JP3014752B2 - 細胞の活性化を測定するための酵素アッセイおよびアッセイキット - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明の背景 発明の分野 免疫学、細胞生物学、および薬学の分野におよぶ本発
明は細胞、特にリンパ球のような血液細胞の活性化をリ
ンパ球が特有に反応する抗原のような、細胞活性化物質
によって、測定するための酵素によるアッセイおよびア
ッセイキットに関するものである。

背景技術の記載 特異免疫応答あるいは免疫系の一般的な反応性を測定
することは多くの重大な疾病の診断および研究に貴重な
手段である。元来、このような検査は、急性あるいは遅
延過敏症の存在を検出する皮膚反応のようなインビボ技
術に限られていた。

1960年代から、インビボ免疫応答の相関物としてはた
らく数多くのインビトロアッセイが開発されてきた。こ
れらのバイオアッセイの多くは免疫系の細胞、すなわち
リンパ球が応答する化学構造、たとえばリンパ球に特有
な抗原をリンパ球が認識するという事実に基づく。この
応答の一部としてリンパ球は活性化され、「芽細胞（bl
ast）にまで大きくなり、分裂、および／または分化を
する。

このように、適正に存在した攻撃抗原の存在下でリン
パ球の胚子発生あるいはリンパ球の増殖をインビトロで
測定することは主としてＴリンパ球クラスの特異免疫応
答の測定法として役立つ。全クラスのリンパ球（正確に
は、抗原−特異母集団よりむしろ）を刺激する、ポリク
ローナル アクチベーターにより、リンパ球の大部分に
誘発される同様の反応は医者および研究者にリンパ球母
集団の一般的な反応性を評価する手段を与えている。

ポリクローナル活性化は多種の物質、たとえば植物か
ら誘導された有糸分裂促進性レクチン（たとえばコンカ
ナバリンＡ、植物性血球凝集素、アメリカヤマゴボウ
マイトジェン）、細菌生産物（たとえばリポ多糖、細胞
壁物質、エンテロトキシン）、および種々の化学物質若
しくは生化学物質（たとえばホルボールエステル、過ヨ
ウ素酸ナトリウム、ガラクトース オキシダーゼ、硫酸
デキストラン）により誘発される。〔ロイト，アイ．
（Roitt,I.）ら、イムノロジー（IMMUNOLOGY）、シー．
ブイ．モスビー カンパニー（C.V.Mosby Co.）（1985
年）参照〕。

現在実施されているように、リンパ球の活性化あるい
は刺激のインビトロアッセイはDNAの放射性前駆物質、
最も一般的には³H−チミジンあるいは¹²⁵ヨードデオキ
シウリジンを増殖しつつある細胞に混入させることによ
り細胞の生長（たとえば増殖）を測定することを必要と
する。これらのアッセイは技術的に無菌の細胞培養条件
および血液試料の多段階分別を要求し、必要としてお
り、このため該アッセイは比較的高価である。さらに、
これらのアッセイは、米国において増加が問題となって
いる放射性廃棄物を発生する。おそらく最も重要なこと
は、これらアッセイが一般に３〜７日必要とし、特に応
答の違い（たとえば、患者と健常対照者との間）が、
「すべてが応答するかまたは応答しない」ではなく、有
意ではあるが大きくない場合には、結果は全く変わりや
すい。さらに、一連の刺激に対する応答を測定するため
に現在のアッセイは、比較的多数のリンパ球を必要と
し、リンパ球減少症あるいは白血球減少症の患者（たと
えば化学療法、骨髄移植の後、あるいはエイズのような
免疫不全症の場合）の検定の際、問題が生じる。

従って、迅速で、簡単であり、試料としてわずかな量
の血液しか必要とせず、かつ放射性同位体の使用を避け
得るリンパ球活性化のアッセイは極めて有用である。臨
床研究室の目的にとって、かかるアッセイが：（１）容
易にルーチン化され、可能なかぎり、わずかな量の細胞
の操作しか要求せず；（２）自動化され、（３）現在の
細胞増殖アッセイが与えるよりもより再現性のある結果
を提供することは重要なことである。

更に迅速なアッセイへの１つの方法は細胞活性化に対
する開始刺激後、初期に発生する事象を測定することで
あり、その事象はDNA合成および細胞増殖に先行してい
る。細胞内のあるいは膜−結合酵素の「活性化」は細胞
膜が特定のリンパ球に接触する抗原のようなシグナルに
よって、「引き起こされた」後、初期に発生する事象の
１つのタイプである〔セル，エス．（Sell,S.），イム
ノロジー，イムノパソロジー，アンド イムニティー
（Immunology,Immunopathology,and Immunity），エル
セビア（Elsevier）,1987年〕。かかる酵素の活性化、
あるいは、応答の有効性は色素生成性基質あるいは他の
物理的に検出可能な反応体あるいは生成物を用いた酵素
−基質反応を使用することで容易にモニターできる。

ランデグレン，ユー，（Landegren,U.）、〔ジャーナ
ル オブ イムノロジカルメソッズ（J.Immunol.Met
h.）67:379−388（1984年）〕は、偏在するリソソーム
酵素、ヘキソサミニダーゼを利用し、マイクロプレート
のウエルに存在する細胞の数を計るためのアッセイを開
発した。この酵素に対する色素生成性基質、ｐ−ニトロ
−フェノール−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド
は、比色定量プレート読み取り装置を用い405nmの吸光
度（A₄₀₅）として測定される着色反応生成物を生成させ
るために用いられた。基質を培養中の細胞に添加する場
合に、発生した色（たとえば形成された反応生成物）の
量は、所定の反応時間の間、細胞数に正比例した。この
方法を適用して生長因子に応じたリンパ球増殖、細胞の
表面への付着、および抗体で被覆されたプレートへの細
胞の付着を測定した。このように、この方法はリンパ球
増殖のアッセイにおいて放射性同位体の使用の有用な代
替法となり得るが、この文献に開示されているように、
初期のリンパ球活性化を測定するには価値がなく、この
理由は、この酵素が明らかにいつでも基質に対して活性
で、有効性をもっているからである。さらに、問題はこ
の酵素が血清中に存在することであり、インビトロでイ
ンキュベーションする前に血液細胞を十分に洗浄して血
清−結合酵素を取り除く必要がある。

ランデグレンによって記載されたアッセイ（前記）は
細胞内寄生体の生育性および殺生性を検出するために、
アルシナ，エー．（Alcina,A.），らジャーナル オブ
イムノロジカル メソッズ 105:1−８（1987年）に
よって改変された。

モスマン，ティー．（Mosmann,T.）（ジャーナル オ
ブ イムノロジカル メソッズ 65:55−63（1983
年））はテトラゾリウム塩MTT（３−（4,5−ジメチルチ
アゾール−２−イル）−2,5−ジフェニル テトラゾリ
ウム、ブロマイド）を用いた同様のアッセイを開発し、
アッセイはミトコンドリア脱水素酵素により変性して青
色ホルマザン生成物を形成し、この生成物の吸光度は57
0nmで分光測光法で測定できる。細胞数が特定の範囲に
亘り、この基質は細胞数と色調形成との間に直線関係が
成立した。この方法は成長因子による若干のリンパ球細
胞株の生長の刺激を測定するのに有用であった。他は細
胞毒性アッセイにおいて細胞の生存を測定するためにモ
スマンの方法を改変した〔グリーン エル．エム．（Gr
een L.M.），ら、ジャーナル オブ イムノロジカルメ
ソッズ 70:257−268（1984年）〕。

アルカリホスファターゼは種々の正常および白血病リ
ンパ球タイプの分泌性および吸収性表面に結合している
ことで知られている酵素である〔ノイマン，エイチ．
（Neumann,H.）ら、プロシーディング オブ ナショナ
ル アカデミー オブ サイエンス オブ ザ ユナイ
テッドステイツ オブ アメリカ（Proc.Natl.ACad.Sc
i.USA）73:1432（1976年）；クルベナー，ジェイ．ジ
ー．（Culvenor,J.G.），ら、ザ ジャーナル オブ
イムノロジー（J.Immunol.）126:1974（1981年））．ガ
ルシア−ロザス，シー．（Garcia−Rozas,C.），ら（ザ
ジャーナル オブ イムノロジー 129:52−55（1982
年））は種々のマイトジェンと共にインビトロで培養し
たマウスリンパ球において、基質としてｐ−ニトロフェ
ニルホスフェートを用い、アルカリホスファターゼをア
ッセイした。アッセイする前に、細胞をグルタルアルデ
ヒドで固定し界面活性剤で処理し、しかる後基質を加
え、色調反応をプレート読み取り装置を使用し、プレー
トで直接読み取った（A₄₀₅）。アルカリホスファターゼ
が特にＢリンパ球と関連していることが明らかになっ
た。酵素活性はリポ多糖（LPS）あるいはアメリカヤマ
ゴボウ マイトジェン（PWM）で３日間「活性化した」
Ｂ細胞において有意に高められ、大きくなった「芽」細
胞と関連していた。

ハシモト，エヌ．（Hashimoto,N.），ら〔ジョーナル
オブ イムノロジカル メソッズ）90:97−103（1986
年）〕はガルシア−ロザスらのアッセイ（前記）におい
て、界面活性剤中の基質を刺激したＢ細胞（１度洗浄し
た後の細胞）が含まれるマイクロ ウエルに直接添加す
ることに改変した。このアッセイはLPSで３日間刺激
し、さらにＴ細胞誘導因子で１〜２日間刺激した後Ｂ細
胞増殖の測定を可能にした。このアッセイは³H−チミジ
ンの取り込みの測定に比べ、「汚染」Ｔ細胞が多数存在
している際でも選択的にＢ細胞増殖を検出でき、HAT培
地（通常、ハイブリドーマ選別に使用される）において
細胞を測定することもできる点で有利であった。３日よ
り前に酵素「活性化」を示す証拠は全く存在せず、新鮮
なＢ細胞の検出可能な酵素活性の限界値は10⁵あるいは
それ以上の細胞を必要とすると思われた。

欧州特許出願公開第0166505号明細書（1985年１月２
日）は、クロマトグラフ分離および比色定量アッセイを
介してアルカリホスファターゼを定量的に検出する方法
を提供し、そこでは酵素活性の２×10^-6単位が検出可能
なシグナルを与えた。しかし、この文献に開示されたア
ッセイ系およびキットは部分的に精製された酵素の使用
のために設計されており、全細胞（Who−le cell）用
ではない。

チャン，ケー−エム．（Chan,K−M.）ら〔アナリティ
カル バイオケミストリー（Anal.Biochem）157:375−3
80（1986年）〕は、含脂肪細胞の形質膜調製物あるいは
肝臓ミクロソーム上のCa²⁺−刺激ATPアーゼ活性の測定
のための直接比色定量アッセイを記載した。このアッセ
イはATP基質からつくられるPi生成物に色素生成反応を
組合せることによる。この酵素は単に細胞抽出物におい
て測定され、全細胞での使用は示唆されていなかった。

欧州特許出願公開第0122028号明細書（1984年10月17
日）には、比色定量アッセイが生物学的標本中の酵素の
検出に有用であることが開示されている。基質を綿棒の
ような表面に吸収させ、これを酵素−含有標本と接触さ
せて表面上で色調反応を起こさせる。このアッセイ系は
定性的というよりむしろ純粋に定量的であり、特に試料
中の細菌の存在を検出するために設計されたものであ
る。このアッセイ系は１種以上の基質を吸収させた綿棒
を細菌−含有試料へ浸漬し、かつ綿棒での発色を検出す
ることにより、試料中の１種以上の細菌タイプの存在を
検出するために設計された。

発明の開示 本発明は、血液細胞のような、細胞を特異抗原のよう
な細胞−活性化物質で活性化した際特定の細胞酵素が活
性化されるか、或いは基質との反応に有効になるという
ことを知見したことに基づく。

本発明はこの反応を無傷細胞（intact cell）を用い
て測定するための迅速で、簡単であり、再現性あるアッ
セイを提供するもので、このアッセイでは基質を、検出
可能な生成物あるいは、検出可能な生成物が得られる他
の反応につなげられる生成物に転化させる。

本発明は（ａ）細胞を適当な間隔で細胞−活性化物質
と接触させ、ここで細胞−活性化物質が細胞の酵素を反
応にとって有効にし、；（ｂ）酵素と反応可能な酵素基
質を供給し、；（ｃ）酵素−基質反応の生成物を測定す
ることにより細胞の活性化を検出することから、所定の
細胞−活性化物質による細胞の活性化を検出する方法に
関するものである。

本発明はさらに（ａ）リンパ球を適当な間隔で抗原と
接触させ、ここで、抗原との相互作用がリンパ球の酵素
を反応にとって有効にし、；（ｂ）酵素と反応可能な酵
素基質を供給し；（ｃ）酵素−基質反応の生成物の測定
によりリンパ球の活性化を検出することによって所定の
抗原に特異なリンパ球の存在を検出するようなアッセイ
の使用にも関するものである。

本発明は、（ａ）披検者からの血液細胞を抗原に供給
し；（ｂ）前記細胞を細胞が活性化をうけるよう十分な
期間、抗原と共にインキュベートし、これが細胞の酵素
を反応にとって有効にし；（ｃ）この酵素と反応可能な
酵素基質を供給し、；（ｄ）酵素−基質反応の生成物を
測定することにより、免疫学的感作を検出することによ
って抗原に対する免疫学的感作を検出する方法を提供す
る。

本発明はさらに血液細胞のような細胞の活性化を測定
するためのキットに関するもので、このキットでは支持
マトリックスに結合した抗原のような細胞−活性化物質
および酵素のための基質を供給する。

好適例の記載 本発明のアッセイは、試験する細胞を、細胞と同時に
加えたか、あるいはあらかじめ支持マトリックスに結合
させておいて、次いで細胞と接触させる細胞−活性化物
質と共にインキュベートすることを含む。これらの細胞
および活性化物質は細胞において酵素を活性化させるの
に十分な時間相互作用させておく。本発明の主要な利点
は活性化を測定できる迅速性である（約３時間が最
適）。活性化した酵素にとっての基質は、細胞と共にあ
るいは活性化が進行した後に添加し、活性なあるいは有
効な酵素によって作用を受けて細胞の活性化を知らせる
検出可能な反応生成物を生じる。

ここで「細胞−活性化物質」とは、細胞のレセプター
あるいは他の結合構造体の所有あるいは摂取メカニズ
ム、および／または適当な代謝機構によって、細胞に反
応を引き起こすことができる物質を意味する。

リンパ球および単球／マクロファージのような免疫系
の細胞い対して、細胞−活性化物質は、特異抗原を含
む。この抗原はペプチド、グリコペプチド、リポタンパ
ク質、あるいはハプテンとすることができる。これら抗
原に含まれるものはアレルゲンとして知られている特定
のクラスであり、これらの多くはハプテンである。また
免疫系の細胞に対する細胞活性化物質は、免疫複合物、
補体成分、免疫グロブリン分子あるいはフラグメント、
リンホカインおよび他のサイトカイン（たとえば、IL1,
IL2,IL4など）を含む。アレルゲンは特定リンパ球ある
いは好塩基球あるいは表面に特異的IgE抗体をもつ肥満
細胞の活性化剤としてはたらく。また、アレルゲンとな
り得る食品物質も、ここで意図する細胞−活性化物質と
して、種々の環境化学物質と同じようにはたらくことが
できる。免疫系の細胞の活性化の議論はたとえば、ここ
に参考のため記載するロイト，アイ．ら、イムノロジ
ー，シー．ブイ．モスビー カンパニー（1985年）を参
照。

本発明のアッセイによって検出されるような血液細胞
を活性化できる物質のリストを次の表１に示す。このリ
ストは網羅することを意図しているのではなく、当業者
は本発明において使用するための付加的な活性化剤を選
択できる。

本発明に係る抗原あるいは他の細胞活性化剤は細胞と
共に（あるいは直後に）反応に添加することができる。
或いはまた、活性化剤は簡単なプレインキュベーション
あるいは業界で良く知られているような化学カップリン
グにより支持マトリックスに結合させることができる。
他の例において活性化剤はリポソームに結び付けるか混
入させるかでき、この形態で細胞に与えられる。

脂肪細胞は、必須脂肪酸、アラキドン酸およびその代
謝物、あるいはトリグリセリドにより活性化され得る。

赤血球細胞前駆体および他の血液細胞は水銀塩および
二亜硫酸塩のような亜硫酸塩などを含む、環境中で見い
出される化学物質により活性化され得る。

肝細胞はアラキドン酸、必須脂肪酸、および種々の生
体異物により活性化することができる。

グルコース−６−ホスフェート重合体を用いて種々の
細胞を活性化することができ、グルコース−６−ホスフ
ェート脱水素酵素の不足あるいは活動亢進を検出でき
る。

種々の細胞をホルモンあるいは成長因子によって活性
化することができる。活性化可能な種々の細胞タイプお
よび種々の生物学的分子あるいは生体異物は業界でよく
知られている（ここに参考のため記載する スミス，イ
ー．エル．（Smith,E.L.），プリンシプル オブ バイ
オケミストリー（PRINCIPLES OF BIOCEMISTRY）：マー
マリアン バイオケミストリー（Mammalian Biochemist
ry），第７版，マグロウ−ヒル（McGraw−Hill），（19
83年）を参照）。

ここで「酵素の活性化」とは活性化の前に酵素活性が
ほとんどまたは全く検出されない場合に、酵素活性の測
定可能な増加が結果として生じた多数の変化の任意の変
化を意味する。このようにして、細胞と反応することに
より、細胞−活性化物質はリン酸化、あるいは脱リン酸
化によるか、あるいは活性部位のアロステリック変化に
よるようにして、化学的に不活性な型から化学的に活性
な型への酵素の改変をまねく多数の細胞内事象を引き起
こすことができる。或いはまた、酵素は細胞質から細胞
表面へというように、基質に接近し難い部位から基質に
接近できる部位へ転位させることができる。膜小胞構造
の内側から外側へのような酵素の局在化における細胞内
変化は細胞質に存在する基質に対して酵素を有効にさせ
ることができる。本発明で使用するような酵素の活性化
は細胞の活性化の過程の一部として、基質を酵素と接触
させることができる細胞における変化によって、酵素を
基質に対して有効とさせることをも含む。酵素活性、局
在化、および基質材料の細胞の透過性あるいは取り込み
における変化は業界で良く知られており、詳細はここに
参考のため記載するアルバーツ,B.（Alberts,B.）ら細
胞の分子生物学（MOLECULAR BIOLOGY OF THE CELL）
（第２版），ガーランド出版社（Garland Publishing,i
nc.）,1989年に述べられている。

ここに「基質」とは：（１）検出可能な生成物（たと
えば発色団）を生成するための興味ある酵素により直接
に作用される基質；（２）最初の基質および第２の物質
との組み合わせを意味し、ここで最初の基質は第２の酵
素／基質反応で、あるいは第２結合色素（ジアゾ色素の
ような）と連結される場合、検出可能な生成物を得、興
味ある酵素の活性を反映する生成物を産生する。第２物
質は、補酵素前駆物質に加え、色素生成性前駆物質でよ
く、ここで興味ある酵素はたとえばニコチンアデニン
ジヌクレオチド ホスフェート（NADP）のような補酵素
前駆物質と適当な条件下で反応してNADを生成し、次い
でこれが前駆物質（色素生成性前駆物質のような）から
検出可能な生成物を産生するために作用する世代（gene
ration）触媒を形成する一連の環状化学反応において用
いられる。この世代触媒は他の酵素、たとえば還元触媒
のようなジアホラーゼとすることができる。このように
生じた発色団の吸光度は従来の比色定量法により測定さ
れる。

ホスファターゼ測定にとっての異種酸化−還元触媒と
の環状NAD/NADH反応は欧州特許出願公開第0058539号明
細書（1982年８月25日公開）に記載されている。

本発明において有用な発色団前駆物質には２−（ｐ−
ヨードフェニル）,3−（ｐ−ニトロフェニル）−５−フ
ェニル−テトラゾリウム クロライド（INT）;3−（4,5
−ジメチルチアゾール−２−イル）−2,5−ジフェニル
テトラゾリウム ブロマイド（MTT）;2,2′,5,5′−テ
トラ−（ｐ−ニトロフェニル）−3,3′−（3,3′−ジメ
トキシ−4,4′−ジフェニレン）ジフェニルテトラゾリ
ウム クロライド（TNBT）;2,2′−ジ（ｐ−ニトロフェ
ニル）−5,5′−ジフェニル−3,3′−（3,3′−ジメト
キシ−4,4′−ジフェニレン）ジフェニル テトラゾリ
ウム クロライド（NBT）;2,2−ジフェレニン−3,3′,
5,5′−テトラフェニル ジテトラゾリウム クロライ
ド（ネオテトラゾリウム クロライドあるいはNT）;2,3
−５−トリフェニルテトラゾリウム クロライド（T
T）；などが含まれる。

かかる発色団前駆物質は興味ある酵素反応に対し、種
々の遠位の部位で作用することが可能である。たとえば
乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）活性は、乳酸塩の存在下
で、NADのNADHへの還元を起こし、このNADHは前に記載
したもののようなテトラゾリウム塩を、適当な波長で比
色定量的に検出可能な還元されたホルマザンに還元でき
る。ホルマザンの生成量はLDH活性の尺度である。

或いはまた、アルカリホスファターゼ活性はNADPから
NADの生成をまねく。このNADは前記LDH反応に結合し、
同様のホルマザン形成を起こすことができ、この場合ア
ルカリホスファターゼ活性の尺度である。

無傷細胞において、かかる酵素反応は付随して生じ、
適当に選別された細胞−活性化物質と発色団前駆物質の
場合相互作用してアッセイの感度を増加させ得ることは
明らかである。

ホルボール エステルは一般的な細胞活性化物質とし
てまたホスホリパーゼのようなエステラーゼに対する基
質として特に良く適合する。発色団前駆物質をホルボー
ル ミリステート アセテート（RMA）のようなホルボ
ール エステルに結合することにより単一化合物は活性
化シグナルを示し、次いで、活性化された酵素により開
裂されて、検出される色素生成性生成物が得られる。食
品および環境化学抗原に対する過敏症のアッセイにおい
て、ホルボール エステル共役物、ホルボール−12−レ
チノエート−13−アセテートは「陽性コントロール」と
してはたらく。

細胞−活性化の条件下で活性化され、本発明において
アッセイされる酵素には、アリールサルファターゼのよ
うなアリールヒドロラーゼ、キナーゼ、リパーゼ、ホス
ファターゼ（たとえばアルカリホスファターゼ）、エス
テラーゼ グリコシダーゼ、ヘキソサミニダーゼ、ペプ
チダーゼ、およびヌクレアーゼ（たとえばDNアーゼ、RN
アーゼ）、エステラーゼ、オキシダーゼ（混合オキシダ
ーゼのような）あるいはヒドロゲナーゼ（たとえばLD
H）が含まれる。

発色団のような検出可能な標識を含むか、または付加
的な反応体に結合している上記酵素に対する基質を下記
の表２に示すが、この表は本発明における有用な酵素お
よび基質を制限せんとするものまたはすべてを示さんと
するものではない。

前記の基質を誘導するのに使用される発色部材は；α
およびβナフチル、αおよびβアルコキシナフチル（例
えばαおよびβ４−メトキシナフチル）、αおよびβ６
−ブロモナフチル、ｏ−ニトロフェノール、ｐ−ニトロ
フェノール、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリ
ル、ブロモチモールフタレイン、フェノールフタレイ
ン、４−メチルウンベリフェリル、フルオレセイン、な
どが含まれる。

酵素基質系（例えばアミノペプチダーゼ）のいくつか
は反応生成物を発色団に転化させるためにジアゾ結合化
合物を必要とする。かかる適当なジアゾ色素には:4−ア
ミノ−2,5−ジメトキシ−４′−ニトロアゾベンゼン
ジアゾニウム塩；テトラアゾ化ｏ−ジアニシジン；ジア
ゾ化−４′−アミノ−２′,5′−ジエトキシベンズアニ
リド塩化亜鉛塩;4ベンゾイルアミノ−2,5−ジメトキシ
アニリン塩化亜鉛のジアゾ化生成物;o−アミノアゾトル
エン ジアゾニウム塩；アントラキノン−１−ジアゾニ
ウム クロライド;5−ニトロ−２−アミノ−メトキシベ
ンゼン ジアゾテート;N′,N′−ジエチル−４−メトキ
シメタニルアミン ジアゾニウム塩;2−アミノ−４−メ
トキシベンズアミド ジアゾニウム塩；ジアゾ−２−ア
ミノ−５−クロロアニソール；ジアゾ−５−クロロ−ｏ
−アニシジン;5−クロロ−２−トルイジンジアゾニウム
クロライド ヘキジンク クロライド;5−クロロ−４
−ベンズアミド−２−メチルベンゼン ジアゾニウム
クロライド ヘキジンク クロライド;6−ベンズアミド
−５−メトキシ−ｍ−トルイジン ジアゾニウム クロ
ライド、および業界で知られている他のジアゾニウム塩
が含まれる。

本発明の他の例は細胞活性化の指標としてはたらく酵
素反応の発生を測定する種々の方法に関している。好適
例において、色素生成性基質は興味ある酵素によって作
用されて発色基質を生成し、この発色基質は反応が行わ
れる血しょうあるいは培地の適当な波長での吸光度の低
下として測定される。30,000±5,000の血液細胞を含む
細胞豊富な血しょうの35μにおいて、典型的な変化
は、バックグランド減少0.001±0.0005単位（開始吸光
度0.150単位に基づいて）と比較して、活性化剤の存在
下に吸光度0.100±0.005単位の減少である。この測定は
標準的96−ウエル プレート読み取り装置を使用して行
われることが好ましい。

吸光度は血しょうあるいは培地において低下するとと
もに反応生成物の産生に基づき細胞内吸光度の増加があ
る。細胞内の色調変化の測定は前記の反応流液測定と共
に行われるか、または他の例として行うことができる。
細胞内の吸光度は細胞内の発色反応生成物の存在により
透過が妨げられるレーザー光線を放射するヒタチ ビデ
オマイクロプローブ（Hitachi Videomicroprobe）（イ
ノウエ，エス．（Inoue,S.），ビデオマイクロスコピー
（Videomicroscopy），プレナム出版（Plenum Pres
s），ニューヨーク,1987年）を用いて、約1,000の細胞
をウエル中で走査することにより測定するのが好まし
い。このようにして、この例では、「陽性」細胞は計数
され、異種細胞タイプ、異種活性化剤（たとえば抗原あ
るいはアレルゲン）などで比較される。

他の例において、細胞の活性化は：血液細胞で代表的
に約１±0.035μである体積変化；粒子が適当に荷電し
た対照プレート間を移動する際電圧（mV）の変化により
測定されるゼータ電圧における検出可能な変化；ミリガ
ウムで測定する磁場のあるいは細胞のシグナルの変化；
スヴェードベリー単位で測定する細胞の粘性における変
化；あるいは細胞膜の高張性あるいは低張性破裂に対す
る抵抗性（ミリオスモル）として測定する溶解に対する
細胞の抵抗性の変化として測定される。かかる変化の測
定は業界で良く知られている。例えばメソッズ イン
バイオケミストリー（Methods in Biochemistry）,I〜C
L II巻エルセビア，（1952年〜1989年）を参照。

細胞−活性化物質が結合される支持マトリックスは反
応容器を構成する材料とすることができる。即ち、反応
容器自体、たとえば改変された48ないし96ウエル マイ
クロタイトレーション プレート、が支持マトリックス
として役立ち、活性化物質がウエルの底（および側壁）
に結合する。支持マトリックスを構成できる材料は、限
定されるものではないが、清浄な光学スチレン、置換ポ
リスチレン、置換アクリロニトリル（SAN）のようなア
クリロニトリル、ポリカーボネート、ポリペンテン、あ
るいはシリコン オキサイドが含まれる。他の例におい
ては、作成した支持マトリックスを反応容器に別個に加
え、さらに該マトリックスは限定されることはないが、
ニトロセルロース、セルロース、ポリスチレン、スチレ
ン、SAN、ポリカーボネート、ポリペンテン、ジビニル
ベンゼン、あるいはシリコン オキサイドが含まれる材
料で構成する。本発明にとって有用なシリコン オキサ
イド材料は三重にシリコン化されたガラスあるいは石英
である。支持マトリックスは反応容器として使われてい
る清浄光学ポリスチレンが好ましい。

アッセイを行う反応容器はアッセイ方法の成功に重要
である。容器は反応の生理学的制御を最適化するよう設
計する。酸素およびCO₂のようなガスの充分な交換、pH
平衡が十分に迅速であること、分子の十分な拡散、外因
性の原因あるいは内因性の反応由来の熱の十分な散逸は
行われねばならない。業界でよく知られている標準プラ
スチック96−ウエル マイクロタイトレーション プレ
ートは主に側壁の高さのために、本発明の実施には不適
当であることを見出した。

従って、本発明は下記の特徴を有する反応容器にも関
するものである： （１） 表面（mm）対反応体積（μ）の比が0.1以上
でなければならない。例えば6mm直径のマイクロプレー
ト ウエル、30μ試料体積のようなものが好ましい。

（２） 反応容器の側壁は可能な限り低くする必要があ
る。例えば、1.1〜５の容器の高さ対反応混合物の高さ
の比が許容され、この比は約２であるのが好ましい。

（３） 好ましいウエル直径は約6mmで好ましい側壁の
高さは約0.5〜約6mmである。約１〜2mmの高さが最も好
ましい。

一例においては、反応容器は標準の96ウエル マイク
ロタイトレーション プレートのレイアウトを有する。
好適例においては、反応容器は、レイアウトにおいて標
準の96ウエル マイクロタイトレーション プレートの
半分と同等の、48ウエル（８×６に配列した）を有す
る。

これらの反応容器のレイアウトは色素生成反応の測定
に特に有用であり、この理由は本発明に係るプレートの
１つあるいは２つを標準的光学特性の96プレートの上に
配列して標準96ウエル マイクロタイトレーション プ
レートを収納するよう設計された代表的な分光測光法的
（あるいは比色定量的）プレート読み取り装置におい
て、色調反応を読み取ることができるからである。

本発明で使用する細胞の準備は調製および手数をほと
んど必要としない。これは、調製段階で細胞に負わせ
る。ストレスによる種々の酵素の活性化を防ぐのに重要
である。たとえば、血しょうキナーゼ、補体成分、ハー
ゲマン因子、などの活性化を通し、血液の凝固が、酵素
を活性化し、アッセイでの更なる活性化が酵素活性にお
いて検出可能なまで増加を起こさないほどバックグラン
ドレベルを上昇させる因子の放出をもたらす場合があ
る。従って、血液の凝固を避せることは重要である。遠
心分離、加熱、あるいは酸化ストレスにつながるインキ
ュベーションのような過度の細胞−細胞接触は、さらに
このアッセイの実施の成功を妨げる。従って、ジャフ
ェ，アール．（Jaffe,R.）ら（ジャーナル オブ クリ
ニカル インベスティゲーション（J.Clin.Invest.）5
3:874〜883.（1974年））により記載されているような
細胞−豊富血しょうの１工程調製が好ましい。

本発明を次の実施例により説明するが、これらの実施
例により本発明は制限されるものではない。

実施例１ 血液の試料をエネ−ジオール化合物、アスコルビン酸
を含む、1/10容量の3.8％クエン酸三ナトリウム、ある
いはK,Mg,Naクエン酸塩で処理して、凝固を防止するた
めに細胞の酸化−還元電位を保った。抗凝固処理全血を
総計980g/分の間遠心分離した。細胞豊富な血しょう（C
RP）をプラスチック製のトランスファーピペットで吸引
した。細胞の乏しい血しょう中の濃度範囲100〜10,000p
molの酵素基質、テトラゾリウムブルーを0.1〜100μ
（10μが最適であることを見出した）添加した。CRP
の35μをあらかじめ抗原を結合させてある前記清浄光
学スチレン製48ウエル マイクロタイター プレートに
移した。

細胞を２〜24時間、35℃でインキュベートした（ほと
んどのアッセイにおいて３時間が最適反応時間であるこ
とを見出した）。細胞活性化を血しょうの色調低下とし
て測定される酵素活性として評価した。吸光度をバイオ
・ラッド モデル1500プレート リーダー（BioRad Mod
el 1500 plate reader）を用い340nmあるいは340/380nm
において読み取った。

35±１℃で３時間インキュベートした結果は次のよう
であった： A. リンパ球（NK細胞、CD4−陽性Ｔ細胞、ヌル細胞、
および他のリンパ球を含む）の細胞内吸光度（A₃₄₀）の
平均は0.204±.008のバックグランドから1.954±.051単
位まで上昇した。

B. 反応体培地の吸光度はこのインキュベーション中約
0.115単位（1.500±.001から1.385±.002単位）低下し
た。

C. CD4−陽性Ｔリンパ球の見掛の細胞体積は6.4±0.2
μから7.9±0.22μ（Ｎ＝400、Ｐ＜0.001）に増加し
た。

実施例２ 細胞の豊富な血しょう試料中の細胞が直接活性化剤に
応答していることを確認するため、および細胞がその応
答に寄与したことを明確にするため、標準勾配沈降法を
用いるストラクタン^tm（stractan^tm）（アラビノシル−
ガラクトース）上での同浸透圧性等密度遠心法（insoos
motic isopycnic centrifugation）によって、ヒトリン
パ球を全血から単離した。

細胞をIEC固定アングルローター遠心器において４
℃、15,000gminで遠心分離した。回収細胞は99％を越え
た純リンパ球（時折単球が混じる）であった。リンパ球
をイーグル培地5mlに再懸濁し、２度目のストラクタン
^tm勾配遠心にかけた。

細胞を実施例１に記載した条件下でインキュベートし
た： （１） 10％牛胎児血清あるいはヒトアルブミンを補っ
たイーグル培地中に細胞30,000±5,000を含む細胞懸濁
液35μ。

（２） 清浄光学スチレン製48ウエル マイクロタイタ
ー プレートにおいての35℃、180分のインキュベーシ
ョン。

（３） 基質としての、0.1Mテトラゾリウムブルー10μ
の添加。酵素活性化は見掛の細胞体積の増加およびイ
ンキュベーション培地の吸光℃の低下として観察した。
これらの結果は血液中のリンパ球および血清成分ではな
い他の細胞種が、酵素的な反応の原因であることを示し
た。

実施例３ 種々のリンパ球クラスに特有の抗体を、前記の如く、
アッセイに組み込み、反応性細胞タイプを決定すること
ができた。この方法は特定の細胞タイプに特有の抗体が
その細胞の活性化を選択的に阻害し、一方存在する他の
細胞の活性化を許容することを知見したことに基づくも
のであった。

thリンパ球マーカーCD2,CD3,CD8,CD11,およびCD12に
対する標準的な市販モノクローナル抗体を使用した。抗
体を細胞、活性化剤および基質の反応に添加することに
よって、酵素の活性化応答がヘルパー細胞（CD4＋）、
ナチュラルキラー細胞（CD12＋）および「ヌル」Ｔ細胞
（CD3＋,CD4−,CD8−,CD11−,CD12−）において引き起
こされることが確認された。これらの結果は主に、特定
のＴ細胞クラスおよびナチュラルキラー細胞が、表１に
示したような抗原による刺激、PHAおよびのPWMような有
糸分裂促進性レクチン、さらにホルボールエステルに対
してのリンパ性細胞全群の応答の原因であることを示し
た。血しょう細胞、赤血球、および血小板は観察された
応答には寄与しなかった。

実施例４ 遅れた相のまたは遅延過敏症の検出において食品およ
び化学的アレルゲン（表１に記載）を用いアッセイの予
見的感度および特異性を決定するために、結果を標準的
症状調査票（コーネル医学指数/CMI^R/1947,1962,1977）
を用い被検者の症状頻度の自己申告に従って分離した。
次に示すように、ほとんど症状をもたない被検者は反応
をほとんど示さなかった。このアッセイでは症状が増加
するにつれて、反応の数および強度の上昇が認められ
た。

臨床条件下でこのアッセイを使用することの有効性を
確認するために、６ヶ月の間隔でアッセイを繰り返した
94人の被検者の１群について、研究に続く検討を行っ
た。アッセイを繰り返した際、個体が反応する物質の数
の減少は被検者により報告された症状の軽減に基づいて
証明されるように改善と相関した。これらの結果は本発
明のアッセイにおける食品あるいは化学的抗原性の刺激
に対する応答性と臨床的に有用なパラメータとの間の強
い相関関係を示した。

実施例５ A.手順 この分析は７ヶ月から32ヶ月にわたり行った102の個
々の試験と再試験を受けた41人の患者の全てのデータを
含んでいる。患者は初期アッセイで陽性に評価された食
品および化学薬品との接触を絶った。次のデータ：試験
時間、性、年齢、強い反応の数、中間反応の数、反応の
総数および180の食品および化学物質に対しての試験結
果（強さ、培地、無反応）をそれぞれの患者から得た。
数ヶ月間の観察による改善の情報は最初から最後までに
行われた個々の試験について強い、中間反応の、および
総ての反応の数における違いから成り立っていた。また
特定の試験薬剤の出現頻度を調べて、最も多数の反応を
用いて項目順に同定および並べた。

B.結果 最初から最後までの試験の陽性反応の減少の全ての平
均は、強い反応の数が平均62％減少することを示した。
初めに、強い反応の平均数は29（180のうち）であっ
た。再試験では強い反応の平均数は11に低下した。中間
反応の平均数は11.3から18.2へ増加し、これは強い反応
が消失前に弱い中間反応になることに原因がある。若干
の場合において、新しい反応は患者が食事を変えた際現
われた。これは中間反応の数を増加させる原因の一部と
なる。

要するに、強い反応の総数のほぼ2/3は減少した（Ｐ
＜0.005）。これらの結果は、初めに患者が陽性に反応
した物質を食事または環境から除いた患者によって強い
反応の数の有意な減少が予測できる証拠を提供する。ま
た反応の総数も減少した。免疫系の活性化応答の検出可
能な変化の前に、症状に基づく、臨床上の改善がしばし
ば行われた。

時間を変える試験のために、それぞれの食事／環境を
改変した患者を３つのカテゴリーに分類し：これらを７
〜12ヶ月間、13〜18ヶ月間および19ヶ月以降で再試験し
た。６ヶ月内の繰り返し試験は本質的に同じ反応：再試
験で観察された陽性反応の総数のわずかな（３％）減少
を示した。これは本発明のアッセイ手順の高い精度と再
現性に一致した。

免疫系の細胞がアッセイにおいて、特異抗原に陽性に
応答する過敏症状態からこれらの抗原に対し無反応な状
態への変動は数ヶ月を必要とすると思われた。この研究
において患者は代表的には、３〜20⁺年の損われた機能
（たとえば過敏症）および処置に対する意外なあるいは
不十分な応答を示した。期間中の反応の全消失について
意味ある陳述を行う前に一層詳細な、管理した研究が必
要となった。予備的なデータは多数の反応が、患者の食
事／環境の慎重な改変により完全に排除され得ることを
示した。

最後に、特定の食品および化学物質に対する反応をこ
の患者の試料で反応の頻度について分類した。食事にお
いて最も普通で、また最も良く加工される食品は人を最
もよく敏感にさせるものの一種であった。トウモロコ
シ、チョコレート／ココア、いぬほうずき、砂糖、コー
ヒー、および酵母のような品目は当時の約70％に陽性反
応を示した。殺菌牛乳、カゼイン、チーズおよびバター
を含む牛の乳製品は当時のほぼ90％に反応を示した。唯
一の陽性反応を示す、不純物を除去したバターは牛起源
の免疫反応物を欠いていた。乳製品中の脂肪ではなく反
応性タンパク質が過敏症の原因であることは明白であっ
た。また、注目すべきことは真菌、Candida albicansに
対する陽性反応の頻度が60％であったことであり、Cand
ida albicansは臨床上免疫抑制性であることが知られて
おり、さらに最近、多くの慢性疾患に関連している。

C.結論 本発明のアッセイの使用は、感受性個体に免疫学的過
敏症反応を引き起こす食品および化学物質の矛盾のない
定量的評価を与えるものである。本アッセイの結果は食
事／環境の適当な改変によって、これらの反応を臨床上
好首尾に反転することができた。この結果はかかる反応
が獲得され、不完全な消化および繰り返される消費を伴
う腸壁透過性の増加と関係があり、ほとんどの場合、遺
伝学上の関係はないことを示す。従ってこれらの結果
は、健康が慢性疾患および免疫防御力の損傷に関連する
過敏症反応により悪い影響を受けた人々に希望を与える
ものである。

本発明は特定例について記載を行ったが、さらに改変
が可能であることは理解されるものである。本発明は一
般に、発明の原理に従い、また本発明が関係する技術範
囲内で通常実施されるように且つ次に示す請求の範囲に
従うように前述の本質的特徴にあてはまるような明細書
の開示からの離脱を含める本発明の種々の変形法、使
用、あるいは適用をカバーすることを意図している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12Q 1/00 - 1/42 C12M 1/16 - 1/32 G01N 33/53 - 33/569 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＥＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ)

Claims (25)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】無傷細胞と接触して細胞内酵素を活性化す
   る物質であり、細胞外の、外因性の細胞活性化物質に対
   して、無傷の動物細胞が応答するのをインビトロで検出
   する方法であり、前記方法が、活性化された前記酵素の
   ための基質の存在下に、前記細胞を固体支持体上に固定
   化された前記活性化物質とインビトロで接触させ、前記
   酵素基質の存在下に、前記活性化された酵素の結果とし
   て生じる活性を検出することを含んでおり、前記接触を
   マイクロタイタープレートの１つまたは複数のウエル中
   で起こす方法であって、 前記マイクロタイタープレートの前記１つまたは複数の
   ウエル中で、前記接触を前記無傷細胞、前記固定化され
   た活性化物質および前記酵素基質の間で起こし、前記マ
   イクロタイタープレートの前記１つまたは複数のウエル
   のそれぞれが、約１〜2mmの高さの垂直な側壁を有して
   おり、前記方法を行うに際し、ａ）前記ウエルの内径
   （mm）の、前記試料の容積（μｌ）に対する比率が、少
   なくとも0.1:1であり、かつｂ）前記ウエルの前記垂直
   方向の高さの、前記ウエル中の前記試料の垂直方向の高
   さ（深さ）に対する比率が1.1:1〜5:1の範囲内であるこ
   とを特徴とする、細胞の応答をインビトロで検出する方
   法。
2. 【請求項２】前記ウエルの前記垂直方向の高さの、前記
   ウエル中の前記試料の垂直方向の高さ（深さ）に対する
   比率が約2:1であることを特徴とする、請求の範囲１記
   載の方法。
3. 【請求項３】前記各ウエルの内径が約6mmであることを
   特徴とする、請求の範囲１又は２記載の方法。
4. 【請求項４】前記外因性細胞活性化物質による前記酵素
   の活性化が比色定量により検出されることを特徴とす
   る、請求の範囲１〜３のいずれか一項記載の方法。
5. 【請求項５】前記細胞内酵素がアリールヒドロラーゼ、
   エステラーゼ、キナーゼ、リパーゼ、ホスファターゼ、
   ヘキソサミニダーゼ、ペプチダーゼおよびヌクレアーゼ
   から成る群から選ばれることを特徴とする、請求の範囲
   １〜４のいずれか一項記載の方法。
6. 【請求項６】前記外因性細胞活性化物質が前記マイクロ
   タイタープレートの前記１つまたは複数のウエルの前記
   ボトムおよび側壁上に固定化されることを特徴とする、
   請求の範囲１〜５のいずれか一項記載の方法。
7. 【請求項７】前記無傷細胞がリンパ球細胞であることを
   特徴とする、請求の範囲１〜６のいずれか一項記載の方
   法。
8. 【請求項８】前記外因性細胞活性化物質が抗原、アレル
   ゲンおよびハプテンから成る群から選ばれることを特徴
   とする、請求の範囲１〜７のいずれか一項記載の方法。
9. 【請求項９】前記外因性細胞活性化物質がホルボールエ
   ステル、植物凝集素、麸素および亜硫酸塩から成る群か
   ら選ばれることを特徴とする、請求の範囲８記載の方
   法。
10. 【請求項１０】前記方法に、複数の異なる外因性細胞活
    性化物質に対する前記無傷細胞の前記応答を同時に検出
    することが含まれており、前記マイクロタイタープレー
    トの前記ウエルの前記ボトムおよび側壁上に固定化され
    た２種以上の細胞活性化物質を、前記マイクロタイター
    プレートのそれぞれ異なるウエル中に含ませることを特
    徴とする、請求の範囲１〜９のいずれか一項記載の方
    法。
11. 【請求項１１】前記無傷の動物細胞が細胞豊富な血漿の
    形態であることを特徴とする、請求の範囲１記載の方
    法。
12. 【請求項１２】請求の範囲１〜11のいずれか一項記載の
    方法に用いるマイクロタイタープレートであり、前記マ
    イクロタイタープレートの前記１つまたは複数のウエル
    が無傷の動物細胞と固定化された外因性細胞活性化物質
    とを含んでおり、前記固定化された外因性細胞活性化物
    質が前記無傷細胞と接触して細胞内酵素を活性化するマ
    イクロタイタープレートであって、 前記マイクロタイタープレートの前記１つまたは複数の
    ウエル中で、前記接触が前記無傷細胞、前記固定化され
    た活性化物質および前記酵素基質の間で起こり、前記マ
    イクロタイタープレートの前記１つまたは複数のウエル
    のそれぞれが、約１〜2mmの高さの垂直な側壁を有して
    おり、前記方法を行うに際し、ａ）前記ウエルの内径
    （mm）の、前記試料の容積（μｌ）に対する比率が少な
    くとも0.1:1であり、かつｂ）前記ウエルの前記垂直方
    向の高さの、前記ウエル中の前記試料の垂直方向の高さ
    （深さ）に対する比率が1.1:1〜5:1の範囲内であること
    を特徴とする、マイクロタイタープレート。
13. 【請求項１３】前記無傷の動物細胞が細胞豊富な血漿の
    形態であることを特徴とする、請求の範囲12記載のマイ
    クロタイタープレート。
14. 【請求項１４】前記各ウエルが約6mmの内径を有してい
    ることを特徴とする、請求の範囲12又は13記載のマイク
    ロタイタープレート。
15. 【請求項１５】前記マイクロタイタープレートが、前記
    マイクロタイタープレートの前記ウエルの前記ボトムお
    よび側壁上に固定化されている細胞活性化物質を有して
    いることを特徴とする、請求の範囲14記載のマイクロタ
    イタープレート。
16. 【請求項１６】前記固定化された活性化物質が抗原、ア
    レルゲン及びハプテンから成る群から選ばれていること
    を特徴とする、請求の範囲15記載のマイクロタイタープ
    レート。
17. 【請求項１７】前記固定化された活性化物質がホルボー
    ルエステル、植物凝集素、麸素および亜硫酸塩から成る
    群から選ばれていることを特徴とする、請求の範囲16記
    載のマイクロタイタープレート。
18. 【請求項１８】前記マイクロタイタープレートが、前記
    マイクロタイタープレートの前記ウエル中に固定化され
    た２種以上の細胞活性化物質を有しており、前記各活性
    化物質が異なるウエル中に存在していることを特徴とす
    る、請求の範囲15記載のマイクロタイタープレート。
19. 【請求項１９】請求の範囲１〜11のいずれか一項記載の
    方法に用いるマイクロタイタープレートであって、 前記マイクロタイタープレートが複数のウエルを含んで
    おり、前記各ウエルが約6mmの直径と１〜2mmの範囲内の
    高さの側壁とを有しており、前記方法を行うに際し、前
    記マイクロタイタープレートの前記１つまたは複数のウ
    エル中で、前記接触が、前記無傷細胞、前記固定化され
    た活性化物質および前記酵素基質の間で起こり、前記マ
    イクロタイタープレートの前記１つまたは複数のウエル
    のそれぞれが、ａ）前記ウエルの内径（mm）の、前記試
    料の容積（μｌ）に対する比率が少なくとも0.1:1であ
    り、かつｂ）前記ウエルの前記垂直方向の高さの、前記
    ウエル中の前記試料の垂直方向の高さ（深さ）に対する
    比率が1.1:1〜5:1の範囲内にある大きさの寸法を有して
    いることを特徴とする、マイクロタイタープレート。
20. 【請求項２０】前記マイクロタイタープレートが、前記
    マイクロタイタープレートの前記ウエルの前記ボトムお
    よび側壁上に固定化されている細胞活性化物質を有して
    いることを特徴とする、請求の範囲19記載のマイクロタ
    イタープレート。
21. 【請求項２１】前記固定化された活性化物質が抗原、ア
    レルゲンおよびハプテンから成る群から選ばれているこ
    とを特徴とする、請求の範囲20記載のマイクロタイター
    プレート。
22. 【請求項２２】前記固定化された活性化物質がホルボー
    ルエステル、植物凝集素、麸素および亜硫酸塩から成る
    群から選ばれていることを特徴とする、請求の範囲21記
    載のマイクロタイタープレート。
23. 【請求項２３】請求の範囲12記載のマイクロタイタープ
    レートを含むアッセイキットであって、 前記マイクロタイタープレートの前記１つまたは複数の
    ウエル中で、前記接触が起こり、前記マイクロタイター
    プレートの前記１つまたは複数のウエルがそれぞれ、約
    １〜2mmの高さの垂直な側壁を有しており、前記ウエル
    の内径（mm）の、前記試料の容積（μｌ）に対する比率
    が少なくとも0.1:1であり、前記ウエルの前記垂直方向
    の高さの、前記ウエル中の前記試料の前記垂直方向の高
    さ（深さ）に対する比率が1.1:1〜5:1の範囲内にあるこ
    とを特徴とする、アッセイキット。
24. 【請求項２４】前記アッセイキットが、更に、前記細胞
    活性化物質により活性化される前記酵素に適切な量の酵
    素基質を含んでいることを特徴とする、請求の範囲23記
    載のキット。
25. 【請求項２５】前記アッセイキットが、更に、前記酵素
    基質および前記固定化された細胞活性化物質の存在下
    に、前記酵素の活性に応答する量の担色試薬を含んでい
    ることを特徴とする、請求の範囲24記載のキット。