JP6362268B2 - Ｅｌ活性が関連する疾患の治療または予防効果を有する医薬の薬効評価方法及びｅｌ活性阻害物質のスクリーニング方法 - Google Patents
Ｅｌ活性が関連する疾患の治療または予防効果を有する医薬の薬効評価方法及びｅｌ活性阻害物質のスクリーニング方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6362268B2 JP6362268B2 JP2014544619A JP2014544619A JP6362268B2 JP 6362268 B2 JP6362268 B2 JP 6362268B2 JP 2014544619 A JP2014544619 A JP 2014544619A JP 2014544619 A JP2014544619 A JP 2014544619A JP 6362268 B2 JP6362268 B2 JP 6362268B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- phosphatidylinositol
- concentration
- test substance
- activity
- lysophosphatidylinositol
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/44—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/92—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving lipids, e.g. cholesterol, lipoproteins, or their receptors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/914—Hydrolases (3)
- G01N2333/916—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. phosphatases (3.1.3), phospholipases C or phospholipases D (3.1.4)
- G01N2333/918—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
- G01N2333/92—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2405/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving lipids
- G01N2405/04—Phospholipids, i.e. phosphoglycerides
- G01N2405/06—Glycophospholipids, e.g. phosphatidyl inositol
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
- G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
- G01N2500/20—Screening for compounds of potential therapeutic value cell-free systems
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2560/00—Chemical aspects of mass spectrometric analysis of biological material
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Description
本発明は、ホスファチジルイノシトール又はリゾホスファチジルイノシトールを指標とする、血管内皮リパーゼ（Endothelial Lipase。以下、ＥＬとする。）の活性測定方法に関する。具体的には、本発明は、ＥＬ活性が関連する疾患の治療または予防効果を有する医薬の薬効評価方法及びＥＬ活性阻害物質のスクリーニング方法に関する。
ＥＬは、Triglyceride Lipase（以下、ＴＧＬとする。）ファミリーに属するPhospholipaseである（非特許文献１）。ヒトＥＬは５００残基（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＰ＿００６０２４．１）のアミノ酸からなり、マウスＥＬも５００残基のアミノ酸からなる。
ＴＧＬファミリーには、Lipoprotein Lipase（以下、ＬＰＬとする。）やHepatic Lipase（以下、ＨＬとする。）が含まれる。
ＴＧＬファミリーには、Lipoprotein Lipase（以下、ＬＰＬとする。）やHepatic Lipase（以下、ＨＬとする。）が含まれる。
ＥＬは、その強いPhospholipase活性によりＨＤＬコレステロール（以下、ＨＤＬ−ｃとする。）の代謝に関与することがそのノックアウトマウスやトランスジェニックマウスの解析から明らかとなり、血中ＨＤＬ−ｃ量を規定する因子として注目されている（非特許文献２）。冠動脈疾患(以下、ＣＡＤとする。)と血中ＨＤＬ−ｃ量に負の相関関係が成立することは古くから知られている。ＨＤＬ−ｃは抗酸化作用・抗炎症作用・コレステロール逆転送作用などを介して抗動脈硬化作用を示すとされ、低ＨＤＬ−ｃ血症はＣＡＤのリスクファクターの一つと認識されている。したがって、ＥＬ阻害剤はＨＤＬ−ｃの上昇を介してＣＡＤ治療薬となり、実際にＥＬをノックアウトした病態マウスではＨＤＬ−ｃ上昇と動脈硬化病変部位の減少が報告されている（非特許文献３）。
これらの知見は、ＥＬの選択的阻害剤は脂質代謝異常症や動脈硬化症における治療薬としての有用性を示している。
これらの知見は、ＥＬの選択的阻害剤は脂質代謝異常症や動脈硬化症における治療薬としての有用性を示している。
ＥＬ阻害剤の薬効評価試験において投薬した薬剤がどの程度、血液中でＥＬを阻害しているかを把握することは、薬効のポテンシーを把握する上で重要事項である。しかしながら、血液中にはＥＬと同様の活性を有するリパーゼが存在するため、血液中のＥＬ活性を特異的に検出できるアッセイ方法を見出すことが、有望化合物の選択のための課題である。
血液中には公知の一般的なアッセイ条件下（非特許文献４)では、ＥＬよりも高い活性を有するリパーゼが存在し、ＥＬの活性が正確に測定できないことから、投薬した阻害剤の血液中でのＥＬ活性阻害率を正確に把握することは困難である。
非臨床試験においてＥＬ活性測定に用いる血液を採取する際には、ＥＬを血管壁から遊離、回収するために大量のヘパリンを静注する必要性があるが、臨床試験において被験者にヘパリンを大量に静注することはできない。したがって、臨床試験ではＥＬ活性の指標となるマーカーが必要になるが、ＥＬ活性を反映できるマーカーの存在についての報告は現在までなされていない。
非臨床試験においてＥＬ活性測定に用いる血液を採取する際には、ＥＬを血管壁から遊離、回収するために大量のヘパリンを静注する必要性があるが、臨床試験において被験者にヘパリンを大量に静注することはできない。したがって、臨床試験ではＥＬ活性の指標となるマーカーが必要になるが、ＥＬ活性を反映できるマーカーの存在についての報告は現在までなされていない。
Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１９９９年、第２１巻第４号、４２４−４２８ページ
ＴＣＭ、２００４年、第１４巻第５号、２０２−２０６ページ
Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００４年、第２７９巻第４３号、４５０８５−４５０９２ページ
Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、２００３年、第１１１巻第３号、３４７−３５５ページ
本発明の目的は、ＥＬ以外のリパーゼも存在する非臨床・臨床試験検体から採取した試料において、ＥＬの活性を特異的に測定することを課題とする。特に、臨床試験においては、被験者にヘパリンを大量に静注することはできないので、被験者にヘパリンを大量に静注することなくＥＬの活性を特異的に測定できるようにすることを課題とする。
本発明者らは、ＥＬ活性測定系の精度、特異性向上およびＥＬ活性のマーカーの特定という課題を解決するためには、血液中のリポタンパク質中のリン脂質の中からＥＬに特異的な基質を見出すことが最善のストラテジーであると考えた。本発明者らは、その方針のもと、鋭意研究を重ねた結果、ホスファチジルイノシトールがＥＬ特異的な基質となることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の［１］〜［１０］を提供する。
［１］ホスファチジルイノシトール又はリゾホスファチジルイノシトールを指標とする、ＥＬ活性測定方法。
［２］(1) 被験物質を投与した後の哺乳動物より採取した試料中のホスファチジルイノシトール又はリゾホスファチジルイノシトール濃度と、被験物質を投与する前の哺乳動物より採取した試料中のホスファチジルイノシトール又はリゾホスファチジルイノシトール濃度を比較する工程、及び
(2) 被験物質を投与した後の哺乳動物より採取した試料中のホスファチジルイノシトール又はリゾホスファチジルイノシトール濃度が、被験物質を投与する前の哺乳動物より採取した試料中のホスファチジルイノシトール又はリゾホスファチジルイノシトール濃度よりも上昇している場合に、被験物質をＥＬ活性が関連する疾患の治療または予防効果を有する医薬と評価する工程を含む、
ＥＬ活性が関連する疾患の治療または予防効果を有する医薬の薬効評価方法。
［３］(1) 被験物質を投与した後の哺乳動物より採取した試料中のホスファチジルイノシトール濃度と、被験物質を投与する前の哺乳動物より採取した試料中のホスファチジルイノシトール濃度を比較する工程、及び
(2) 被験物質を投与した後の哺乳動物より採取した試料中のホスファチジルイノシトール濃度が、被験物質を投与する前の哺乳動物より採取した試料中のホスファチジルイノシトール濃度よりも上昇している場合に、被験物質をＥＬ活性が関連する疾患の治療または予防効果を有する医薬と評価する工程を含む、
ＥＬ活性が関連する疾患の治療または予防効果を有する医薬の薬効評価方法。
［４］(1) 被験物質を投与した後の哺乳動物より採取した試料中のリゾホスファチジルイノシトール濃度と、被験物質を投与する前の哺乳動物より採取した試料中のリゾホスファチジルイノシトール濃度を比較する工程、及び
(2) 被験物質を投与した後の哺乳動物より採取した試料中のリゾホスファチジルイノシトール濃度が、被験物質を投与する前の哺乳動物より採取した試料中のリゾホスファチジルイノシトール濃度よりも上昇している場合に、被験物質をＥＬ活性が関連する疾患の治療または予防効果を有する医薬と評価する工程を含む、
ＥＬ活性が関連する疾患の治療または予防効果を有する医薬の薬効評価方法。
［５］前記試料が血液、血清または血漿である［２］〜［４］いずれかに記載の方法。
［６］(1) ホスファチジルイノシトール、被験物質及びＥＬを接触させる工程、
(2) 被験物質を接触させた場合のホスファチジルイノシトール濃度を、被験物質を接触させない場合のホスファチジルイノシトール濃度と比較する工程、及び
(3) 被験物質を接触させた場合のホスファチジルイノシトール濃度が、被験物質を接触させない場合のホスファチジルイノシトール濃度と比較して上昇している場合に、被験物質をＥＬ活性阻害物質として選択する工程を含む、
ＥＬ活性阻害物質のスクリーニング方法。
［７］ホスファチジルイノシトールが、ホスファチジルイノシトール−リポゾーム、ホスファチジルイノシトール−ＨＤＬ、ホスファチジルイノシトール−再構成ＨＤＬ又はホスファチジルイノシトール−界面活性剤混合ミセルである［６］記載の方法。
［８］(1) ホスファチジルイノシトール、被験物質及びＥＬを接触させる工程、
(2) 被験物質を接触させた場合のリゾホスファチジルイノシトール濃度を、被験物質を接触させない場合のリゾホスファチジルイノシトール濃度と比較する工程、及び
(3) 被験物質を接触させた場合のリゾホスファチジルイノシトール濃度が、被験物質を接触させない場合のリゾホスファチジルイノシトール濃度と比較して減少している場合に、被験物質をＥＬ活性阻害物質として選択する工程を含む、
ＥＬ活性阻害物質のスクリーニング方法。
［９］ホスファチジルイノシトールが、ホスファチジルイノシトール−リポゾーム、ホスファチジルイノシトール−ＨＤＬ、ホスファチジルイノシトール−再構成ＨＤＬ又はホスファチジルイノシトール−界面活性剤混合ミセルである［８］記載の方法。
［１０］前記［６］〜［９］いずれかに記載の方法に使用するためのキット。
［１］ホスファチジルイノシトール又はリゾホスファチジルイノシトールを指標とする、ＥＬ活性測定方法。
［２］(1) 被験物質を投与した後の哺乳動物より採取した試料中のホスファチジルイノシトール又はリゾホスファチジルイノシトール濃度と、被験物質を投与する前の哺乳動物より採取した試料中のホスファチジルイノシトール又はリゾホスファチジルイノシトール濃度を比較する工程、及び
(2) 被験物質を投与した後の哺乳動物より採取した試料中のホスファチジルイノシトール又はリゾホスファチジルイノシトール濃度が、被験物質を投与する前の哺乳動物より採取した試料中のホスファチジルイノシトール又はリゾホスファチジルイノシトール濃度よりも上昇している場合に、被験物質をＥＬ活性が関連する疾患の治療または予防効果を有する医薬と評価する工程を含む、
ＥＬ活性が関連する疾患の治療または予防効果を有する医薬の薬効評価方法。
［３］(1) 被験物質を投与した後の哺乳動物より採取した試料中のホスファチジルイノシトール濃度と、被験物質を投与する前の哺乳動物より採取した試料中のホスファチジルイノシトール濃度を比較する工程、及び
(2) 被験物質を投与した後の哺乳動物より採取した試料中のホスファチジルイノシトール濃度が、被験物質を投与する前の哺乳動物より採取した試料中のホスファチジルイノシトール濃度よりも上昇している場合に、被験物質をＥＬ活性が関連する疾患の治療または予防効果を有する医薬と評価する工程を含む、
ＥＬ活性が関連する疾患の治療または予防効果を有する医薬の薬効評価方法。
［４］(1) 被験物質を投与した後の哺乳動物より採取した試料中のリゾホスファチジルイノシトール濃度と、被験物質を投与する前の哺乳動物より採取した試料中のリゾホスファチジルイノシトール濃度を比較する工程、及び
(2) 被験物質を投与した後の哺乳動物より採取した試料中のリゾホスファチジルイノシトール濃度が、被験物質を投与する前の哺乳動物より採取した試料中のリゾホスファチジルイノシトール濃度よりも上昇している場合に、被験物質をＥＬ活性が関連する疾患の治療または予防効果を有する医薬と評価する工程を含む、
ＥＬ活性が関連する疾患の治療または予防効果を有する医薬の薬効評価方法。
［５］前記試料が血液、血清または血漿である［２］〜［４］いずれかに記載の方法。
［６］(1) ホスファチジルイノシトール、被験物質及びＥＬを接触させる工程、
(2) 被験物質を接触させた場合のホスファチジルイノシトール濃度を、被験物質を接触させない場合のホスファチジルイノシトール濃度と比較する工程、及び
(3) 被験物質を接触させた場合のホスファチジルイノシトール濃度が、被験物質を接触させない場合のホスファチジルイノシトール濃度と比較して上昇している場合に、被験物質をＥＬ活性阻害物質として選択する工程を含む、
ＥＬ活性阻害物質のスクリーニング方法。
［７］ホスファチジルイノシトールが、ホスファチジルイノシトール−リポゾーム、ホスファチジルイノシトール−ＨＤＬ、ホスファチジルイノシトール−再構成ＨＤＬ又はホスファチジルイノシトール−界面活性剤混合ミセルである［６］記載の方法。
［８］(1) ホスファチジルイノシトール、被験物質及びＥＬを接触させる工程、
(2) 被験物質を接触させた場合のリゾホスファチジルイノシトール濃度を、被験物質を接触させない場合のリゾホスファチジルイノシトール濃度と比較する工程、及び
(3) 被験物質を接触させた場合のリゾホスファチジルイノシトール濃度が、被験物質を接触させない場合のリゾホスファチジルイノシトール濃度と比較して減少している場合に、被験物質をＥＬ活性阻害物質として選択する工程を含む、
ＥＬ活性阻害物質のスクリーニング方法。
［９］ホスファチジルイノシトールが、ホスファチジルイノシトール−リポゾーム、ホスファチジルイノシトール−ＨＤＬ、ホスファチジルイノシトール−再構成ＨＤＬ又はホスファチジルイノシトール−界面活性剤混合ミセルである［８］記載の方法。
［１０］前記［６］〜［９］いずれかに記載の方法に使用するためのキット。
本発明により、ホスファチジルイノシトール又はリゾホスファチジルイノシトール濃度を指標とした、ＥＬ活性が関連する疾患の治療または予防効果を有する医薬の薬効評価方法が提供される。また、本発明により、ホスファチジルイノシトールを使用したＥＬ活性阻害物質のスクリーニング方法およびその方法に使用するためのキットが提供される。
本発明において使用される用語は、特に言及する場合を除いて、当該分野で通常用いる意味で用いられる。
本発明は、一実施形態では、ホスファチジルイノシトール又はリゾホスファチジルイノシトールを指標とする、ＥＬ活性測定方法を提供する。かかる方法は、ホスファチジルイノシトール又はリゾホスファチジルイノシトールを指標とするＥＬ活性が関連する疾患の治療または予防効果を有する医薬の薬効評価方法及び、ホスファチジルイノシトール又はリゾホスファチジルイノシトールを指標とするＥＬ活性阻害物質のスクリーニング方法を包含する。
ホスファチジルイノシトールは、極性基にイノシトールをもつ酸性リン脂質の１つであり、ＰＩと略記されることもある。１位、２位の脂肪酸の組み合わせの違いによって多種類の分子種が存在する。例えば、ホスファチジルイノシトールの分子種を質量分析で解析した結果から推定される分子量より、１，２位にエステル結合した脂肪酸の炭素数の合計が３８、２重結合の合計が４と予測された場合、３８：４という表記を行う。
ホスファチジルコリンはレシチンとも呼ばれ、ＰＣと略記されることもある。１位、２位のアシル基の組み合わせの違いによって多種類の分子種が存在する。例えば、ホスファチジルコリンの分子種を質量分析で解析した結果から推定される分子量より、１，２位にエステル結合した脂肪酸の炭素数の合計が３６、２重結合の合計が３と予測された場合、３６：３という表記を行う。
ホスファチジルエタノールアミンは、ＰＥと略語されることもある。１位、２位の脂肪酸の組み合わせの違いによって多種類の分子種が存在する。例えば、ＰＥの分子種を質量分析で解析した結果から推定される分子量より、１、２位にエステル結合した脂肪酸の炭素数の合計が４０、２重結合の合計が６と予測された場合、４０：６という表記を行う。
ＥＬとは、ＴＧＬファミリーに属するPhospholipaseの一種である血管内皮リパーゼを意味する。ヒト、ウサギおよびマウスＥＬのＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号は、それぞれ、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＰ＿００６０２４．１、ＮＰ＿００１１８２５６７．１およびＮＰ＿０３４８５０．３である。
本明細書において、ＥＬとは、前記ＧｅｎＢａｎｋに登録されているアミノ酸配列からなるタンパク質のみならず、前記ＧｅｎＢａｎｋに登録されているアミノ酸配列からなるタンパク質において１アミノ酸又は数アミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたタンパク質も含まれる。ただし、これらのタンパク質は、前記のＧｅｎＢａｎｋに登録されているＥＬと同等のホスホリパーゼ活性を有するものに限定される。
本明細書において、ＥＬとは、前記ＧｅｎＢａｎｋに登録されているアミノ酸配列からなるタンパク質のみならず、前記ＧｅｎＢａｎｋに登録されているアミノ酸配列からなるタンパク質において１アミノ酸又は数アミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたタンパク質も含まれる。ただし、これらのタンパク質は、前記のＧｅｎＢａｎｋに登録されているＥＬと同等のホスホリパーゼ活性を有するものに限定される。
ＥＬ活性が関連する疾患とは、脂質代謝異常症、高脂血症、動脈硬化、アテローム性動脈硬化、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、糖尿病、肥満及びシンドロームＸを意味する。
また、本発明は、一実施形態では、
(1) 被験物質を投与した後の哺乳動物より採取した試料中のホスファチジルイノシトール又はリゾホスファチジルイノシトール濃度と、被験物質を投与する前の哺乳動物より採取した試料中のホスファチジルイノシトール又はリゾホスファチジルイノシトール濃度を比較する工程、及び
(2) 被験物質を投与した後の哺乳動物より採取した試料中のホスファチジルイノシトール又はリゾホスファチジルイノシトール濃度が、被験物質を投与する前の哺乳動物より採取した試料中のホスファチジルイノシトール又はリゾホスファチジルイノシトール濃度と比べて変化している場合に、被験物質をＥＬ活性が関連する疾患の治療または予防効果を有する医薬と評価する工程を含む、
ＥＬ活性が関連する疾患の治療又は予防効果を有する医薬の薬効評価方法を提供する。
ＥＬ活性が関連する疾患とは、脂質代謝異常症、高脂血症、動脈硬化、アテローム性動脈硬化、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、糖尿病、肥満及びシンドロームＸ等を意味する。
(1) 被験物質を投与した後の哺乳動物より採取した試料中のホスファチジルイノシトール又はリゾホスファチジルイノシトール濃度と、被験物質を投与する前の哺乳動物より採取した試料中のホスファチジルイノシトール又はリゾホスファチジルイノシトール濃度を比較する工程、及び
(2) 被験物質を投与した後の哺乳動物より採取した試料中のホスファチジルイノシトール又はリゾホスファチジルイノシトール濃度が、被験物質を投与する前の哺乳動物より採取した試料中のホスファチジルイノシトール又はリゾホスファチジルイノシトール濃度と比べて変化している場合に、被験物質をＥＬ活性が関連する疾患の治療または予防効果を有する医薬と評価する工程を含む、
ＥＬ活性が関連する疾患の治療又は予防効果を有する医薬の薬効評価方法を提供する。
ＥＬ活性が関連する疾患とは、脂質代謝異常症、高脂血症、動脈硬化、アテローム性動脈硬化、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、糖尿病、肥満及びシンドロームＸ等を意味する。
上記方法の工程（１）では、被験物質は、いかなる公知化合物および新規化合物であってもよく、例えば、核酸、糖質、脂質、蛋白質、ペプチド、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分等を例示することができる。
上記方法の工程（１）では、試料中のホスファチジルイノシトール濃度の定量は、例えば、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｌｅｔｔｅｒｓ、２００６年、第３９巻、９５７−９７２ページを参照して質量分析により行うことができる。
一方、試料中のリゾホスファチジルイノシトール濃度の定量は、特開２０１０−６３４７０などを参照してＴＬＣ展開することにより、またはＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉａ、２０１０年、第７２巻第７/８号、６５９−６６４ページを参照して質量分析をすることにより、測定することができる。
一方、試料中のリゾホスファチジルイノシトール濃度の定量は、特開２０１０−６３４７０などを参照してＴＬＣ展開することにより、またはＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉａ、２０１０年、第７２巻第７/８号、６５９−６６４ページを参照して質量分析をすることにより、測定することができる。
上記方法の工程（１）では、被験体である哺乳動物は哺乳動物であれば種類は問わない。また、哺乳動物より採取する試料は、哺乳動物由来のサンプルであれば何でもいいが、血液、血清又は血漿が好ましい。
上記方法の工程（２）では、被験物質投与後のホスファチジルイノシトール又はリゾホスファチジルイノシトール濃度が、被験物質投与前のホスファチジルイノシトール又はリゾホスファチジルイノシトール濃度と比較される。
ホスファチジルイノシトール又はリゾホスファチジルイノシトール濃度の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれる。被験物質投与前のホスファチジルイノシトール又はリゾホスファチジルイノシトール濃度は、被験物質投与後の測定に対し、事前に測定したホスファチジルイノシトール又はリゾホスファチジルイノシトール濃度であっても、同時に測定したホスファチジルイノシトール又はリゾホスファチジルイノシトール濃度であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定したホスファチジルイノシトール又はリゾホスファチジルイノシトール濃度であることが好ましい。
ホスファチジルイノシトール又はリゾホスファチジルイノシトール濃度の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれる。被験物質投与前のホスファチジルイノシトール又はリゾホスファチジルイノシトール濃度は、被験物質投与後の測定に対し、事前に測定したホスファチジルイノシトール又はリゾホスファチジルイノシトール濃度であっても、同時に測定したホスファチジルイノシトール又はリゾホスファチジルイノシトール濃度であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定したホスファチジルイノシトール又はリゾホスファチジルイノシトール濃度であることが好ましい。
上記方法の工程（１）及び（２）では、血液中等にＥＬを遊離させる必要は一切ない。そのため、被験者から試料を採取する際には、ヘパリンを静注することは不要であるので、臨床試験における被験者にも本評価方法を使用することができるのが利点である。
また、本発明は、一実施形態では、
(1) ホスファチジルイノシトール、被験物質及びＥＬを接触させる工程
(2) 被験物質を接触させた場合のホスファチジルイノシトール濃度を、被験物質を接触させない場合のホスファチジルイノシトール濃度と比較する工程、及び
(3) 被験物質を接触させた場合のホスファチジルイノシトール濃度が、被験物質を接触させない場合のホスファチジルイノシトール濃度と比較して上昇している場合に、被験物質をＥＬ活性阻害物質として選択する工程を含む、
ＥＬ活性阻害物質のスクリーニング方法を提供する。
(1) ホスファチジルイノシトール、被験物質及びＥＬを接触させる工程
(2) 被験物質を接触させた場合のホスファチジルイノシトール濃度を、被験物質を接触させない場合のホスファチジルイノシトール濃度と比較する工程、及び
(3) 被験物質を接触させた場合のホスファチジルイノシトール濃度が、被験物質を接触させない場合のホスファチジルイノシトール濃度と比較して上昇している場合に、被験物質をＥＬ活性阻害物質として選択する工程を含む、
ＥＬ活性阻害物質のスクリーニング方法を提供する。
上記方法の工程（１）で用いられるホスファチジルイノシトールは、ホスファチジルイノシトール−リポゾーム、ホスファチジルイノシトール−ＨＤＬ、ホスファチジルイノシトール−再構成ＨＤＬおよびホスファチジルイノシトール−界面活性剤混合ミセルのいずれの形態であっても、ホスファチジルイノシトールを含む形態である限り、いかなる形態であっても許容される。
ホスファチジルイノシトール−リポゾームとは、超音波処理等の機械的操作も含めてホスファチジルイノシトール又はホスファチジルイノシトールと脂質との混合体として溶液中に分散させた状態を意味する。ホスファチジルイノシトールとの混合成分として使用される脂質としては、例えば、血中に含有される脂質などをあげることができる。
ホスファチジルイノシトール−リポゾームは、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９７６年、第１７巻第３号、２３９−２４７ページを参照して、適宜作製することができる。
ホスファチジルイノシトール−リポゾームは、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９７６年、第１７巻第３号、２３９−２４７ページを参照して、適宜作製することができる。
ホスファチジルイノシトール−ＨＤＬとは、ホスファチジルイノシトールとＨＤＬを混合することにより、人為的にホスファチジルイノシトールの導入されたＨＤＬを意味する。ホスファチジルイノシトールとの混合成分として使用されるＨＤＬとしては、例えば、ＨＤＬ、もしくはその構成物のＨＤＬ２、ＨＤＬ３などを挙げることができる。
ホスファチジルイノシトール−再構成ＨＤＬとは、ホスファチジルイノシトール又はホスファチジルイノシトールと脂質の混合物をアポ蛋白と混合することにより再構成されたＨＤＬを意味する。ホスファチジルイノシトールとの混合成分として使用される脂質としては、例えば、血中に含有される脂質などをあげることができる。ホスファチジルイノシトール−再構成ＨＤＬ作製に使用されるアポ蛋白としては、例えば、血中に含有されるアポ蛋白などをあげることができる。
ホスファチジルイノシトール−再構成ＨＤＬは、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９８２年、第２５７巻第８号、４５３５−４５４０ページを参照して、適宜作製することができる。
ホスファチジルイノシトール−再構成ＨＤＬは、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９８２年、第２５７巻第８号、４５３５−４５４０ページを参照して、適宜作製することができる。
ホスファチジルイノシトール−界面活性剤混合ミセルとは、界面活性剤によりホスファチジルイノシトール又はホスファチジルイノシトールと脂質との混合体として溶解させることにより形成された混合ミセルを意味する。ホスファチジルイノシトールとの混合成分として使用される脂質としては、例えば、血中に含有される脂質などをあげることができる。ホスファチジルイノシトール−界面活性剤混合ミセルの作製に使用される界面活性剤としては、例えば、イオン性、非イオン性界面活性剤などをあげることができる。
ホスファチジルイノシトール−界面活性剤混合ミセルは、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９８８年、第２６３巻第１２号、５７２４−５７３１ページを参照して、適宜作製することができる。
ホスファチジルイノシトール−界面活性剤混合ミセルは、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９８８年、第２６３巻第１２号、５７２４−５７３１ページを参照して、適宜作製することができる。
スクリーニング方法に供される被験物質は、いかなる公知化合物および新規化合物であってもよく、例えば、核酸、糖質、脂質、蛋白質、ペプチド、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分等が例示される。
上記方法の工程（２）では、ホスファチジルイノシトール濃度の測定は、例えば、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２００６年、第３９巻、９５７−９７２ページを参照して質量分析を行い直接ホスファチジルイノシトール濃度を測定するか、基質であるホスファチジルイノシトールから生成されるＮＥＦＡの量を測定すること等により行う。
上記方法の工程（３）では、被験物質を接触させた場合のホスファチジルイノシトール濃度が、被験物質を接触させない場合のホスファチジルイノシトール濃度と比較される。
ホスファチジルイノシトール濃度の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれる。被験物質を接触させないホスファチジルイノシトール濃度は、被験物質を接触させたホスファチジルイノシトール濃度の測定に対し、事前に測定したホスファチジルイノシトール濃度であっても、同時に測定したホスファチジルイノシトール濃度であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定したホスファチジルイノシトール濃度であることが好ましい。
ホスファチジルイノシトール濃度の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれる。被験物質を接触させないホスファチジルイノシトール濃度は、被験物質を接触させたホスファチジルイノシトール濃度の測定に対し、事前に測定したホスファチジルイノシトール濃度であっても、同時に測定したホスファチジルイノシトール濃度であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定したホスファチジルイノシトール濃度であることが好ましい。
スクリーニングによって見出されたＥＬ活性阻害物質は、ＥＬ活性が関連する疾患、すなわち、脂質代謝異常症、高脂血症、動脈硬化、アテローム性動脈硬化、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、糖尿病、肥満及びシンドロームＸ等の疾患の治療または予防効果を有する。
更に、本発明の一実施形態では、
(1) ホスファチジルイノシトール、被験物質及びＥＬを接触させる工程
(2) 被験物質を接触させた場合のリゾホスファチジルイノシトール濃度を、被験物質を接触させない場合のリゾホスファチジルイノシトール濃度と比較する工程、及び
(3) 被験物質を接触させた場合のリゾホスファチジルイノシトール濃度が、被験物質を接触させない場合のリゾホスファチジルイノシトール濃度と比較して減少している場合に、被験物質をＥＬ活性阻害物質として選択する工程を含む、
ＥＬ活性阻害物質のスクリーニング方法を提供する。
(1) ホスファチジルイノシトール、被験物質及びＥＬを接触させる工程
(2) 被験物質を接触させた場合のリゾホスファチジルイノシトール濃度を、被験物質を接触させない場合のリゾホスファチジルイノシトール濃度と比較する工程、及び
(3) 被験物質を接触させた場合のリゾホスファチジルイノシトール濃度が、被験物質を接触させない場合のリゾホスファチジルイノシトール濃度と比較して減少している場合に、被験物質をＥＬ活性阻害物質として選択する工程を含む、
ＥＬ活性阻害物質のスクリーニング方法を提供する。
上記方法の工程（２）では、ホスファチジルイノシトールの分解産物であるリゾホスファチジルイノシトール濃度が測定される。リゾホスファチジルイノシトール濃度の定量は、特開２０１０−６３４７０などを参照してＴＬＣ展開することにより、またはＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉａ、２０１０年、第７２巻第７/８号、６５９−６６４ページを参照して質量分析をすることにより、測定することができる。
以下、実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は下記実施例に制限されるものではない。
マウス血漿中リポタンパク質のリン脂質に対するＥＬの基質特異性の検証
マウスＥＬをコードするＤＮＡをクローニングしたｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０ (インビトロジェン社製) をＦｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３Ｆ細胞にトランスフェクションし、３７℃、８%ＣＯ２で２日間培養した。培養液を遠心分離し、細胞を回収して、２０Ｕ／ｍｌのヘパリンを含むＦｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にて懸濁し、３７℃で４５分間インキュベーションした。その後、遠心分離により細胞を除去して得た上清をマウスＥＬ酵素溶液とした。Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスのプレヘパリンプラズマとマウスＥＬ酵素溶液からなる反応溶液（９：１、ｖ/ｖ）を３７℃で２時間インキュベーションした後、ＥＤＴＡ（終濃度１０ｍＭ）を添加し反応を停止した。その後、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２００６年、第３９巻、９５７−９７２ページを参照して質量分析法により、反応溶液中の各種リン脂質を定量した。反応溶液にＥＬ酵素溶液を入れずにインキュベーションした際の各種リン脂質の変動のプロファイルと、ＥＬ酵素溶液添加時でのプロファイルとの比較より、ＥＬ添加で特異的に変動するリン脂質を検索した（図１〜３）。その結果、ホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミンにはＥＬ以外のリパーゼの作用が認められたが、ホスファチジルイノシトールにはＥＬのみが活性を示すことが明らかとなった。
マウスＥＬをコードするＤＮＡをクローニングしたｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０ (インビトロジェン社製) をＦｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３Ｆ細胞にトランスフェクションし、３７℃、８%ＣＯ２で２日間培養した。培養液を遠心分離し、細胞を回収して、２０Ｕ／ｍｌのヘパリンを含むＦｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にて懸濁し、３７℃で４５分間インキュベーションした。その後、遠心分離により細胞を除去して得た上清をマウスＥＬ酵素溶液とした。Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスのプレヘパリンプラズマとマウスＥＬ酵素溶液からなる反応溶液（９：１、ｖ/ｖ）を３７℃で２時間インキュベーションした後、ＥＤＴＡ（終濃度１０ｍＭ）を添加し反応を停止した。その後、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２００６年、第３９巻、９５７−９７２ページを参照して質量分析法により、反応溶液中の各種リン脂質を定量した。反応溶液にＥＬ酵素溶液を入れずにインキュベーションした際の各種リン脂質の変動のプロファイルと、ＥＬ酵素溶液添加時でのプロファイルとの比較より、ＥＬ添加で特異的に変動するリン脂質を検索した（図１〜３）。その結果、ホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミンにはＥＬ以外のリパーゼの作用が認められたが、ホスファチジルイノシトールにはＥＬのみが活性を示すことが明らかとなった。
ホスファチジルイノシトール−ＨＤＬを基質とした、マウスＥＬ活性測定とＥＬ活性阻害剤の評価
クロロホルム溶媒中のホスファチジルイノシトール（Ａｖaｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ社製）を必要量採取し、窒素存在下で溶媒を完全に蒸発乾固した。ＰＢＳを添加後、氷上で超音波処理して調製したホスファチジルイノシトールベシクルを、ヒトＨＤＬ（Ａｔｈｅｎｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）と混合、４℃で２４時間インキュベーションすることにより、ホスファチジルイノシトール（２．５ｍｇ／ｍｌ）をＨＤＬ（５ｍｇ/ｍｌ）に導入したホスファチジルイノシトール−ＨＤＬを作製した。マウスＥＬをコードするＤＮＡをクローニングしたｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０(インビトロジェン社製) をＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３Ｆ細胞にトランスフェクションし、３７℃、８% ＣＯ２で２日間培養した。培養液を遠心分離し、細胞を回収して、２０Ｕ/ｍｌのヘパリンを含むＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にて懸濁し、３７℃で４５分間インキュベーションした。その後、遠心分離により細胞を除去して得た上清をマウスＥＬ酵素溶液とした。２０ｍＭ トリス塩酸緩衝液 (ｐＨ７．５)、０．５％ ウシ血清アルブミン、４ｍＭ 塩化カルシウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウムで構成される反応溶液に基質としてホスファチジルイノシトール−ＨＤＬあるいはＨＤＬを終濃度２ｍｇ／ｍｌになるように加え、最後にマウスＥＬ酵素溶液を添加した（全量で１０μｌ）。３７℃で２時間反応後、ＥＬによって基質から生成されるＮＥＦＡをＮＥＦＡ Ｃ−テストワコー (和光純薬工業社製) で測定し、そのＮＥＦＡ量（吸光度）を酵素活性指標とした。マウスＥＬ酵素溶液を添加しないときのＮＥＦＡ量をバックグラウンド値とし、実測値よりバックグラウンド値を差し引いた値をＥＬ活性とした（図４）。その結果、マウスＥＬは、ホスファチジルイノシトール−ＨＤＬを基質とした方が、ＨＤＬを基質とした時よりも約２倍高い活性を示し、ＨＤＬよりも高感度の基質であることが示唆された。また、ホスファチジルイノシトール−ＨＤＬを基質とし、既知のリパーゼ阻害剤であるオルリスタットのマウスＥＬに対する阻害活性を評価したところ、用量依存的な阻害が認められ、阻害剤評価への適用が可能であることが示された（図５）。
クロロホルム溶媒中のホスファチジルイノシトール（Ａｖaｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ社製）を必要量採取し、窒素存在下で溶媒を完全に蒸発乾固した。ＰＢＳを添加後、氷上で超音波処理して調製したホスファチジルイノシトールベシクルを、ヒトＨＤＬ（Ａｔｈｅｎｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）と混合、４℃で２４時間インキュベーションすることにより、ホスファチジルイノシトール（２．５ｍｇ／ｍｌ）をＨＤＬ（５ｍｇ/ｍｌ）に導入したホスファチジルイノシトール−ＨＤＬを作製した。マウスＥＬをコードするＤＮＡをクローニングしたｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０(インビトロジェン社製) をＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３Ｆ細胞にトランスフェクションし、３７℃、８% ＣＯ２で２日間培養した。培養液を遠心分離し、細胞を回収して、２０Ｕ/ｍｌのヘパリンを含むＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にて懸濁し、３７℃で４５分間インキュベーションした。その後、遠心分離により細胞を除去して得た上清をマウスＥＬ酵素溶液とした。２０ｍＭ トリス塩酸緩衝液 (ｐＨ７．５)、０．５％ ウシ血清アルブミン、４ｍＭ 塩化カルシウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウムで構成される反応溶液に基質としてホスファチジルイノシトール−ＨＤＬあるいはＨＤＬを終濃度２ｍｇ／ｍｌになるように加え、最後にマウスＥＬ酵素溶液を添加した（全量で１０μｌ）。３７℃で２時間反応後、ＥＬによって基質から生成されるＮＥＦＡをＮＥＦＡ Ｃ−テストワコー (和光純薬工業社製) で測定し、そのＮＥＦＡ量（吸光度）を酵素活性指標とした。マウスＥＬ酵素溶液を添加しないときのＮＥＦＡ量をバックグラウンド値とし、実測値よりバックグラウンド値を差し引いた値をＥＬ活性とした（図４）。その結果、マウスＥＬは、ホスファチジルイノシトール−ＨＤＬを基質とした方が、ＨＤＬを基質とした時よりも約２倍高い活性を示し、ＨＤＬよりも高感度の基質であることが示唆された。また、ホスファチジルイノシトール−ＨＤＬを基質とし、既知のリパーゼ阻害剤であるオルリスタットのマウスＥＬに対する阻害活性を評価したところ、用量依存的な阻害が認められ、阻害剤評価への適用が可能であることが示された（図５）。
ＥＬトランスジェニックマウスの血漿中の内因性ＥＬの活性測定
クロロホルム溶媒中のホスファチジルイノシトール（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ社製）を必要量採取し、窒素存在下で溶媒を完全に蒸発乾固した。ＰＢＳを添加し、氷上で超音波処理して調製したホスファチジルイノシトールベシクルを、ヒトＨＤＬ（Ａｔｈｅｎｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）と混合、４℃で２４時間インキュベーションすることにより、ホスファチジルイノシトール（２．５ｍｇ／ｍｌ）をＨＤＬ（５ｍｇ/ｍｌ）に導入したホスファチジルイノシトール−ＨＤＬを作製した。ＥＬトランスジェニックマウスにヘパリン（シグマアルドリッチ社製）を含む生理食塩水（大塚製薬社製）を５０ＫＵ／ｋｇ尾静脈より投与し、３０分後に腹部大静脈より採血して得られた血液を遠心分離後、上清を回収して内因性ＥＬを含むプラズマを得た。１００ｍＭトリス塩酸緩衝液 (ｐＨ７．５)、５ｍＭ 塩化カルシウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウムで構成される反応溶液にホスファチジルイノシトール−ＨＤＬあるいはＨＤＬを基質として終濃度１．５ｍｇ／ｍｌになるように加え、最後に過剰量のマウスＥＬ中和抗体又はノーマル抗体処理後のプラズマを添加した（全量で10μｌ）。３７℃で１時間反応後、酵素反応によって生成されたＮＥＦＡをＮＥＦＡ Ｃ―テストワコー (和光純薬工業社製)で測定し、そのＮＥＦＡ量（吸光度）を酵素活性指標とした。血中にあらかじめ内在するＮＥＦＡ量をバックグランドとして、酵素反応時の測定値から差し引いてそれぞれの酵素活性値とした。マウスＥＬ中和抗体存在下での酵素活性値をＮｏｎ ＥＬ活性、ノーマル抗体存在下での酵素活性値からマウスＥＬ中和抗体存在下での酵素活性値を引いた差をＥＬ活性とした（図６）。その結果、ホスファチジルイノシトール−ＨＤＬを基質とした方がＥＬ活性が顕在化し、ＥＬとＮｏｎ ＥＬの活性比（ＥＬ活性／Ｎｏｎ ＥＬ活性）は、ＨＤＬに比較してホスファチジルイノシトール−ＨＤＬを基質とした時の方が約３．５倍高いことが明らかとなった（図６、７）。
クロロホルム溶媒中のホスファチジルイノシトール（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ社製）を必要量採取し、窒素存在下で溶媒を完全に蒸発乾固した。ＰＢＳを添加し、氷上で超音波処理して調製したホスファチジルイノシトールベシクルを、ヒトＨＤＬ（Ａｔｈｅｎｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）と混合、４℃で２４時間インキュベーションすることにより、ホスファチジルイノシトール（２．５ｍｇ／ｍｌ）をＨＤＬ（５ｍｇ/ｍｌ）に導入したホスファチジルイノシトール−ＨＤＬを作製した。ＥＬトランスジェニックマウスにヘパリン（シグマアルドリッチ社製）を含む生理食塩水（大塚製薬社製）を５０ＫＵ／ｋｇ尾静脈より投与し、３０分後に腹部大静脈より採血して得られた血液を遠心分離後、上清を回収して内因性ＥＬを含むプラズマを得た。１００ｍＭトリス塩酸緩衝液 (ｐＨ７．５)、５ｍＭ 塩化カルシウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウムで構成される反応溶液にホスファチジルイノシトール−ＨＤＬあるいはＨＤＬを基質として終濃度１．５ｍｇ／ｍｌになるように加え、最後に過剰量のマウスＥＬ中和抗体又はノーマル抗体処理後のプラズマを添加した（全量で10μｌ）。３７℃で１時間反応後、酵素反応によって生成されたＮＥＦＡをＮＥＦＡ Ｃ―テストワコー (和光純薬工業社製)で測定し、そのＮＥＦＡ量（吸光度）を酵素活性指標とした。血中にあらかじめ内在するＮＥＦＡ量をバックグランドとして、酵素反応時の測定値から差し引いてそれぞれの酵素活性値とした。マウスＥＬ中和抗体存在下での酵素活性値をＮｏｎ ＥＬ活性、ノーマル抗体存在下での酵素活性値からマウスＥＬ中和抗体存在下での酵素活性値を引いた差をＥＬ活性とした（図６）。その結果、ホスファチジルイノシトール−ＨＤＬを基質とした方がＥＬ活性が顕在化し、ＥＬとＮｏｎ ＥＬの活性比（ＥＬ活性／Ｎｏｎ ＥＬ活性）は、ＨＤＬに比較してホスファチジルイノシトール−ＨＤＬを基質とした時の方が約３．５倍高いことが明らかとなった（図６、７）。
野生型マウス及びＥＬノックアウトマウスの血漿中ホスファチジルイノシトール及びホスファチジルエタノールアミン濃度の比較
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統の野生型マウス及びＥＬノックアウトマウスから採取したプレヘパリンプラズマ中のホスファチジルイノシトールの定量を、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２００６年、第３９巻、９５７−９７２ページを参照して質量分析により実施した（図８及び図９）。その結果、ＥＬノックアウトマウスのプラズマ中のホスファチジルイノシトール濃度は、野生型マウスのそれよりも約１．８倍の上昇が認められたのに対し、ホスファチジルエタノールアミンの濃度は約１．１倍のみの上昇であったことから、ホスファチジルイノシトール濃度が内在性のＥＬ活性を高感度に反映していることが示唆された。
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統の野生型マウス及びＥＬノックアウトマウスから採取したプレヘパリンプラズマ中のホスファチジルイノシトールの定量を、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２００６年、第３９巻、９５７−９７２ページを参照して質量分析により実施した（図８及び図９）。その結果、ＥＬノックアウトマウスのプラズマ中のホスファチジルイノシトール濃度は、野生型マウスのそれよりも約１．８倍の上昇が認められたのに対し、ホスファチジルエタノールアミンの濃度は約１．１倍のみの上昇であったことから、ホスファチジルイノシトール濃度が内在性のＥＬ活性を高感度に反映していることが示唆された。
カニクイザルにＥＬ中和抗体を投与した際の血中ＨＤＬコレステロール、ホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジルイノシトール濃度の推移
カニクイザルにＥＬ中和抗体を静脈内投与し経時的に採血したプレヘパリンプラズマ中のＨＤＬコレステロール、ホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジルイノシトールの濃度を測定した。ＨＤＬコレステロールの定量は自動分析装置で実施した（図１０）。ホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジルイノシトールの定量は、質量分析により実施し、各分子種のトータル量として算出した（図１１、１２）。その結果、ＨＤＬコレステロール、ホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジルイノシトールともにＥＬ中和抗体投与後、経時的に増加し、個々のＥＬ中和抗体投与前の初期値に比較して、ＥＬ中和抗体投与７時間後で、ＨＤＬコレステロールで１.６倍、ホスファチジルイノシトールで２.４倍、リゾホスファチジルイノシトールで２.６倍になっていた。
カニクイザルにＥＬ中和抗体を静脈内投与し経時的に採血したプレヘパリンプラズマ中のＨＤＬコレステロール、ホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジルイノシトールの濃度を測定した。ＨＤＬコレステロールの定量は自動分析装置で実施した（図１０）。ホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジルイノシトールの定量は、質量分析により実施し、各分子種のトータル量として算出した（図１１、１２）。その結果、ＨＤＬコレステロール、ホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジルイノシトールともにＥＬ中和抗体投与後、経時的に増加し、個々のＥＬ中和抗体投与前の初期値に比較して、ＥＬ中和抗体投与７時間後で、ＨＤＬコレステロールで１.６倍、ホスファチジルイノシトールで２.４倍、リゾホスファチジルイノシトールで２.６倍になっていた。
ホスファチジルイノシトール−リポゾーム、ホスファチジルイノシトール−再構成ＨＤＬ及びホスファチジルイノシトール−界面活性剤混合ミセルを基質とした、ＥＬ活性測定
ホスファチジルイノシトール−リポゾームは、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９７６年、第１７巻第３号、２３９−２４７ページを、ホスファチジルイノシトール−再構成ＨＤＬは、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９８２年、第２５７巻第８号、４５３５−４５４０ページを参照して、適宜作製する。
一方、ホスファチジルイノシトール−リポゾーム又はホスファチジルイノシトール−再構成ＨＤＬを基質としたＥＬ活性測定は、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００３年、第４２巻第４６号、１３７７８−１３７８５ページ等を参照して行う。
一方、ホスファチジルイノシトール−界面活性剤混合ミセルは、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９８８年、第２６３巻第１２号、５７２４−５７３１ページを参照して、適宜作製する。また、同文献を参照して、ホスファチジルイノシトール−界面活性剤混合ミセルを基質として、ＥＬ活性を測定する。
ホスファチジルイノシトール−リポゾームは、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９７６年、第１７巻第３号、２３９−２４７ページを、ホスファチジルイノシトール−再構成ＨＤＬは、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９８２年、第２５７巻第８号、４５３５−４５４０ページを参照して、適宜作製する。
一方、ホスファチジルイノシトール−リポゾーム又はホスファチジルイノシトール−再構成ＨＤＬを基質としたＥＬ活性測定は、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００３年、第４２巻第４６号、１３７７８−１３７８５ページ等を参照して行う。
一方、ホスファチジルイノシトール−界面活性剤混合ミセルは、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９８８年、第２６３巻第１２号、５７２４−５７３１ページを参照して、適宜作製する。また、同文献を参照して、ホスファチジルイノシトール−界面活性剤混合ミセルを基質として、ＥＬ活性を測定する。
Claims (3)
- (1) ＥＬ阻害剤である被験物質を投与した後の哺乳動物より採取した血清または血漿中のホスファチジルイノシトール又はリゾホスファチジルイノシトール濃度と、該被験物質を投与する前の哺乳動物より採取した血清または血漿中のホスファチジルイノシトール又はリゾホスファチジルイノシトール濃度を比較する工程、及び
(2) 該被験物質を投与した後の哺乳動物より採取した血清または血漿中のホスファチジルイノシトール又はリゾホスファチジルイノシトール濃度が、該被験物質を投与する前の哺乳動物より採取した血清または血漿中のホスファチジルイノシトール又はリゾホスファチジルイノシトール濃度と比べて変化している場合に、該被験物質をＥＬ活性が関連する疾患の治療または予防効果を有する医薬と評価する工程を含む、
ＥＬ活性が関連する疾患の治療または予防効果を有する医薬の薬効評価方法。 - (1) ホスファチジルイノシトール、被験物質及びＥＬを接触させる工程、
(2) 被験物質を接触させた場合のホスファチジルイノシトール濃度を、被験物質を接触させない場合のホスファチジルイノシトール濃度と比較する工程、及び
(3) 被験物質を接触させた場合のホスファチジルイノシトール濃度が、被験物質を接触させない場合のホスファチジルイノシトール濃度と比較して上昇している場合に、被験物質をＥＬ活性阻害物質として選択する工程を含む、
ＥＬ活性阻害物質のスクリーニング方法。 - (1) ホスファチジルイノシトール、被験物質及びＥＬを接触させる工程、
(2) 被験物質を接触させた場合のリゾホスファチジルイノシトール濃度を、被験物質を接触させない場合のリゾホスファチジルイノシトール濃度と比較する工程、及び
(3) 被験物質を接触させた場合のリゾホスファチジルイノシトール濃度が、被験物質を接触させない場合のリゾホスファチジルイノシトール濃度と比較して減少している場合に、被験物質をＥＬ活性阻害物質として選択する工程を含む、
ＥＬ活性阻害物質のスクリーニング方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2012243324 | 2012-11-05 | ||
| JP2012243324 | 2012-11-05 | ||
| PCT/JP2013/079814 WO2014069651A1 (ja) | 2012-11-05 | 2013-11-05 | Ｅｌ活性が関連する疾患の治療または予防効果を有する医薬の薬効評価方法及びｅｌ活性阻害物質のスクリーニング方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPWO2014069651A1 JPWO2014069651A1 (ja) | 2016-09-08 |
| JP6362268B2 true JP6362268B2 (ja) | 2018-07-25 |
Family
ID=50627543
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2014544619A Active JP6362268B2 (ja) | 2012-11-05 | 2013-11-05 | Ｅｌ活性が関連する疾患の治療または予防効果を有する医薬の薬効評価方法及びｅｌ活性阻害物質のスクリーニング方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US9695462B2 (ja) |
| EP (1) | EP2915882B1 (ja) |
| JP (1) | JP6362268B2 (ja) |
| WO (1) | WO2014069651A1 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9695462B2 (en) * | 2012-11-05 | 2017-07-04 | Shionogi & Co., Ltd. | Method for evaluation of drug efficacy of a medicine having a therapeutic or preventive effect against a disease related to EL activity and a method for screening an inhibitor of EL activity |
| EP3373014B1 (en) * | 2015-10-20 | 2020-12-23 | MedImmune, LLC | Diagnostic marker for coronary artery disease |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030181353A1 (en) * | 1998-08-03 | 2003-09-25 | Nyce Jonathan W. | Composition & use as analgesic, anti-inflammatory, wound healing agent, for treatment of heart conditions, assessment of heart function & tissue & cell protection & healing & reperfusion, mood disorders & symptoms & sequelae of menopause & for inducing unconsciousness, sleep & anesthesia |
| WO2000007566A1 (en) * | 1998-08-03 | 2000-02-17 | Epigenesis Pharmaceuticals, Inc. | A new analgesic, anti-inflammatory and wound healing agent |
| BR0009333A (pt) | 1999-03-26 | 2002-01-08 | Aventis Pharm Prod Inc | Composição para reduzir a expessão do gene lipg e a atividade enzimática do polipeptìdeo de lipg, para inibir a atividade enzimática do polipeptìdeo de lipg., para aumentar o nìvel e a atividade enzimática de polipeptìdeo lipg em um paciente e métodos para aumentar o nìvel de colesterol de lipoproteìna de alta densidade e apolipoproteìna ai, para reduzir o nìvel de colesterol de lipoproteìna de densidade muito baixa e de colesterol ldl e colesterol vldl em um paciente, para diagnosticar uma predisposição para baixos nìveis de colesterol hdl e a apolipoproteìna ai, e para determinar se um composto de teste pode inibir a reação enzimática entre o polipeptìdeo de lipg e o colesterol hdl e apolipoproteìna ai e pode aumentar a reação enzimática entre o polipeptìdeo de lipg e o colesterol vldl e vdl |
| EP1613608A1 (en) * | 2003-04-01 | 2006-01-11 | Eli Lilly And Company | Phospholipase inhibitors |
| JP2005080508A (ja) * | 2003-09-04 | 2005-03-31 | Sankyo Co Ltd | 脂質代謝改善剤の試験方法 |
| JP2005080608A (ja) | 2003-09-10 | 2005-03-31 | Seiko Epson Corp | 植物育成装置 |
| EP2249156A1 (en) | 2009-04-29 | 2010-11-10 | Aterovax | Enzymatic assay for the quantitative determination of phospholipase A1 or A2 activity in a sample based on the use of a solid phase coated with a fluorochrome-labelled substrate |
| JP5065370B2 (ja) | 2009-12-24 | 2012-10-31 | 辻製油株式会社 | 高純度リゾホスファチジルイノシトール及び糖脂質の製造方法 |
| US9695462B2 (en) * | 2012-11-05 | 2017-07-04 | Shionogi & Co., Ltd. | Method for evaluation of drug efficacy of a medicine having a therapeutic or preventive effect against a disease related to EL activity and a method for screening an inhibitor of EL activity |
-
2013
- 2013-11-05 US US14/437,941 patent/US9695462B2/en active Active
- 2013-11-05 EP EP13851614.1A patent/EP2915882B1/en active Active
- 2013-11-05 WO PCT/JP2013/079814 patent/WO2014069651A1/ja active Application Filing
- 2013-11-05 JP JP2014544619A patent/JP6362268B2/ja active Active
-
2017
- 2017-06-01 US US15/611,316 patent/US20170268034A1/en not_active Abandoned
-
2019
- 2019-12-06 US US16/705,720 patent/US20200109433A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP2915882A4 (en) | 2016-04-27 |
| EP2915882B1 (en) | 2018-10-17 |
| US9695462B2 (en) | 2017-07-04 |
| EP2915882A1 (en) | 2015-09-09 |
| WO2014069651A1 (ja) | 2014-05-08 |
| US20170268034A1 (en) | 2017-09-21 |
| US20200109433A1 (en) | 2020-04-09 |
| JPWO2014069651A1 (ja) | 2016-09-08 |
| US20150291998A1 (en) | 2015-10-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Boffa et al. | Oxidized phospholipids as a unifying theory for lipoprotein (a) and cardiovascular disease | |
| Lehti et al. | Extracellular lipids accumulate in human carotid arteries as distinct three-dimensional structures and have proinflammatory properties | |
| Rosenson et al. | Dysfunctional HDL and atherosclerotic cardiovascular disease | |
| Toth et al. | High-density lipoproteins: a consensus statement from the National Lipid Association | |
| Bochkov et al. | Generation and biological activities of oxidized phospholipids | |
| Reis et al. | Dramatic remodeling of advanced atherosclerotic plaques of the apolipoprotein E–deficient mouse in a novel transplantation model | |
| Shentu et al. | The role of oxysterols in control of endothelial stiffness | |
| JP4812751B2 (ja) | Ｌｐ−ＰＬＡ２活性およびＬｐ−ＰＬＡ２活性阻害を検出する方法 | |
| Chao et al. | Disentangling oxidation/hydrolysis reactions of brain mitochondrial cardiolipins in pathogenesis of traumatic injury | |
| Yuan et al. | An essential role for lysophosphatidylcholine in the inhibition of platelet aggregation by secretory phospholipase A2 | |
| EP3004889B1 (en) | Method for determining cardiovascular disease risk by determining the level of at least two of the lipids of triacylglycerol, cholesterol esters and phosphatidylethanolamine | |
| JP2015526696A (ja) | プロタンパク質転換酵素スブチリシン／ケキシン９型（ｐｃｓｋ９）阻害に対する高感度の有効性および特異性バイオマーカー | |
| Melchior et al. | Pregnancy is accompanied by larger high density lipoprotein particles and compositionally distinct subspecies | |
| Ryborg et al. | Increased lysophosphatidylcholine content in lesional psoriatic skin | |
| US20200109433A1 (en) | Method for evaluation of drug efficacy of a medicine having a therapeutic or preventive effect against a disease related to el activity and a method for screening an inhibitor of el activity | |
| Duvernay et al. | Platelet lipidomic profiling: novel insight into cytosolic phospholipase A2α activity and its role in human platelet activation | |
| US20070265216A1 (en) | Enhanced medical treatment in diabetic cardiomyopathy | |
| Bessueille et al. | Inhibition of alkaline phosphatase impairs dyslipidemia and protects mice from atherosclerosis | |
| De León et al. | Systems biology research into cardiovascular disease: contributions of lipidomics-based approaches to biomarker discovery | |
| US20140322735A1 (en) | Method to Measure Endogenous Enzymatic Serum/Plasma Cholesterol Esterification by LCAT (Lecithin:Cholesterol Acyltransferase) Assay | |
| POLGÁR et al. | Human group II 14 kDa phospholipase A2 activates human platelets | |
| US20120053114A1 (en) | Method | |
| WO2003035901A1 (en) | Assay method for measurement of net cholesterol flux | |
| Guo et al. | Efficient quantitative analysis of carboxyalkylpyrrole ethanolamine phospholipids: Elevated levels in sickle cell disease blood | |
| Traczyk et al. | Diacylglycerol kinase-ε is S-palmitoylated on cysteine in the cytoplasmic end of its N-terminal transmembrane fragment |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20160912 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20170725 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20180306 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20180425 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20180612 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20180625 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6362268 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |