JPH05502099A - 細胞の活性化を測定するための酵素アッセイおよびアッセイキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 細胞の活性化を測定するための酵素アッセイおよびアッセイキット 免疫学、細胞生物学、および薬学の分野におよぶ本発明は細胞、特にリンパ球の ような血液細胞の活性化をリンパ球が特有に反応する抗原のような、細胞活性化 物質によって、測定するための酵素によるアッセイおよびアッセイキットに関す るもの特異免疫応答あるいは免疫系の一般的な反応性を測定することは多くの重 大な疾病の診断および研究に貴重な手段である。

元来、このような検査は、急性あるいは遅延過敏症の存在を検出する皮膚反応の ようなインビボ技術に限られていた。

１９６０年代から、インビボ免疫応答の相関物としてはたらく数多くのインビト ロアッセイが開発されてきた。これらのバイオアッセイの多くは免疫系の細胞、 すなわちリンパ球が応答する化学構造、たとえばリンパ球に特有な抗原をリンパ 球が認識するという事実に基づく。この応答の一部としてリンパ球は活性化され 、「芽細胞（ｂｌａｓｔ　）にまで大きくなり、分裂、および／または分化をす る。

このように、適正に存在した攻撃抗原の存在下でリンパ球の立つ。全クラスのリ ンパ球（正確には、抗原−特異母集団よりむしろ）を刺激する、ポリクローナル 　アクチベーターにより、リンパ球の大部分に誘発される同様の反応は医者およ び研究者にリンパ球母集団の一般的な反応性を評価する手段を与えている。

ポリクローナル活性化は多種の物質、たとえば植物がら誘導された有糸分裂促進 性レクチン（たとえばコンカナバリンＡ、植物性血球凝集素、アメリカヤマゴボ ウ　マイトジェン）、細菌生産物（たとえばリボ多糖、細胞壁物質、エンテロト キシン）、および種々の化学物質若しくは生化学物質（たとえばホルボールエス テル、過ヨウ素酸ナトリウム、ガラクトース　オキシダーゼ、硫酸デキストラン ）により誘発される。〔ロイド、アイ。

（Ｒｏｉｔｔ、　ｌ　）ら、イムノロジー（ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ）　、シー、 ブイ。

モスビー　カンバー１−−　（ＣＪ、Ｍｏ５ｂｙ　Ｃｏ、）（１９８５年）参照 〕。

現在実施されているように、リンパ球の活性化あるいは刺激のインビトロアッセ イはＤＮＡの放射性前駆物質、最も一般的には３Ｈ−チミジンあるいは＋２３ヨ ードデオキシウリジンを増殖しつつある細胞に混入させることにより細胞の生長 （たとえば増殖）を測定することを必要とする。これらのアッセイは技術的に無 菌の細胞培養条件および血液試料の多段階分別を要求し、必要としており、この ため該アッセイは比較的高価である。

さらに、これらのアッセイは、米国において増加が問題となっている放射性廃棄 物を発生する。おそらく最も重要なことは、これらアッセイか一般に３〜７日必 要とし、特に応答の違い（たとえば、患者と健常対照者との間）が、「すべてが 応答するかまたは応答しない」ではなく、有意ではあるが大きくない場合には、 結果は全く変わりやすい。さらに、一連の刺激に対する応答を測定するために現 在のアッセイは、比較的多数のリンパ球を必要とし、リンパ球減少症あるいは白 血球減少症の患者（たとえば化学療法、骨髄移植の後、あるいはエイズのような 免疫不全症の場合）の検定の際、問題が生じる。

従って、迅速で、簡単であり、試料としてわずかな量の血液しか必要とせず、か つ放射性同位体の使用を避は得るリンパ球活性化のアッセイは極めて有用である 。臨床研究室の目的にとって、かかるアッセイか：（１）容易にルーチン化され 、可能なかぎり、わずかな量の細胞の操作しか要求せず；（２）自動化され、　 （３）現在の細胞増殖アッセイが与えるよりもより再現性のある結果を提供する ことは重要なことである。

更に迅速なアッセイへの１つの方法は細胞活性化に対する開始刺激後、初期に発 生する事象を測定することであり、その事象はＤＮＡ合成および細胞増殖に先行 している。細胞内のあるいは膜−結合酵素の「活性化」は細胞膜が特定のリンパ 球に接触する抗原のようなシグナルによって、「引き起こされた」後、初期に発 生する事象の１つのタイプである〔セル、ニス、（Ｓｅｌｌ。

Ｓ、）、イムノロジー、イムツバソロジー、アンド　イムニティ−（Ｉｍｍｕｎ ｏｌｏｇｙ、ＩｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇＬ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｉｔｙ）、 −ｒ−ルセビア（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）、　１９８７年〕。かかる酵素の活性化、 あるいは、応答の有効性は色素生成性基質あるいは他の物理的に検出可能な反応 体あるいは生成物を用いた酵素−基質反応を使用することで容易にモニターでき る。

８４年）〕は、偏在するリゾソーム酵素、ヘキソサミニダーゼを利用し、マイク ロプレートのウェルに存在する細胞の数を計るためのアッセイを開発した。この 酵素に対する色素生成性基質、ｐ−ニトロ−フェノール−Ｎ−アセチル−β−Ｄ −グルコサミニドは、比色定量プレート読み取り装置を用い４０５ｎｍの吸光度 （Ａ、。、）として測定される着色反応生成物を生成させるために用いられた。

基質を培養中の細胞に添加する場合に、発生した色（たとえば形成された反応生 成物）の量は、所定の反応時間の間、細胞数に正比例した。この方法を適用して 生長因子に応じたリンパ球増殖、細胞の表面への付着、および抗体で被覆された プレートへの細胞の付着を測定した。このように、この方法はリンパ球増殖のア ッセイにおいて放射性同位体の使用の有用な代替法となり得るが、この文献に開 示されているように、初期のリンパ球活性化を測定するには価値がなく、この理 由は、この酵素か明らかにいつでも基質に対して活性で、有効性をもっているか らである。さらに、問題はこの酵素か血清中に存在することであり、インビトロ でインキュベーションする前に血液細胞を十分に洗浄して血清−結合酵素を取り 除く必要がある。

ランデグレンによって記載されたアッセイ（前記）は細胞内寄生体の生育性およ び殺生性を検出するために、アルシナ、ニー、　（Ａｌｃｉｏａ、Ａ、）、らジ ャーナル　オブ　イムノロジカル　メソッズ　１０５：　１−８　（１９８７年 ）によって改変された。

モスマン、ティー、（Ｍｏｓｍａｎｎ、Ｔ、）　（ジャーナル　オブ　イムム塩 ＭＴＴ　（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニ ル　テトラゾリウム　ブロマイド）を用いた同様のアッセイを開発し、アッセイ はミトコンドリア脱水素酵素により変性して青色ホルマザン生成物を形成し、こ の生成物の吸光度は５７０　ｎｍで分光測光法で測定できる。細胞数が特定の範 囲に亘り、この基質は細胞数と色調形成との間に直線関係が成立した。この方法 は成長因子による若干のリンパ球細胞株の生長の刺激を測定するのに有用であっ た。他は細胞毒性アッセイにおいて細胞の生存を測定するためにモスマンの方法 を改変した〔グリーン　エル、エム、（Ｇｒｅｅｎ　Ｌ、Ｍ、）、ら、シャー＋ ／Ｌ／エフ　イムノロジヵルメソッズ　７０：２５７−２６８　（１９８４年ン 〕。

アルカリホスファターゼは種々の正常および白血病リンパ球タイプの分泌性およ び吸収性表面に結合していることで知られている酵素である〔ノイマン、エイチ 、　（Ｎｅｕｍａｎｎ、　Ｈ，）ら、プロジー、（Ｃｕｌｖｅｎｏｒ、Ｊ、Ｇ、 ）、ら、ザ　ジャーナルオフイムノロシー（Ｊ、　１ｍｍｕｎｏ１．　）　１２ ６　：　１９７４　（１９８１年））、ガルシアーロザス。

シー、　（Ｇａｒｃｉａ−Ｒｏｚａｓ、　Ｃ，）、ら（ザ　ジャーナル　オフ　 イムノ−ニトロフェニルホスフェートを用い、アルカリホスファターゼをアッセ イした。アッセイする前に、細胞をグルタルアルデヒドで固定し界面活性剤で処 理し、しかる後基質を加え、色調反応をプレート読み取り装置を使用し、プレー トで直接読み取った（Ａａｏｓ）。アルカリホスファターゼが特に８９２８球と 関連していることが明らかになった。酵素活性はリポ多糖（ＬＰＳ）あるいはア メリカヤマゴボウ　マイトジェン（ＰＷＭ）で３日間「活性化した」Ｂ細胞にお いて有意に高められ、大きくなった「芽」細胞と関連していた。

ハシモト、エヌ、（ｔ（ａｓｈｉｍｏｔｏ、Ｎ、）、ら〔（ジャーナル　オフイ ムノロジカル　メソッズ）　９０　：　９７−１０３（１９８６年）〕はガルシ アーロザスらのアッセイ（前記）において、界面活性剤中の基質を刺激したＢ細 胞（１度洗浄した後の細胞）が含まれるマイクロ　ウェルに直接添加することに 改変した。このアッセイはＬＰＳで３日間刺激し、ざらにＴ細胞誘導因子で１〜 ２日間刺激した後Ｂ細胞増殖の測定を可能にした。このアッセイは３Ｈ−チミジ ンの取り込みの測定に比べ、「汚染ＪＴ細胞が多数存在している際でも選択的に Ｂ細胞増殖を検出でき、ＨＡＴ培地（通常、ハイブリドーマ選別に使用される） において細胞を測定することもできる点で有利であった。３日より前に酵素「活 性化」を示す証拠は全く存在せず、新鮮なり細胞の検出可能な酵素活性の限界値 はＩＯ２あるいはそれ以上の細胞を必要とすると思われた。

欧州特許出願公開第０１６６５０５号明細書（１９８５年１月２日）は、クロマ トグラフ分離および比色定量アッセイを介してアルカリホスファターゼを定量的 に検出する方法を提供し、そこでは酵素活性の２　Ｘ　１０−’単位か検出可能 なシグナルを与えた。しかし、この文献に開示されたアッセイ系およびキットは 部分的に精製された酵素の使用のために設計されており、全細胞（Ｗｈｏ−１ｅ ｃｅｌｌ）用ではない。

チャン、ケーーエム、（Ｃｈａｎ、に−Ｍ、）ら〔アナリティカル　バイオケミ ストリー（Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ）　１５７　：　３７５−３８０（１９８ ６年）〕は、含脂肪細胞の形質膜調製物あるいは肝臓ミクロソーム上の（ａ　２ 　＋−刺激ＡＴＰアーゼ活性の測定のための直接比色定量アッセイを記載した。

このアッセイはＡＴＰ基質からつくられるＰ！生成物に色素生成反応を組合せる ことによる。この酵素は単に細胞抽出物において測定され、全細胞での使用は示 唆されていなかった。

欧州特許出願公開第０１２２０２８号明細書（１９８４年］Ｏ月１７日）には、 比色定量アッセイが生物学的標本中の酵素の検出に有用であることが開示されて いる。基質を綿棒のような表面に吸収させ、これを酵素−含有標本と接触させて 表面上で色調反応を起こさせる。このアッセイ系は定性的というよりむしろ純粋 に定量的であり、特に試料中のｍ菌の存在を検出するために設計されたものであ る。このアッセイ系は１種以上の基質を吸収させた綿棒を細菌−含有試料へ浸漬 し、かつ綿棒での発色を検出することにより、試料中の１種以上の細菌タイプの 存在を検出するために設計された。

発明の開示 本発明は、血液細胞のような、細胞を特異抗原のような細胞−活性化物質で活性 化した際特定の細胞酵素が活性化されるか、或いは基質との反応に有効になると いうことを知見したことに基づく。

本発明はこの反応をそのままの細胞（ｉｎｔａｃｔ　ｃｅｌｌ）を用いて測定す るための迅速で、簡単であり、再現性あるアッセイを提供するもので、このアッ セイでは基質を、検出可能な生成物あるいは、検出可能な生成物が得られる他の 反応につなげられる生成物に転化させる。

本発明は（ａ）細胞を適当な間隔で細胞−活性化物質と接触させ、ここで細胞− 活性化物質か細胞の酵素を反応にとって有効にし、；（ｂ）酵素と反応可能な酵 素基質を供給し、；（Ｃ）酵素−基質反応の生成物を測定することにより細胞の 活性化を検出することから、所定の細胞−活性化物質による細胞の活性化を検出 する方法に関するものである。

本発明はさらに（ａ）リンパ球を適当な間隔で抗原と接触させ、ここで、抗原と の相互作用がリンパ球の酵素を反応にとって有効にし、；（ｂ）酵素と反応可能 な酵素基質を供給し；（Ｃ）酵素−基質反応の生成物の測定によりリンパ球の活 性化を検出することによって所定の抗原に特異なリンパ球の存在を検出するよう なアッセイの使用にも関するものである。

本発明は、（ａ）被検者からの血液細胞を抗原に供給し：（ｂ）前記細胞を細胞 が活性化をうけるよう十分な期間、抗原と共にインキュベートし、これが細胞の 酵素を反応にとって有効にし；（Ｃ）この酵素と反応可能な酵素基質を供給し、 ；（ｄ）酵素−基質反応の生成物を測定することにより、免疫学的感作を検出す ることによって抗原に対する免疫学的感作を検出する方法を提供する。

本発明はさらに血液細胞のような細胞の活性化を測定するだめのキットに関する もので、このキットでは支持マトリックスに結合した抗原のような細胞−活性化 物質および酵素のための基質を供給する。

好適例の記載 本発明のアッセイは、試験する細胞を、細胞と同時に加えたか、あるいはあらか じめ支持マトリックスに結合させておいて、次いで細胞と接触させる細胞−活性 化物質と共にインキュベートすることを含む。これらの細胞および活性化物質は 細胞において酵素を活性化させるのに十分な時間相互作用させておく。

本発明の主要な利点は活性化を測定できる迅速性である（約３時間が最適）。活 性化した酵素にとっての基質は、細胞と共にあるいは活性化が進行した後に添加 し、活性なあるいは有効な酵素によって作用を受けて細胞の活性化を知らせる検 出可能な反応生成物を生しる。

ここで「細胞−活性化物質」とは、細胞のレセプターあるいは他の結合構造体の 所をあるいは摂取メカニズム、および／または適当な代謝機構によって、細胞に 反応を引き起こすことができる物質を意味する。

リンパ球および単球／マクロファージのような免疫系の細胞い対して、細胞−活 性化物質は、特異抗原を含む。この抗原はペプチド、グリコペプチド、リポタン パク質、あるいはノ１ブテンとすることができる。これら抗原に含まれるものは アレルゲンとして知られている特定のクラスであり、これらの多くはノ＼ブテン である。また免疫系の細胞に対する細胞活性化物質は、免疫複合物、補体成分、 免疫グロブリン分子あるいはフラグメント、リンホカインおよび他のサイトカイ ン（たとえば、ｒＬｌ、ｒＬ２．ＩＬ４など）を含む。アレルゲンは特定リンパ 球あるいは好塩基球あるいは表面に特異的１ｇＥ抗体をもつ肥満細胞の活性化剤 としてはたらく。また、アレルゲンとなり得る食品物質も、ここで意図する細胞 −活性化物質として、種々の環境化学物質と同じようにはたらくことができる。

免疫系の細胞の活性化の議論はたとえば、ここに参考のため記載するロイド、ア イ、ら、イムノロジー、シー、ブイ、モスビー　カンパニー（１９８５年）を参 照。

本発明のアッセイによって検出されるような血液細胞を活性化できる物質のリス トを次の表１に示す。このリストは網羅することを意図しているのではなく、当 業者は本発明において使用するための付加的な活性化剤を選択できる。

本発明に係る抗原あるいは他の細胞活性化剤は細胞と共に（あるいは直後に）反 応に添加することができる。

或いはまた、活性化剤は簡単なブレインキュベーションあるいは業界で良く知ら れているような化学カップリングにより支持マトリックスに結合させることがで きる。他の例において活性化剤はリポソームに結び付けるか混入させるかでき、 この形態で細胞に与えられる。

脂肪細胞は、必須脂肪酸、アラキドン酸およびその代謝物、あるいはトリグリセ リドにより活性化され得る。

赤血球細胞前駆体および他の血液細胞は水銀塩および二亜硫酸塩のような亜硫酸 塩などを含む、環境中で見い出される化学物質により活性化され得る。

肝細胞はアラキドン酸、必須脂肪酸、および種々の生体異物により活性化するこ とかできる。

グルコース−６−ホスフェート重合体を用いて種々の細胞を活性化することがで き、グルコース−６−ホスフェート脱水素酵素の不足あるいは活動亢進を検出で きる。

種々の細胞をホルモンあるいは成長因子によって活性化することかできる。活性 化可能な種々の細胞タイプおよび種々の生物学的分子あるいは生体異物は業界で よく知られている（ここに参考のため記載する　スミス、イー、エル、　（Ｓｍ ｉｔｈ、Ｅ、Ｌ、）。

Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第７版、マグロウ−ヒル（ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌ ｌ）、　（１９８３年）を参照）。

表　１ 細胞活性化のアッセイによって免疫学的過敏症を測定するための物質 カテゴリー　抗原（あるいは抽出物ン Ａ　食　品 ■、甲殻類／　カニ、ロブスタ−、エビシャコ、クラム。

軟体動物　カキ、イタヤガイ ２、乳製品　バター、チーズ、ミルク、カゼイン、ヨーグルト ３、魚　類　アンチョビー、バス、ナマズ、タラ、バトック、バーチ／サバ、赤 黒、タイセイヨウサケ、サーディン、ソール／カレイ／オヒョウ、メカジキ、マ ス、マグロ。

ターバト（ｔｕｒｂｏｔ）／白身の魚 ４、鶏　卵白、卵黄、チキン、ガチョウ、カモ。

七面鳥 ５、果　実　リンゴ、アプリコツト、バナナ、べり一（セイヨウヤブイチゴ、コ ケモモ１　ボイゼンベリー、クランベリー、キイチゴ。

ストロベリー）、サクランボ、ココナツ。

カランッ、デーツ、イチジク、ぶどぅ／干しぶどう、グレープフルーツ、キーウ ィ、レモン、ライム、マンダリンミヵン／タンジェリン、マンゴ−、メロン（カ ンタロープ、カン口メロン、スイヵン。

ネクタリン、オレンジ、パパイヤ、モモ。

西洋ナシ、パイナツプル、プラム、タマリンド ６、穀　類　アマランス、大麦、ソバ、トウモロコシキビ、オートムギ、米（白 米）、米（玄米）、ライ麦、ライコムギ、小麦 ７、肉　牛肉／子牛肉、子羊／羊肉、豚肉、シカ肉／猟獣の肉、ウサギ ８、ナツツ　アルファルファ、アーモンド、アニス。

７種　子　ブラジルナツツ、カシュー、クリノ実。

ハシバミの実、マカダミア２　ビーナツツ。

ベカン、マツ、ビスタシオ、ケシの実。

カポチャ、ゴマ、ヒマワリ、クルミ ９、油　脂　タラ肝臓、トウモロコシ、綿実、ハシバミの実、硬化油、亜麻仁、 オリーブ、ビーナツツ、サクラソウ、ベニバナ、ゴマ。

ヒマワリ、クルミ １０、スパイス　オールスパイス、クズウコン、ベイリーフ、カラウェーの実、 唐からし、シナモン、丁香、カレー、イノンド、ジンジャ−、セイヨウワサビ、 メース、マスタード、ｍ＼ナツツグ、ハナハッカ、パプリカ、パセリ、胡＊（黒 胡淑、粉唐辛子。

白胡Ｌ　ピーマン）、ハツカ７　ローズマリー、セージ／バフル１　オランダハ ツカ。

タイム、バニラ １１、野菜類　アーチチョーク、アスパラガス、アボカド、豆〔ササゲ、イナゴ マメ、ヒョコマメ、インゲン、ライマビーン、白インゲン、ぶちインゲン、大豆 ストリング （Ｓｔｒｉｎｇ）／ワックス（ＷＡＸ）　：］　、ビート。

ブロッコリー、芽キャベツ、キャベツ。

ニンジン、カリフラワー、七ロリー、トウモロコシ、キュウリ、ナス、ニンニク 。

ヒラマメ、レタス、マシュルーム、オリーブ、オニオン、パセリ、パースニップ 。

赤トウガラシ、ピーマン、ピミエント。

ポテト（ジャガイモ、サツマイモ）ラディッシュ、ダイオウ、ルタバガ、ホウレ ンソウ、カポチャ、カブ、クレソン そ　の　他　藻類〔スピルリナ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ）　）　、：！　−ビート ココア、コーラ、ジン（ビヤクシンベリー）、ホップ、ケルプ／海藻、麦芽、オ オバコ種子、バラの実、タピオカ。

茶、タバコ、トーフ／ミソ、酵母（パン雇用、醸造用） 食品添加物　アスパルテーム、ＢＨＴ／ＢＨＡ、食用および保存剤　色素、グル タミン酸ソーダ、サッカリン。

安息香酸塩、亜硫酸塩／二層硫酸塩 化学物質および薬品 アセトアミノフェン、アルデヒド（ホルムアルデヒド）、ふくらし粉１重ソウ （重炭酸ナトリウム）、カフェイン、カルバミン酸塩、コールタール、界面活性 剤、ハロゲン化農薬、金属触媒、（Ｎｉ。

Ｃｄ、Ｈｇなど）、硝酸塩、有機リン酸エステル、フェノール、石油副産物（溶 剤）、サリチル酸塩１石ケン（ドデシル硫酸ナトリウム） ここで「酵素の活性化」とは活性化の前に酵素活性かほとんどまたは全く検出さ れない場合に、酵素活性の測定可能な増加が結果として生した多数の変化の任意 の変化を意味する。このようにして、細胞と反応することにより、細胞−活性化 物質はリン酸化、あるいは脱リン酸化によるか、あるいは活性部位のアロステリ ック変化によるようにして、化学的に不活性な型から化学的に活性な型への酵素 の改変をまねく多数の細胞内事象を引き起こすことかできる。或いはまた、酵素 は細胞質から細胞表面へというように、基質に接近し難い部位から基質に接近で きる部位へ転位させることができる。膜小胞構造の内側から外側へのような酵素 の局在化における細胞内変化は細胞質に存在する基質に対して酵素を有効にさせ ることかできる。本発明で使用するような酵素の活性化は細胞の活性化の過程の 一部として、基質を酵素と接触させることができる細胞における変化によって、 酵素を基質に対して有効とさせることをも含む。酵素活性、局在化、および基質 材料の細胞の透過性あるいは取り込みにおける変化は業界で良く知られており、 詳細はここに参出版社（Ｇａｒｌａｎｄ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、　Ｉｎｃ、　 ）、　１９８９年に述べられている。

ここに「基質」とは：（１）検出可能な生成物（たとえば発色団）を生成するた めの興味ある酵素により直接に作用される基質；（２）最初の基質および第２の 物質との組み合わせを意味し、ここで最初の基質は第２の酵素／基質反応で、あ るいは第２結合色素（ジアゾ色素のような）と連結される場合、検出可能な生成 物を得、興味ある酵素の活性を反映する生成物を産生ずる。第２物質は、補酵素 前駆物質に加え、色素生成性前駆物質でよく、ここで興味ある酵素はたとえばニ コチンアデニンジヌクレオチド　ホスフェート（ＮＡＤＰ）のような補酵素前駆 物質と適当な条件下で反応してＮＡＤを生成し、次いでこれが前駆物質（色素生 成性前駆物質のような）から検出可能な生成物を産生ずるために作用する世代（ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）触媒を形成する一連の環状化学反応において用いられる 。この世代触媒は他の酵素、たとえば還元触媒のようなジアホラーゼとすること ができる。このように生じた発色団の吸光度は従来の比色定量法により測定され る。

ホスファターゼ測定にとっての異種酸化−還元触媒との環状ＮＡＤ／ＮＡＤＨ反 応は欧州特許出願公開第００５８５３９号明細書（１９８２年８月２５日公開） に記載されている。

本発明において有用な発色団前駆物質には２−（ｐ−ヨードフェニル）、３−（ ｐ−ニトロフェニル）−５−フェニル−テトラゾリウム　クロライド（ＩＮＴ） ；　３−　（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテ トラゾリウム　ブロマイド（ＭＴＴ）；２，２’、５．５’−テトラ−（ｐ−ニ トロフェニル）−３，３’　−（３，３’−ジメトキシ−４，４’−ジフェニレ ン）ジフェニルテトラゾリウム　クロライド（ＴＮＢＴ）；２，２’−ジ（ｐ− ニトロフェニル）−５，５′−ジフェニル−３，３’　−（３，３’−ジメトキ シ−４，４′−ジフェニレン）ジフェニル　テトラゾリウム　クロライド（ＮＢ Ｔ）、２．２−ジフエレニンー３．３’、５．５’−テトラフェニル　ジテトラ ゾリウム　クロライド（ネオテトラゾリウム　クロライドあるいはＮＴ）；２， ３−５−　トリフェニルテトラゾリウム　クロライド（ＴＴ）：などが含まれる 。

かかる発色団前駆物質は興味ある酵素反応に対し、種々の遠位の部位で作用する ことが可能である。たとえば乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性は、乳酸塩の 存在下で、ＮＡＤのＮＡＤＨへの還元を起こし、このＮＡＤＨは前に記載したも ののようなテトラゾリウム塩を、適当な波長で比色定量的に検出可能な還元され たホルマザンに還元できる。ホルマザンの生成量はＬＤＨ活性の尺度である。

或いはまた、アルカリホスファターゼ活性はＮＡＤＰからＮＡＤの生成をまねく 。このＮＡＤは前記ＬＤＨ反応に結合し、同様のホルマザン形成を起こすことか でき、この場合アルカリホスファターゼ活性の尺度である。

そのままの細胞において、かかる酵素反応は付随して生し、適当に選別された細 胞−活性化物質と発色団前駆物質の場合相互作用してアッセイの感度を増加させ 得ることは明らかである。

ホルボール　エステルは一般的な細胞活性化物質としてまたホスホリパーゼのよ うなエステラーゼに対する基質として特に良く適合する。発色団前駆物質をホル ボール　ミリステートアセテート（ＰＭＡ）のようなホルボール　エステルに結 合することにより単一化合物は活性化シグナルを示し、次いで、活性化された酵 素により開裂されて、検出される色素生成性生成物が得られる。食品および環境 化学抗原に対する過敏症のアッセイにおいて、ホルボール　エステル共役物、ホ ルボール−１２−レチンエート−１３−アセテートは「陽性コントロール」とし てはたらく。

細胞−活性化の条件下で活性化され、本発明においてアッセイされる酵素には、 アリールヒドロラ−ゼのようなアリールヒドロラーゼ、キナーゼ、リパーゼ、ホ スファターゼ（たとえばアルカリホスファターゼ）、エステラーゼ　グリコシダ ーゼ、ヘキソサミニダーゼ、ペプチダーゼ、およびヌクレアーゼ（たとえばＤＮ アーゼ、ＲＮアーゼ）、エステラーゼ、オキシダーゼ（混合オキシダーゼのよう な）あるいはヒドロゲナーゼ（たとえばＬＤＨ）が含まれる。

発色団のような検出可能な標識を含むか、または付加的な反応体に結合している 上記酵素に対する基質を下記の表２に示すが、この表は本発明における有用な酵 素および基質を制限せんとするものまたはすべてを示さんとするものではない。

前記の基質を誘導するのに使用される発色部分は：αおよびβナフチル、αおよ びβアルコキシナフチル（例えばαおよびβ４−メトキシナフチル）、αおよび β６−ブロモナフチル、Ｏ−ニトロフェノール、ｐ−ニトロフェノール、５−ブ ロモ−４−クロロ−３−インドリル、ブロモチモールフタレイン、フェノールフ タレイン、４−メチルウンベリフェリル、フルオレセイン、などが含まれる。

表２ アリールヒドロラーゼ　置換した炭化水素アリールヒドロラ−ゼ　硫酸塩 エステラーゼ　種々の炭素数の飽和および／または不飽和、分枝および／または 直鎖カルボン酸、およびその塩（例えばブチレート、アセテート、カプロエート 、カブリレート、ミリステート、ラウレエート、パルミテート、オレエート、バ レレート、など）、ホルボール　エステルキナーゼ　アデノシン、アデノシン三 リン酸、環式アデノシン−リン酸、グアノシンニリン酸、環式グアノシン−リン 酸、ホスホセリン、ホスホセリンン　テトラゾリウム　ブルー リパーゼ　グリセロール脂肪酸共役体、ホルボールエステル ヌクレアーゼ　チミジン−３−ホスフェート、ポリイノシン−ポリシチジル酸、 ポリアデニル−ポリウリジル酸 オキシダーゼ　Ｎ、　Ｎ−ジメチル−ｐ−フェニレンジアミンＣＩ ペプチダーゼ　ジあるいはトリ　ペプチドのようなアミノ酸オリゴマー、アミノ 酸　ナフチルアミド酵素基質系（例えばアミノペプチダーゼ）のいくつかは反応 生成物を発色団に転化させるためにジアゾ結合化合物を必要とする。かかる適当 なジアゾ色素には＝４−アミノ−２，５−ジメトキシ−４′−ニトロアゾベンゼ ン　ジアゾニウム塩：テトラアゾ化０−ジアニシジン；ジアゾ化−４′−アミノ −２′。

５′−ジェトキシベンズアニリド塩化亜鉛塩：４ヘンシイルアミノ−２，５−ジ メトキシアニリン塩化亜鉛のジアゾ化生成物；０−アミノアゾトルエン　ジアゾ ニウム塩；アントラキノン−１−ジアゾニウム　クロライド；５−ニトロ−２− アミノ−メトキシベンゼン　ジアゾテート；Ｎ’＋Ｎ’　−ジエチル−４〜メト キシメタニルアミン　ジアゾニウム塩；２−アミノ−４−メトキシベンズアミド 　ジアゾニウム塩；ジアゾ−２−アミノ−５−クロロアニソール；ジアゾ−５− クロロ−〇−アニシジン；５−クロロー２−トルイジンジアゾニウム　りロライ ドへミジンク　クロライド；５−クロロ−４−ベンズアミド−２−メチルベンゼ ン　ジアゾニウム　りロライド　へミジンフクロライド：６−ペンズアミド−５ −メトキシ−ｍ−トルイジン　ジアゾニウム　クロライド、および業界で知られ ている他のジアゾニウム塩が含まれる。

本発明の他の例は細胞活性化の指標としてはたらく酵素反応の発生を測定する種 々の方法に関している。好適例において、色素生成性基質は興味ある酵素によっ て作用されて発色基質を生成し、この発色基質は反応が行われる血しょうあるい は培地の適当な波長での吸光度の低下として測定される。３０．０００±５、０ ００の血液細胞を含む細胞豊富な血しょうの３５μｌにおいて、典型的な変化は 、バックグランド減少ｏ、ｏｏｔ±０．０００５単位（開始吸光度０．１５０単 位に基づいて）と比較して、活性化剤の存在下に吸光度０．１００±０．００５ 単位の減少である。この測定は標準的９６−ウェル　プレート読み取り装置を使 用して行われることが好ましい。

吸光度は血しょうあるいは培地において低下するとともに反応生成物の産生に基 づき細胞内吸光度の増加がある。細胞内の色調変化の測定は前記の反応流液測定 と共に行われるか、または他の例として行うことができる。細胞内の吸光度は細 胞内の発色反応生成物の存在により透過が妨げられるレーザー光線を放射するヒ タチ　ビデオマイクロプローブ（ｌ（ｉｔａｃｈｉＶｊｄｅｏｍｉｃｒｏｐｒｏ ｂｅ）　（イノウニ、ニス、（Ｉｎｏｕｅ、　Ｓ、）　、ビデオマイクロスコピ ーｆｆ：ｄｅｏｍｉｃｒｏｓｒ、ｏｐｙ　）　、プレナム出版（ＰＩｅｎｔ＋ｍ Ｐｒｅｓｓ）　、　−−ニーヨーク、　１９８７年）を用いて、約１．０００の 細胞をウェル中で走査することにより測定するのが好ましい。このようにして、 この例では、「陽性」細胞は計数され、異種細胞タイプ、異種活性化剤（たとえ ば抗原あるいはアレルゲン）などで比較される。

他の例において、細胞の活性化は：血液細胞で代表的に約１±０．０３５μであ る体積変化；粒子か適当に荷電した対照プレート間を移動する際電圧（ｍＶ）の 変化により測定されるゼータ電圧における検出可能な変化；ミリガウスで測定す る磁場のあるいは細胞のシグナルの変化；スヴ工−ドベリ一単位で測定する細胞 の粘性における変化；あるいは細胞膜の高張性あるいは低張性破裂に対する抵抗 性（ミリオスモル）として測定する溶解に対する細胞の抵抗性の変化として測定 される。かかる変化のエルセピア、（１９５２年〜１９８９年）を参照。

細胞−活性化物質が結合される支持マトリックスは反応容器を構成する材料とす ることかできる。即ち、反応容器自体、たとえば改変された４８ないし９６ウエ ル　マイクロタイトレーンヨン　プレート、が支持マトリックスとして役立ち、 活性化物質がウェルの底（および側壁）に結合する。支持マトリックスを構成で きる材料は、限定されるものではないが、清浄な光学スチレン、置換ポリスチレ ン、置換アクリロニトリル（ＳＡＮ）のようなアクリロニトリル、ポリカーボネ ート、ポリペンテン、あるいはシリコン　オキサイドか含まれる。他の例におい ては、作成した支持マトリックスを反応容器に別個に加え、さらに該マトリック スは限定されることはないが、ニトロセルロース、セルロース、ポリスチレン、 スチレン、ＳＡＮ、ポリカーボネート、ポリペンテン、ジビニルベンゼン、ある いはシリコンオキサイドが含まれる材料で構成する。本発明にとって有用なシリ コン　オキサイド材料は三重にシリコン化されたガラスあるいは石英である。支 持マトリックスは反応容器として使われている清浄光学ポリスチレンか好ましい 。・アッセイを行う反応容器はアッセイ方法の成功に重要である。

容器は反応の生理学的制御を最適化するよう設計する。酸素およびＣＯ２のよう なガスの充分な交換、ｐＨ平衡が十分に迅速であること、分子の十分な拡散、外 因性の原因あるいは内因性の反応由来の熱の十分な散逸は行われねばならない。

業界でよく知られている標準プラスチック９６−ウェル　マイクロタイトレージ ョン　プレートは主に側壁の高さのために、本発明の実施には不適当であること を見出した。

従って、本発明は下記の特徴を有する反応容器にも関するものである、 （１）表面（ｍｍ）対反応体積（μＩりの比か０．１以上でなければならない。

例えば６ｍｍ直径のマイクロプレート　ウェル、３０μ！試料体積のようなもの が好ましい。

（２）反応容器の側壁は可能な限り低くする必要がある。例えば、１．１〜５の 容器の高さ対反応混合物の高さの比か許容され、この比は約２であるのが好まし い。

（３）好ましいウェル直径は約６ｍｍで好ましい側壁の高さは約０．５〜約６ｍ ｍである。約１〜２ｍｍの高さが最も好ましい。

−例においては、反応容器は標準の９６ウエル　マイクロタイトレーンヨン　プ レートのレイアウトを有する。好適例においては、反応容器は、レイアウトにお いて標準の９６ウエル　マイクロタイトレージョン　プレートの半分と同等の、 ４８ウエル（８×６に配列した）を有する。

これらの反応容器のレイアウトは色素生成反応の測定に特に有用であり、この理 由は本発明に係るプレートの１つあるいは２つを標準的光学特性の９６プレート の上に配列して標準９６ウエル　マイクロタイトレージョン　プレートを収納す るよう設計された代表的な分光測光法的（あるいは比色定量的）プレート読み取 り装置において、色調反応を読み取ることができるからである。

本発明で使用する細胞の準備は調製および手数をほとんど必要としない。これは 、調製段階で細胞に負わせる。ストレスによる種々の酵素の活性化を防ぐのに重 要である。たとえば、血しようキナーゼ、補体成分、ハーゲマン因子、などの活 性化を通し、血液の凝固が、酵素を活性化し、アッセイでの更なる活性化が酵素 活性において検出可能なまで増加を起こさないほどバックグランドレベルを上昇 させる因子の放出をもたらす場合がある。従って、血液の凝固を避せることは重 要である。遠心分離、加熱、あるいは酸化ストレスにつながるインキュベーショ ンのような過度の細胞−細胞接触は、さらにこのアッセイの実施の成功を妨げる 。従って、ジャフエ、アール、（Ｊａｆｆｅ、　Ｒ，）されているような細胞− 豊富面しょうの１工程調製が好ましい。

本発明を次の実施例により説明するが、これらの実施例により本発明は制限され るものではない。

実施例１ 血液の試料をエネージオール化合物、アスコルビン酸を含む、１／１０容量の３ ．８％クエン酸三ナトリウム、あるいはに、　Ｍｇ。

Ｎａクエン酸塩で処理して、凝固を防止するために細胞の酸化−還元電位を保っ た。抗凝固処理全血を総計９８０ｇ／分の間遠心分離した。細胞豊富な血しょう （ＣＲＰ）をプラスチック類のトランスファーピペットで吸引した。細胞の乏し い血しょう中の濃度範囲１００〜ｉｏ、０００　ｐ　０１０１の酵素基質、テト ラゾリウムブルーを０．１〜１００μＩ！（１０μｌが最適であることを見出し た）添加した。ＣＲＰの３５μβをあらかじめ抗原を結合させである前記清浄光 学スチレン製４８ウエル　マイクロタイター　プレートに移した。

細胞を２〜２４時間、３５°Ｃでインキュベートした（はとんとのアッセイにお いて３時間か最適反応時間であることを見出した）。

細胞活性化を血しょうの色調低下として測定される酵素活性として評価した。吸 光度をバイオ・ラッド　モデル１５００プレート　リーダー　（ＢｉｏＲａｄ　 Ｍｏｃｌｅｌ　１５００　ｐｌａｔｅ　ｒｅａｄｅｒ）を用い３４０ｎｍあるい は３４０／　３８０ｎｍにおいて読み取った。

３５±１℃で３時間インキ子ベートした結果は次のようであった二 Ａ、リンパ球（ＮＫｗＩ胞、ＣＤ４−１１Ｊｉ性Ｔ細１ａ、ヌル細胞、および他 のリンパ球を含む）の細胞内吸光度（Ａｊｓｏ）の平均は０．２０４±、００８ のパックグランドから　１．．９５４±、０５１単位まで上昇した。

Ｂ１反応体培地の吸光度はこのインキュベーション巾約０．１１５単位（１，５ ００±、００１から　１．３８５±、００２単位）低下した。

Ｃ，ＣＤ４−陽性Ｔリンパ球の見掛の細胞体積は６．４±０．２μから７．９± ０．２２μ（Ｎ＝４００　、Ｐ＜０．００１　’）に増加した。

実施例２ 細胞の豊富な血しょう試料中の細胞か直接活性化剤に応答していることを確認す るため、および細胞がその応答に寄与したことを明確にするため、標準勾配沈降 法を用いるストラフタン１″′（ｓＬｒａｃｔａｎｌ″′）　（アラビノシル− ガラクトース）上テノ同浸透圧性等密度遠心法（ｉｎｓｏｏｓｍｏＬｉｃ　１ｓ ｏｐｙｃｎｉｃ　ｃｅｎＬｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）によって、ヒトリンパ球を全 血から単離した。

細胞をＩＥＣ固定アングルローター遠心器において４℃、１５．０００　ｇｍｉ ｎで遠心分離した。回収細胞は９９％を越えた純リンパ球（時折単球か混しる） であった。リンパ球をイーグル培地５＋ｎｊ’に再懸濁し、２度目のストラフタ ンＩ勾配遠心にかけた。

細胞を実施例１に記載した条件下でインキュベートした：Ｔｌｌ　１０％牛脂児 血清あるいはヒトアルブミンを補ったイーグル培地中に細胞３０．０００±５． ０００を含む細胞懸濁液３５μＩ！。

（２）清浄光学スチレン製４８ウエル　マイクロタイター　プレートにおいての ３５°Ｃ，１８０分のインキュベーション。

（３）基質としての、０．１Ｍテトラゾリウムブルー１０μβの添加。

酵素活性化は見掛の細胞体積の増加およびインキュベーション培地の吸光度の低 下として観察した。これらの結果は血液中のリンパ球および血清成分ではない他 の細胞種が、酵素的な反応の原因であることを示した。

実施例３ 種々のリンパ球クラスに特有の抗体を、前記の如く、アッセイに組み込み、反応 性細胞タイプを決定することかできた。この方法は特定の細胞タイプに特有の抗 体がその細胞の活性化を選択的に阻害し、一方存在する他の細胞の活性化を許容 することを知見したことに基づくものであった。

ｔｈリンパ球ママ−カーＣＤ２ＣＤ３．ＣＤ８．ＣＤｌ１．およびＣＤ１２に対 する標準的な市販モノクローナル抗体を使用した。

抗体を細胞、活性化剤および基質の反応に添加することによって、酵素の活性化 応答かヘルパー細胞（ＣＤ４＋）、ナチュラルキラー細胞（ＣＤ１２＋）および 「ヌル」Ｔ細胞（ＣＤ３＋。

ＣＤ４−、ＣＤ８−、ＣＤｌｌ−、ＣＤ１２−）において引き起こされることか 確認された。これらの結果は主に、特定のＴ細胞クラスおよびナチュラルキラー 細胞か、表１に示したような抗原による刺激、ＰＨＡおよびＰＷＭのような有糸 分裂促進性レクチン、さらにホルボールエステルに対してのリンパ性細胞全群の 応答の原因であることを示した。血しよう細胞、赤血球、および血小板は観察さ れた応答には寄与しなかった。

実施例４ 遅れた相のまたは遅延過敏症の検出において食品および化学的アレルゲン（表１ に記載）を用いアッセイの予見的感度および特異性を決定するために、結果を標 準的症状調査票（コーネル医学指数／ＣＭ　Ｉ　”　／１９４７．１９６２．１ ９７７）を用い被検者の症状頻度の自己申告に従って分類した。次に示すように 、はとんと症状をもたない被検者は反応をはとんと示さなかった。このアッセイ では症状か増加するにつれて、反応の数および強度の上昇か認められた。

症状の数　陽性反応 臨床条件下でこのアッセイを使用することの有効性を確認するために、６ケ月の 間隔でアッセイを繰り返した９４人の被検者の１群について、研究に続く検討を 行った。アッセイを繰り返した際、個体が反応する物質の数の減少は被検者によ り報告された症状の軽減に基づいて証明されるように改善と相関した。

これらの結果は本発明のアッセイにおける食品あるいは化学的抗原性の刺激に対 する応答性と臨床的に有用なパラメータとの間の強い相関関係を示した。

実施例５ Ａ９手順 この分析は７ケ月から３２ケ月にわたり行った１０２の個々の試験と再試験を受 けた４１人の患者の全てのデータを含んでいる。

患者は初期アッセイで陽性に評価された食品および化学薬品との接触を絶った。

次のデータ：試験時間、性、年齢、強い反応の数、中間反応の数、反応の総数お よび１８０の食品および化学物質に対しての試験結果（強さ、培地、無反応）を それぞれの患者から得た。数ケ月間の観察による改善の情報は最初から最後まで に行われた個々の試験について強い、中間反応の、および総ての反応の数におけ る違いから成り立っていた。また特定の試験薬剤の出現頻度を調べて、最も多数 の反応を用いて項目順に同定および並べた。

Ｂ、結果 最初から最後までの試験の陽性反応の減少の全ての平均は、強い反応の数か平均 ６２％減少することを示した。初めに、強い反応の平均数は２９　（１８０のう ち）であった。再試験では強い反応の平均数は１１に低下した。中間反応の平均 数は１１．３から１８．２へ増加し、これは強い反応が消失藺に弱い中間反応に なることに原因がある。若干の場合において、新しい反応は患者が食事を変えた 際現われた。これは中間反応の数を増加させる原因の一部となる。

要するに、強い反応の総数のほぼ２／３は減少した（Ｐ＜０．００５　）。これ らの結果は、初めに患者が陽性に反応した物質を食事または環境から除いた患者 によって強い反応の数の有意な減少が予測できる証拠を提供する。また反応の総 数も減少した。免疫系の活性化応答の検出可能な変化の前に、症状に基づく、臨 床上の改善がしばしば行われた。

時間を変える試験のために、それぞれの食事／環境を改変した患者を３つのカテ ゴリーに分類し：これらを７〜１２ケ月間、１３〜１８ケ月問および１９ケ月以 降で再試験した。６ケ月内の繰り返し試験は本質的に同じ反応：再試験で観察さ れた陽性反応の総数のわずかな（３％）減少を示した。これは本発明のアッセイ 手順の高い精度と再現性に一致した。

免疫系の細胞がアッセイにおいて、特異抗原に陽性に応答する過敏症状態からこ れらの抗原に対し無反応な状態への変動は数ケ月を必要とすると思われた。この 研究において患者は代表的には、３〜２０＋年の損われた機能（たとえば過敏症 ）および処置に対する意外なあるいは不十分な応答を示した。期間中の反応の全 消失について意味ある陳述を行う前に一層詳細な、管理した研究が必要となった 。予備的なデータは多数の反応が、患者の食事／環境の慎重な改変により完全に 排除され得ることを示した。

最後に、特定の食品および化学物質に対する反応をこの患者の試料で反応の頻度 について分類した。食事において最も普通で、また最も良く加工される食品は人 を最もよく敏感にさせるものの一種であった。トウモロコシ、チョコレート／コ コア、いぬほうずき、砂糖、コーヒー、および酵母のような品目は当時の約７０ ％に陽性反応を示した。殺菌牛乳、カゼイン、チーズおよびバターを含む牛の乳 製品は当時のほぼ９０％に反応を示した。唯一の陽性反応を示す、不純物を除去 したバターは牛起源の免疫反応物を欠いていた。乳製品中の脂肪ではなく反応性 タンパク質が過敏症の原因であることは明白であった。また、注目すべきことは 真菌、Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓに対する陽性反応の頻度が６０％であ ったことであり、Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓは臨床上免疫抑制性である ことが知られており、さらに最近、多くの慢性疾患に関連している。

Ｃ９結論 本発明のアッセイの使用は、感受性個体に免疫学的過敏症反応を引き起こす食品 および化学物質の矛盾のない定量的評価を与えるものである。本アッセイの結果 は食事／環境の適当な改変によって、これらの反応を臨床上杆首尾に反転するこ とができた。この結果はかかる反応が獲得され、不完全な消化および繰り返され る消費を伴う腸壁透過性の増加と関係があり、はとんどの場合、遺伝学上の関係 はないことを示す。従ってこれらの結果は、健康が慢性疾患および免疫防御力の 損傷に関連する過敏症反応により悪い影響を受けた人々に希望を与えるものであ る。

本発明は特定例について記載を行ったか、さらに改変か可能であることは理解さ れるものである。本発明は一般に、発明の原理に従い、また本発明か関係する技 術範囲内で通常実施されるように且つ次に示す請求の範囲に従うように前述の本 質的特徴にあてはまるような明細書の開示からの離脱を含める本発明の種々の変 形法、使用、あるいは適用をカバーすることを意図している。

国際調査報告 Ｉ″′−一１＾−”’　−’　ＭＴ／ＩＩ（Ｑｌ’ｌ／ｎＡ？＋７゜

Claims (33)

【特許請求の範囲】
1. １．そのままの細胞の活性化を検出するに当り：（ａ）上記細胞を適当な間隔で 細胞−活性化物質と接触させ、ここで上記細胞−活性化物質が上記細胞の酵素を 反応にとって有効にし； （ｂ）上記細胞中あるいは上記細胞上で上記酵素と反応可能な酵素基質を供給し ； （ｃ）上記酵素−基質反応の生成物を測定することにより上記細胞の活性化を検 出することを特徴とする細胞の活性化を検出する方法。
2. ２．特異抗原によってそのままのリンパ球の活性化を検出するに当り： （ａ）上記リンパ球を上記活性化を行うのに十分な期間上記抗原と接触させ、 ここで上記活性化が上記リンパ球の酵素を反応にとって有効にし； （ｂ）上記そのままのリンパ球の上記酵素と反応可能な酵素基質を供給し； （ｃ）上記酵素−基質反応の生成物の測定によって、上記活性化を検出すること を特徴とするリンパ球の活性化を検出する方法。
3. ３．被検者において抗原に対する免疫学的感作を検出するに当り： （ａ）上記被検者からのそのままの血液細胞を上記血液細胞が活性化を受けるの に十分な期間上記抗原と接触させ、ここで、上記活性化が上記細胞の酵素を反応 にとって有効にし； （ｂ）上記そのままの血液細胞の上記酵素と反応可能な酵素基質を供給し； （ｃ）上記酵素−基質反応の生成物を測定することにより上記免疫学的感作を検 出することを特徴とする免疫学的感作を検出する方法。
4. ４．さらに、工程（ａ）の前に、上記細胞−活性化物質あるいは抗原を支持マト リックスに結合させることを特徴とする請求の範囲１，２または３記載の方法。
5. ５．上記支持マトリックスが清浄光学スチレン、置換アクリロニトリル、ポリカ ーボネート、ポリペンテン、こトロセルロース、セルロース、およびシリコンオ キサドから成る群から選ばれることを特徴とする請求の範囲４記載の方法。
6. ６．上記支持マトリックスが清浄光学スチレンであることを特徴とする請求の範 囲５記載の方法。
7. ７．上記酵素がアリールヒドロラーゼ、キナーゼ、リパーゼホスファターゼ、ヘ キソサミニダーゼ、ペプチダーゼおよびヌクレアーゼから成る群から選ばれるこ とを特徴とする請求の範囲１〜４のいずれか−つの項に記載の方法。
8. ８．上記酵素：基質の組み合わせが （ａ）アリールヒドロラーゼ：置換炭化水素；（ｂ）キナーゼ：アデノシン二リ ン酸；（ｃ）キナーゼ：アデノシン三リン酸；（ｄ）キナーゼ：環式アデノシン −リン酸；（ｅ）キナーゼ；環式グアノシン−リン酸；（ｆ）キナーゼ：ホスホ セリン； （ｇ）キナーゼ：ホスホチロシン； （ｈ）リパーゼ：グリセロール脂肪酸共役体；（ｉ）エステラーゼ：ホルボール エステル；（ｊ）ペプチダーゼ：アミノ酸オリゴマー；（ｋ）ヌクレアーゼ：ポ リイノシン−ポリシチジル酸；（ｌ）ヌクレアーゼ：ポリアデニル−ポリウリジ ル酸から成る群から選ばれることを特徴とする請求の範囲１〜４のいずれか−つ の項に記載の方法。
9. ９．上記酵素基質が色素生成性であることを特徴とする請求の範囲１〜４のいず れか−つの項に記載の方法。
10. １０．上記酵素基質が、ネオテトラゾリウムクロライドであることを特徴とする 請求の範囲１記載の方法。
11. １１．上記細胞が原核細胞であることを特徴とする請求の範囲１記載の方法。
12. １２．上記の細胞が、真核細胞であることを特徴とする請求の範囲１記載の方法 。
13. １３．上記細胞が血液細胞であることを特徴とする請求の範囲１記載の方法。
14. １４．上記血液細胞が単球であることを特徴とする請求の範囲１３記載の方法。
15. １５．上記血液細胞が好塩基球であることを特徴とする請求の範囲１３記載の方 法。
16. １６．上記細胞あるいはリンパ球を上記支持マトリックスに固定することを特徴 とする請求の範囲４記載の方法。
17. １７．上記測定法が比色定量、偏光分析、電気測定、容積測定あるいは電位差測 定であることを特徴とする請求の範囲４記載の方法。
18. １８．上記測定法が比色定量であることを特徴とする請求の範囲１７記載の方法 。
19. １９．１つ以上の容器を密閉状態で収納するために区画室に分けられている、細 胞の活性化を検出するためのキットにおいて：（ａ）それぞれが異なる細胞−活 性化物質を含む１つ以上の第１容器； （ｂ）酵素基質を含む第２容器； （ｃ）支持マトリックス； （ｄ）少なくとも１つの反応容器 を有することを特徴とする細胞の活性化を検出するためのキット。
20. ２０．１つ以上の容器を密閉状態で収納するために区画室に分けられている、細 胞の活性化を検出するためのキットにおいて：（ａ）それぞれが１つ以上の細胞 −活性化物質を結合した支持マトリックスを含む１つ以上の第１容器；（ｂ）酵 素基質を含む第２容器； （ｃ）少なくとも１つの反応容器 を有することを特徴とする細胞の活性化を検出するためのキット。
21. ２１．上記支持マトリックスが反応容器を構成することを特徴とする請求の範囲 １９または２０記載のキット。
22. ２２．上記細胞−活性化物質がホルボールエステル、植物性血球凝集素、グルテ ン、および亜硫酸塩より成る群から選ばれることを特徴とする請求の範囲１９， ２０または２１記載のキット。
23. ２３．上記活性化物質が抗原であることを特徴とする請求の範囲１９，２０また は２１記載のキット。
24. ２４．ペプチド、グリコペプチド、リポプロテイン、およびハプテンより成る群 から上記抗原が選ばれることを特徴とする請求の範囲２３記載のキット。
25. ２５．上記抗原がアレルゲンであることを特徴とする請求の範囲２３記載のキッ ト。
26. ２６．上記酵素基質が置換炭化水素、アデノシン二リン酸、アデノシン三リン酸 、環式アデノシン−リン酸、グアノシン二リン酸、環式グアノシン−リン酸、ホ スホセリン、ホスホチロシン、グリセロール脂肪酸共役体、ホルボールエステル 、アミノ酸オリゴマー、ポリイノシン−ポリシチジル酸、およびポリアデニル− ポリウリジル酸より成る群から選ばれる請求の範囲１９，２０または２１記載の キット。
27. ２７．上記酵素基質が環式グアノシン−リン酸であることを特徴とする請求の範 囲２６記載のキット。
28. ２８．上記支持マトリックスが清浄光学スチレン、置換アクリロニトリル、ポリ カーボネート、ポリペンテン、ニトロセルロース、セルロース、およびシリコン オキサドより成る群から選ばれることを特徴とする請求の範囲１９，２０または ２１記載のキット。
29. ２９．上記支持マトリックスが清浄光学スチレンであることを特徴とする請求の 範囲２８記載のキット。
30. ３０．上記反応容器がマイクロタイトレーションプレートを構成することを特徴 とする請求の範囲１９，２０または２１記載のキット。
31. ３１．直径約６ｍｍのウエルおよび高さ約０．５画ｍｍ〜６ｍｍの壁から構成さ れる請求の範囲１〜４のいずれか−つの項に記載の方法を実施するのに有用なプ ラスチック製マイクロタイトレーションプレート。
32. ３２．上記プラスチックが清浄光学スチレン、置換アクリロニトリルおよびポリ カーボネートより成る群から選ばれることを特徴とする請求の範囲３１記載のプ レート。
33. ３３．上記プラスチックが清浄光学スチレンであることを特徴とする請求の範囲 ３２記載のプレート。