JP5637959B2 - Lp−PLA2活性のハイスループットアッセイ - Google Patents
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Description
本明細書中用いる「シークエスター分子」は、他の分子および/または溶液から第2分子の分離を促進するように、単独または他の分子もしくは共同因子と相まって第2分子と複合体を形成し得る任意の分子をいう。例えば、シークエスター分子は第2分子に付着し、それを溶液から沈殿させる蛋白質であってもよく、または第2分子上で電荷を帯び、それが正または負電極に引き寄せられやすいようにする蛋白質であってもよい。PAFに対するシークエスター分子の例はウシ血清アルブミン(以下「BSA」という)およびヒト血清アルブミンを包含するが、これらに限定されない。
本明細書で提供される式にて用いられる記号「*」は乗法の数学関数である。
CPM全計数=(CPM正味全計数*VRT)/(VSA)
[ここで、
CPM正味全計数=全計数反応物から由来の上清のアリコートにおける正味平均計数;
VRT=遠心分離前の最終反応溶液の全容量;および
VSA=シンチレーションカウンティング用にアリコートされた全計数反応物から由来の上清の容量である]
を用いて、全計数反応の正味平均計数として算出される。
Lp−PLA2活性(ナノモル/分/ml)=S*(CPM試料-CPMブランク)*VST/(CPM全計数*VSA*V*T)
[ここで、
S=調製工程の溶液中のPAF全量(ナノモル);
CPM試料=各試料の上清の平均計数;
CPMブランク=ブランク反応物の上清の平均計数;
VST=上清の全容量;
CPM全計数=全計数反応物の平均計数;
VSA=シンチレーションカウンティング用にアリコートされた各上清の容量;
V=第一接触工程にてアリコートされた試料の全容量(μL);および
T=第一接触工程の総時間(分)である]
を用いて算出される。
CPM総添加計数=(CPM正味スパイク計数*VPAF)/(Vスパイク)
[ここで、
CPM正味スパイク計数=総添加計数から由来の上清の正味平均計数;
VPAF=第一接触工程にて添加した調製工程の溶液の容量;
Vスパイク=総添加計数用にブランク反応物上清に添加された調製工程の溶液の容量であ る]
を用いて容量調整した、総添加計数反応物の正味平均計数として算出した。
Lp−PLA2活性(ナノモル/分/ml)=S*(CPM試料−CPMブランク)*VST/(CPM総添加計数*VSA*V*T)
[ここで、
S=調製工程の溶液中の全PAF量(ナノモル);
CPM試料=各試料上清の平均計数;
CPMブランク=ブランク反応物から由来の上清の平均計数;
VST=上清の全容量;
CPM総添加計数=総添加計数の平均計数;
VSA=シンチレーションカウンティング用にアリコートした各上清の容量;
V=第一接触工程にてアリコートした試料の全容量(μL);および
T=第一接触工程の総時間(分)である]
を用いて各上清にて算出した。
実施例1.封鎖および沈殿のためのBSA濃度滴定
BSA濃度および遊離3H−PAFとの接触時間を試験した。緩衝溶液中の濃度が200μMの3H−PAFを濃度1.04mg/mLないし16.67mg/mLのBSAに5分間または一晩接触させた。ついで、BSAおよびPAF複合体を7.78%TCAで沈殿させ、4℃で15分間、6,000gの遠心分離によりペレットを得た。溶液に残存する遊離3H−PAFの割合をシンチレーションカウンティングにより上清にて測定した。表1に示すように、沈殿として溶液から除去された遊離PAFの割合はBSA濃度およびインキュベーション時間の増大と共に増大した。
緩衝溶液中の3H−PAFを濃度16.67mg/mLのBSAで封鎖し、氷上で5分間インキュベートした。PAFを7.78%氷冷TCAで沈殿させ、氷上で15分間インキュベートするか、あるいは室温にて7.78%TCAで沈殿させ、ついで室温にて5、10または20分間インキュベートした。表2で示すように、氷冷TCAおよび続く氷上での15分間のインキュベーションにおいて溶液に残存するPAF割合が最も小さかった。
緩衝溶液中の3H−PAFを濃度16.6mg/mLのBSAで封鎖し、氷上で5分間インキュベートした。PAF−BSA複合体を7.78%氷冷TCAで沈殿させ、氷上で15分間インキュベートした。沈殿したPAF−BSA複合体を微小遠心力800gないし13,000gにて遠心分離した。遠心分離後、溶液に残存する3H−PAF割合を測定した。5,000g未満の微小遠心力を用いて約1.3%ないし約2%のPAF−BSA複合体が溶液に残存した。微小遠心力を少なくとも6,000gに増大した場合、わずか約1.1%またはそれ未満のPAF−BSA複合体だけが溶液に残存した。
37℃および室温(約21℃)にてLp−PLA2をPAFと30分間反応させ、該活性をPAFから放出された生成物の放射能(すなわち、毎分の壊変数/DPM)としてシンチレーションカウンティングにて測定した。反応速度は反応温度に関わらず30分間にわたり直線的であった。37℃にて実施した反応は室温にて実施した反応より高いLp−PLA2活性を示した。30分でのLp−PLA2活性は37℃での反応については約80,000DPM、室温での反応については40,000DPMであった。
市販シンチレーション用カクテル3種を緩衝溶液中のPAF放射能を測定するために用いた。MicroScint−20(登録商標)、MicroScint−40(登録商標)およびScintisafe(登録商標)を試験した。PAF溶液40μLのカウント毎分(CPM)はMicroScint−40よりMicroScint−20が高かった。加えて、MicroScint−40中の反応生成物80μLの計数はMicroScint−20中の同じ反応生成物40μLの放射能の2倍には至らなかった。同様に、MicroScint−20はScintiSafeより非常に高い計数効率(30%)を示した。
室温にて3H−PAFと5分間反応させたヒト血漿試料希釈液のLp−PLA2活性を測定した。16.67mg/mLの氷冷BSAでPAF基質を封鎖することで反応を終結させた。該PAF−BSA複合体を7.78%氷冷TCAで沈殿させ、4℃で15分間、6,000gの遠心分離によりペレットを得た。MicroScint−20カクテルを用いるシンチレーションカウンティングにより上清中の反応生成物を測定した。0.1μL/反応および5μL/反応の血漿を別々の反応で用いた。ヒト血漿試料にて測定されたLp−PLA2活性値は反応に添加したヒト血漿量に直線比例した。
アッセイバッファーを以下の仕様にて室温で調製し貯蔵した:100mM HEPES、pH7.4;150mM NaCl;および5mM EDTA。
480μLの3H−PAF(10.0Ci/mmolにて10μM=0.1mCi/ml)および24.6μLのC16−PAF(「1−ヘキサデシル−2−アセチル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン」としても知られている)(5.0mg/ml;MW:524)をチューブにアリコートし、100反応用の3H−PAF溶液を調製した。該2溶液を混合し、フードにて風乾した。乾燥ペレットを12.0mLのアッセイバッファーに再懸濁し、20μM PAFの3H−PAF溶液(すなわち0.4μMの3H−PAFおよび19.6μMの冷C16−PAF)を調製した。
氷冷TCA溶液(25μLの56%容量/容量の溶液)を各ウェルに添加し、混合し、冷蔵庫で15分間インキュベートした。ついで該プレートを6,000gで15分間、4℃で遠心分離した。各上清のアリコート(45μL)を96−ウェルのポリスチレンプレートに移した。
Lp−PLA2活性を以下の式;
Lp−PLA2活性(ナノモル/分/ml)=32*(CPM45μl−上清−CPM
ブランク)/(CPM10μl−スパイク−CPMブランク)
[ここで、
CPM45μl−上清は各試料の平均計数であり、
CPMブランクはブランクの平均計数であり、
CPM10μl−スパイクは全計数の平均計数ある]
を用いて算出した。
Lp−PLA2阻害剤またはプラシーボ投与から投与後144時間に至るまでのベースラインおよび予定した時間ポイントにて健常ボランティアから血漿試料を収集した。実施例7記載のとおり血漿試料をLp−PLA2活性についてアッセイした。薬剤処置されたボランティアにてLp−PLA2活性の有意な阻害(>85%)が阻害剤投与後約1時間ないし約6〜約8時間で観察された。測定された当該阻害は阻害剤の薬物動態学的データに相関していた。一方、プラシーボ処置されたボランティアにおいてはLp−PLA2活性の有意な減少は全く検出されなかった。血漿試料を分光光度的にアッセイした場合に、Lp−PLA2のほんの約30%の阻害が阻害剤で処置されたボランティア由来の同試料から検出された。
実施例7記載の放射標識基質を用いるハイスループットLp−PLA2活性測定に関連する本発明の方法を、アッセイ内活性測定との比較ならびに抽出法にて決定される活性測定との比較により検証した。本発明の方法は0.2ナノモル/分/mLの検出限界(「LOD」)および約100倍の線形ダイナミック・レンジ(0.5−48.5ナノモル/分/ml)を有する卓越した性能特性を示した。
Claims (28)
- 複数の試料におけるリポ蛋白ホスホリパーゼA2(Lp−PLA2)酵素活性を測定するハイスループット法であって、
(i)標識された血小板活性化因子(PAF)を含む溶液を調製する工程;
(ii)複数の試料の各々を、マイクロタイタープレートのウェルまたは微小遠心管にアリコートする工程;
(iii)複数の試料の各々を、工程(i)にしたがって調製された溶液と接触させる工程;
(iv)第一の接触工程(iii)の溶液の各々を、ウシ血清アルブミンまたはヒト血清アルブミンであるPAFのシークエスター分子と接触させてPAF−シークエスター分子の複合体を形成する工程;
(v)該PAF−シークエスター分子の複合体をトリクロロ酢酸(TCA)を含む沈殿化溶液と接触させて沈殿物および上清を形成する工程;
(vi)該マイクロタイタープレートまたは微小遠心管を10℃未満で少なくとも5分間、少なくとも6,000gで遠心分離することによって該PAF−シークエスター分子の複合体を取り出す工程;および
(vii)Lp−PLA2活性を検出する工程
を含むハイスループット法。 - 少なくとも1の試料が、血清、細胞溶解物、組織溶解物、尿および血漿からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
- 標識されたPAFが放射標識されている、請求項1または2記載の方法。
- 工程(i)にしたがって調製された溶液中のPAFの全濃度が、少なくとも20μMである、請求項1ないし3のいずれか1項に記載の方法。
- 該溶液が、標識されたおよび標識されていないPAFを含むものであって、緩衝溶液である、請求項1ないし4のいずれか1項に記載の方法。
- 緩衝溶液が、HEPES、塩化ナトリウム(NaCl)、およびエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を含む、請求項5記載の方法。
- 工程(i)にしたがって調製された溶液および試料が、少なくとも5秒間混合され、21℃で少なくとも1分間インキュベートされる、請求項1ないし6のいずれか1項に記載の方法。
- 該シークエスター分子が、外因性ウシ血清アルブミン(BSA)である、請求項1ないし7のいずれか1項に記載の方法。
- BSAが10℃未満である、請求項8記載の方法。
- BSAが4℃である、請求項8記載の方法。
- BSAが50mg/mLの濃度である、請求項8または9記載の方法。
- 該シークエスター分子が、内因性ヒト血清アルブミンである、請求項1ないし7のいずれか1項に記載の方法。
- TCAを含む沈殿化溶液が10℃未満である、請求項1ないし12のいずれか1項に記載の方法。
- 遠心分離が4℃で15分間実施される、請求項1ないし13のいずれか1項に記載の方法。
- Lp−PLA2活性がシンチレーションカウンティングによって測定される、請求項1ないし14のいずれか1項に記載の方法。
- 緩衝溶液を、全RIカウントまたはブランクを測定するための少なくとも2つの容器にアリコートすることをさらに含む、請求項1記載の方法。
- 容器が、微小遠心管またはマイクロタイタープレートのウェルである、請求項16記載の方法。
- 少なくとも1つのブランクを測定するための反応物をほぼ同容量および濃度の工程(i)にしたがって調製された溶液およびシークエスター分子と接触させ、少なくとも2つの全RIカウントを測定するための反応物のアリコートをほぼ同容量の工程(i)にしたがって調製された溶液およびシークエスター分子の置換用溶液と接触させること、ここで、該置換用溶液はシークエスター分子を含有しない;各試料の上清部分、ブランクを測定するための反応物および全RIカウントを測定するための反応物を別々の容器にアリコートすること;および、その各アリコートにシンチレーションカクテルを接触させることをさらに含む、請求項17記載の方法。
- 複数の血清または血漿試料におけるリポ蛋白ホスホリパーゼA2(Lp−PLA2)酵素活性を測定するハイスループット法であって、
(i)放射標識された血小板活性化因子(PAF)および標識されていないPAFを含む緩衝溶液を調製する工程、ここで、溶液中のPAFの全濃度は少なくとも20μMであり、標識されたPAFは溶液中に最大20%のPAFを含む;
(ii)複数の試料の各々を、マイクロタイタープレートのウェルまたは微小遠心管にアリコートする工程;
(iii)複数の試料の各々を、工程(i)にしたがって調製された溶液と接触させる工程;
(iv)第一の接触工程(iii)の溶液の各々を、外因性ウシ血清アルブミン(BSA)であるPAFのシークエスター分子と10℃未満で接触させてPAF−シークエスター分子の複合体を形成する工程、ここで、第一の接触工程(iii)の溶液およびシークエスター分子は10℃未満で少なくとも1分間インキュベートされる;
(v)該PAF−シークエスター分子の複合体をトリクロロ酢酸(TCA)を含む沈殿化溶液と接触させて沈殿物および上清を形成する工程、ここで、沈殿化溶液は10℃未満であり、TCAは第二の接触工程(iv)の溶液と少なくとも1分間インキュベートされる;
(vi)該マイクロタイタープレートまたは微小遠心管を10℃未満で少なくとも5分間、少なくとも6,000gで遠心分離することによって該PAF−シークエスター分子の複合体を取り出す工程;および
(vii)Lp−PLA2活性を検出する工程
を含む、ハイスループット法。 - 緩衝溶液が、HEPES、塩化ナトリウム(NaCl)、およびエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を含む、請求項19記載の方法。
- 工程(i)にしたがって調製された溶液および試料が、少なくとも5秒間混合され、21℃で少なくとも1分間インキュベートされる、請求項19または20に記載の方法。
- 各試料が、工程(i)にしたがって調製された溶液と一緒に5分間インキュベートされる、請求項21記載の方法。
- BSAが4℃である、請求項19ないし22のいずれか1項に記載の方法。
- 遠心分離が4℃で15分間実施される、請求項19ないし23のいずれか1項に記載の方法。
- Lp−PLA2活性がシンチレーションカウンティングによって測定される、請求項19ないし24のいずれか1項に記載の方法。
- 緩衝溶液を、全RIカウントまたはブランクを測定するための少なくとも2つの容器にアリコートすることをさらに含む、請求項19記載の方法。
- 容器が、微小遠心管またはマイクロタイタープレートのウェルである、請求項26記載の方法。
- 少なくとも1つのブランクを測定するための反応物をほぼ同容量および濃度の工程(i)にしたがって調製された溶液およびシークエスター分子と接触させ、少なくとも2つの全RIカウントを測定するための反応物のアリコートをほぼ同容量の工程(i)にしたがって調製された溶液およびシークエスター分子の置換用溶液と接触させること、ここで、該置換用溶液はシークエスター分子を含有しない;各試料の上清部分、ブランクを測定するための反応物および全RIカウントを測定するための反応物を別々の容器にアリコートすること;および、その各アリコートにシンチレーションカクテルを接触させることをさらに含む、請求項27記載の方法。
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