JP3693302B2 - カルシウムイオン測定方法および組成物 - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は被検体中に含まれるカルシウムイオンの定量法に関する。さらに詳しくは、被検体を、ホスファチジルグリセロールに作用するホスホリパーゼ及びホスファチジルグリセロールの存在下に作用せしめ、被検体中のカルシウムイオン量に応じて変化するホスホリパーゼの酵素活性を測定することを特徴とするカルシウムイオン測定方法およびホスファチジルグリセロール、ホスホリパーゼＡ2 、リゾホスホリパーゼ、グリセロホスホリルコリンホスホジエステラーゼ、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ、過酸化水素指示薬を含有するカルシウムイオン測定用組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体成分中のカルシウムイオンの定量法として、ｏ−クレゾールフタレインコンプレクソン（ｏ−ｃｒｅｓｏｌｐｈｔｈａｌｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘｏｎｅ；ｏ−ＣＰＣ）法が日常広く用いられている。この方法はｏ−ＣＰＣがアルカリ性下でカルシウムイオンと反応して赤紫色の色素を生成するという原理による発色法であるが、マグネシウムイオンの影響を受けるなど特異性に欠けること、タンパク質や温度の影響を受けるなどの欠点がある。
【０００３】
そのため、近年、より特異性の高い酵素法が種々報告されている。これらは、いずれも酵素のカルシウムイオンによる活性化や阻害作用を利用したもので、
（１）ホスホリパーゼＤを用いるものとして例えば特開昭６２−１９５２９７号公報；レシチン、ホスホリパーゼＤ及びコリンオキシダーゼからなる組成物、特開平４−１８７０９８号公報；コリン系リン脂質、ホスホリパーゼＤ、コリンオキシダーゼ、界面活性剤及び２価金属塩からなる組成物、特開平４−２３９９９号公報；非天然型ホスフォリルコリン誘導体、ホスホリパーゼＤ及びコリンオキシダーゼ又はコリンデヒドロゲナーゼからなる組成物。
【０００４】
（２）ホスホリパーゼＡ2 を用いるものとして例えば特開平１−２３１８９６号公報；ホスフォリルコリンチオエステルを基質に用いてホスホリパーゼＡ2 酵素活性を測定する方法、特開平５−１６８４９８号公報；基質としてコリンリン脂質またはエタノールアミンリン脂質を用いてホスホリパーゼＡ2 酵素活性を測定する方法。
【０００５】
（３）カルモジュリンを用いるものとして例えば特開昭６２−３６１９９号公報）。
（４）ピルビン酸キナーゼを用いるものとして例えば特開平２−１４２４９８号公報。
（５）アミラーゼを用いるものとして例えば臨床化学、１９（補冊）、６９、１９９０年。
（６）トランスアミナーゼを用いるものとして例えば特開平５−２１９９９２号公報などがある。
【０００６】
これらの方法において、（３）はカルモジュリンの入手が困難である点、２段階の活性化を利用するため反応時間が長いという問題がある。（４）はカルシウムイオンの阻害作用を利用したものであるため測定精度に問題点があった。また、（５）は内在性のアミラーゼの影響を受けやすいという点や亜鉛、銅イオン等の影響を受ける。更に（６）は生成物のひとつであるヒドロキサム酸について特異性の高い定量法がないこと、またもう一方の生成物であるアンモニアを定量する場合の内在性アンモニアによる干渉等の問題がある。
【０００７】
また上記（１）及び（２）はホスホリパーゼを用いる方法であるが、これらの測定法で基質として用いられているレシチン等のコリン系リン脂質やエタノールアミンリン脂質の場合には、これらの基質はいずれも水に不溶な界面活性能を有する物質である。従って、水に溶解性の高い他の界面活性剤等と組合せて可溶化された混合ミセルとして用いられるが、ホスファチジルグリセロールに比べ溶解性が低いため、基質濃度に限界があった。
【０００８】
また、レシチンは細胞膜を構成するリン脂質として最も含量が多く、通常血液中にもリポ蛋白の成分として存在するものである。リポ蛋白は、リン脂質やコレステロール等の水に不溶な成分と蛋白質との複合体であり、可溶化された状態で血中に存在する。このリン脂質の約７０％がレシチンであり、この影響により正確な測定が妨げられるという欠点を有する。
【０００９】
更に、リポ蛋白中に存在するコレステロールは、レシチンと複合体を形成することが知られており、医薬、化粧品、食品分野等でレシチン−コレステロール複合体として様々に利用されていることからわかるようにレシチンに対する親和性が強く、特に検体が血液の場合には、大きな影響を与える。コレステロールはそのエステル型も合わせ、通常、低密度リポ蛋白（ＬＤＬ）では約４５％、また高密度リポ蛋白（ＨＤＬ）にも約３０％含まれており、しかもこの含量には大きな個体差が認められるので個々の検体により影響の度合が異なり正確な測定をなし得ない。
【００１０】
これらの種々の問題点を改良するために、上記した非天然型ホスフォリルコリン誘導体を基質とし、ホスホリパーゼＤ及びコリンオキシダーゼ又はコリンデヒドロゲナーゼからなる組成物及び測定法が報告されている（特開平４−２３９９９号公報）。この方法は従来のレシチン基質の代わりに水に対する溶解性を改善するため非天然型とした合成ホスホリルコリン誘導体を基質に用い、ホスホリパーゼＤを作用させる方法であるが、水に対する溶解性を改善した基質であることから天然に存在しないものであり、従って合成が必要である点で実用性に欠け、さらに内在性基質の影響を受けるものであった。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ホスホリパーゼのカルシウムイオンによる活性化反応に基づくカルシウムイオン測定法に関するものである。更に詳しくは、溶解性に優れた基質を用いることにより、精度の高い測定法を、また被検体に内在する成分の影響を受けない正確な測定法を提供するものである。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
これまでにホスホリパーゼＡ2 またはホスホリパーゼＤを用いたカルシウムイオン測定法は種々報告されているが前述のように種々の問題があった。
そこで本発明者らはこのような点に鑑み、調製が簡単でより実用的なカルシウムイオン測定試薬を提供することを目的に鋭意検討した結果、ホスホリパーゼの基質としてレシチンに比べ溶解性の高いホスファチジルグリセロールを基質に用い、ホスファチジルグリセロールに作用するホスホリパーゼを用いることにより、被検体に内在する成分の影響を受けることなくより正確にカルシウムイオンが定量できることを見い出した。
【００１３】
この知見におけるひとつの特徴は、基質濃度を従来に比べ高く設定する事ができるため過剰量の基質という酵素反応にとって理想的な条件設定が可能になったということである。このような条件下ではその測定値は、多少の基質の変動による影響を受けないため、より精度の高い測定が可能となる。また他の特徴は、ホスファチジルグリセロールが血清や尿等の生体成分にほとんど存在しない物質であるため、レシチンを用いたときのような内在性基質の影響を受けない点が挙げられる。さらに本発明者らは意外にもホスファチジルグリセロールを基質に用いた場合、内在性リポ蛋白の影響を殆ど受けないということを見出し本発明を完成するに至った。
【００１４】
本発明は、上記の知見に基づいて完成されたもので、被検体を、ホスファチジルグリセロールに作用するホスホリパーゼ及びホスファチジルグリセロールの存在下に作用せしめ、被検体中のカルシウムイオン量に応じて変化するホスホリパーゼの酵素活性を測定することを特徴とするカルシウムイオン測定方法、およびホスファチジルグリセロール、ホスホリパーゼＡ2 、リゾホスホリパーゼ、グリセロホスホリルコリンホスホジエステラーゼ、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ、過酸化水素指示薬を含有するカルシウムイオン測定用組成物である。
【００１５】
本発明の被検体としては、一般的にはその測定対象の性質上、生体成分である場合が多い。生体成分の例としては生体体液、食品などが挙げられ、例えば血清、血漿、涙液、唾液や尿、牛乳、骨髄、乳製品などが挙げられる。これら被検体は、一般に１μｌ〜５００μｌ、好ましくは３μｌ〜１００μｌの適宜な量を用いればよい。
【００１６】
本発明に用いる基質であるホスファチジルグリセロールは、簡便には市販の試薬を用いればよく、それらは一般的には１位は飽和、２位は飽和または不飽和であり脂肪酸残基の炭素数がＣ8 〜Ｃ24であるが、使用するホスホリパーゼが作用し得る、即ち基質となり得るものであることが必要である。
【００１７】
好ましくはホスファチジルグリセロールの１位が炭素数Ｃ12〜Ｃ20の飽和脂肪酸残基、２位が炭素数Ｃ12〜Ｃ20の飽和または不飽和脂肪酸残基で示されるもので、特に好適には例えばジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジルグリセロール、１−リノレオイル−２−オレオイルホスファチジルグリセロール等の単独または混合物が挙げられ、また例えば、卵黄レシチンよりその塩基交換反応により作られたものや、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジルグリセロール、１−リノレオイル−２−オレオイルホスファチジルグリセロール等の合成ホスファチジルグリセロールが挙げられる。
【００１８】
また、ホスファチジルグリセロールに作用するホスホリパーゼとしては、ホスホリパーゼＡ2 （ＥＣ３．１．１．４）またはホスホリパーゼＤ（ＥＣ３．１．４．４）が挙げられ、ホスホリパーゼＡ2 を用いる場合にはホスホリパーゼＡ2 の酵素活性を測定し、またホスホリパーゼＤを用いる場合にはホスホリパーゼＤの酵素活性を測定して、目的とするカルシウムイオンの測定を行うものである。
【００１９】
このうちホスホリパーゼＡ2 は基質であるホスファチジルグリセロールを含むジアシルグリセロリン脂質の２位の脂肪酸エステル結合の加水分解を触媒する酵素であり、ヘビ毒、ハチ毒、ブタすい臓（臨床酵素ハンドブック、第６０７頁、講談社、１９８２年）やストレプトマイセス属などに存在が知られている。
【００２０】
例えばストレプトマイセス属由来のホスホリパーゼＡ2 （旭化成工業（株）製、カタロクナンバー：Ｔ−３１）を用いた場合、ホスファチジルグリセロールを基質に用いることにより、レシチンを基質に用いた場合に比べ、本発明の効果に加え、その反応性が格段にすぐれており、より少量の酵素でカルシウムイオンの定量が可能であること、また、定量域においてもレシチン基質の場合よりも広いことが示された。また、ブタすい臓、ハチ毒由来の酵素についても、レシチンを用いたときに比べ、必要な酵素量が格段に少なくてすむことが確認された。
【００２１】
本発明においては、ホスホリパーゼの酵素活性が測定されるが、ホスホリパーゼＡ2 の酵素活性の測定につき例示的に説明すると、ホスホリパーゼＡ2 を酵素に用いる場合の反応生成物のひとつであるリゾホスファチジルグリセロールをリゾホスホリパーゼ（ＥＣ３．１．１．５）（ＬＹＰＬ）及びグリセロホスホリルコリンホスホジエステラーゼ（ＥＣ ３．１．４．２）（ＧＰＣＰ）の作用によりグリセロール−３−リン酸を生成せしめ、このグリセロール−３−リン酸を公知の定量手段、好適にはグリセロール−３−リン酸オキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．２１、例えば旭化成工業（株）製、カタロクナンバー：Ｔ−１５、Ｔ−４０）（ＧＰＯ）の作用により、酸素を消費し、ジヒドロキシアセトンリン酸および過酸化水素を形成せしめばよい。
【００２２】
この反応形式を以下に示す。
【００２３】
次いで、この反応において、例えば消費された酸素を酸素電極で定量するか、形成された過酸化水素を過酸化水素電極や過酸化水素指示薬、例えばカプラーとして４−アミノアンチピリン、また水素供与体としてフェノ−ル、３−メチル−Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒドロキシエチル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジンナトリウム、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−アニシジン等の色原体及びペルオキシダーゼ（ＥＣ１．１１．１．７）、蛍光基質や発光基質、例えばフェニルチオヒダントイン、ホモバニリン酸、４−ヒドロキシフェニル酢酸等の蛍光基質、ルミノール、イソルミノール、ルシゲニン等の発光基質を、必要に応じて水素供与体、ペルオキシダーゼの存在下に作用せしめて過酸化水素を定量すればよく、例えば過酸化水素指示薬を用いた場合には反応によって形成された色素を分光光度計を用いて適宜その吸収波長域にて吸光度を求めることにより容易に定量でき、また蛍光基質や発光基質を用いた場合には蛍光光度計または発光検出器により定量すればよい。
【００２４】
前記した反応で用いられるリゾホスホリパーゼについては実質的にホスファチジルグリセロールに作用しないものであれば特に限定はされず、動物、植物、微生物等の起源より取得することができる。微生物由来の酵素としては、ビブリオ属由来の酵素（旭化成工業（株）製、カタログナンバー：Ｔ−３２）が適している。またグリセロホスホリルコリンホスホジエステラーゼも同様に特に限定はされず例えばグリオクラディウム属の酵素（旭化成工業（株）製、カタログナンバー：Ｔ−３３）等が利用できる。これらの酵素については適宜、基質特異性を確認したのち使用すればよい。
【００２５】
また、本発明において用いられるホスホリパーゼＤについては、その由来を含め特に限定はされるものではない。ホスホリパーゼＤはレシチンのコリン−リン酸エステル結合を加水分解する触媒作用を有し、さらにホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール等のグリセロリン脂質にも作用する酵素であるが、その起源としては例えば、キャベツ、ニンジン、ラット脳などの動植物由来（酵素ハンドブック、第４５１頁、朝倉書店、１９８３年）、ストレプトマイセス・クロモファスカスなどの微生物由来のものが挙げられる。
【００２６】
例えば、ストレプトマイセス クロモファスカス（旭化成工業（株）製、カタログナンバー：Ｔ−０７）を用いた場合、酵素の使用量はレシチン基質のときに比べ多く必要とするが、内在性成分の影響に関しての効果は、ホスホリパーゼＡ2 の場合と同等以上であった。
【００２７】
本発明においてホスホリパーゼとしてホスホリパーゼＤを使用する場合、ホスホリパーゼＤの酵素活性が測定される。この場合、被検体中のカルシウムイオンとホスファチジルグリセロールの存在下にてホスホリパーゼＤの酵素活性が発現して生成される反応生成物はホスファチジン酸およびグリセロールである。従って、このホスホリパーゼＤの酵素活性の測定に当たっては、反応生成物であるホスファチジン酸またはグリセロールを公知の方法により測定すればよい。
【００２８】
例えばグリセロールを定量する場合は、ＡＴＰの存在下グリセロールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．３０、例えば旭化成工業（株）製、カタログナンバー：Ｔ−０９）を用いればグリセロール−３−リン酸に転換されるので、このグリセロール−３−リン酸を前述の方法により簡単に定量することができる。
【００２９】
本発明のカルシウムイオン測定法において、基質に用いるホスファチジルグリセロール濃度は０．２〜２０ｍＭ、特に０．８〜４ｍＭが好ましい。またホスホリパーゼの使用量は０．０２５〜１０ｕ／ｍｌが適切であるが、ホスホリパ−ゼＡ2 を用いる場合は０．０２５〜１０ｕ／ｍｌ、特に０．１〜２．５ｕ／ｍｌが好ましく、ホスホリパーゼＤを用いる場合は０．０３〜８ｕ／ｍｌ、特に０．０８〜２ｕ／ｍｌが好ましい。
【００３０】
ＬＹＰＬは１．０〜２０ｕ ／ｍｌ、特に２〜１０ｕ／ｍｌが好ましく、ＧＰＣＰは０．０２〜５ｕ／ｍｌ、特に０．１〜１ｕ／ｍｌが好ましく、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼは１０〜２００ｕ／ｍｌ、特に２０〜１００ｕ／ｍｌが好ましい。また過酸化水素指示薬についてペルオキシダーゼは２〜５０ｕ／ｍｌ、特に４〜２５ｕ／ｍｌが好ましく、色原体は０．２〜３０ｍＭを用いればよい。
【００３１】
さらに反応媒体として、例えばトリス緩衝液、リン酸緩衝液、ＰＩＰＥＳやＨＥＰＥＳ等のグッドの緩衝液などを例えばｐＨ６．５〜８．５に適宜調整して使用すればよい。さらに可溶化助剤として、例えば非イオン界面活性剤、例えばアルキル アリル ポリエーテル アルコール（オクチル フェノキシ ポリエトキシエタノール、商品名；トリトン Ｘ−１００）を０．０５〜５％添加してもよい。
【００３２】
このようにして調製された上記した諸成分組成からなる反応試薬について、例えば１テスト当り反応試薬０．５〜１ｍｌを用い、これに被検体を添加し、３７℃で加温し、例えば２分間以上で１０分間以内、好ましくは５分間以内のホスホリパーゼによる反応を行い、その後簡便には例えば反応で形成された色素を適宜その吸収波長域にて吸光度を求めることにより定量すればよい。これらホスホリパーゼ反応によりホスファチジルグリセロールから生成した物質の定量は、ホスホリパーゼ反応と同時に行ってもよく、または逐次的に行うこともできる。好適にはこの反応の一定時間内の色素の生成速度として定量すればよい。
【００３３】
本発明の測定用組成物の調製に当たっては、反応試薬は一つまたは二つ以上に分け、二つ以上に分けた場合には、それら各成分を適宜組み合わせることもできる。吸光度の測定は分光光度計のみならず、臨床検査室でもよく用いられている自動分析機を用いて連続測定にも適応できる。
【００３４】
【実施例】
次いで、本発明を実施例にて説明するが、本発明は何らこれらによって限定されるものではない。
実施例１
ホスホリパーゼＡ2 （ストレプトマイセス由来）によるカルシウムイオンの定量）
【００３５】
＜試薬１＞
５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）
１．６７ｍＭ ＴＯＯＳ（（株）同仁化学研究所製）
１．２ｍＭ ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（日本精化（株）製）
０．２％トリトン Ｘ−１００（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）
５ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ
２０ｕ／ｍｌ グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ（旭化成工業（株）製）
０．２ｕ／ｍｌ グリセロホスホリルコリンホスホジエステラーゼ（旭化成工業（株）製）
２ｕ／ｍｌ リゾホスホリパーゼ（旭化成工業（株）製）
【００３６】
＜試薬２＞
３００ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）
１０ｍＭ ４−アミノアンチピリン
０．４８ｕ／ｍｌ ホスホリパーゼＡ2 （ストレプトマイセス属由来、旭化成工業（株）製、カタログナンバー：Ｔ−３１）
１８ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ
【００３７】
〔操作〕
上記試薬１を１．５ｍｌずつ分注し、０、０．４、０．８、１．２、１．６、２．０ｍＭの塩化カルシウム水溶液０．０５ｍｌを添加し、３７℃にて５分間予備加温した。その後、試薬２を０．５ｍｌ加え、３７℃において５４６ｎｍの吸光度変化を追跡した。試薬２添加後の３分目、４分目の吸光度を測定し、その差を求めた。被検液の代わりに、水を用いたものを試薬ブランクとして同様の操作を行い、各々の計算値より差し引き、その結果を図１に示した。図１から明らかなように、吸光度変化量は塩化カルシウム濃度に対し、良好な直線性を示した。
【００３８】
実施例２
実施例１使用の酵素に対して、ホスファチジルグリセロールを基質に用いた場合と、ホスファチジルコリン（レシチン）を用いた場合の添加回収率の比較
【００３９】
＜試薬１Ａ＞
５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）
１．６７ｍＭ ＴＯＯＳ（（株）同仁化学研究所製）
１．５ｍＭ ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（日本精化（株）製）
０．３％ トリトン Ｘ−１００
３ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ
２７ｕ／ｍｌ グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ（旭化成工業（株）製）
０．１３ｕ／ｍｌ グリセロホスホリルコリンホスホジエステラーゼ（旭化成工業（株）製）
２ｕ／ｍｌ リゾホスホリパーゼ（旭化成工業（株）製）
【００４０】
＜試薬２Ａ＞
２５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）
１０ｍＭ ４−アミノアンチピリン
０．４８ｕ／ｍｌ ホスホリパーゼＡ2 （ストレプトマイセス属由来、旭化成工業（株）製）
１８ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ
【００４１】
＜試薬１Ｂ＞
５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）
１．６７ｍＭ ＴＯＯＳ（（株）同仁化学研究所製）
１．３３ｍＭ ジパルミトイルホスファチジルコリン（日本精化（株）製）０．２７％ トリトン Ｘ−１００
３ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ
２７ｕ／ｍｌ グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ（旭化成工業（株）製）
０．１３ｕ／ｍｌ グリセロホスホリルコリンホスホジエステラーゼ（旭化成工業（株）製）
２ｕ／ｍｌ リゾホスホリパーゼ（旭化成工業（株）製）
【００４２】
＜試薬２Ｂ＞
２５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）
１０ｍＭ ４−アミノアンチピリン
２．４ｕ／ｍｌ ホスホリパーゼＡ2 （ストレプトマイセス属由来、旭化成工業（株）製）
１８ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ
【００４３】
〔操作〕
精度管理用凍結乾燥プール血清（商品名：コンセーラ（日水製薬（株））９容に対して、０、１０、２０、３０、４０、５０ｍＭ塩化カルシウム溶液１容を混合し、添加回収用の試料とした。各々の試料５０μｌに対して、上記試薬１Ａを１．５ｍｌずつ分注し、３７℃にて５分間予備加温した。その後、試薬２Ａを０．５ｍｌ加え、３７℃において５４６ｎｍの吸光度変化を追跡した。試薬２Ａ添加後の３分目、４分目の吸光度を測定し、その差を求めた。被検試料の代わりに、水を用いたものを試薬ブランクとし同様の操作を行い、各々の計算値より差し引いた。２ｍＭ塩化カルシウム水溶液を標準液として用い、これら測定値を濃度換算し、その添加回収率を求めた。
【００４４】
ホスファチジルグリセロールの代わりにレシチンを用いた試薬１Ｂと試薬２Ｂの組み合わせで 同様の操作を行い、添加回収率を求めた。これらの結果は表１に示した。
【００４５】
【表１】
【００４６】
表１から明らかなように、ホスファチジルグリセロールを基質に用いた場合の添加回収率が９６％〜１０３％と良好であるのに対し、レシチンの場合は、７６％〜８１％と添加回収率が悪かった。
【００４７】
実施例３
血清のカルシウムイオン測定へ及ぼす影響
反応液は上記の実施例２と同じものを使用した。
〔操作〕
脂質検査用管理血清（商品名：リピッドコンセーラ「ニッスイ」、日水製薬（株））を生理食塩水にて５段階希釈した。この０〜１００％のリピッドコンセーラ９容に対し、（１）生理食塩水１容を混合したもの、（２）５０ｍＭ塩化カルシウム溶液１容を混合したもの、を調製し試料とした。操作は、前記実施例２のとおり、ホスファチジルグリセロールを用いたとき（表２）、レシチンを用いたとき（表３）両方につき実施し、結果を同様に濃度換算した。
【００４８】
夫々のリピッドコンセーラ濃度について、塩化カルシウム添加試料の値から塩化カルシウム無添加の値を差し引いた。この値から、リピッドコンセーラ０の時を１００％として、５ｍＭ塩化カルシウムの回収率を計算し、各々の表２、表３に示した。レシチンを基質に用いた場合は、リピッドコンセーラ量の増加に従い、回収率が顕著に低下するのに対して、ホスファチジルグリセロールを用いた場合は殆ど影響を受けていないことが示された。
【００４９】
【表２】
【００５０】
【表３】
【００５１】
実施例４
ホスホリパーゼＡ2 （ブタ膵由来）を用いた場合の添加回収率の比較
＜試薬１Ａ＞
５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）
１．６７ｍＭ ＴＯＯＳ（（株）同仁化学研究所製）
１．２ｍＭ ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（日本精化（株）製）
０．２４％ トリトン Ｘ−１００
３．３３ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ
２７ｕ／ｍｌ グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ（旭化成工業（株）製）
０．２６ｕ／ｍｌ グリセロホスホリルコリンホスホジエステラーゼ（旭化成工業（株）製）
５．２４ｕ／ｍｌ リゾホスホリパーゼ（旭化成工業（株）製）
【００５２】
＜試薬２Ａ＞
２５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
０．２％ ４−アミノアンチピリン
０．６ｕ／ｍｌ ホスホリパーゼＡ2 （ブタ膵由来、ノボ・ノルディスク社製）
１８ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ
０．２Ｍ ＮａＣｌ
【００５３】
＜試薬１Ｂ＞
５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）
１．６７ｍＭ ＴＯＯＳ（（株）同仁化学研究所製）
１．２ｍＭ ジパルミトイルホスファチジルコリン（日本精化（株）製）
０．２４％ トリトン Ｘ−１００
３．３３ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ
２７ｕ／ｍｌ グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ（旭化成工業（株）
製）
０．２６ｕ／ｍｌ グリセロホスホリルコリンホスホジエステラーゼ（旭化成工業（株）製）
５．２４ｕ／ｍｌ リゾホスホリパーゼ（旭化成工業（株）製）
【００５４】
＜試薬２Ｂ＞
２５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
０．２％ ４−アミノアンチピリン
２８ｕ／ｍｌ ホスホリパーゼＡ2 （ブタ膵由来、ノボ・ノルディスク社製）
１８ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ
０．２Ｍ ＮａＣｌ
【００５５】
〔操作〕
精度管理用凍結乾燥プール血清（商品名：コンセーラ（日水製薬（株））９容に対して、０、１０、２０ｍＭ塩化カルシウム溶液１容を混合し、添加回収用の試料とした。おのおのの試料２５μｌに対して上記試薬１Ａを０．７５ｍｌずつ分注し、３７℃にて５分間予備加温した。その後、試薬２Ａを０．２５ｍｌ加え、３７℃において５分間加熱した。反応停止液として０．５％ＳＤＳ溶液２ｍｌを加え、５４６ｎｍの吸光度を測定した。被検試料の代わりに、水を用いたものを試薬ブランクとし同様の操作を行い、各々の測定値より差し引いた。２ｍＭ塩化カルシウム水溶液を標準液として用い、これら測定値を濃度換算し、その添加回収率を求めた。
【００５６】
ホスファチジルグリセロールの代わりにレシチンを用いた試薬１Ｂと試薬２Ｂの組み合わせで 同様の操作を行い、添加回収率を求めた。これらの結果は表４に示した。
【００５７】
【表４】
【００５８】
表４から明らかなように、ホスファチジルグリセロールを基質に用いた場合の添加回収率が９７％〜１０７％と良好であるのに対し、レシチンの場合は、５９％〜６２％と添加回収率が悪かった。
【００５９】
実施例５
ホスホリパーゼＤ（ストレプトマイセス・クロモファスカス由来）によるカルシウムイオンの定量
＜反応液＞
４０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
２ｍＭ ＡＴＰ
２ｍＭ ＭｇＣｌ2
１．５ｍＭ ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（日本精化（株）製）
０．３％ トリトン Ｘ−１００
９ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ
３８ｕ／ｍｌ グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ（旭化成工業（株）製）
０．３ｕ／ｍｌ グリセロールキナーゼ（旭化成工業（株）製）
０．０３％ ４−アミノアンチピリン
０．０２％ フェノール
０．３２ｕ／ｍｌ ホスホリパーゼＤ（ストレプトマイセス・クロモファスカス由来、旭化成工業（株）製）
【００６０】
〔操作〕
上記反応液を１ｍｌずつ分注し３７℃にて予備加温する．０、０．０５、０．１、０．２、０．２５、０．５ｍＭの塩化カルシウム水溶液０．０５ｍｌをそれぞれ添加し３７℃にて正確に５分間反応させた。０．５％ＳＤＳ（１０ｍＭＥＤＴＡを含む）を２ｍｌ加え反応を停止し、５００ｎｍの吸光度を測定した。、その結果を図２に示した。図２から明らかなように、吸光度変化量は、塩化カルシウム濃度に対し、良好な直線性を示した。
【００６１】
実施例６
実施例５使用のホスホリパーゼＤに対して、ホスファチジルグリセロールを基質に用いた場合と、ホスファチジルコリン（レシチン）を用いた場合の添加回収率の比較
【００６２】
＜試薬１Ａ＞
４０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
２．７ｍＭ ＡＴＰ
２．７ｍＭ ＭｇＣｌ2
２ｍＭ ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（日本精化（株）製）
０．４％ トリトン Ｘ−１００
１２ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ
５０ｕ／ｍｌ グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ（旭化成工業（株）製）
０．３ｕ／ｍｌ グリセロールキナーゼ（旭化成工業（株）製）
０．０２７％ フェノール
【００６３】
＜試薬２Ａ＞
４０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
０．１２％ ４−アミノアンチピリン
０．２６ｕ／ｍｌ ホスホリパーゼＤ（ストレプトマイセス・クロモファスカス由来、旭化成工業（株）製）
【００６４】
＜試薬１Ｂ＞
４０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）
３ｍＭ ジパルミトイルホスファチジルコリン（日本精化（株）製）
０．６％ トリトン Ｘ−１００
０．０５２ｕ／ｍｌ ホスホリパーゼＤ（ストレプトマイセス・クロモファスカス由来、旭化成工業（株）製）
【００６５】
＜試薬２Ｂ＞
１００ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）
０．０３％ ４−アミノアンチピリン
０．０２％ フェノール
４．５ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ
６ｍＭ ＥＤＴＡ
５ｕ／ｍｌ コリンオキシダーゼ（旭化成工業（株）製）
【００６６】
〔操作〕
脂質検査用管理血清（商品名：リピッドコンセーラ「ニッスイ」、日水製薬（株））を生理食塩水にて３倍に希釈したもの９容に対して、０、２、４、６ｍＭ塩化カルシウム溶液１容を混合し、添加回収用の試料とした。各々の試料５０μｌに対して、上記試薬１Ａを１．５ｍｌずつ分注し、３７℃にて５分間予備加温した。その後、試薬２Ａを０．５ｍｌ加え、３７℃において５４６ｎｍの吸光度変化を追跡した。試薬２Ａ添加後の３分目、５分目の吸光度を測定し、その差を求めた。
【００６７】
被検試料の代わりに、水を用いたものを試薬ブランクとし同様の操作を行い、各々の計算値より差し引いた。０．５ｍＭ塩化カルシウム水溶液を標準液として用い、これら測定値を濃度換算し、その添加回収率を求めた。次に、ホスファチジルグリセロールの代わりにレシチンを用い、比較検討した。まず、試薬１Ｂ０．５ｍｌを３７℃にて予備加温したものに上記試料１０μｌを加え、３７℃にて１０分間反応させた。
【００６８】
次いで、試薬２Ｂを１ｍｌ加え、ホスホリパーゼＤ反応を止めるとともに、更に３７℃、１５分間加温した。０．５％ＳＤＳ１．５ｍｌを加えたのち５００ｎｍの吸光度を測定した。被検試料の代わりに、水を用いたものを試薬ブランクとし同様の操作を行い、各々の測定値より差し引いた。０．５ｍＭ塩化カルシウム水溶液を標準液として用い、これら測定値を濃度換算し、その添加回収率を求めた。これらの結果は表５に示した。
【００６９】
【表５】
【００７０】
表５から明らかなように、ホスファチジルグリセロールを基質に用いた場合の添加回収率が９８％〜１０８％と良好なのに対し、レシチンの場合は、９．７％〜１２．５％と添加回収率が極端に悪かった。
【００７１】
【発明の効果】
被検体中のカルシウムイオンの量に応じて変化するホスホリパーゼの酵素活性を測定する方法において、基質としてホスファチジルグリセロールを用いることにより、被検体中の内在性成分、特にレシチンやリポ蛋白の悪影響を受けず、簡便で精度の高いカルシウムイオンの測定ができ、かつ良好に測定するための組成物を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ホスホリパーゼＡ2 を用いた場合の塩化カルシウム濃度に対する検量線を表す図である。
【図２】ホスホリパーゼＤを用いた場合の塩化カルシウム濃度に対する検量線を表す図である。
【産業上の利用分野】
本発明は被検体中に含まれるカルシウムイオンの定量法に関する。さらに詳しくは、被検体を、ホスファチジルグリセロールに作用するホスホリパーゼ及びホスファチジルグリセロールの存在下に作用せしめ、被検体中のカルシウムイオン量に応じて変化するホスホリパーゼの酵素活性を測定することを特徴とするカルシウムイオン測定方法およびホスファチジルグリセロール、ホスホリパーゼＡ2 、リゾホスホリパーゼ、グリセロホスホリルコリンホスホジエステラーゼ、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ、過酸化水素指示薬を含有するカルシウムイオン測定用組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体成分中のカルシウムイオンの定量法として、ｏ−クレゾールフタレインコンプレクソン（ｏ−ｃｒｅｓｏｌｐｈｔｈａｌｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘｏｎｅ；ｏ−ＣＰＣ）法が日常広く用いられている。この方法はｏ−ＣＰＣがアルカリ性下でカルシウムイオンと反応して赤紫色の色素を生成するという原理による発色法であるが、マグネシウムイオンの影響を受けるなど特異性に欠けること、タンパク質や温度の影響を受けるなどの欠点がある。
【０００３】
そのため、近年、より特異性の高い酵素法が種々報告されている。これらは、いずれも酵素のカルシウムイオンによる活性化や阻害作用を利用したもので、
（１）ホスホリパーゼＤを用いるものとして例えば特開昭６２−１９５２９７号公報；レシチン、ホスホリパーゼＤ及びコリンオキシダーゼからなる組成物、特開平４−１８７０９８号公報；コリン系リン脂質、ホスホリパーゼＤ、コリンオキシダーゼ、界面活性剤及び２価金属塩からなる組成物、特開平４−２３９９９号公報；非天然型ホスフォリルコリン誘導体、ホスホリパーゼＤ及びコリンオキシダーゼ又はコリンデヒドロゲナーゼからなる組成物。
【０００４】
（２）ホスホリパーゼＡ2 を用いるものとして例えば特開平１−２３１８９６号公報；ホスフォリルコリンチオエステルを基質に用いてホスホリパーゼＡ2 酵素活性を測定する方法、特開平５−１６８４９８号公報；基質としてコリンリン脂質またはエタノールアミンリン脂質を用いてホスホリパーゼＡ2 酵素活性を測定する方法。
【０００５】
（３）カルモジュリンを用いるものとして例えば特開昭６２−３６１９９号公報）。
（４）ピルビン酸キナーゼを用いるものとして例えば特開平２−１４２４９８号公報。
（５）アミラーゼを用いるものとして例えば臨床化学、１９（補冊）、６９、１９９０年。
（６）トランスアミナーゼを用いるものとして例えば特開平５−２１９９９２号公報などがある。
【０００６】
これらの方法において、（３）はカルモジュリンの入手が困難である点、２段階の活性化を利用するため反応時間が長いという問題がある。（４）はカルシウムイオンの阻害作用を利用したものであるため測定精度に問題点があった。また、（５）は内在性のアミラーゼの影響を受けやすいという点や亜鉛、銅イオン等の影響を受ける。更に（６）は生成物のひとつであるヒドロキサム酸について特異性の高い定量法がないこと、またもう一方の生成物であるアンモニアを定量する場合の内在性アンモニアによる干渉等の問題がある。
【０００７】
また上記（１）及び（２）はホスホリパーゼを用いる方法であるが、これらの測定法で基質として用いられているレシチン等のコリン系リン脂質やエタノールアミンリン脂質の場合には、これらの基質はいずれも水に不溶な界面活性能を有する物質である。従って、水に溶解性の高い他の界面活性剤等と組合せて可溶化された混合ミセルとして用いられるが、ホスファチジルグリセロールに比べ溶解性が低いため、基質濃度に限界があった。
【０００８】
また、レシチンは細胞膜を構成するリン脂質として最も含量が多く、通常血液中にもリポ蛋白の成分として存在するものである。リポ蛋白は、リン脂質やコレステロール等の水に不溶な成分と蛋白質との複合体であり、可溶化された状態で血中に存在する。このリン脂質の約７０％がレシチンであり、この影響により正確な測定が妨げられるという欠点を有する。
【０００９】
更に、リポ蛋白中に存在するコレステロールは、レシチンと複合体を形成することが知られており、医薬、化粧品、食品分野等でレシチン−コレステロール複合体として様々に利用されていることからわかるようにレシチンに対する親和性が強く、特に検体が血液の場合には、大きな影響を与える。コレステロールはそのエステル型も合わせ、通常、低密度リポ蛋白（ＬＤＬ）では約４５％、また高密度リポ蛋白（ＨＤＬ）にも約３０％含まれており、しかもこの含量には大きな個体差が認められるので個々の検体により影響の度合が異なり正確な測定をなし得ない。
【００１０】
これらの種々の問題点を改良するために、上記した非天然型ホスフォリルコリン誘導体を基質とし、ホスホリパーゼＤ及びコリンオキシダーゼ又はコリンデヒドロゲナーゼからなる組成物及び測定法が報告されている（特開平４−２３９９９号公報）。この方法は従来のレシチン基質の代わりに水に対する溶解性を改善するため非天然型とした合成ホスホリルコリン誘導体を基質に用い、ホスホリパーゼＤを作用させる方法であるが、水に対する溶解性を改善した基質であることから天然に存在しないものであり、従って合成が必要である点で実用性に欠け、さらに内在性基質の影響を受けるものであった。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ホスホリパーゼのカルシウムイオンによる活性化反応に基づくカルシウムイオン測定法に関するものである。更に詳しくは、溶解性に優れた基質を用いることにより、精度の高い測定法を、また被検体に内在する成分の影響を受けない正確な測定法を提供するものである。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
これまでにホスホリパーゼＡ2 またはホスホリパーゼＤを用いたカルシウムイオン測定法は種々報告されているが前述のように種々の問題があった。
そこで本発明者らはこのような点に鑑み、調製が簡単でより実用的なカルシウムイオン測定試薬を提供することを目的に鋭意検討した結果、ホスホリパーゼの基質としてレシチンに比べ溶解性の高いホスファチジルグリセロールを基質に用い、ホスファチジルグリセロールに作用するホスホリパーゼを用いることにより、被検体に内在する成分の影響を受けることなくより正確にカルシウムイオンが定量できることを見い出した。
【００１３】
この知見におけるひとつの特徴は、基質濃度を従来に比べ高く設定する事ができるため過剰量の基質という酵素反応にとって理想的な条件設定が可能になったということである。このような条件下ではその測定値は、多少の基質の変動による影響を受けないため、より精度の高い測定が可能となる。また他の特徴は、ホスファチジルグリセロールが血清や尿等の生体成分にほとんど存在しない物質であるため、レシチンを用いたときのような内在性基質の影響を受けない点が挙げられる。さらに本発明者らは意外にもホスファチジルグリセロールを基質に用いた場合、内在性リポ蛋白の影響を殆ど受けないということを見出し本発明を完成するに至った。
【００１４】
本発明は、上記の知見に基づいて完成されたもので、被検体を、ホスファチジルグリセロールに作用するホスホリパーゼ及びホスファチジルグリセロールの存在下に作用せしめ、被検体中のカルシウムイオン量に応じて変化するホスホリパーゼの酵素活性を測定することを特徴とするカルシウムイオン測定方法、およびホスファチジルグリセロール、ホスホリパーゼＡ2 、リゾホスホリパーゼ、グリセロホスホリルコリンホスホジエステラーゼ、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ、過酸化水素指示薬を含有するカルシウムイオン測定用組成物である。
【００１５】
本発明の被検体としては、一般的にはその測定対象の性質上、生体成分である場合が多い。生体成分の例としては生体体液、食品などが挙げられ、例えば血清、血漿、涙液、唾液や尿、牛乳、骨髄、乳製品などが挙げられる。これら被検体は、一般に１μｌ〜５００μｌ、好ましくは３μｌ〜１００μｌの適宜な量を用いればよい。
【００１６】
本発明に用いる基質であるホスファチジルグリセロールは、簡便には市販の試薬を用いればよく、それらは一般的には１位は飽和、２位は飽和または不飽和であり脂肪酸残基の炭素数がＣ8 〜Ｃ24であるが、使用するホスホリパーゼが作用し得る、即ち基質となり得るものであることが必要である。
【００１７】
好ましくはホスファチジルグリセロールの１位が炭素数Ｃ12〜Ｃ20の飽和脂肪酸残基、２位が炭素数Ｃ12〜Ｃ20の飽和または不飽和脂肪酸残基で示されるもので、特に好適には例えばジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジルグリセロール、１−リノレオイル−２−オレオイルホスファチジルグリセロール等の単独または混合物が挙げられ、また例えば、卵黄レシチンよりその塩基交換反応により作られたものや、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジルグリセロール、１−リノレオイル−２−オレオイルホスファチジルグリセロール等の合成ホスファチジルグリセロールが挙げられる。
【００１８】
また、ホスファチジルグリセロールに作用するホスホリパーゼとしては、ホスホリパーゼＡ2 （ＥＣ３．１．１．４）またはホスホリパーゼＤ（ＥＣ３．１．４．４）が挙げられ、ホスホリパーゼＡ2 を用いる場合にはホスホリパーゼＡ2 の酵素活性を測定し、またホスホリパーゼＤを用いる場合にはホスホリパーゼＤの酵素活性を測定して、目的とするカルシウムイオンの測定を行うものである。
【００１９】
このうちホスホリパーゼＡ2 は基質であるホスファチジルグリセロールを含むジアシルグリセロリン脂質の２位の脂肪酸エステル結合の加水分解を触媒する酵素であり、ヘビ毒、ハチ毒、ブタすい臓（臨床酵素ハンドブック、第６０７頁、講談社、１９８２年）やストレプトマイセス属などに存在が知られている。
【００２０】
例えばストレプトマイセス属由来のホスホリパーゼＡ2 （旭化成工業（株）製、カタロクナンバー：Ｔ−３１）を用いた場合、ホスファチジルグリセロールを基質に用いることにより、レシチンを基質に用いた場合に比べ、本発明の効果に加え、その反応性が格段にすぐれており、より少量の酵素でカルシウムイオンの定量が可能であること、また、定量域においてもレシチン基質の場合よりも広いことが示された。また、ブタすい臓、ハチ毒由来の酵素についても、レシチンを用いたときに比べ、必要な酵素量が格段に少なくてすむことが確認された。
【００２１】
本発明においては、ホスホリパーゼの酵素活性が測定されるが、ホスホリパーゼＡ2 の酵素活性の測定につき例示的に説明すると、ホスホリパーゼＡ2 を酵素に用いる場合の反応生成物のひとつであるリゾホスファチジルグリセロールをリゾホスホリパーゼ（ＥＣ３．１．１．５）（ＬＹＰＬ）及びグリセロホスホリルコリンホスホジエステラーゼ（ＥＣ ３．１．４．２）（ＧＰＣＰ）の作用によりグリセロール−３−リン酸を生成せしめ、このグリセロール−３−リン酸を公知の定量手段、好適にはグリセロール−３−リン酸オキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．２１、例えば旭化成工業（株）製、カタロクナンバー：Ｔ−１５、Ｔ−４０）（ＧＰＯ）の作用により、酸素を消費し、ジヒドロキシアセトンリン酸および過酸化水素を形成せしめばよい。
【００２２】
この反応形式を以下に示す。
次いで、この反応において、例えば消費された酸素を酸素電極で定量するか、形成された過酸化水素を過酸化水素電極や過酸化水素指示薬、例えばカプラーとして４−アミノアンチピリン、また水素供与体としてフェノ−ル、３−メチル−Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒドロキシエチル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジンナトリウム、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−アニシジン等の色原体及びペルオキシダーゼ（ＥＣ１．１１．１．７）、蛍光基質や発光基質、例えばフェニルチオヒダントイン、ホモバニリン酸、４−ヒドロキシフェニル酢酸等の蛍光基質、ルミノール、イソルミノール、ルシゲニン等の発光基質を、必要に応じて水素供与体、ペルオキシダーゼの存在下に作用せしめて過酸化水素を定量すればよく、例えば過酸化水素指示薬を用いた場合には反応によって形成された色素を分光光度計を用いて適宜その吸収波長域にて吸光度を求めることにより容易に定量でき、また蛍光基質や発光基質を用いた場合には蛍光光度計または発光検出器により定量すればよい。
【００２４】
前記した反応で用いられるリゾホスホリパーゼについては実質的にホスファチジルグリセロールに作用しないものであれば特に限定はされず、動物、植物、微生物等の起源より取得することができる。微生物由来の酵素としては、ビブリオ属由来の酵素（旭化成工業（株）製、カタログナンバー：Ｔ−３２）が適している。またグリセロホスホリルコリンホスホジエステラーゼも同様に特に限定はされず例えばグリオクラディウム属の酵素（旭化成工業（株）製、カタログナンバー：Ｔ−３３）等が利用できる。これらの酵素については適宜、基質特異性を確認したのち使用すればよい。
【００２５】
また、本発明において用いられるホスホリパーゼＤについては、その由来を含め特に限定はされるものではない。ホスホリパーゼＤはレシチンのコリン−リン酸エステル結合を加水分解する触媒作用を有し、さらにホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール等のグリセロリン脂質にも作用する酵素であるが、その起源としては例えば、キャベツ、ニンジン、ラット脳などの動植物由来（酵素ハンドブック、第４５１頁、朝倉書店、１９８３年）、ストレプトマイセス・クロモファスカスなどの微生物由来のものが挙げられる。
【００２６】
例えば、ストレプトマイセス クロモファスカス（旭化成工業（株）製、カタログナンバー：Ｔ−０７）を用いた場合、酵素の使用量はレシチン基質のときに比べ多く必要とするが、内在性成分の影響に関しての効果は、ホスホリパーゼＡ2 の場合と同等以上であった。
【００２７】
本発明においてホスホリパーゼとしてホスホリパーゼＤを使用する場合、ホスホリパーゼＤの酵素活性が測定される。この場合、被検体中のカルシウムイオンとホスファチジルグリセロールの存在下にてホスホリパーゼＤの酵素活性が発現して生成される反応生成物はホスファチジン酸およびグリセロールである。従って、このホスホリパーゼＤの酵素活性の測定に当たっては、反応生成物であるホスファチジン酸またはグリセロールを公知の方法により測定すればよい。
【００２８】
例えばグリセロールを定量する場合は、ＡＴＰの存在下グリセロールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．３０、例えば旭化成工業（株）製、カタログナンバー：Ｔ−０９）を用いればグリセロール−３−リン酸に転換されるので、このグリセロール−３−リン酸を前述の方法により簡単に定量することができる。
【００２９】
本発明のカルシウムイオン測定法において、基質に用いるホスファチジルグリセロール濃度は０．２〜２０ｍＭ、特に０．８〜４ｍＭが好ましい。またホスホリパーゼの使用量は０．０２５〜１０ｕ／ｍｌが適切であるが、ホスホリパ−ゼＡ2 を用いる場合は０．０２５〜１０ｕ／ｍｌ、特に０．１〜２．５ｕ／ｍｌが好ましく、ホスホリパーゼＤを用いる場合は０．０３〜８ｕ／ｍｌ、特に０．０８〜２ｕ／ｍｌが好ましい。
【００３０】
ＬＹＰＬは１．０〜２０ｕ ／ｍｌ、特に２〜１０ｕ／ｍｌが好ましく、ＧＰＣＰは０．０２〜５ｕ／ｍｌ、特に０．１〜１ｕ／ｍｌが好ましく、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼは１０〜２００ｕ／ｍｌ、特に２０〜１００ｕ／ｍｌが好ましい。また過酸化水素指示薬についてペルオキシダーゼは２〜５０ｕ／ｍｌ、特に４〜２５ｕ／ｍｌが好ましく、色原体は０．２〜３０ｍＭを用いればよい。
【００３１】
さらに反応媒体として、例えばトリス緩衝液、リン酸緩衝液、ＰＩＰＥＳやＨＥＰＥＳ等のグッドの緩衝液などを例えばｐＨ６．５〜８．５に適宜調整して使用すればよい。さらに可溶化助剤として、例えば非イオン界面活性剤、例えばアルキル アリル ポリエーテル アルコール（オクチル フェノキシ ポリエトキシエタノール、商品名；トリトン Ｘ−１００）を０．０５〜５％添加してもよい。
【００３２】
このようにして調製された上記した諸成分組成からなる反応試薬について、例えば１テスト当り反応試薬０．５〜１ｍｌを用い、これに被検体を添加し、３７℃で加温し、例えば２分間以上で１０分間以内、好ましくは５分間以内のホスホリパーゼによる反応を行い、その後簡便には例えば反応で形成された色素を適宜その吸収波長域にて吸光度を求めることにより定量すればよい。これらホスホリパーゼ反応によりホスファチジルグリセロールから生成した物質の定量は、ホスホリパーゼ反応と同時に行ってもよく、または逐次的に行うこともできる。好適にはこの反応の一定時間内の色素の生成速度として定量すればよい。
【００３３】
本発明の測定用組成物の調製に当たっては、反応試薬は一つまたは二つ以上に分け、二つ以上に分けた場合には、それら各成分を適宜組み合わせることもできる。吸光度の測定は分光光度計のみならず、臨床検査室でもよく用いられている自動分析機を用いて連続測定にも適応できる。
【００３４】
【実施例】
次いで、本発明を実施例にて説明するが、本発明は何らこれらによって限定されるものではない。
実施例１
ホスホリパーゼＡ2 （ストレプトマイセス由来）によるカルシウムイオンの定量）
【００３５】
＜試薬１＞
５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）
１．６７ｍＭ ＴＯＯＳ（（株）同仁化学研究所製）
１．２ｍＭ ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（日本精化（株）製）
０．２％トリトン Ｘ−１００（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）
５ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ
２０ｕ／ｍｌ グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ（旭化成工業（株）製）
０．２ｕ／ｍｌ グリセロホスホリルコリンホスホジエステラーゼ（旭化成工業（株）製）
２ｕ／ｍｌ リゾホスホリパーゼ（旭化成工業（株）製）
【００３６】
＜試薬２＞
３００ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）
１０ｍＭ ４−アミノアンチピリン
０．４８ｕ／ｍｌ ホスホリパーゼＡ2 （ストレプトマイセス属由来、旭化成工業（株）製、カタログナンバー：Ｔ−３１）
１８ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ
【００３７】
〔操作〕
上記試薬１を１．５ｍｌずつ分注し、０、０．４、０．８、１．２、１．６、２．０ｍＭの塩化カルシウム水溶液０．０５ｍｌを添加し、３７℃にて５分間予備加温した。その後、試薬２を０．５ｍｌ加え、３７℃において５４６ｎｍの吸光度変化を追跡した。試薬２添加後の３分目、４分目の吸光度を測定し、その差を求めた。被検液の代わりに、水を用いたものを試薬ブランクとして同様の操作を行い、各々の計算値より差し引き、その結果を図１に示した。図１から明らかなように、吸光度変化量は塩化カルシウム濃度に対し、良好な直線性を示した。
【００３８】
実施例２
実施例１使用の酵素に対して、ホスファチジルグリセロールを基質に用いた場合と、ホスファチジルコリン（レシチン）を用いた場合の添加回収率の比較
【００３９】
＜試薬１Ａ＞
５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）
１．６７ｍＭ ＴＯＯＳ（（株）同仁化学研究所製）
１．５ｍＭ ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（日本精化（株）製）
０．３％ トリトン Ｘ−１００
３ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ
２７ｕ／ｍｌ グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ（旭化成工業（株）製）
０．１３ｕ／ｍｌ グリセロホスホリルコリンホスホジエステラーゼ（旭化成工業（株）製）
２ｕ／ｍｌ リゾホスホリパーゼ（旭化成工業（株）製）
【００４０】
＜試薬２Ａ＞
２５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）
１０ｍＭ ４−アミノアンチピリン
０．４８ｕ／ｍｌ ホスホリパーゼＡ2 （ストレプトマイセス属由来、旭化成工業（株）製）
１８ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ
【００４１】
＜試薬１Ｂ＞
５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）
１．６７ｍＭ ＴＯＯＳ（（株）同仁化学研究所製）
１．３３ｍＭ ジパルミトイルホスファチジルコリン（日本精化（株）製）０．２７％ トリトン Ｘ−１００
３ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ
２７ｕ／ｍｌ グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ（旭化成工業（株）製）
０．１３ｕ／ｍｌ グリセロホスホリルコリンホスホジエステラーゼ（旭化成工業（株）製）
２ｕ／ｍｌ リゾホスホリパーゼ（旭化成工業（株）製）
【００４２】
＜試薬２Ｂ＞
２５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）
１０ｍＭ ４−アミノアンチピリン
２．４ｕ／ｍｌ ホスホリパーゼＡ2 （ストレプトマイセス属由来、旭化成工業（株）製）
１８ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ
【００４３】
〔操作〕
精度管理用凍結乾燥プール血清（商品名：コンセーラ（日水製薬（株））９容に対して、０、１０、２０、３０、４０、５０ｍＭ塩化カルシウム溶液１容を混合し、添加回収用の試料とした。各々の試料５０μｌに対して、上記試薬１Ａを１．５ｍｌずつ分注し、３７℃にて５分間予備加温した。その後、試薬２Ａを０．５ｍｌ加え、３７℃において５４６ｎｍの吸光度変化を追跡した。試薬２Ａ添加後の３分目、４分目の吸光度を測定し、その差を求めた。被検試料の代わりに、水を用いたものを試薬ブランクとし同様の操作を行い、各々の計算値より差し引いた。２ｍＭ塩化カルシウム水溶液を標準液として用い、これら測定値を濃度換算し、その添加回収率を求めた。
【００４４】
ホスファチジルグリセロールの代わりにレシチンを用いた試薬１Ｂと試薬２Ｂの組み合わせで 同様の操作を行い、添加回収率を求めた。これらの結果は表１に示した。
【００４５】
【表１】
表１から明らかなように、ホスファチジルグリセロールを基質に用いた場合の添加回収率が９６％〜１０３％と良好であるのに対し、レシチンの場合は、７６％〜８１％と添加回収率が悪かった。
【００４７】
実施例３
血清のカルシウムイオン測定へ及ぼす影響
反応液は上記の実施例２と同じものを使用した。
〔操作〕
脂質検査用管理血清（商品名：リピッドコンセーラ「ニッスイ」、日水製薬（株））を生理食塩水にて５段階希釈した。この０〜１００％のリピッドコンセーラ９容に対し、（１）生理食塩水１容を混合したもの、（２）５０ｍＭ塩化カルシウム溶液１容を混合したもの、を調製し試料とした。操作は、前記実施例２のとおり、ホスファチジルグリセロールを用いたとき（表２）、レシチンを用いたとき（表３）両方につき実施し、結果を同様に濃度換算した。
【００４８】
夫々のリピッドコンセーラ濃度について、塩化カルシウム添加試料の値から塩化カルシウム無添加の値を差し引いた。この値から、リピッドコンセーラ０の時を１００％として、５ｍＭ塩化カルシウムの回収率を計算し、各々の表２、表３に示した。レシチンを基質に用いた場合は、リピッドコンセーラ量の増加に従い、回収率が顕著に低下するのに対して、ホスファチジルグリセロールを用いた場合は殆ど影響を受けていないことが示された。
【００４９】
【表２】
【表３】
実施例４
ホスホリパーゼＡ2 （ブタ膵由来）を用いた場合の添加回収率の比較
＜試薬１Ａ＞
５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）
１．６７ｍＭ ＴＯＯＳ（（株）同仁化学研究所製）
１．２ｍＭ ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（日本精化（株）製）
０．２４％ トリトン Ｘ−１００
３．３３ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ
２７ｕ／ｍｌ グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ（旭化成工業（株）製）
０．２６ｕ／ｍｌ グリセロホスホリルコリンホスホジエステラーゼ（旭化成工業（株）製）
５．２４ｕ／ｍｌ リゾホスホリパーゼ（旭化成工業（株）製）
【００５２】
＜試薬２Ａ＞
２５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
０．２％ ４−アミノアンチピリン
０．６ｕ／ｍｌ ホスホリパーゼＡ2 （ブタ膵由来、ノボ・ノルディスク社製）
１８ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ
０．２Ｍ ＮａＣｌ
【００５３】
＜試薬１Ｂ＞
５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）
１．６７ｍＭ ＴＯＯＳ（（株）同仁化学研究所製）
１．２ｍＭ ジパルミトイルホスファチジルコリン（日本精化（株）製）
０．２４％ トリトン Ｘ−１００
３．３３ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ
２７ｕ／ｍｌ グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ（旭化成工業（株）
製）
０．２６ｕ／ｍｌ グリセロホスホリルコリンホスホジエステラーゼ（旭化成工業（株）製）
５．２４ｕ／ｍｌ リゾホスホリパーゼ（旭化成工業（株）製）
【００５４】
＜試薬２Ｂ＞
２５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
０．２％ ４−アミノアンチピリン
２８ｕ／ｍｌ ホスホリパーゼＡ2 （ブタ膵由来、ノボ・ノルディスク社製）
１８ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ
０．２Ｍ ＮａＣｌ
【００５５】
〔操作〕
精度管理用凍結乾燥プール血清（商品名：コンセーラ（日水製薬（株））９容に対して、０、１０、２０ｍＭ塩化カルシウム溶液１容を混合し、添加回収用の試料とした。おのおのの試料２５μｌに対して上記試薬１Ａを０．７５ｍｌずつ分注し、３７℃にて５分間予備加温した。その後、試薬２Ａを０．２５ｍｌ加え、３７℃において５分間加熱した。反応停止液として０．５％ＳＤＳ溶液２ｍｌを加え、５４６ｎｍの吸光度を測定した。被検試料の代わりに、水を用いたものを試薬ブランクとし同様の操作を行い、各々の測定値より差し引いた。２ｍＭ塩化カルシウム水溶液を標準液として用い、これら測定値を濃度換算し、その添加回収率を求めた。
【００５６】
ホスファチジルグリセロールの代わりにレシチンを用いた試薬１Ｂと試薬２Ｂの組み合わせで 同様の操作を行い、添加回収率を求めた。これらの結果は表４に示した。
【００５７】
【表４】
表４から明らかなように、ホスファチジルグリセロールを基質に用いた場合の添加回収率が９７％〜１０７％と良好であるのに対し、レシチンの場合は、５９％〜６２％と添加回収率が悪かった。
【００５９】
実施例５
ホスホリパーゼＤ（ストレプトマイセス・クロモファスカス由来）によるカルシウムイオンの定量
＜反応液＞
４０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
２ｍＭ ＡＴＰ
２ｍＭ ＭｇＣｌ2
１．５ｍＭ ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（日本精化（株）製）
０．３％ トリトン Ｘ−１００
９ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ
３８ｕ／ｍｌ グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ（旭化成工業（株）製）
０．３ｕ／ｍｌ グリセロールキナーゼ（旭化成工業（株）製）
０．０３％ ４−アミノアンチピリン
０．０２％ フェノール
０．３２ｕ／ｍｌ ホスホリパーゼＤ（ストレプトマイセス・クロモファスカス由来、旭化成工業（株）製）
【００６０】
〔操作〕
上記反応液を１ｍｌずつ分注し３７℃にて予備加温する．０、０．０５、０．１、０．２、０．２５、０．５ｍＭの塩化カルシウム水溶液０．０５ｍｌをそれぞれ添加し３７℃にて正確に５分間反応させた。０．５％ＳＤＳ（１０ｍＭＥＤＴＡを含む）を２ｍｌ加え反応を停止し、５００ｎｍの吸光度を測定した。、その結果を図２に示した。図２から明らかなように、吸光度変化量は、塩化カルシウム濃度に対し、良好な直線性を示した。
【００６１】
実施例６
実施例５使用のホスホリパーゼＤに対して、ホスファチジルグリセロールを基質に用いた場合と、ホスファチジルコリン（レシチン）を用いた場合の添加回収率の比較
【００６２】
＜試薬１Ａ＞
４０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
２．７ｍＭ ＡＴＰ
２．７ｍＭ ＭｇＣｌ2
２ｍＭ ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（日本精化（株）製）
０．４％ トリトン Ｘ−１００
１２ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ
５０ｕ／ｍｌ グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ（旭化成工業（株）製）
０．３ｕ／ｍｌ グリセロールキナーゼ（旭化成工業（株）製）
０．０２７％ フェノール
【００６３】
＜試薬２Ａ＞
４０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
０．１２％ ４−アミノアンチピリン
０．２６ｕ／ｍｌ ホスホリパーゼＤ（ストレプトマイセス・クロモファスカス由来、旭化成工業（株）製）
【００６４】
＜試薬１Ｂ＞
４０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）
３ｍＭ ジパルミトイルホスファチジルコリン（日本精化（株）製）
０．６％ トリトン Ｘ−１００
０．０５２ｕ／ｍｌ ホスホリパーゼＤ（ストレプトマイセス・クロモファスカス由来、旭化成工業（株）製）
【００６５】
＜試薬２Ｂ＞
１００ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）
０．０３％ ４−アミノアンチピリン
０．０２％ フェノール
４．５ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ
６ｍＭ ＥＤＴＡ
５ｕ／ｍｌ コリンオキシダーゼ（旭化成工業（株）製）
【００６６】
〔操作〕
脂質検査用管理血清（商品名：リピッドコンセーラ「ニッスイ」、日水製薬（株））を生理食塩水にて３倍に希釈したもの９容に対して、０、２、４、６ｍＭ塩化カルシウム溶液１容を混合し、添加回収用の試料とした。各々の試料５０μｌに対して、上記試薬１Ａを１．５ｍｌずつ分注し、３７℃にて５分間予備加温した。その後、試薬２Ａを０．５ｍｌ加え、３７℃において５４６ｎｍの吸光度変化を追跡した。試薬２Ａ添加後の３分目、５分目の吸光度を測定し、その差を求めた。
【００６７】
被検試料の代わりに、水を用いたものを試薬ブランクとし同様の操作を行い、各々の計算値より差し引いた。０．５ｍＭ塩化カルシウム水溶液を標準液として用い、これら測定値を濃度換算し、その添加回収率を求めた。次に、ホスファチジルグリセロールの代わりにレシチンを用い、比較検討した。まず、試薬１Ｂ０．５ｍｌを３７℃にて予備加温したものに上記試料１０μｌを加え、３７℃にて１０分間反応させた。
【００６８】
次いで、試薬２Ｂを１ｍｌ加え、ホスホリパーゼＤ反応を止めるとともに、更に３７℃、１５分間加温した。０．５％ＳＤＳ１．５ｍｌを加えたのち５００ｎｍの吸光度を測定した。被検試料の代わりに、水を用いたものを試薬ブランクとし同様の操作を行い、各々の測定値より差し引いた。０．５ｍＭ塩化カルシウム水溶液を標準液として用い、これら測定値を濃度換算し、その添加回収率を求めた。これらの結果は表５に示した。
【００６９】
【表５】
表５から明らかなように、ホスファチジルグリセロールを基質に用いた場合の添加回収率が９８％〜１０８％と良好なのに対し、レシチンの場合は、９．７％〜１２．５％と添加回収率が極端に悪かった。
【００７１】
【発明の効果】
被検体中のカルシウムイオンの量に応じて変化するホスホリパーゼの酵素活性を測定する方法において、基質としてホスファチジルグリセロールを用いることにより、被検体中の内在性成分、特にレシチンやリポ蛋白の悪影響を受けず、簡便で精度の高いカルシウムイオンの測定ができ、かつ良好に測定するための組成物を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ホスホリパーゼＡ2 を用いた場合の塩化カルシウム濃度に対する検量線を表す図である。
【図２】ホスホリパーゼＤを用いた場合の塩化カルシウム濃度に対する検量線を表す図である。
Claims (3)
- 被検体を、ホスファチジルグリセロールに作用するホスホリパーゼＡ2 及びホスファチジルグリセロールの存在下に作用せしめ、被検体中のカルシウムイオン量に応じて変化するホスホリパーゼＡ2 の酵素活性を測定することによるカルシウムイオン測定方法であって、該ホスホリパーゼＡ 2 の酵素活性の測定がホスホリパーゼＡ 2 の作用により、カルシウムイオン濃度に応じて生成するリゾホスファチジルグリセロールをリゾホスホリパーゼ、グリセロホスホリルコリンホスホジエステラーゼの作用によりグリセロール−３−リン酸に変換せしめ、このグリセロール−３−リン酸の定量であることを特徴とするカルシウムイオン測定方法。
- 濃度が０．２〜２０ｍＭのホスファチジルグリセロールを用いる請求項１記載のカルシウムイオン測定方法。
- ホスファチジルグリセロール、ホスホリパーゼＡ2 、リゾホスホリパーゼ、グリセロホスホリルコリンホスホジエステラーゼ、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ、過酸化水素指示薬を含有するカルシウムイオン測定用組成物。
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| JP13584294A JP3693302B2 (ja) | 1994-06-17 | 1994-06-17 | カルシウムイオン測定方法および組成物 |
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1994
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