentrifugation erhalten wurden, wurden unterteilt, und bei drei Temperaturen (4 °C, -25 °C, -80 °C) gelagert, beginnend eine Stunde nach der Blutentnahme. Die Lp- PLA2- Aktivität der Einzelseren A bis D wurde dann nach 1 oder 2 Stunden, oder 1, 2, 3, 4, 7, 15 oder 28 Tagen, Lagerung bei 4 °C; oder nach 1 Stunde, oder 1, 2, 3 oder 4 Tagen, Lagerung bei -25 °C und -80 °C gemessen (n = 3). Die Zusammensetzungen der Reagenzien waren die gleichen wie in Beispiel 22. Ein automatischer Analysator 7170 von Hitachi wurde zur Messung verwendet, und die Messparameter waren die gleichen wie in Beispiel 22.Das gepoolte Serum J042-II, für das in Referenzbeispiel 11 festgestellt worden war, dass es eine Lp- PLA2- Konzentration von 23,1 (nmol/ min/ ml (U / I)) aufweist, wurde als Kalibrierungsreagenz verwendet.
  • Die Lp- PLA2- Konzentrationen wurden mit Hilfe des oben beschriebenen „Verfahren 2 zur Berechnung des Werts der Aktivität der Lp-PLA2“ gemessen, und eine Einpunktkalibrierung unter Verwendung von einem Kalibrierungsreagens und destilliertem Wasser, gleichzeitig als 0 (nmol/ min/ ml (U / L)) gemessen, wurde als Kalibrierungsmethode ausgewählt.
  • Bei den Messergebnissen waren die Messwerte der Lp- PLA2- Aktivität (nmol/ min/ ml (U / I)) der Einzelseren A bis D nach 28-tägiger Lagerung der Probe bei 4 °C, beginnend 1 Stunde nach der Blutentnahme, alle innerhalb ± 11%, wobei als 100% Wert, die Messwerte der Einzelseren A bis D, die 1 Stunde lang bei 4 °C gelagert worden waren, beginnend 1 Stunde nach der Blutentnahme, angenommen wurden. Wenn die Proben 1, 2, 3 oder 4 Tage lang bei -25 °C oder -80 °C gelagert wurden, beginnend 1 Stunde nach der Blutentnahme, waren die Messwerte der Lp- PLA2- Aktivität (nmol/ min/ ml (U / I)) innerhalb ± 6%, wobei als 100% Wert, die Messwerte der Proben, die 1 Stunde lang bei 4 °C gelagert worden waren, beginnend 1 Stunde nach der Blutentnahme, angenommen wurden. Die Messwerte der Lp-PLA2- Aktivität in Proben, die mit Hilfe des Verfahrens der vorliegenden Erfindung bestimmt werden konnten, waren in einem Bereich von -80 °C bis 4 °C (was den üblichen Temperaturbereich zur Lagerung von Proben beinhaltet) stabil. Dies zeigt deutlich, dass das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist sehr vielseitig und nützlich ist.
  • Aus der Literatur (Clinical Biochemistry 44 (2011), 1247-1252) ist bekannt, dass mit Hilfe von ELISA bestimmte Messwerte der Lp- PLA2- Aktivität in Proben, die 2 Tage lang bei 4 °C gelagert wurden, um 15% höher sind, und in Proben, die 2 Tage lang bei -25 °C gelagert wurden, um 30% höher sind im Vergleich zu Proben vor der Lagerung, was darauf hinweist, dass die Lagerung der Proben einen großen Einfluss auf die Messwerte der Lp- PLA2-Aktivität hat. Wie vorstehend erörtert, war jedoch der Einfluss der Lagerung der Proben auf die Messwerte der Aktivität geringer, wenn die Aktivität der Lp-PLA2 durch das erfindungsgemäße Verfahren gemessen wurde, was die Nützlichkeit des Verfahrens der vorliegenden Erfindung beweist.
  • [Beispiel 25]
  • <Messung der Lp- PLA2- Aktivität der gelagerten Probe 2>
  • Das Einzelserum E wurde eingefroren und 0 bis 5 Mal aufgetaut, und die Lp- PLA2- Aktivität wurde gemessen. Die Reagenzien, die Messbedingungen und dergleichen waren wie in Beispiel 22. Das Kalibrierungsreagens und die Kalibrierungsmethode waren wie in Beispiel 24.
  • Die Messergebnisse zeigen, dass die Messungen der Aktivität der Lp-PLA2 in Proben, die fünfmal wiederholt eingefroren und aufgetaut worden waren, alle innerhalb von ± 4% lagen, wobei die Messung der Lp-PLA2-Aktivität in der Probe vor dem Einfrieren und Auftauen als 100% angenommen wurde. Die Ergebnisse der Beispiele 24 und 25 zeigen deutlich, dass die Aktivität der Lp- PLA2 in Proben, die mindestens bei Temperaturen im Bereich von -80 °C und 4 °C gelagert wurden, mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung stabil, mit hoher Empfindlichkeit und genau gemessen werden kann.
  • [Beispiel 26]
  • <Bestimmung von LOB, LOD und LOQ>
  • Die Grenze des Leerwerts (LOB, limit of blank), die Nachweisgrenze (LOD, limit of detection) und die Bestimmungsgrenze (LOQ, limit of quantitation) der erfindungsgemäßen Reagenzien wurden bestimmt gemäß Standard: CLSI EP17 (Evaluation of Detection Capability for Clinical Laboratory Measurement Procedures: Approved Guideline (IEEE) [Bewertung der Nachweisfähigkeit für klinische Labormessverfahren: Genehmigte Richtlinie (IEEE)]). Die Zusammensetzungen der Reagenzien waren die gleichen wie in Beispiel 22. Ein automatischer Analysator 7170 von Hitachi wurde zur Messung verwendet, und die Messparameter waren wie in Beispiel 22. Das Kalibrierungsreagens und die Kalibrierungsmethode waren wie in Beispiel 24.
  • (Proben)
  • BJ pool, verdünnt mit physiologischer Kochsalzlösung (0,9 Gew. / Vol.% NaCl) zu Lp- PLA2-Konzentrationen von 0,0, 1,4, 2,9, 4,3, 5,8, 7,2, 8,7, 10,1, 11,6, 13,0 und 14,5 U / I.
  • (Messung)
  • Die Proben wurden täglich 5 Tage lang gemessen (n = 5), und der Variationskoeffizient (CV%), der durchschnittliche CV und 2SD (Standardabweichung x 2) wurden berechnet. Die Ergebnisse sind in 19 gezeigt. In 19 ist die 2SD des CV(%) mit einem Fehlerbalken dargestellt, und die Lp- PLA2- Konzentrationen und die Variationskoeffizienten sind statistisch gewichtet (power-approximated) und als eine durchgezogene Linie gezeigt (y = 37,644 x-1,155).
  • (LOB)
  • Die LOB betrug 0,346 (nmol/ min/ ml (U / I)), wie nach der folgenden Formel aus dem durchschnittlichen Variationskoeffizienten bei einer Lp- PLA2- Konzentration von 0 (nmol/ min/ ml (U / I)), oder anders gesagt von Kochsalzlösung, und der Standardabweichung des Variationskoeffizienten berechnet. LOB = Durchschnitt + 1.645 × SD = − 0,1247 + 1,645 × 0,2862 = 0,346
    Figure DE112017003142T5_0024
  • (LOD)
  • Die LOD betrug 0,810 (nmol/ min/ ml (U / I)), wie nach der folgenden Formel aus der LOB und der Standardabweichung (0,2804) der Messwerte bei einer Lp- PLA2- Konzentration von 1,4 (nmol/ min/ ml) (U / I)) berechnet. LOD = LOB + 1.653 × SD =0 ,346+1 ,653 × 0 ,2804 =0 ,810
    Figure DE112017003142T5_0025
  • (LOQ)
  • Bei der LOQ wurde die LOQ als der gemessene Wert definiert, bei dem der CV(%), basierend auf einer statistischen Gewichtung der Lp- PLA2- Konzentration und des Variationskoeffizienten (y = 37,644 x-1,155), wie in 19 gezeigt, 5% oder weniger betrug, und wurde somit als 5,742 (nmol/ min/ ml (U / I)) berechnet. LOQ = ( 5 / 37,644 ) ( 1 / − 1,155 ) = 5,742
    Figure DE112017003142T5_0026
  • Die Ergebnisse von diesem Beispiel zeigen, dass die minimale Menge an Lp- PLA2, die mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung nachgewiesen werden kann, etwa 0,810 (U / I) beträgt, wohingegen der kleinste Wert, bei dem die quantitativen Ergebnisse ausreichend verlässlich sind, etwa 5,742 (U / I) beträgt, und da erwartet wird, dass die LOB und die LOQ annähernd gleichwertig sind, selbst wenn sich die Zusammensetzungen des Reagens ändern, bestätigt dies, dass das erfindungsgemäße Verfahren für praktische Anwendungen benutzt werden kann.
  • [Beispiel 27]
  • <PLD- Aktivität von Lyso- PAF- PLD Mutanten mit eingeführten ortsspezifischen Mutationen>
  • Ortsspezifische Mutationen wurden eingeführt, indem M an der 45. Position der Lyso- PAF-PLD mit der SEQ ID NO: 9 (entsprechend M an der 71. Position von SEQ ID NO: 1) durch G, A, L oder D ersetzt wurde, und die PLD- Aktivität gegenüber Lyso- PAF (kcat / Km (s-1mM-1)) vor und nach der Mutation wurde verglichen. Im Ergebnis betrug die PLD- Aktivität vor der Mutation 1385 (s-1mM-1), während die Mutante, bei der das M an der 45. Position der SEQ ID NO: 9 durch G ersetzt war (bezeichnet als M45G), und die ähnlich benannten Mutanten M45A, M45L und M45D, PLD- Aktivitäten von 3059, 11411, 3284 bzw. 4557 (s-1mM-1) aufwiesen.
  • Ferner wurden ortsspezifische Mutationen eingeführt, indem F an der 257. Position der Lyso- PAF- PLD mit der SEQ ID NO: 9 (entsprechend F an der 283. Position von SEQ ID NO: 1) durch G, E, R, K oder W ersetzt wurde, und die PLD- Aktivität gegenüber Lyso- PAF (kcat / Km (s-1mM-1)) wurde vor und nach der Mutation verglichen. Im Ergebnis betrug die PLD-Aktivität vor der Mutation 1385 (s-1mM-1), während die Mutante, bei der F an der 257. Position von SEQ ID NO: 1 durch G ersetzt war (bezeichnet als F257G), und die ähnlich benannten Mutanten F257E, F257R, F257K und F257W PLD- Aktivitäten von 1200, 1000, 1080, 1020 bzw. 1320 aufwiesen.
  • Die PLD- Aktivität der Lyso- PAF- PLD Mutanten, die durch ortsspezifische Mutationen erhalten wurde, wurde wie folgt gemessen. 1,211 g Tris, 14,7 mg Calciumchlorid-Dihydrat (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 20 ml Lyso-PAF Lösung und 2 ml 1% TODB Lösung wurden in 60 ml gereinigtem Wasser gelöst, der pH wurde mit 1 N HCl auf 7,5 (25 °C) eingestellt; 4 ml 100 U/ ml Cholinoxidase, 4 ml 100 U/ ml Peroxidaselösung und 2 ml 1% 4-AA Lösung wurden zugegeben und gelöst; und das Gesamte wurde mit gereinigtem Wasser auf 100 ml gebracht, um ein Reagens zur Messung der PLD- Aktivität für Lyso- PAF (Reaktionsreagensgemisch) zu erhalten. Die Lyso-PAF Lösung wurde so eingestellt, dass die Konzentration von Lyso-PAF in der Reaktionsreagensmischung 0 bis 5 mM betrug. 3 ml des Reaktionsreagensgemisches wurden 5 Minuten lang bei 37 °C vorgewärmt, und mit 50 µl einer Lösung der Mutante der Lyso- PAF- PLD mit der eingeführten ortsspezifischen Mutation gemischt, wobei auf geeignete Weise mit 10 mM Tris- HCl (pH 7,5) verdünnt wurde, um eine Reaktion zu initiieren, und die Änderung der Absorption wurde 8 bis 9 Minuten nach dem Beginn der Reaktion 1 Minute lang bei 546 nm gemessen. Der Aktivitätswert (µmol / min) wurde berechnet, wobei der millimolare Extinktionskoeffizient des Chinoniminfarbstoffs bei 546 nm mit 36 (cm2 / µmol) angegeben war. Der Proteingehalt (mg / ml) wurde nach der Bradford- Methode unter Verwendung von Rinderserumalbumin als Standard berechnet. Km und kcat wurden mit Hilfe der Michaelis- Menten- Formel gemäß den Verfahren, die in dem zuvor genannten Theorie und Praxis von Enzymen und anderen Proteinen [Tanpakushitsu / Kouso no kiso jikkenhou] und in Voet Lehrbuch der Biochemie [Basic Biochemistry] (4. Ausgabe) und dergleichen beschrieben sind, berechnet. Für die Zwecke der Berechnung wurde für das Enzym ein Molekulargewicht von 33583 eingesetzt.
  • Die PLD- Aktivität (kcat / Km (s-1mM-1)) von jeder Mutante ist in Tabelle 47 gezeigt.
    [Tabelle 47]
    WT / Mutante Km (mM) kcat (s-1) kcat / Km(s-1mM-1)
    WT 0,058 81 1385
    M45G 0,027 82 3059
    M45A 0,012 136 11411
    M45L 0,023 147 3284
    M45D 0,034 157 4557
    F257G 0,13 156 1200
    F257E 0,10 100 1000
    F257R 0,15 162 1080
    F257K 0,090 92 1020
    F257W 0,10 132 1320
  • Die ortsspezifische Mutanten der Lyso- PAF- PLD hatten somit eine ähnliche PLD-Aktivität wie die der Wildtyp (WT).
  • Die Reagenzien und Verfahren der vorliegenden Erfindung sind umfangreich anwendbar und zweckmäßig, da sie es ermöglichen, die Lp- PLA2- Aktivität unter Verwendung eines automatischen Allzweckanalysators zu messen. Das Messverfahren hat sich auch als sicher erwiesen, da die Aktivität der Lp-PLA2 gemessen werden kann, ohne radioaktive Isotope oder dergleichen zu verwenden. Darüber hinaus wurde auch gezeigt, dass das Verfahren als stabil gegenüber Kohlendioxidgas aus der Luft ist, da die Messung unter neutralen Bedingungen durchgeführt werden kann. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass das Verfahren die in vivo Aktivität genau widerspiegeln kann, da es PAF verwendet, welcher ein endogenes Substrat der Lp- PLA2 ist. Das Verfahren ist auch wirtschaftlich, da die in den Beispielen und dergleichen eingesetzten Reagenzien leicht aus kommerziellen Quellen erhältlich sind und leicht hergestellt werden können.
  • Industrielle Anwendbarkeit
  • Das Messverfahren und der Kit der vorliegenden Erfindung können die Aktivität der Lp-PLA2 in einer Probe leicht, stabil und mit einem hohen Maß an Empfindlichkeit messen. Daher ist die vorliegende Erfindung besonders nützlich für die Diagnose und das Managen von Krankheiten oder Zuständen, wie, z. B., eine kardiovaskuläre Erkrankung, die mit Lp-PLA2 in Verbindung stehen, und kann im medizinischen Bereich und in der Branche der Hersteller von Reagenzien (reagent industry) Anwendung finden.
  • Die vorliegende Anmeldung beansprucht die Priorität, die auf der japanischen Patentanmeldung Nr. 2016-123707 , eingereicht am 22. Juni 2016, basiert und der gesamte Inhalt derselben wird hiermit durch Bezugnahme aufgenommen.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
  • Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
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Claims (21)

  1. Was beansprucht wird ist:
  2. Verwendung eines Enzyms in der Gegenwart von Plättchen- aktivierenden Faktoren (PAFs), die durch die nachstehende Allgemeine Formel I dargestellt sind:
    Figure DE112017003142T5_0027
     wobei: R1 eine lineare oder verzweigte, gesättigte oder teilweise ungesättigte höhere Kohlenwasserstoffgruppe ist; R2 eine lineare niedere Alkylgruppe ist; und X -C (O)-, -CH2- oder -CH=CH- ist, und Lyso- PAFs, die durch die nachstehende Allgemeine Formel II dargestellt sind:
    Figure DE112017003142T5_0028
     wobei R1 und X wie in der Allgemeinen Formel I definiert sind, um dadurch mit Hilfe der Hydrolyse der Lyso- PAFs Cholin herzustellen, ohne Cholin durch Hydrolyse der PAFs zu erzeugen, wobei das Enzym ein Protein gemäß einem der nachstehend genannten Punkte (a) bis (c) ist: (a) ein Protein, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die durch SEQ ID NO: 1 oder 9 dargestellt ist; oder (b) ein Protein, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die durch SEQ ID NO: 1 oder 9 dargestellt ist, wobei eine oder mehrere Aminosäuren darin entfernt, substituiert oder hinzugefügt sind; und eine Phospholipase D (PLD)- artige- Aktivität für Lyso- PAF, aber keine PLD- Aktivität für PAF, besitzt; oder (c) ein Protein, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die mindestens 90% Sequenzidentität mit einer Aminosäuresequenz aufweist, die durch SEQ ID NO: 1 oder 9 dargestellt ist; und eine PLD- Aktivität für Lyso- PAF, aber keine PLD- Aktivität für PAF, besitzt.
  3. Verfahren zum Messen der Aktivität der Lipoprotein-assoziierten Phospholipase A2 (Lp- PLA2) in einer Probe, die Lp- PLA2 enthält, wobei das Verfahren die folgenden Schritte (A) bis (C) umfasst: (A) das Umwandeln von Plättchen- aktivierenden Faktoren (PAFs), die durch die nachstehende Allgemeine Formel I dargestellt sind:
    Figure DE112017003142T5_0029
     wobei: R1 eine lineare oder verzweigte, gesättigte oder teilweise ungesättigte höhere Kohlenwasserstoffgruppe ist; R2 eine lineare niedere Alkylgruppe ist; und X -C (O)-, -CH2- oder -CH=CH- ist, in Lyso- PAFs, die durch die nachstehende Allgemeine Formel II dargestellt sind:
    Figure DE112017003142T5_0030
     wobei R1 und X wie in der Allgemeinen Formel I definiert sind, indem die PAFs in der Probe mit der Lp- PLA2 zur Reaktion gebracht werden; (B) das Hydrolysieren der Lyso-PAFs, die in Schritt (A) hergestellt worden sind, mit einem Enzym, das ein Protein gemäß einem der nachstehend genannten Punkte (a) bis (c) ist: (a) ein Protein, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die durch SEQ ID NO: 1 oder 9 dargestellt ist; (b) ein Protein, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die durch SEQ ID NO: 1 oder 9 dargestellt ist, wobei eine oder mehrere Aminosäuren darin entfernt, substituiert oder hinzugefügt sind; und eine Phospholipase D (PLD)- artige- Aktivität für Lyso- PAF, aber keine PLD- Aktivität für PAF, besitzt; oder (c) ein Protein, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die mindestens 90% Sequenzidentität mit einer Aminosäuresequenz aufweist, die durch SEQ ID NO: 1 oder 9 dargestellt ist; und eine PLD- Aktivität für Lyso- PAF, aber keine PLD- Aktivität für PAF, besitzt; um ein Hydrolysat zu erhalten; und (C) das Messen der Aktivität der Lp- PLA2 in der Probe unter Verwendung einer quantitativen Änderung als Indikator, wobei die quantitative Änderung dem Hydrolysat, das in Schritt (B) erhalten wurde, zuordenbar ist.
  4. Das Verfahren nach Anspruch 2, wobei die quantitative Änderung in Schritt (C) eine Änderung der Menge des Cholins im Hydrolysat ist.
  5. Das Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Schritt (C) ferner den folgenden Schritt (C-1) als ein Verfahren zum Messen der Änderung bei der Menge des Cholins umfasst: (C-1) das Umsetzen von Cholin mit Cholinoxidase zur Erzeugung von Wasserstoffperoxid.
  6. Das Verfahren nach Anspruch 4, wobei der Schritt (C) ferner den folgenden Schritt (C-2) umfasst: (C-2) das Messen der Menge an Wasserstoffperoxid, die in Schritt (C-1) erzeugt wurde, mit Hilfe eines kolorimetrischen Verfahrens unter Verwendung eines chromogenen Reagens.
  7. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, welches ferner den folgenden Schritt (D) vor dem Schritt (A) umfasst: (D) das Entfernen von Cholin in der Probe.
  8. Das Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Schritt (D) das Entfernen von Cholin in der Probe unter Verwendung von Cholinoxidase ist.
  9. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 7, wobei R2 eine Methylgruppe ist.
  10. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 8, wobei R1 unabhängig aus linearen C15 - und C17 - Alkylgruppen ausgewählt ist.
  11. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 9, wobei X -CH2- ist.
  12. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 9, wobei X -C(O)- ist.
  13. Kit zur Messung der Aktivität der Lipoprotein- assoziierten Phospholipase A2 (Lp-PLA2) in einer Probe, wobei der Kit umfasst: ein Enzym, das ein Protein gemäß einem der nachstehend genannten Punkte (a) bis (c) ist: (a) ein Protein, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die durch SEQ ID NO: 1 oder 9 dargestellt ist; (b) ein Protein, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die durch SEQ ID NO: 1 oder 9 dargestellt ist, wobei eine oder mehrere Aminosäuren darin entfernt, substituiert oder hinzugefügt sind; und eine Phospholipase D (PLD)- artige- Aktivität für Lyso- PAF, aber keine PLD- Aktivität für PAF, besitzt; oder (c) ein Protein, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die mindestens 90% Sequenzidentität mit einer Aminosäuresequenz aufweist, die durch SEQ ID NO: 1 oder 9 dargestellt ist; und eine PLD- Aktivität für Lyso- PAF, aber keine PLD- Aktivität für PAF, besitzt; und PAFs, die durch die nachstehende Allgemeine Formel I dargestellt sind:
    Figure DE112017003142T5_0031
     wobei: R1 eine lineare oder verzweigte, gesättigte oder teilweise ungesättigte höhere Kohlenwasserstoffgruppe ist; R2 eine lineare niedere Alkylgruppe ist; und X -C(O)-, -CH2- oder -CH=CH- ist.
  14. Der Kit nach Anspruch 12, welcher ferner eine Cholinoxidase umfasst.
  15. Der Kit nach Anspruch 13, welcher ferner eine Peroxidase, ein Trinder- Reagens und einen Kuppler umfasst.
  16. Der Kit nach einem der Ansprüche 12 bis 14, welcher umfasst: ein erstes Reagens, das das Enzym umfasst; und ein zweites Reagens, das die PAFs umfasst.
  17. Der Kit nach Anspruch 15, wobei das erste Reagens ferner eine Cholinoxidase umfasst.
  18. Verfahren zum Diagnostizieren und / oder Managen einer Krankheit und / oder eines Zustands, der mit Lp- PLA2 in Verbindung steht, wobei das Verfahren das Messen der Aktivität der Lp- PLA2 in einer Probe von einem Subjekt unter Verwendung des Kits gemäß einem der Ansprüche 12 bis 16 umfasst.
  19. Das Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Krankheit und / oder der Zustand, die / der mit Lp- PLA2 In Verbindung steht, eine kardiovaskuläre Erkrankung ist, die mit Atherosklerose in Beziehung steht.
  20. Der Kit nach einem der Ansprüche 12 bis 16, welcher ein Kit zum Diagnostizieren einer Krankheit und / oder eines Zustands ist, die / der mit Lp- PLA2 in Verbindung steht.
  21. Der Kit nach Anspruch 19, wobei die Krankheit und / oder der Zustand, die / der mit Lp- PLA2 In Verbindung steht, eine kardiovaskuläre Erkrankung ist, die mit Atherosklerose in Beziehung steht.
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