JP4892350B2 - Ｌｐ−ＰＬＡ２活性のハイスループットアッセイ - Google Patents

Description

発明の詳細な説明

（技術分野）
本発明は、一般に、動物由来の試料におけるリポ蛋白関連ホスホリパーゼＡ２（以下「Ｌｐ−ＰＬＡ２」という）酵素活性を測定する方法および材料に関する。

（従来技術）
冠動脈心疾患（以下「ＣＨＤ」という）は多数の産業国における主要な死因である。アテローム性動脈硬化は、動脈にてコレステロールおよび脂質含有のプラークが進行的に集結するところの、動脈硬化または動脈が固くなる形態である。当該集結は心疾患および疾患性冠動脈事象の危険性増大に関連する。動脈におけるプラークの集結は内皮損傷にて生じる免疫応答に関連する。まず、マクロファージ、脂質、コレステロール、カルシウム塩およびコラーゲンと相まって繊維性プラークを形成する平滑筋細胞の遊走および蓄積を惹起する免疫反応に帰因して、単球由来マクロファージが損傷部位にて蓄積する。かかる病変増大は結果として動脈を閉塞させ、血流を制限し得る。

ＰＡＦアセチルヒドロラーゼとしても知られているリポ蛋白関連ホスホリパーゼＡ２（Ｌｐ−ＰＬＡ２）は大きなホスホリーパーゼＡ２スーパーファミリー（Ｔｅｗら（１９９６）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ．１６（４）：５９１−９；Ｔｊｏｅｌｋｅｒら（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ ３７４（６５２２）：５４９−５３）に属する分泌性カルシウム依存性メンバーである。該酵素は単球、マクロファージおよびリンパ球により産生され、ヒト血漿中のＬＤＬと優勢的に関連する（約８０％）ことが分かった。該酵素は血小板活性化因子（以下「ＰＡＦ」という）としても知られている１−Ｏ−アルキル−２−セチル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンのｓｎ−２ エステルを含んでなる極性リン脂質を分解する（Ｔｊｏｅｌｋｅｒら（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ ３７４（６５２２）：５４９−５３）。

多くの観察により未変性、非修飾リポ蛋白質との比較にて酸化ＬＤＬの炎症誘発性活性が実証された。ＬＤＬ酸化における最も初期の事象の１つは、相当量のリゾホスファチジルコリン（リゾ−ＰＣ）および酸化された脂肪酸を産生する、酸化修飾されたホスファチジルコリンの加水分解である。当該加水分解はＬｐ−ＰＬＡ２単独にて仲介される（すなわちＬｐ−ＰＬＡ２はＰＡＦを加水分解し、リゾ−ホスファチジルコリン（「リゾ−ＰＣ」）およびアセテートを生じる）（Ｓｔａｆｆｏｒｉｎｉら（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，１７８９５）。

リゾ−ＰＣは炎症誘発性およびアテローム発生誘発性メディエーターであると推測される。高濃度にて細胞毒性であることに加えて、リゾ−ＰＣは単球およびＴ−リンパ球の走化性刺激ならびにより穏当な濃度にて接着分子および炎症性サイトカインの発現誘発が可能である。リゾ−ＰＣはＬＤＬの抗原性に関与する酸化ＬＤＬ成分としても同定されており、該特徴はアテローム性動脈硬化の炎症性の一因となってもよい。さらに、リゾ−ＰＣはマクロファージ増殖を促進し、また様々な動脈床にて内皮機能の不全を誘発する。リゾ−ＰＣと共に遊離される酸化された脂肪酸もまた単球の化学誘引物質であり、細胞シグナリングのごとき他の生物学的活性に関与していてもよい。Ｌｐ−ＰＬＡ２加水分解の当該生成物は共に単球循環のための強力な化学誘引物質であるため、Ｌｐ−ＰＬＡ２は動脈中のコレステロールエステルを担持する細胞の蓄積に関与し、アテローム性動脈硬化の初期段階に関連する「脂肪線状」の特徴を生じると考えられる。

Ｌｐ−ＰＬＡ２は、酸化的修飾されやすい低密度ＬＤＬの高アテローム発生性リポ蛋白サブフラクションに富むことも見出されている。さらに、酵素レベルは高脂血症、脳卒中、１型および２型糖尿病を患う患者ならびに閉経後の女性にて増大した。血漿Ｌｐ−ＰＬＡ２レベルはそれ自体アテローム性動脈硬化の促進および臨床的な心血管事象の発症の危険性が認められる個体にて上昇する傾向がある。故に、Ｌｐ−ＰＬＡ２酵素の阻害は（リゾホスファチジルコリン形成の阻害により）当該脂肪線状の形成を阻止することが期待され、それ故にアテローム性動脈硬化の処置に有用であろう。さらに、Ｌｐ−ＰＬＡ２は動物が高いＬｐ−ＰＬＡ２レベルまたは高いＬｐ−ＰＬＡ２活性に関連する疾患を発症する危険性があるかどうか決定するための生物マーカーとして用いられ得る。

Ｌｐ−ＰＬＡ２阻害剤はＬＤＬ酸化を阻害する。故に、Ｌｐ−ＰＬＡ２阻害剤は、例えばアテローム性動脈硬化および糖尿病のごとき状態、関節リウマチのごとき他の状態、脳卒中、心筋梗塞（Ｓｅｒｅｂｒｕａｎｙら‘Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ．’９０（２）：１２７−３０（１９９８））、再灌流障害ならびに急性および慢性炎症に加えて、該酵素活性に関連して脂質過酸化に伴って生じる障害にて一般的な用途を有するかもしれない。加えて、Ｌｐ−ＰＬＡ２は冠動脈性心疾患（Ｂｌａｎｋｅｎｂｅｒｇら‘Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ’２００３年５月１日）および動脈硬化（ＴｓｅｌｅｐｉｓおよびＣｈａｐｍａｎ‘Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒ Ｓｕｐｐｌ’３（４）：５７−６８（２００２））の生物マーカーとして目下探究されている。さらに、Ｌｐ−ＰＬＡ２は以下の疾患：呼吸窮迫症候群（Ｇｒｉｓｓｏｍら‘Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．’３１（３）：７７０−５（２００３）；免疫グロブリンＡ腎症（Ｙｏｏｎら‘Ｃｌｉｎ Ｇｅｎｅｔ’６２（２）：１２８−３４（２００２）；大腿膝窩動脈バイパスの移植片開存性（Ｕｎｎｏら‘Ｓｕｒｇｅｒｙ’１３２（１）：６６−７１（２００２）；口腔炎症（ＭｃＭａｎｕｓおよびＰｉｎｃｋａｒｄ‘Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｏｒａｌ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ．’１１（２）：２４０−５８（２０００））；気道炎症および過敏性（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎら‘Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．’１５；１６４（６）：３３６０−７（２０００））；ＨＩＶおよびＡＩＤＳ（Ｋｈｏｖｉｄｈｕｎｋｉｔら‘Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．’４８（１２）：１５２４−３１（１９９９））；喘息（Ｓａｔｏｈら‘Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．’１５９（３）：９７４−９（１９９９））；若年性関節リウマチ（Ｔｓｅｌｅｐｉｓら‘Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．’４２（２）：３７３−８３（１９９９））；ヒト中耳貯留液（Ｔｓｕｊｉら‘ＯＲＬ Ｊ Ｏｔｏｒｈｉｎｏｌａｒｙｎｇｏｌ Ｒｅｌａｔ Ｓｐｅｃ．’６０（１）：２５−９（１９９８））；総合失調症（Ｂｅｌｌら‘Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．’２９；２４１（３）：６３０−５ ９ （１９９７））；壊死性全腸炎発症（Ｍｕｇｕｒｕｍａら‘Ａｄｖ Ｅｘｐ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ．’４０７：３７９−８２（１９９７））；および虚血性腸壊死（‘Ｐｅｄｉａｔｒ Ｒｅｓ．’３４（２）：２３７−４１（１９９３））への関与が示されている。

分光学的活性および蛍光性活性アッセイ（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、ＡｔｈｅｒｏＧｅｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．およびＫａｒｌａｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を用いてヒト試料のＬｐ−ＰＬＡ２活性を測定した。Ｋｏｓａｋａら‘Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ Ａｃｔａ’２９６（１−２）：１５１−６１（２０００）およびＫｏｓａｋａら‘Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ Ａｃｔａ’３１２（１−２）：１７９−８３（２００１）も参照のこと。しかしながら、Ｌｐ−ＰＬＡ２阻害剤が存在する場合、特に動物から試料を得る前に阻害剤が該動物に投与される場合に、当該法は非感受性であり得る。本発明のアッセイは試料中のＬｐ−ＰＬＡ２阻害剤濃度とＬｐ−ＰＬＡ２活性との相関を実証した。阻害剤で処置した患者にて経時的に測定されたＬｐ−ＰＬＡ２活性は、阻害剤の薬物動態学的特性と相関関係にあった。

放射標識されたＰＡＦはＬｐ−ＰＬＡ２活性に関するロースループットアッセイにて用いられてきた（Ｔｓｅｌｅｐｉｓら‘Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ．’１５（１０）：１７６４−７３（１９９５）およびＭｉｎら‘Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，’４０（１５）：４５３９４５４９（２００１）。しかしながら、当該法はハイスループット法として開発されず、故に、本発明と比較して大規模研究には有用ではない。ハイスループット法を用いるＥＬＩＳＡアッセイにてヒト試料由来のＬｐ−ＰＬＡ２濃度を測定した。利用可能な当該活性アッセイとマス・アッセイまたはＥＬＩＳＡアッセイの間には強い相関が見られた。しかしながら、マス・アッセイまたはＥＬＩＳＡアッセイは試料中のＬｐ−ＰＬＡ２阻害剤の検出には恐らく非感受性であろう。阻害剤の有無に関わらず大規模研究にてＬｐ−ＰＬＡ２活性を測定するために、または選択された生物マーカーとしてのＬｐ−ＰＬＡ２について多数の試料をスクリーニングするために、ハイスループット活性プロトコルが必要である。故に、複数の試料のＬＰ−ＰＬＡ２活性測定方法が非常に必要である。

（発明の概要）
故に、本発明の目的の１つは、標識された血小板活性化因子（ＰＡＦ）を含む溶液を調製する工程；複数の組織試料の各々を調製工程の溶液およびＰＡＦのシークエスター（Ｓｅｑｕｅｓｔｅｒ）分子と接触させ、ＰＡＦ−シークエスター分子の複合体を形成する工程；該ＰＡＦ−シークエスター分子の複合体を取り出す工程；およびＬｐ−ＰＬＡ２活性を検出する工程を含んでなる、試料中のリポ蛋白関連ホスホリパーゼＡ２（Ｌｐ−ＰＬＡ２）酵素活性を測定する方法を提供することである。

本発明の別の目的は、血小板活性化因子（ＰＡＦ）、ＰＡＦのシークエスター分子および沈殿化溶液を含有する複数の試料におけるＬｐ−ＰＬＡ２酵素活性を測定するためのキットを提供することである。

（発明の詳細な記載）
用語
本明細書中用いる「シークエスター分子」は、他の分子および／または溶液から第２分子の分離を促進するように、単独または他の分子もしくは共同因子と相まって第２分子と複合体を形成し得る任意の分子をいう。例えば、シークエスター分子は第２分子に付着し、それを溶液から沈殿させる蛋白質であってもよく、または第２分子上で電荷を帯び、それが正または負電極に引き寄せられやすいようにする蛋白質であってもよい。ＰＡＦに対するシークエスター分子の例はウシ血清アルブミン（以下「ＢＳＡ」という）およびヒト血清アルブミンを包含するが、これらに限定されない。

本明細書中用いる「ＰＡＦ−シークエスター分子の複合体」は、シークエスター分子がＰＡＦに接触し、他の分子および／または溶液からＰＡＦの分離が促進されるようにシークエスター分子に結合したＰＡＦをいう。一例として、ＢＳＡと複合体を形成してもよく、それは溶液から沈殿し得る。ＰＡＦ−シークエスター分子の複合体はシークエスター分子との複合体中に、分解されていないＰＡＦおよびリゾ−ＰＣの両方を包含してもよい。ＰＡＦ−ＢＳＡ複合体はＰＡＦ−シークエスター分子の複合体の一例である。

本明細書中用いる「Ｌｐ−ＰＬＡ２酵素活性」は、任意のＬｐ−ＰＬＡ２酵素活性を包含するが、これに限定されない。当該活性は酵素の基質との結合、生成物の放出、および／またはリン脂質もしくは他の分子の加水分解を包含するが、これらに限定されない。

「ポリペプチド」は、ペプチド結合または修飾されたポリペプチド結合により各々他と結合している２つまたはそれ以上のアミノ酸を含んでなる任意のペプチドまたは蛋白質をいう。「ポリペプチド」は、通常ペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーと呼ばれる短鎖、ならびに通常蛋白質と呼ばれる長鎖をいう。ポリペプチドは２０種の遺伝子コードアミノ酸以外のアミノ酸を含んでもよい。「ポリペプチド」はプロセシングおよび他の翻訳後修飾のごとき自然工程だけでなく化学的修飾技法により修飾されたものも包含する。かかる修飾は基本書、さらには研究論文および多量の研究文献にて詳細に記述されており、当業者に知られている。任意のポリペプチドのいくつかの部位にて同じまたは異なる程度で同種の修飾が存在していてもよいということが理解されよう。また、任意のポリペプチドは多種の修飾を含んでいてもよい。修飾はペプチドバックボーン、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシル末端を包含するポリペプチド中の任意の場所にて生じ得る。例えば、修飾はアセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化，フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、閉環、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋形成、システイン形成、ピログルタミン酸形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨー素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、蛋白質分解的プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、グリコシル化、脂質付着、硫酸化、グルタミン酸残基のγ−カルボキシル化、ヒドロキシル化およびＡＤＰ−リボシル化、セレノイル化（Ｓｅｌｅｎｏｙｌａｔｉｏｎ）、硫酸化、蛋白質への転移−ＲＮＡ仲介アミノ酸付加（例えばアルギニル化）およびユビキチン化を包含する。

例えば、ＰＲＯＴＥＩＮＳ−ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）ａｎｄ Ｗｏｌｄ，Ｆ．，Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ，ｐｇｓ．１−１２ ｉｎ ＰＯＳＴＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮＡＬ ＣＯＶＡＬＥＮＴ ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒら‘Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．’１８２：６２６−６４６（１９９０）およびＲａｔｔａｎら‘Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ａｇｉｎｇ’Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６３：４８−６２（１９９２）を参照のこと。ポリペプチドは分岐しているか、または分岐に関係なく鎖状であってよい。分岐鎖状および分岐環状のポリペプチドは翻訳後の自然工程から生じてもよく、さらに完全な合成法により合成されてもよい。

本明細書中用いる「沈殿化溶液」は溶液からＰＡＦ−シークエスター分子の複合体を沈殿し得る任意の溶液をいう。沈殿化溶液はトリクロロ酢酸（「ＴＣＡ」）、デキストランまたはポリエチレングリコールのごとき非イオン性ポリマーまたはＭｎ^２＋、Ｆｅ^２＋、Ｃｏ^２＋、Ｎｉ^２＋、Ｚｎ^２＋、Ｃｄ^２＋、Ｃａ^２＋、Ｂａ^＋２、Ｍｇ^＋２、Ｐｂ^＋２、Ａｇ^＋、Ｈｇ^２＋およびＰｂ^２＋のごとき金属イオンを包含するが、これらに限定されない。沈殿化溶液に等電沈殿を利用してもよく、すなわち、溶液の塩濃度を変え、沈殿を促進してもよい。沈殿化溶液は有機溶媒添加により溶液の誘電率を変化させてもよい。沈殿化溶液中用いられてもよい有機溶媒は２メチル−２，４−ペンタンジオール（ＭＰＤ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、アセトンおよびエタノールを包含するが、これらに限定されない。沈殿化溶液は沈殿を促進するようにＰＡＦのシークエスター分子含有溶液のｐＨを変化させてもよい。

本明細書中用いる「濾過」または「濾過する」は溶液からの任意の物質の取り出しを包含するが、これらに限定されず、さらに濾紙、ワットマン紙、チーズクロス、あるいは物理的および／または化学的特性に基づき溶液から物質を特異的に取り出すカラムに、取り出すべき物質を含有する溶液を通すことを包含してもよい。取り出すべき物質はＰＡＦ−シークエスター分子の複合体を包含してもよい。濾過により物質を取り出すために用いられてよい物理的および化学的特性は、カラム充填剤に結合しやすくさせるイオン電荷、大きさ、分子量、極性および／または物質と結合する化学的部分を包含するが、これらに限定されない。溶液からの物質除去を促進するための濾過は重力、真空および／または遠心の使用を包含してもよい。

本明細書中用いる「シンチレーションカクテル」は液体シンチレーションのために溶解度を高め試料の均一懸濁を維持し得る有機溶媒を一般的に含有している、溶質および溶液の混合物をいう。液体シンチレーション工程はβ線放出の捕獲による試料内のβ崩壊検出を含む。シンチレーションカクテル混合物はβ線放出を捕獲し、シンチレーション計数装置内の光電子増倍管にて検出可能である光子放出に変換するよう設計されている。いくつかのシンチレーションカクテルは市販されている。シンチレーションカクテルの組成の修飾は試料に依存して液体シンチレーションからの検出可能な読み取りに効果を及ぼし、および／または最適化し得るということが理解される。

本明細書中用いる「組織」は血清、細胞溶解物、組織溶解物、尿、血漿、プラーク、単球またはマクロファージ細胞を包含する。当該組織はＬｐ−ＰＬＡ２、そのホモログまたはオルソログを発現するヒト、ヒトでない哺乳類または他の動物由来であり得る。
本明細書で提供される式にて用いられる記号「＊」は乗法の数学関数である。

Ｌｐ−ＰＬＡ２は公知のリン脂質加水分解酵素である。Ｌｐ−ＰＬＡ２はｓｎ−２位にてリン脂質を分解しリゾホスファチジルコリン（リゾ−ＰＣ）および酸化された脂肪酸を生成し得る。ＰＡＦはｓｎ−２位に炭素数２のアシル基を有し；故にＰＡＦがＬｐ−ＰＬＡ_２により加水分解される場合には、この短いアシル基はその分子の残渣、リゾホスファチジルコリン（リゾ−ＰＣ）より、水溶性アセテートとして切断される。リゾ−ＰＣが水溶液から沈殿し得る条件下でアセテートは水溶性である。例えば、ＢＳＡのごときシークエスター分子は分解されていないＰＡＦおよび／またはリゾ−ＰＣと結合して、複合体を形成し得る。ついで、この複合体は溶液から除去され、溶液中に水溶性小分子（この場合アセテート）を残存させ得る。沈殿後の溶液に残存する水溶性小分子定量のために多数の方法が存在するということは当該分野にて理解されよう。例えば、アセテートは分解される前に放射標識に付し、液体シンチレーションにより検出してもよい。或いは、溶液から沈殿したホスホコリン量を検出し、Ｌｐ−ＰＬＡ２活性を測定してもよい。

本発明の一の実施形態は、試料中のＬｐ−ＰＬＡ２酵素活性を測定する方法であって、標識されたＰＡＦを含む溶液を調製する工程；複数の組織試料の各々を、調製工程の溶液と、およびＰＡＦのシークエスター分子と接触させてＰＡＦ−シークエスター分子の複合体を形成する工程；該ＰＡＦ−シークエスター分子の複合体を除去する工程；およびＬｐ−ＰＬＡ２活性を検出する工程、を含む方法を提供することである。一の態様において、そのＰＡＦのシークエスター分子は沈殿、遠心分離および／または濾過により除去することができる。もう一つ別の態様において、少なくとも一の試料を、Ｌｐ−ＰＬＡ２阻害物質が投与されている動物より得る。

さらなる実施態様にて、組織試料を調製工程の溶液に接触すること、およびＰＡＦのシークエスター分子に接触させＰＡＦ−シークエスター分子の複合体を形成することは、同時または別段階（順は任意）で実施されてもよい。

本発明のさらにもう一つ別の実施態様は、複数の試料中のリポ蛋白関連ホスホリパーゼＡ２（Ｌｐ−ＰＬＡ２）酵素活性を測定する方法であって、標識された血小板活性化因子（ＰＡＦ）を含む溶液を調製する工程；その複数の組織試料の各々をその調製工程の溶液と第一に接触させる工程；その第一の接触工程の各々の溶液をＰＡＦのシークエスター分子と第二に接触させてＰＡＦ−シークエスター分子の複合体を形成する工程；該ＰＡＦ−シークエスター分子の複合体を沈殿化溶液と接触させて沈殿物を形成する工程；その沈殿物を上清から分離する工程；およびＬｐ−ＰＬＡ２活性を検出する工程、を含む方法を提供することである。本発明の一の態様において、少なくとも一の試料は血液を含む。一の態様において、ＰＡＦのシークエスター分子は遠心分離および／または濾過により分離されてもよい。もう一つ別の態様において、少なくとも一の試料は容量が約５μＬである。もう一つ別の態様において、複数の試料の各々を微小遠心管またはマイクロタイタープレート上のウェルにアリコートされる。

本発明の別の態様において、標識されたＰＡＦは放射標識されている。標識されたＰＡＦはトリチウム化されているかまたは^１４Ｃで標識されていてもよい。本発明の別の態様において、標識されたＰＡＦは溶液中ＰＡＦの最大２０％を含み、別の態様において、ＰＡＦ溶液にて約０．４％ないし約２．０％である。ＰＡＦは溶液中少なくとも約２０μＭの濃度を有していてもよい。本発明の別の態様において、ＰＡＦはＬｐ−ＰＬＡ２の基質である。別の態様において、ＰＡＦは緩衝溶液中にある。緩衝溶液は４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）およびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含有してもよい。

本発明の別の態様において、調製工程の溶液を試料と少なくとも５秒間混合し、約２１℃で少なくとも約１分間インキュベートすることを含んでなる方法が提供される。試料は調製工程の溶液と一緒に約５分間インキュベートされてもよい。

本発明の別の態様において、接触工程のシークエスター分子は外因性ウシ血清アルブミンであるが、内因性ヒト血清アルブミンであってもよい。ＢＳＡの温度は約１０℃未満であってもよく、約４℃であってもよい。別の態様において、ＢＳＡは約５０ｍｇ／ｍＬの濃度である。さらなる別の態様において、シークエスター分子および試料は１０℃未満で少なくとも約１分間インキュベートされる。

本発明の別の態様において、沈殿化溶液はＴＣＡを含有する。別の態様において、ＴＣＡ含有沈殿化溶液は約１０℃未満である。別の態様において、ＴＣＡは水に対して約５６％容量／容量の濃度を有する。別の態様において、第二接触工程の溶液はＴＣＡを含有する溶液と少なくとも１分間インキュベートされる。沈殿は約１０℃未満で約５分間、少なくとも約６，０００ｇの遠心分離により上清から分離されてもよい。別の態様において、遠心分離は約４℃で約１５分間行われる。

本発明のもう一つ別の態様において、緩衝溶液を全計数反応またはブランク反応として用いるための少なくとも２つの容器にアリコートする。これらの容器は微小遠心管またはマイクロタイタープレート上のウェルであってよい。もう一つ別の態様において、緩衝溶液は、ＰＡＦが溶液に添加されていないところの、調製工程の溶液と同じである。本発明のもう一つ別の態様において、全計数反応およびブランク反応のためにアリコートされた緩衝溶液の容量は各試料の反応に使用される試料の容量と同じである。調製工程の溶液およびシークエスター分子を、試料と同じ容量、濃度、接触および沈殿条件にて、ブランク反応として用いるための緩衝溶液のアリコートに添加してもよい。本発明のもう一つ別の態様において、少なくとも２つの全計数反応のアリコートを、略同じ容量の調製工程の溶液およびシークエスター分子の置換溶液（この置換溶液はシークエスター分子を含有しない）と接触される。試料および／またはブランク反応物に添加されるシークエスター分子を含む溶液とほぼ同じ容量で、緩衝溶液または蒸留水が全計数反応物の各々に添加されてもよい。

本発明の別の態様において、各試料の上清部分、ブランク反応物および全計数（Ｔｏｔａｌ ｃｏｕｎｔ）反応物が別容器にアリコートされる。上清、ブランク反応物および全計数反応物の各アリコートはシンチレーションカクテルに接触され、少なくとも約１分間シンチレーション計数装置にて計数されてもよい。

本発明の別の態様において、ＣＰＭ_全計数は式：
ＣＰＭ_全計数＝（ＣＰＭ_{正味全計数}＊Ｖ_ＲＴ）／（Ｖ_ＳＡ）
［ここで、
ＣＰＭ_{正味全計数}＝全計数反応物から由来の上清のアリコートにおける正味平均計数；
Ｖ_ＲＴ＝遠心分離前の最終反応溶液の全容量；および
Ｖ_ＳＡ＝シンチレーションカウンティング用にアリコートされた全計数反応物から由来の上清の容量である］
を用いて、全計数反応の正味平均計数として算出される。

別の態様において、各上清のＬｐ−ＰＬＡ２活性は式：
Ｌｐ−ＰＬＡ２活性（ナノモル／分／ｍｌ）＝Ｓ＊（ＣＰＭ_試料ＣＰＭ_ブランク）＊Ｖ_ＳＴ／（ＣＰＭ_全計数＊Ｖ_ＳＡ＊Ｖ＊Ｔ）
［ここで、
Ｓ＝調製工程の溶液中のＰＡＦ全量（ナノモル）；
ＣＰＭ_試料＝各試料の上清の平均計数；
ＣＰＭ_ブランク＝ブランク反応物の上清の平均計数；
Ｖ_ＳＴ＝上清の全容量；
ＣＰＭ_全計数＝全計数反応物の平均計数；
Ｖ_ＳＡ＝シンチレーションカウンティング用にアリコートされた各上清の容量；
Ｖ＝第一接触工程にてアリコートされた試料の全容量（μＬ）；および
Ｔ＝第一接触工程の総時間（分）である］
を用いて算出される。

本発明の別の態様において、緩衝溶液はブランク反応用に少なくとも２つの容器にアリコートされる。当該容器は微小遠心管またはマイクロタイタープレート上のウェルであってもよい。別の態様において、緩衝溶液は、ＰＡＦが溶液に添加されていないところの、調製工程の溶液と同じである。本発明の別の態様において、ブランク反応用にアリコートされた緩衝溶液の容量は各試料の反応に用いられる試料の容量と同じである。調製工程の溶液はブランク反応用に試料と同じ容量、濃度、接触および沈殿条件にて緩衝溶液アリコートへ添加されてもよい。

本発明の別の態様において、調製工程の溶液アリコートは総添加計数（Ｔｏｔａｌ ａｄｄｅｄ ｃｏｕｎｔ）用に少なくとも１つのブランク反応物と接触される。調製工程の溶液のアリコートの容量は約１μＬないし約２０μＬであってもよく、または約１０μＬであってもよい。本発明の別の態様において、上清、ブランク反応物および総添加計数用の各アリコートはシンチレーションカクテルに接触され、少なくとも約１分間シンチレーション計数装置にて計数される。

本発明の別の態様において、ＣＰＭ_{総添加計数}を式：
ＣＰＭ_{総添加計数}＝（ＣＰＭ_{正味スパイク計数}＊Ｖ_ＰＡＦ）／（Ｖ_スパイク）
［ここで、
ＣＰＭ_{正味スパイク計数}＝総添加計数から由来の上清の正味平均計数；
Ｖ_ＰＡＦ＝第一接触工程にて添加した調製工程の溶液の容量；
Ｖ_スパイク＝総添加計数用にブランク反応物上清に添加された調製工程の溶液の容量であ る］
を用いて容量調整した、総添加計数反応物の正味平均計数として算出した。

本発明の別の態様において、Ｌｐ−ＰＬＡ２活性を式：
Ｌｐ−ＰＬＡ２活性（ナノモル／分／ｍｌ）＝Ｓ＊（ＣＰＭ_試料−ＣＰＭ_ブランク）＊Ｖ_ＳＴ／（ＣＰＭ_{総添加計数}＊Ｖ_ＳＡ＊Ｖ＊Ｔ）
［ここで、
Ｓ＝調製工程の溶液中の全ＰＡＦ量（ナノモル）；
ＣＰＭ_試料＝各試料上清の平均計数；
ＣＰＭ_ブランク＝ブランク反応物から由来の上清の平均計数；
Ｖ_ＳＴ＝上清の全容量；
ＣＰＭ_{総添加計数}＝総添加計数の平均計数；
Ｖ_ＳＡ＝シンチレーションカウンティング用にアリコートした各上清の容量；
Ｖ＝第一接触工程にてアリコートした試料の全容量（μＬ）；および
Ｔ＝第一接触工程の総時間（分）である］
を用いて各上清にて算出した。

本発明の別の実施態様において、血小板活性化因子（ＰＡＦ）、ＰＡＦのシークエスター分子およびＴＣＡを含有する溶液を含んでなる複数の血液試料におけるリポ蛋白関連ホスホリパーゼＡ２（Ｌｐ−ＰＬＡ２）酵素活性を測定するためのキットが提供される。

下記実施例は本発明の種々の態様を説明する。当該実施例は添付の請求の範囲にて定義される本発明の範囲を限定しない。

実施例
実施例１．封鎖および沈殿のためのＢＳＡ濃度滴定
ＢＳＡ濃度および遊離^３Ｈ−ＰＡＦとの接触時間を試験した。緩衝溶液中の濃度が２００μＭの^３Ｈ−ＰＡＦを濃度１．０４ｍｇ／ｍＬないし１６．６７ｍｇ／ｍＬのＢＳＡに５分間または一晩接触させた。ついで、ＢＳＡおよびＰＡＦ複合体を７．７８％ ＴＣＡで沈殿させ、４℃で１５分間、６，０００ｇの遠心分離によりペレットを得た。溶液に残存する遊離^３Ｈ−ＰＡＦの割合をシンチレーションカウンティングにより上清にて測定した。表１に示すように、沈殿として溶液から除去された遊離ＰＡＦの割合はＢＳＡ濃度およびインキュベーション時間の増大と共に増大した。
表１．ＰＡＦ封鎖のためのＢＳＡ濃度滴定

実施例２．ＴＣＡ沈殿の時間および温度の至適化
緩衝溶液中の^３Ｈ−ＰＡＦを濃度１６．６７ｍｇ／ｍＬのＢＳＡで封鎖し、氷上で５分間インキュベートした。ＰＡＦを７．７８％ 氷冷ＴＣＡで沈殿させ、氷上で１５分間インキュベートするか、あるいは室温にて７．７８％ ＴＣＡで沈殿させ、ついで室温にて５、１０または２０分間インキュベートした。表２で示すように、氷冷ＴＣＡおよび続く氷上での１５分間のインキュベーションにおいて溶液に残存するＰＡＦ割合が最も小さかった。
表２．ＴＣＡ沈殿

実施例３．ＰＡＦ−ＢＳＡ複合体遠心分離
緩衝溶液中の^３Ｈ−ＰＡＦを濃度１６．６ｍｇ／ｍＬのＢＳＡで封鎖し、氷上で５分間インキュベートした。ＰＡＦ−ＢＳＡ複合体を７．７８％ 氷冷ＴＣＡで沈殿させ、氷上で１５分間インキュベートした。沈殿したＰＡＦ−ＢＳＡ複合体を微小遠心力８００ｇないし１３，０００ｇにて遠心分離した。遠心分離後、溶液に残存する^３Ｈ−ＰＡＦ割合を測定した。５，０００ｇ未満の微小遠心力を用いて約１．３％ないし約２％のＰＡＦ−ＢＳＡ複合体が溶液に残存した。微小遠心力を少なくとも６，０００ｇに増大した場合、わずか約１．１％またはそれ未満のＰＡＦ−ＢＳＡ複合体だけが溶液に残存した。

実施例４．経時的な反応温度に影響されるＬｐ−ＰＬＡ２活性
３７℃および室温（約２１℃）にてＬｐ−ＰＬＡ２をＰＡＦと３０分間反応させ、該活性をＰＡＦから放出された生成物の放射能（すなわち、毎分の壊変数／ＤＰＭ）としてシンチレーションカウンティングにて測定した。反応速度は反応温度に関わらず３０分間にわたり直線的であった。３７℃にて実施した反応は室温にて実施した反応より高いＬｐ−ＰＬＡ２活性を示した。３０分でのＬｐ−ＰＬＡ２活性は３７℃での反応については約８０，０００ＤＰＭ、室温での反応については４０，０００ＤＰＭであった。

実施例５．反応生成物のシンチレーションカウンティング用カクテル
市販シンチレーション用カクテル３種を緩衝溶液中のＰＡＦ放射能を測定するために用いた。ＭｉｃｒｏＳｃｉｎｔ−２０（登録商標）、ＭｉｃｒｏＳｃｉｎｔ−４０（登録商標）およびＳｃｉｎｔｉｓａｆｅ（登録商標）を試験した。ＰＡＦ溶液４０μＬのカウント毎分（ＣＰＭ）はＭｉｃｒｏＳｃｉｎｔ−４０よりＭｉｃｒｏＳｃｉｎｔ−２０が高かった。加えて、ＭｉｃｒｏＳｃｉｎｔ−４０中の反応生成物８０μＬの計数はＭｉｃｒｏＳｃｉｎｔ−２０中の同じ反応生成物４０μＬの放射能の２倍には至らなかった。同様に、ＭｉｃｒｏＳｃｉｎｔ−２０はＳｃｉｎｔｉＳａｆｅより非常に高い計数効率（３０％）を示した。

実施例６．Ｌｐ−ＰＬＡ２活性を測定するための血漿希釈液の直線性
室温にて^３Ｈ−ＰＡＦと５分間反応させたヒト血漿試料希釈液のＬｐ−ＰＬＡ２活性を測定した。１６．６７ｍｇ／ｍＬの氷冷ＢＳＡでＰＡＦ基質を封鎖することで反応を終結させた。該ＰＡＦ−ＢＳＡ複合体を７．７８％ 氷冷ＴＣＡで沈殿させ、４℃で１５分間、６，０００ｇの遠心分離によりペレットを得た。ＭｉｃｒｏＳｃｉｎｔ−２０カクテルを用いるシンチレーションカウンティングにより上清中の反応生成物を測定した。０．１μＬ／反応および５μＬ／反応の血漿を別々の反応で用いた。ヒト血漿試料にて測定されたＬｐ−ＰＬＡ２活性値は反応に添加したヒト血漿量に直線比例した。

実施例７．マイクロプレート使用の複数の試料用Ｌｐ−ＰＬＡ２活性アッセイ
アッセイバッファーを以下の仕様にて室温で調製し貯蔵した：１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４；１５０ｍＭ ＮａＣｌ；および５ｍＭ ＥＤＴＡ。
４８０μＬの^３Ｈ−ＰＡＦ（１０．０Ｃｉ／ｍｍｏｌにて１０μＭ＝０．１ｍＣｉ／ｍｌ）および２４．６μＬのＣ１６−ＰＡＦ（「１−ヘキサデシル−２−アセチル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン」としても知られている）（５．０ｍｇ／ｍｌ；ＭＷ：５２４）をチューブにアリコートし、１００反応用の^３Ｈ−ＰＡＦ溶液を調製した。該２溶液を混合し、フードにて風乾した。乾燥ペレットを１２．０ｍＬのアッセイバッファーに再懸濁し、２０μＭ ＰＡＦの^３Ｈ−ＰＡＦ溶液（すなわち０．４μＭの^３Ｈ−ＰＡＦおよび１９．６μＭの冷Ｃ１６−ＰＡＦ）を調製した。

Ｌｐ−ＰＬＡ２活性アッセイについて、５μＬのアッセイバッファー（全計数およびブランクについて；ｎ＝８）または２通りの血漿試料を９６−ウェルプレートにアリコートした。各プレートをテープで密封し蒸発を防止した。プレートは２１℃に平衡させた。

１００マイクロリットルの^３Ｈ−ＰＡＦ溶液を各ウェルに添加し、混合し、２１℃で５分間インキュベートした。代わりに５０μｌの水を添加した、全計数として用いられる試料を除き、氷冷ＢＳＡ溶液（５０μＬの５０ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ水溶液）を各ウェルに添加した。ついで該溶液を混合し冷蔵庫で５分間インキュベートした。
氷冷ＴＣＡ溶液（２５μＬの５６％容量／容量の溶液）を各ウェルに添加し、混合し、冷蔵庫で１５分間インキュベートした。ついで該プレートを６，０００ｇで１５分間、４℃で遠心分離した。各上清のアリコート（４５μＬ）を９６−ウェルのポリスチレンプレートに移した。

^３Ｈ−ＰＡＦ溶液（１０μＬ）を６ウェルに添加し、全計数として用いた。ＭｉｃｒｏＳｃｉｎｔ−２０ シンチレーションカクテル（２００μＬ）を各ウェルに添加し、プレートをテープで密封し、１０分間最大速度のボルテックスにて混合した。ウェットティッシュでぬぐい、別のきれいなティッシュで乾かすことでプレートの静電気を除去した。トップカウントシンチレーション計数装置を用い各試料について２分間の試料計数を得た。
Ｌｐ−ＰＬＡ２活性を以下の式；
Ｌｐ−ＰＬＡ２活性（ナノモル／分／ｍｌ）＝３２＊（ＣＰＭ_{４５μｌ−上清}−ＣＰＭ
_ブランク）／（ＣＰＭ_{１０μｌ−スパイク}−ＣＰＭ_ブランク）
［ここで、
ＣＰＭ_{４５μｌ−上清}は各試料の平均計数であり、
ＣＰＭ_ブランクはブランクの平均計数であり、
ＣＰＭ_{１０μｌ−スパイク}は全計数の平均計数ある］
を用いて算出した。

実施例８．Ｌｐ−ＰＬＡ２阻害剤で処置されたヒトにおけるＬｐ−ＰＬＡ２活性
Ｌｐ−ＰＬＡ２阻害剤またはプラシーボ投与から投与後１４４時間に至るまでのベースラインおよび予定した時間ポイントにて健常ボランティアから血漿試料を収集した。実施例７記載のとおり血漿試料をＬｐ−ＰＬＡ２活性についてアッセイした。薬剤処置されたボランティアにてＬｐ−ＰＬＡ２活性の有意な阻害（＞８５％）が阻害剤投与後約１時間ないし約６〜約８時間で観察された。測定された当該阻害は阻害剤の薬物動態学的データに相関していた。一方、プラシーボ処置されたボランティアにおいてはＬｐ−ＰＬＡ２活性の有意な減少は全く検出されなかった。血漿試料を分光光度的にアッセイした場合に、Ｌｐ−ＰＬＡ２のほんの約３０％の阻害が阻害剤で処置されたボランティア由来の同試料から検出された。

実施例９：ハイスループット放射分析によるＬｐ−ＰＬＡ２活性測定の検証
実施例７記載の放射標識基質を用いるハイスループットＬｐ−ＰＬＡ２活性測定に関連する本発明の方法を、アッセイ内活性測定との比較ならびに抽出法にて決定される活性測定との比較により検証した。本発明の方法は０．２ナノモル／分／ｍＬの検出限界（「ＬＯＤ」）および約１００倍の線形ダイナミック・レンジ（０．５−４８．５ナノモル／分／ｍｌ）を有する卓越した性能特性を示した。

加えて、２つの臨床試験、試験Ａ（ｎ＝６８）および試験Ｂ（ｎ＝４８）の試料にて比較した場合に本発明の方法を用いて決定したＬｐ−ＰＬＡ２活性値は抽出法にて決定した値と大いに相関した。さらに、血漿試料が少量でよいこと、放射性有機廃棄物がないこと、および必要ならば自動化にてさらに増大され得る非常に高いハイスループットであることを包含する、抽出法に勝る多数の利点を提供する。本発明の放射標識基質（実施例７）を用いるハイスループットＬｐ−ＰＬＡ２活性アッセイのための分散成分分析は、プレート内（アッセイ内）の分散成分推定値（「ＣＶ」）が分散基準を満たすことを示した（分散成分研究アッセイ内ＣＶは約１１．２％；＜１５％ 基準）。アッセイ間ＣＶ推定値もまた分散基準を満たした（アッセイ間ＣＶは約１２．９％；＜２０％ 基準）。ブランク血清および全計数ウェルの数を各２から各４へ増加した場合にアッセイ間における変動の減少の評価は付加したブランク血清および全計数ウェルにて約１．５％であった。異なるピペットチップを用いた列間の分散に関する別の分析はアッセイ内ＣＶ推定値に約１３％の寄与を示した。

本明細書にて引用した特許および特許出願を含め、すべての刊行物を出典明示により本明細書の一部とする。本出願が優先権主張する任意の特許出願もまた上記と同様に出典明示により本明細書の一部とする。

Claims (18)

1. 複数の試料におけるリポ蛋白ホスホリパーゼＡ２（Ｌｐ−ＰＬＡ２）酵素活性を測定するハイスループット法であって、
   ｉ．標識された血小板活性化因子（ＰＡＦ）を含む溶液を調製する工程；
   ｉｉ．複数の試料の各々を、マイクロタイタープレート上のウェルまたは微小遠心管にアリコートする工程；
   ｉｉｉ．複数の組織試料の各々を、工程ｉにしたがって調製される溶液と接触させる工程；
   ｉｖ．その第一の接触工程の溶液の各々をＰＡＦのシークエスター分子と接触させてＰＡＦ−シークエスター分子の複合体を形成する工程；
   ｖ．該ＰＡＦ−シークエスター分子の複合体をトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を含む沈殿化溶液と接触させて沈殿物および上清を形成する工程；
   ｖｉ．該マイクロタイタープレートまたは微小遠心管を１０℃未満で少なくとも５分間、少なくとも６，０００ｇで遠心分離することによって該ＰＡＦ−シークエスター分子の複合体を取り出す工程；および
   ｖｉｉ．Ｌｐ−ＰＬＡ２活性を検出する工程
   を含むハイスループット法であり、ここで、少なくとも１の試料がＬｐ−ＰＬＡ２阻害剤が投与されている動物から得られ、該ＰＡＦのシークエスター分子が、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはヒト血清アルブミンである、ハイスループット法。
2. 少なくとも１の試料が、血清、細胞溶解物、組織溶解物、尿または血漿からなる群より選択される、請求項１記載の方法。
3. 標識されたＰＡＦが放射標識されている、請求項１または２記載の方法。
4. 工程ｉにしたがって調製される溶液中のＰＡＦの全濃度が、少なくとも２０μＭである、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
5. 標識されたおよび標識されていないＰＡＦが緩衝溶液である、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
6. 緩衝溶液が、ＨＥＰＥＳ、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、およびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む、請求項５記載の方法。
7. 工程ｉにしたがって調製される溶液および試料が、少なくとも５秒間混合され、２１℃で少なくとも１分間インキュベートされる、請求項１ないし６のいずれか１項に記載の方法。
8. 接触工程のシークエスター分子が、外因性ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である、請求項１ないし７のいずれか１項に記載の方法。
9. ＢＳＡが１０℃未満である、請求項８記載の方法。
10. ＢＳＡが４℃である、請求項８記載の方法。
11. ＢＳＡが５０ｍｇ／ｍＬの濃度である、請求項８または９記載の方法。
12. 接触工程のシークエスター分子が、内因性ヒト血清アルブミンである、請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の方法。
13. ＴＣＡを含む沈殿化溶液が１０℃未満である、請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の方法。
14. 遠心分離が４℃で１５分間実施される、請求項１ないし１３のいずれか１項に記載の方法。
15. Ｌｐ−ＰＬＡ２活性がシンチレーションカウンティングによって測定される、請求項１ないし１４のいずれか１項に記載の方法。
16. 全ＲＩカウントまたはブランクを測定するための少なくとも２つの容器に緩衝溶液をアリコートすることをさらに含む、請求項１記載の方法。
17. 容器が、微小遠心管またはマイクロタイタープレート上のウェルである、請求項１６記載の方法。
18. 少なくとも１つのブランクを測定するための反応混合物をほぼ同容量および濃度の工程ｉにしたがって調製される溶液およびＢＳＡまたはヒト血清アルブミンと接触させ、少なくとも２つの全ＲＩカウントを測定するための反応混合物をほぼ同容量の工程ｉにしたがって調製される溶液およびＢＳＡまたはヒト血清アルブミンの置換溶液と接触させること、ここで、該置換溶液はＢＳＡまたはヒト血清アルブミンを含有しない；得られた各試料の上清部分、得られたブランクを測定するための反応混合物および得られた全ＲＩカウントを測定するための反応混合物を別々の容器にアリコートすること；および、その各アリコートにシンチレーションカクテルを接触させることをさらに含む、請求項１７記載の方法。