DE69029269T2 - Neue inhibitoren für hydrolytische enzyme und substrate und bestimmungsverfahren, selbige einschliessende verfahren und testsätze - Google Patents

Neue inhibitoren für hydrolytische enzyme und substrate und bestimmungsverfahren, selbige einschliessende verfahren und testsätze

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Description

    Technisches Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung verwendet in all ihren Formen als eine fundamentale Aussage eine neue Klasse von Inhibitoren (Inaktivatoren) hydrolytischer Enzyme und Enzymsubstrate fur Assays. Diese Inhibitoren und Substrate wirken als die Gesamtheit von drei Teilen. Ein Teil kann von dem aktiven Zentrum (den aktiven Zentren) eines gegebenen hydrolytischen Enzymes erkannt werden, so daß das Enzym, wenn es in Kontakt mit dem Inhibitor gebracht wird, hydrolytisch mit begleitender Beseitigung dieses Teiles wirkt. Ein zweiter Teil, ist ein abspaltbarer Teil, wie z.B. ein Markerchromophor, der bestimmt und gemessen werden kann, und der dritte Teil ist ein verbleibender Teil, welcher den ersten und zweiten Teil miteinander verbindet, und der nach der Beseitigung des ersten und zweiten Teiles eine cyclische Konfiguration annimmt, die im Falle der Inhibitoren seine weitere Reaktion mit dem Enzym zur Folge hat, wodurch das Enzym durch die Ausbildung kovalenter Bindungen an dem aktiven Zentrum (den aktiven Zentren) irreversibel inaktiviert wird. Die neuen Inhibitoren und Substrate hydrolytischer Enzyme gemäß der vorliegenden Erfindung schaffen daher Wege, um die Aktivität hydrolytischer Enzyme zu bestimmen und Wege zur Modulation der Aktivität hydrolytischer Enzyme bei der Kontrolle oder Behandlung von verschiedenen Krankheitszuständen oder Leiden, bei denen eine solche Aktivität hydrolytischer Enzyme beteiligt ist.
    • Hintergrund der Erfindung
  • In einem Sonderbericht, welcher in Chemical and Engineering News 61, 48 (1983), publiziert wurde, diskutiert Abeles allgemein eine Klasse von Enzyminaktivatoren, die als "Suicidenzyminaktivatoren" oder "Mechanismus-basierende Inaktivatoren" bezeichnet werden. Diese Inaktivatoren, ob Naturstoffe oder künstliche Produkte, haben eine Konfiguration, die dem natürlichen Substrat eines natürlichen Enzymes ähnelt und deshalb von dem aktiven Zentrum des Enzymes erkannt wird. Wenn das Enzym mit dieser erkennbaren Konfiguration reagiert, wird der Inaktivator chemisch modifiziert, und dadurch in eine Verbindung umgewandelt, die mit dem Enzym reagiert und zu einer folgenden Enzyminaktivierung führt, die in der Regel ihrer Natur und irreversibel ist. Durch die Reaktion mit dem Suicidsubstrat (Inaktivator) führt das Enzym seine eigene Zerstörung herbei. Der Autor postuliert, daß die Entwicklung von Inhibitoren oder Inaktivatoren spezifischer Enzyme dadurch nützlich sein kann, daß sie eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von Medikamenten, die mit der normalen Enzymaktivität interferieren können, spielen. Wo solche Enzyme als bei Krankheitszuständen beteiligt identifiziert wurden, wäre die Verwendung von solchen Inhibitoren oder Inaktivatoren nützlich, um die Enzymaktivität in der Behandlung oder Prävention des gegebenen Krankheitszustandes, in dem das Enzym beteiligt ist, zu modulieren.
  • Forschungsanstrengungen haben sich auf die Wirkung oder den Mechanismus von Phospholipasen, wie z.B. der Phospholipase A&sub2;, welche in der Regulation von vielen wichtigen zellulären Funktionen beteiligt ist, konzentriert. Siehe Lapetina, Kapitel 21 "Phospholipase", Annual Reports in Medicinal Chemistry 19, 213 Academic Press Inc. (1984).
  • Begleitende Forschungsziele zur Inaktivierung oder Inhibition der Phospholipaseenzymaktivität können unter anderem Chang et al., Biochemical Pharmacology 36, 2429 (1987) entnommen werden. Siehe ebenso Dennis Biotechnology 5, 1294 (1987). Diese Kommentare stellen eine Übersicht der Struktur und Biochemie bestimmter Phospholipasen zur Verfügung und führen den Leser zu anderen Artikeln, in denen eine ausführlichere Behandlung dieser Klasse hydrolytischer Enzyme gefunden werden kann. Die Autoren schlagen vor, daß die Phospholipase-Aktivierung einen Geschwindigkeits-bestimmenden Schritt in dem gesamten Prozess der Lipidmediatorsynthese darstellt, von der man gefunden hat, daß sie beim Vorhandensein von verschiedenen Krankheitszuständen oder Leiden beteiligt ist. Insbesondere nimmt man an, daß die Phospholipase A&sub2; (PLA&sub2;) das Enzym ist, welches für die Freisetzung freier Arachidonsäure, von der man glaubt, daß sie in der Kontrolle der Biosynthese von Prostaglandin, Leukotrien und verwandter Eicosanoide bei Entzündungen und sonstigen Krankheitszuständen beteiligt ist, aus den Membranphospholipiden verantwortlich ist.
  • Sie fügen hinzu, daß die Inhibition der PLA&sub2;-Aktivität einen attraktiven therapeutischen Ansatz für das Design von neuen Medikamenten für die Behandlung von solchen Entzündungen und anderen Gewebeverletzungen darstellen könne. Die Autoren stellen für eine große Anzahl von Phospholipase- A&sub2;-Enzymen die Quellen und Strukturreferenzen zu Verfügung und diskutieren den Mechanismus der Aktivierung dieser Enzyme. Schließlich stellen sie eine Analyse der Konsequenz solcher Enzymaktivitäten zur Verfügung und liefern daher eine Basis für ein Ziel für Drugdesign-Forscher, nämlich die Herstellung neuer Klassen von Medikamenten-Entitäten, die bei der Behandlung oder Kontrolle von verschiedenen Krankheitszuständen oder Leiden durch Einflußnahme auf die Ebene der Phospholipase oder anderer hydrolytischer Enzymaktivitäten nützlich sein können.
  • Somit vermittelt offensichtlich PLA&sub2;, nachdem es aktiviert wurde, eine Verschiedenheit von pathophysiologischen Reaktionen wahrscheinlich durch seine Produkte, nämlich Lysophospholipide und Arachidonsäure, und mehrere starke biologisch aktive Substanzen, wie z.B. Prostaglandine, Leukotriene, usw. Wenn das Phospholipidsubstrat einen Alkylether oder eine plasmalogene Funktion enthält, schließen die Produkte der PLA&sub2;-Wirkung außerdem lysoPAF (PAF = Blutplättchen-aktivierender Faktor) oder Analoga ein, die, wenn sie acetyliert werden, PAF und Analoga produzieren, die ebenfalls starke biologisch aktive Substanzen sind. Man nimmt an, daß diese Produkte oder Coprodukte der PLA&sub2;-Aktivierung zytotoxische Substanzen sind und an verschiedenen entzündlichen und allergischen Leiden des Menschen beteiligt sind. Diese und andere Daten lassen vermuten, daß PLA&sub2; sehr wahrscheinlich bei Entzündungen und Gewebsverletzungen, die mit verschiedenen Krankheiten assoziiert sind, beteiligt ist.
  • Erhöhte PLA&sub2;-Spiegel wurden außerdem bei rheumatoiden arthritischen Leiden, Psoriasis, pankreatischem und septischem Schock gefunden. Man nimmt ebenso an, daß bei myocardialer Ischämie eine PLA&sub2;-Aktivierung beteiligt ist. PLA&sub2; könnte außerdem in der Lungenpathophysiologie, insbesondere bei Asthma, in kritischer Weise beteiligt sein.
  • All diese Daten weisen darauf hin, daß eine Inhibition oder Inaktivierung von PLA&sub2; ein vielversprechender Ein-Schritt-Ansatz sein könnte, um mit der Bildung der Produkte und Coprodukte einer solchen Aktivierung zu interferieren, die bei verschiedenen Krankheitszuständen beteiligt sind, so daß dies zu der möglichen Milderung des Krankheitsprozesses führt.
  • Eine ziemlich detaillierte Charakterisierung von Phospholipaseenzymen wird auch von Dennis, The Enzymes XVI, 307, Academic Press Inc. (1983), geliefert. Dieser Artikel liefert Charakterisierungsdaten für und Reinigung von mehreren Phospholipasen, die Kinetik und Reaktionen, von denen man glaubt, daß diese Phospholipasen verantwortlich sind, die biologischen Wirkungen und die Identifikation von Sequenzen und konformationeller Struktur, die auf ein aktives Zentrum (aktive Zentren) hinweist.
  • Phospholipase-A&sub2;-Inhibition und Modifikation bei Manoalid war Gegenstand der U.S. Patente 4 447 445 und 4 616 089. Manoalid ist ein mariner Naturstoff, welcher aus Schwämmen isoliert wird, und von welchem man zeigte, daß er anti-entzündliche Aktivität in vivo hat. Die Erforschung dieses Naturstoffs ergab, daß er auf der Ebene der Phospholipase A&sub2; wirkt, und es wurde gezeigt, daß er ein Inhibitor sowohl der Kobra- als auch der Bienengiftphospholipase A&sub2; (PLA&sub2;) ist. Siehe Lombardo et al., J. Biol. Chem. 260, 7234 (1985) und Deems et al. Biochem. Biophys. Acta, 917, 258 (1987). Die von diesem weiterführende Forschung über synthetische Analoga ist in Reynolds et al., J. Am. Chem. Soc. 110, 5172 (1988) beschrieben. Diese Studien zeigen, daß Manoalid eine zeitabhängige irreversible Inaktivierung von PLA&sub2; verursacht, wie durch die Modifikation von Lysinresten gezeigt wurde. Ein die Verwendung von Manoalid begleitender Nachteil ist seine nicht-spezifische Reaktivität mit einer Vielzahl von Proteinen.
  • Vor kurzem offenbarte die europäische Patentanmeldung 0 331 167, angemeldet am 2. März 1989 und veröffentlicht am 6. September 1989 und die daher im Stand der Technik gemäß Artikel EPÜ 54(3) enthalten ist, Phospholipasesubstrate der Formel W-Y-C(O)-A-C(O)-X, in welchen X der Rest einer aromatischen Hydroxy- oder Thiolverbindung ist, welche bei Kontakt mit Phospholipase-enthaltenden Proben für eine Freisetzung empfindlich ist, und die Verwendung der genannten Substrate für eine in vitro optische Bestimmung von Phospholipasen. Dieser Offenbarung fehlt jedoch jeglicher therapeutischer Ansatz.
  • Ermutigt durch dieses Ziel, endogene Substrate zu produzieren, die die hydrolytische Enzymaktivität, wie z.B. der Phospholipase, modulieren könnten, ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, Substanzen zu produzieren, die mit Krankheitszuständen oder Leiden über molekulare Interaktion von spezifischen hydrolytischen Enzymaktivitäten über Suicidinaktivierung oder die Inhibitor-mechanistische Ebene interferieren können. Basierend auf derartiger Forschung und Untersuchung unter Verwendung von Phospholipase A&sub2; als Modell konzentriert sich die vorliegende Forschung auf das Design von neuen Inhibitoren (Inaktivatoren) hydrolytischer Enzyme, die über die Erkennung durch das aktive Zentrum eines solchen Enzymes wirken und in der Inhibition der Enzymfunktionalität resultieren. Daher führen die genannten Inhibitoren zu einem funktionalen Suicid der enzymatischen Aktivität.
    • Zusammenfassung der Erfindung
  • In ihren verschiedenen Aspekten zusammengenommen, beruht die vorliegende Erfindung auf einer fundamentalen Aussage, welche auf einer neuen Klasse von neuen Inhibitoren (Inaktivatoren) und Substraten hydrolytischer Enzyme beruht. Diese neuen Verbindungen wirken nach Erkennung als Substrat und Prozessierung durch ein spezifisches hydrolytisches Enzym durch irreversible Inaktivierung des genannten Enzymes. Gleichzeitig wird ein Nebenprodukt dieser Reaktion in Form eines nachweisbaren und meßbaren Teiles gebildet, der als Mittel verwendet werden kann, um das Maß der hydrolytischen Enzymaktivität in einer Probe zu messen. Dies ist die Grundlage für einen Test zur Messung der hydrolytischen Enzymaktivität Wenn sie auf diese Weise verwendet werden, sind die inhibitorischen Eigenschaften der Verbindungen auf das Mindestmaß herabgesetzt. Durch die hierin genannten neuen Verbindungen ist ebenso ein Weg für die Behandlung von verschiedenen Krankheitszuständen oder Leiden durch die Modulation der hydrolytischen Enzymaktivität, welche im speziellen Krankheitszustand oder Leiden, welches behandelt werden soll, beteiligt ist, bereitgestellt. Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin zugehörige Wege und zu dem Assay gehörige Kits und Behandlungsmethoden bereit, welche oben definiert wurden.
  • Unter einem ersten Gesichtspunkt ist die Erfindung auf Inhibitoren (Inaktivatoren) und Substrate hydrolytischer Enzyme gerichtet, welche durch die folgende allgemeine Formel (I) dargestellt werden:
  • worin R Sauerstoff oder Imino bedeutet,
  • jedes X unabhängig Sauerstoff, Schwefel oder Imino bedeutet,
  • A eine Einheit ist, die von einem Phospholipase-A&sub2;-Enzym so erkannt wird, daß das Enzym die Bindung, die AX mit C(O)Y verknüpft, hydrolysiert,
  • B eine Komponente einer spaltbaren Einheit BX ist,
  • Y ein Alkylen oder Alkenylen oder Alkylen oder Alkenylen, das mit einer oder mehreren Niedrigalkylgruppe(n), umfassend 1 bis 4 Kohlenstoffatome, substituiert ist, ist,
  • zur therapeutischen Verwendung.
  • In einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung ist R Sauerstoff und jedes X Sauerstoff.
  • In einer anderen vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung ist Y entweder:
  • n-Propylen
  • 1,1-Dimethyl-n-propylen
  • 2,2-Dimethyl-n-propylen
  • Ethylen, oder
  • 1,1-Dimethylethylen.
  • In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung ist AX 1-Decanoylglycerin-3-phosphorylcholin. Die erfindungsgemäßen neuen Inhibitoren (Inaktivatoren) hydrolytischer Enzyme und Substrate, wie oben in Formel (I) dargestellt, können spezifischer als eine bevorzugte Untergruppierung von Verbindungen der folgenden Formel (II) dargestellt werden:
  • worin jedes A und B wie oben definiert ist und C2,3 einen Linkertyp repräsentiert, der wenigstens zwei oder drei Kohlenstoffatome hat, die gesättigt oder ungesättigt, unsubstituiert oder substituiert sein können.
  • Im Hinblick auf jede Verbindungsklasse, die oben durch die Formeln (I) und (II) dargestellt ist, ist B vorzugsweise eine chromophore Gruppe, wie z.B. p-Nitrophenyl.
  • Weiterhin bevorzugt innerhalb der Klasse neuer Verbindungen, wie oben durch die Formeln (I) und (II) repräsentiert und wie oben weiterhin definiert in Bezug auf die genauere Definition der Gruppe B, ist Gruppe A vorzugsweise ausgewählt aus einer Gruppierung, die ein Glyceringrundgerüst hat, in denen ein Sauerstoffatom mit dem Linker der obigen repräsentativen Verbindungen verbunden ist; andere an das Glyceringrundgerüst gebundene Atome sind verbunden: eines, entweder Sauerstoff, Stickstoff oder Schwefel mit einer Alkyl- oder einer Fettsäurekette und eines, ein Sauerstoff über einen Phosphodiester oder eine andere geeignete Verknüpfung mit einer polaren Gruppe, z.B. Cholin. Die Fettsäurekette kann eine gesättigte oder ungesättigte Kette sein, die der Substratspezifität, falls es eine gibt, des in Frage kommenden spezifischen hydrolytischen Enzymes entsprechen wird.
  • Unter einem zweiten Gesichtspunkt ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung die Verwendung einer Verbindung, wie oben dargestellt, für die Herstellung eines Medikamentes für die Phospholipase-A&sub2;-Inhibierung.
  • Die oben dargestellten Inhibitoren (Inaktivatoren) und Substrate hydrolytischer Enzyme können in einem Assay zur Messung der spezifischen hydrolytischen Enzymaktivität in einer Probe z.B. in einer biologischen Probe, die einem Menschen entnommen wurde, verwendet werden, wobei der Assay darin besteht, die genannte Probe mit einem, wie oben dargestellten, neuen hydrolytischen Enzymsubstrat in Kontakt zu bringen, auf eine Art und unter Bedingungen, daß die genannte Verbindung in situ chemisch nahe an ein Ziel, ein spezifisches hydrolytisches Enzym, falls es in der genannten Probe enthalten ist, gebracht wird, so daß es damit reagiert und die Höhe einer solchen Aktivität über die Abspaltung und den Nachweis und die Messung eines Markerteiles der genannten Verbindung als Folge der Reaktion der genannten Verbindung mit der genannten hydrolytischen Enzymaktivität zu messen und nachzuweisen.
  • Die oben dargestellten Inhibitoren (Inaktivatoren) und Substrate hydrolytischer Enzyme können ebenfalls in einer Methode und auf eine Weise zur Behandlung eines pathologischen Krankheitszustandes oder eines Leidens, welches durch eine spezifische hydrolytische Enzymaktivität vermittelt wird, verwendet werden, die es beinhaltet, einem Patienten, der für den genannten pathologischen Krankheitszustand oder das Leiden empfindlich ist oder diese erleidet, eine Menge des neuen oben dargestellten Inhibitors (Inaktivators) eines hydrolytischen Enzymes zu verabreichen, die ausreicht, die oben genannte hydrolytische Enzymaktivität irreversibel zu inaktivieren und inhibieren, wobei der genannte Inhibitor (Inaktivator) eines hydrolytischen Enzymes in einer pharmazeutisch annehmbaren Form verabreicht wird.
  • Die wie oben definierte Erfindung schließt in ihren verschiedenen Formen alle verwandten Weisen und Methoden in Form pharmazeutischer Kits ein, die auf eine Art und Weise zusammengesetzt und nützlich sind, daß sie dem Assay und dem Aspekt der Behandlungsmethode der vorliegenden Erfindung verwandt sind.
  • Die vorliegende Erfindung ist auf die Art und Weise, von der angenommen werden kann, daß sie biologisch funktioniert, mechanistisch beschrieben. Es versteht sich von selbst, daß der Mechanismus als solcher nicht notwendigerweise in den Aufgabenbereich eingeschlossen ist, sollte er sich im Detail tatsächlich vom vorgeschlagenen Mechanismus unterscheiden.
    • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung wird mit Hilfe eines Modellsystems, in dem besondere neue Inhibitoren (Inaktivatoren) und Substrate hydrolytischer Enzyme in Verbindung mit Phospholipase A&sub2; verwendet werden, beschrieben. Der Ansatz dieser Erfindung, wie er durch das Modellsystem beschrieben wird, kann verallgemeinert werden und wird verallgemeinert, um die Entwicklung von verschiedenen anderen spezifischen Inhibitoren und Substraten hydrolytischer Enzyme in Assays oder Behandlungsmaßnahmen für andere hydrolytische Enzyme zu erleichtern. Bei derartigen anderen hydrolytischen Enzymen sind Phospholipasen, Lipasen, Esterasen, Proteasen usw. eingeschlossen. Die therapeutischen Anwendungen für derartige Inhibitoren für diese Klasse von Enzymen erstrecken sich über Zustände von Entzündung, Bluthochdruck, Lipidmetabolismus, Fettsucht, usw. Die Assays, die auf dem Ansatz der Erfindung beruhen, sind selektiv, billig und geeignet für die wichtigen Enzyme innerhalb dieser Klassen.
  • Das wesentliche Merkmal der hier genannten neuen Verbindungen ist die Verwendung einer bifunktionellen Brücke zur Verbindung in einem Molekülganzen, welches funktionell die notwendigen strukturellen Merkmale, die für die Erkennung durch eine aktive Stelle (aktive Zentren) eines spezifischen hydrolytischen Enzyms benötigt werden und einer Abgangsgruppe, die neben der Reaktion der hier genannten neuen Verbindungen mit einem spezifischen hydrolytischen Enzym detektiert und gemessen werden kann, beinhaltet. In bevorzugten Ausführungsformen ist die Brücke eine dibasische Säure, die in der Lage ist, ein cyclisches Anhydrid zu bilden. Als Folge der enzymatischen Hydrolyse der Bindung, welche die Brücke mit dem Teil, welcher die enzymatische Spezifität trägt, verbindet, nimmt man an, daß das Carboxylatanion des resultierenden Hydrolyseproduktes als ein nucleophiler Katalysator wirkt, um die Esterbindung, welche die Abgangsgruppe und die Brücke verbindet, zu spalten, so daß ein cyclisches Anhydrid entsteht. Die Reaktivität des Anhydrides mit dem aktiven Zentrum schafft eine kovalente Bindung zwischen den beiden, wodurch die enzymatische Aktivität inaktiviert oder wenigstens inhibiert wird. Die Reaktivität des Anhydrids ist ausreichend groß, so daß, sollte es aus dem aktiven Zentrum des Enzyms diffundieren, die überwältigende Wahrscheinlichkeit ist, daß es mit Wasser reagieren würde, bevor es auf ein anderes Protein treffen würde.
  • Daher stellt man sich bei mechanistischer Betrachtung vor, daß das Carboxylatanion des entstehenden Hydrolyseproduktes, welches als Folge der enzymatischen Hydrolyse der Bindung entsteht, welche die Brücke mit der die enzymatische Spezifität tragenden Einheit verbindet, als nucleophiler Katalysator wirkt, um die Bindung, welche die Abgangsgruppe und die Brücke verbindet, zu spalten. Das Nettoergebnis ist die Erzeugung eines reaktiven cydischen Anhydrides am katalytischen Zentrum. Die Acylierung einer nucleophilen Gruppe des Enzymes durch ein Anhydrid inaktiviert das Enzym irreversibel. Die Rate der Anhydridbildung kann moduliert werden durch 1) Einstellung des pka der Abgangsgruppe, und 2) Einführung eines Alkyls oder anderer Substituenten an den dazwischenliegenden Atomen der Brücke, oder 3) Inkorporation der dazwischenliegenden Atome der Brücke in eine cyclische Struktur, wie z.B. eine aromatische Gruppierung.
  • Beispiele möglicher Brückenstrukturen, dargestellt innerhalb vollständiger Verbindungsstrukturen, sind in Figur 6 dargestellt. Die Ausgangsmaterialien, welche derartige Brücken enthalten, oder mit welchen solche Brücken konstruiert werden können, sind dem Fachmann verfügbar - siehe z.B. den Aldrich Chemical Co. Katalog.
  • Die generellen Vorteile der neuen Verbindungen gemäß dieser Erfindung sind die allgemeine Anwendbarkeit und die hohe Spezifität für das Zielenzym, aufgrund 1) des Substratdesigns, und 2) dem Auftreten der enzymatischen Acylierung, hauptsächlich innerhalb des Enzymsubstratkomplexes, welcher die cyclische Verbindung erzeugte.
  • Die gleichen strukturellen Merkmale werden benötigt, damit dieses Verfahren in einem Assay verwendet werden kann, mit Ausnahme der Notwendigkeit, daß der Teil B ein chromophorer Farbstoff oder anderer Marker ist, und daß der Ringschluß ausreichend langsam ist, damit das Anhydrid erzeugt wird, nachdem das Enzym und die initialen Hydrolyseprodukte voneinander diffundierten.
  • Die entsprechenden mechanistischen Prinzipien finden Anwendung, wenn die Brücke ein Carbonyl/Amid ist.
  • Das Chromophor oder andere bestimm- und meßbare Gruppierungen sind dem Fachmann gut bekannt. Entsprechende Beispiele sind p-Nitrophenol, Azophenole, Azonaphthole, Hydroxycumarine. Strukturbeispiele für entsprechende Gruppierungen sind in Figur 7, Teil B, gegeben.
  • Beispiele möglicher Strukturen für A (dargestellt mit der abgeleiteten Bindung zu dem Molekülrest) sind in Figur 7, Teil A, angegeben. Im Design eines Teiles A, der für ein gegebenes hydrolytisches Enzym spezifisch ist, wird das Wissen um die Substratspezifität des gegebenen hydrolytischen Enzymes ausgenutzt. Entsprechende Beispiele können der vorhandenen Literatur entnommen werden und schließen Chymotrypsin, Lipase, Proteasen und Phospholipase A&sub2; ein.
  • Die Proteasen können in vier Hauptklassen eingeteilt werden, welche die Art des katalytischen Zentrums wiederspiegeln. Zwei Klassen fördern die Hydrolyse von Peptidbindungen durch nucleophile Katalyse, welche die Bildung eines Acylenzym-Intermediates zur Folge hat. Bei diesen handelt es sich um die Serin- und Cysteinproteasen, welche entweder die Hydroxylgruppe eines Serinrestes oder das Thiol eines Cysteinrestes am aktiven Zentrum verwenden, um die Peptidbindung des Substrates zu spalten. Diese Enzyme prozessieren Nicht-Peptidbindungen und entsprechendermaßen wurden chromogene Assays erfunden. Entsprechendermaßen ermöglichte diese Substratflexibilitat die Entwicklung einer Mannigfaltigkeit von Mechanismus-basierenden Inhibitoren.
  • Die verbleibenden zwei Klassen verwenden ein aktiviertes Wassermolekül, welches am aktiven Zentrum gebunden ist, um eine Peptidbindung zu spalten. Normalerweise werden lediglich Peptidbindungen prozessiert; als Folge davon waren chromogene Assays, die die Freisetzung eines Farbstoffes als Funktion der Enzymaktivität zur Folge haben, nicht möglich. Bei diesen beiden Klassen handelt es sich um Metalloproteasen und Asparaginproteasen. Für diese beiden Klassen sind gute Mechanismus-basierende Inhibitoren nicht bekannt, was die strengen Ansprüche an die Substraterkennung widerspiegelt.
  • Im allgemeinen kann man sich vorstellen, daß das aktive Zentrum aller Proteasen in einer Spalte liegt, die eine Anzahl von Bindungstaschen haben kann, um nicht nur die Seitenketten der Aminosäurereste aufzunehmen, welche die zu spaltende Peptidbindung umfassen, sondern auch die Seitenketten der Aminosäurereste, die vor und nach der zu spaltenden Peptidbindung liegen. Die hohe Substratspezifität spiegelt nicht nur die Bindungsansprüche in der Nachbarschaft des aktiven Zentrums wider, sondern auch diese der zusätzlichen Bindungsstellen. Stellen, die an Seitenkettenreste binden, die in Richtung des N-Terminus des Substrates liegen, sind als s&sub1;-sn fortlaufend weg vom aktiven Zentrum markiert; entsprechend sind Stellen, die Reste in Richtung des Zielterminus binden, als s1'-sn' markiert. Proteasen können entweder Exopeptidasen (spalten die erste oder letzte Peptidbindung des Substrates) oder Endopeptidasen (spalten eine Peptidbindung, welche im Substrat eingebettet ist) sein.
  • Um die Aktivität der Proteasen in Bezug auf die Substraterkennung zu modulieren, muß der Inhibitor geeignete Funktionalitäten enthalten, so daß "A" die notwendigen s1'-sn' besetzt. "Y" und "B" würden die s&sub1;-Stelle besetzen. Einige Endopeptidasen benötigen die Besetzung der s&sub2;- und s&sub3;-Stellen. In diesen Fällen muß die Struktur von "Y" Merkmale einschließen, welche diese Anforderungen an die Substraterkennungen erfüllen. Am einfachsten wird dies dadurch erreicht, daß Y eine substituierte Asparagin- oder Glutaminsäure ist.
  • Das folgende ist eine teilweise Auflistung von therapeutisch nützlichen Zielen, geordnet nach Enzymklassen.
  • Metalloproteasen
  • 1) Collagenase, Arthritis
  • 2) Elastase, Emphysem, Entzündung
  • 3) Angiotensin-umwandelndes Enzym, Bluthochdruck Asparaginproteasen
  • 1) HIV-Protease, AIDS-Proliferation
  • 2) Renin, Bluthochdruck
  • 3) Pepsin, Ulkus
  • Cysteinproteasen
  • 1) Cathepsin B, Entzündung
  • Serinproteasen
  • 1) Trypsin, Pankreatitis
  • 2) Granulocytenelastase, Entzündung
  • 3) Thrombin, Coronarinfarkt
  • Für jedes der obigen Enzyme würde das Design von Suicidinhibitoren durch bekannte Substratanforderungen und zweitens, falls verfügbar, Röntgenstrukturdaten, geleitet werden. Z.B. erkennt Renin die Sequenz HisProPheHisLeuValIleHis und spaltet die Leu-Val-Bindung. Das Ersetzen des Leu-Restes durch einen Asparaginsäurerest, in welchem die endständige Carboxylgruppe mit der Abgangsgruppe "B" verestert war, würde ein Substrat erzeugen, das als Folge des Prozessierens ein cyclisches Anhydrid erzeugen würde, das als Folge der Acylierung des Renins dieses inaktivieren könnte. Siehe Barrett & Salvesen Hrg. Proteinase Inhibitors Bd. II Elsevier, Amsterdam (1986) und Hydrolytic Enzymes Hrg. Neuberger & Brocklehurst, Elsevier, Amsterdam (1987).
  • Die Chemie für die Herstellung der neuen hier genannten Inhibitoren (Inaktivatoren) und Substrate hydrolytischer Enzyme ist dem erfahrenen organischen Chemiker generell bekannt. Wenn man z.B. eine dibasische Säure einer bevorzugten Ausführungsform verwendet, können beide Teile A und B über übliche Veresterungsreaktionen angefügt werden. Das dibasische Säurenausgangsmaterial ist dem Fachmann entweder bekannt oder kann durch Standard-dibasische Acidifizierungsverfahren hergestellt werden.
  • Unter Vorgabe der modularen Art der
  • AX -Y- -XB
  • Einheit kann die synthetische Sequenz entweder sein: 1) die Reaktion von AXH mit einer aktivierten dibasischen Säure, gefolgt von der Aktivierung und der Reaktion mit BXH, oder 2) der Synthese von
  • BX -Y-CO&sub2;H,
  • unter Verwendung des Verfahrens von Gaetjens, et al, Amer. Chem. Soc. 82, 5328 (1960), gefolgt von der Aktivierung und der Reaktion mit AYH.
  • Werden die hier genannten neuen Verbindungen aus denen ausgewählt, in denen R NH und/oder jedes X Schwefel oder NH ist, finden erneut Standard-organisch-chemische Standard-Reaktionen Anwendung. Kurz zusammengefaßt, ist R z.B. NH, kann Chlorwasserstoff durch eine Dichlormethanlösung geleitet werden, welche eine äquimolare Mischung an 4-Cyanobuttersäure und p- Nitrophenol enthält, um den Iminoether zu erzeugen. Die Behandlung dieser Verbindung mit Oxalsäuredichlorid in Dichlormethan, gefolgt von der Beseitigung des Oxalsäuredichlorides im Vakuum und dann der Zugabe des Teiles AXH und eines Äquivalentes an Base, führt zur Erzeugung der gewünschten Verbindung.
  • Wenn eines der X Schwefel oder Stickstoff ist, würde man dem Verfahren folgen, wie es unten für die X = Sauerstoff-Verbindungen beschrieben ist, mit Ausnahme des Austausches von AOH gegen ASH oder ANH&sub2; oder BOH gegen BSH oder BNH&sub2;.
  • Nachdem das spezielle Modellsystem, welches in der vorliegenden Forschung zur Bereitstellung der hier genannten generischen Klasse von Inhibitoren hydrolytischer Enzyme beschrieben wurde, und nachdem die Methodik zur Herstellung derartiger Inhibitoren, welche auf üblichen gut bekannten organisch-chemischen Reaktionen basiert, bereitgestellt wurde, und nachdem ein Assaysystem erläutert wurde, wobei dieses Modellsystem im Falle der Phospholipase A&sub2; verwendet werden kann, und nachdem Informationen geliefert wurden, die für die Herstellung eines pharmazeutisch annehmbaren Präparats derartiger Verbindungen zur Verwendung in der Behandlung von in Verbindung stehenden Krankheitszuständen oder Leiden nützlich sind, ist die vorliegende Offenbarung ausreichend, um jemanden dazu zu befähigen, andere hier genannte Inhibitoren (Inaktivatoren) und Substrate herzustellen und Assays, Behandlungsmethoden und Kits usw. für ihre Anwendung in einer äquivalenten pharmazeutisch basierenden Behandlung zu ersinnen. Daher werden Forscher, die die vorhandene Literatur und Techniken und das vorliegende Konzept verwenden, gut wissen, wie Inhibitoren (Inaktivatoren) und Substrate gemäß der vorliegenden Erfindung für spezifische hydrolytische Enzyme, die entweder bekannt sind oder noch zu entdecken sind, hergestellt und designt werden. Somit würde man 1) die strukturellen Merkmale des natürlichen Substrates variieren, um die Grundanforderungen zu bestimmen, 2) eine Verbindung synthetisieren, welche diese Merkmale enthält (verkörpert in Teil A), 3) A und Y (die Brücke) kovalent verbinden, und 4) B an die basische Einheit AY anheften.
    • 1. Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • Figur 1 ist eine schematische Darstellung des Mechanismus, durch welchen eine Anzahl der hier genannten neuen Inhibitoren (Inaktivatoren) hydrolytischer Enzyme in Bezug auf ihre Reaktivität mit einem hydrolytischen Enzym wirken. Im Detail sind fünf (5) derartige neue Verbindungen (1a-1e) dargestellt, die vermittelt über die Glyceringrundgerüst-basierende Seitenkette (Teil A, wie oben definiert) für Phospholipase-hydrolytische Enzyme, wie in Abbildung 1 als PLA&sub2; dargestellt, spezifisch sind. Der erste Schritt der dargestellten Reaktion zeigt die Spaltung der Teil A Glycerin-basierenden enzymspezifischen Seitenkette durch PLA&sub2; mit dem Ergebnis, daß sie abgespalten wird und ein Carboxylatanion zurückläßt, welches am anderen Ende der Brücke die p-Nitrophenol-chromophore Gruppierung enthält. Als Folge eines nachfolgenden nicht-enzymatisch katalysierten intramolekularen Ringschlusses wird diese chromophore Gruppierung zum Nachweis und zur Messung abgespalten und läßt eine cyclisierte Verbindung zurück, welche dazu dient, über eine nucleophile Reaktion PLA&sub2; zu acylieren, um eine Art von PLA&sub2; zu erzeugen, die durch kovalente Bindungsreaktion inaktiviert ist.
  • Figur 2 zeigt eine graphische Darstellung der spezifischen Aktivität der Phospholipase A&sub2;, welche aus Kobragift (Naja naja naja) erhalten wurde, als Funktion der Konzentration der Verbindung 1a (siehe Figur 1) in gemischten Micellen, die Triton X-100 und Phospholipid im Verhältnis von 3,2:1 enthalten, bei einer Temperatur von 40ºC.
  • Figur 3 zeigt die Geschwindigkeit der Hydrolyse (Δ0.D.λ400 in 20 s) von 0,4 mM Verbindung 1a in 1,8:1 Triton:Phospholipid-gemischten Micellen bei 40ºC als Funktion der Menge an PLA&sub2; (siehe Figur 1).
  • Figur 4 zeigt die Zeitverläufe für die Inaktivierung von Phospholipase A&sub2;, welche aus Kobragift erhalten wurde, durch die Vorinkubation der Verbindungen 1a bis 1e (siehe Figur 1).
  • Figur 5 zeigt den Effekt der Inhibitorkonzentration auf die Phospholipase-A&sub2;-Aktivität für die Verbindung 1d (siehe Figur 1).
  • Figur 6 stellt mögliche Brückenteile (Y) dar, die hierin verwendet werden können.
  • Figur 7 zeigt mögliche A-Teile (Part A) und B-Teile (Part B), die hierbei verwendet werden können.
    • 2. Definitionen
  • Mit den Begriffen, die sich auf den Linker (bzw. die Brücke) beziehen, der oben als Y in den obigen Formeln dargestellt wurde, ist ein Teil gemeint, der zwei Funktionen erfüllt: Er besitzt an beiden Enden geeignete Funktionalitäten, so daß er zur Bindung mit den Teilen A und B in der Lage ist. In weiteren bevorzugten Ausführungsformen erfolgen diese Bindung über eine Carboxylatfunktionalität. Die zweite Anforderung ist, daß er strukturelle Merkmale enthält, die als Folge der enzymatischen Spaltung der Seitengruppierung A und dem gleichzeitigen Abgang von B die Bildung einer cyclischen Verbindung favorisieren würde. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform würde die Brücke wenigstens zwei oder drei Kohlenstoffatome enthalten, gesättigt oder ungesättigt, substituiert oder nicht-substituiert. Die Brücke kann Teil eines aromatischen Systemes sein, wie es durch eine Phenyloder Naphthalingruppierung dargestellt ist. Die einzigen vorhersehbaren Einschränkungen sind die, daß der Linker als Folge der Spaltung der Seitengruppierungen A und B in in situ-chemischer Nähe zum Zielenzym intramolekular binden würde, so daß sich eine cyclische Verbindung bildet. Im Falle der bevorzugten Ausführungsform wäre die endgültige cyclische Verbindung ein Anhydrid (siehe z.B. Figur 1).
  • Mit dem Begriff, welcher sich auf einen Teil bezieht, der in der Lage ist, an eine aktives Stelle zu binden, ist ein aktives-Zentrum-spezifischer Teil gemeint, der durch ein spezielles hydrolytisches Enzym erkannt werden kann. Im Falle von Lipasen könnte ein solcher Teil ein Glyceringrundgerüst enthalten, in dem eines der Sauerstoffatome mit der Brücke verbunden ist und die anderen beiden Sauerstoffe mit einer gesättigten oder ungesättigten Acyl- oder Alkylkette verbunden wären, welche für das fragliche Enzym geeignet sind. Im Falle der Phospholipase-hydrolytischen Enzyme würde eines der beiden anderen Sauerstoffatome mit einem Phosphodiester verbunden werden, welcher eine polare Gruppe, z.B. Cholin, Ethanolamin, Serin, Inosit, Glycerin, Methyl, usw. hat.
  • Im Falle der Begriffe, die sich auf den spaltbaren Teil B beziehen, der bestimmt und gemessen werden kann, bestehen zwei Anforderungen: 1) daß er spezifisch spaltbar ist, wie z.B. in Figur 1 gezeigt, und 2) daß, um ein Medikament zu sein, die Reaktion im Vergleich zur Diffusion schnell sein muß; für einen Assay, daß er meßbar und bestimmbar ist.
  • Mit dem Begriff "modulieren" in Bezug auf verschiedene Krankheitszustände oder Leiden, ist die Beeinflussung der hydrolytischen Enzymaktivität gemeint, wenn eine solche Aktivität beim Ausbruch oder bei der Aufrechterhaltung oder der Neigung für einen gegebenen Krankheitszustand oder Leidenssymptome beteiligt ist. Im Falle von bevorzugten Ausführungsformen können verschiedene inflammatorische Leiden gemildert werden, durch die Verwendung eines Phospholipase-A&sub2;-Inhibitors gemäß der vorliegenden Erfindung, so daß die Wirkung des genannten Enzymes in Bezug auf die Bildung von Produkten oder Coprodukten entweder selber oder nach weiteren Reaktionen Entzündungszustände hervorzurufen, vermindert oder begrenzt wird.
  • Mit Begriffen, die sich auf den Nachweis und die Messung der hydrolytischen Enzymaktivität über eine geeignete Gruppierung beziehen, ist jede Gruppierung gemeint, die spaltbar und nachweisbar und meßbar ist, wie z.B. das oben gezeigte p-Nitrophenol. Im allgemeinen würde man Spektrophotometer verwenden. Jedoch können in bestimmten Anwendungen andere Nachweisverfahren, wie z.B. Fluorometer oder Scintillationszähler, vorteilhaft sein.
  • Mit "Niedrigalkyl" oder "Alkyl" sind alle Isomere gemeint, die 1 bis 4 Kohlenstoffatome enthalten.
    • 3. Beispiele Herstellung von Modell-Phospholipase-A&sub2;-spezifischen Inhibitoren und Substraten
  • Die Verbindung 1a (siehe Figur 1) wurde durch Acylierung kommerziell erhältlichen 1-Decanoyl-2-lysophosphatidylcholins mit einem Überschuß an Glutarsäureanhydrid und Triethylamin in Dichlormethan bei 40ºC hergestellt. Nach der Reinigung auf einem Silicagel unter Verwendung von Essigsäure:Wasser:Methylalkohol:Trichlormethan im Verhältnis 1:4:30:65 wurde das Halbsäureprodukt in die Verbindung 1a umgewandelt durch sequentielle Behandlung in Methylenchlorid bei 20ºC mit 1) einem Überschuß an Oxalsäuredichlorid, 2) Entfernung flüchtiger Verbindungen im Vakuum in Methylenchlorid und 3) einem Überschuß an p-Nitrophenol/Triethylamin. Die Verbindung 1a wurde durch zwei selektive Fällungen, die durch die 50-fache Verdünnung einer konzentrierten Methylenchloridlösung mit Diethylether induziert wurde, gereinigt. Um die letzten Spuren an p-Nitrophenol zu beseitigen, wurde ein Äquivalent an Triethylamin zu der Methylenchloridlösung zugegeben, um die Wasserstoffbindung des Phenoles an das Phospholipid zu zerstören. Die Hydrolyse der Verbindung 1a scheint auf Silicagel, Florisil und Aluminium katalysiert zu werden. Die präparative HPLC unter Verwendung einer C&sub1;&sub8;-Säule mit Methanol als Elutionsmittel ergab 1a frei von Spurenverunreinigungen. Das NMR und die Hochauflösungs-Spektren waren strukturell in Übereinstimmung mit Verbindung 1a.
  • ¹H-NMR (CDCl&sub3;), δ 0,86 (t, 3H), 1,29 (S, 12H), 1,6 (n, 2H), 2,05 (t, 2H), 2,28 (m, 2H), 2,5 (m, 2H), 2,7 (m, 2H), 3,35 (s, 9H), 3,72 (m, 2H), 3,95 (m, 2H), 4,15 (m, 1H), 4,3 (m, 2H), 4,4 (m, 1H), 5,2 (m, 1H), 7,3 (ABq, 2H), 8,25 (ABq, 2H), MS (FAB) m/e 647; exakte Masse berechnet für C&sub2;&sub9;H&sub4;&sub8;N&sub2;O&sub1;&sub2;P 647,2945; gefunden 647,2952
  • Für Teil-A-Gruppierungen, welche Peptidfunktionalitäten enthalten, würden mildere Kondensationsbedingungen angewendet werden.
  • Verbindungen 1b bis 1e (siehe Figur 1 und die obige Beschreibung) wurden unter Verwendung des gleichen Verfahrens, welches oben für die Herstellung der Verbindung 1a beschrieben wurde, hergestellt. Im Gegensatz zu Verbindung 1a konnten diese Ester auf Silicagel unter Verwendung von Trichlormethan/Methylalkohol im Verhältnis 2:1 als Elutionsmittel chromatographisch getrennt werden. Spurenverunreinigungen konnten durch HPLC unter identischen Bedingungen, wie für 1a angewandt, entfernt werden. Die NMR und Hochauflösungs-Massenspektren waren in Übereinstimmung mit allen vier Strukturen:
  • 1b: ¹H NMR (CDCl&sub3;) δ 0,9 (t, 3H), 1,3 (S, 12H), 1,4 (S, 6H), 1,6 (m, 2H), 2,05 (t, 2H), 2,25 (t, 2H), 2,45 (t, 2H), 3,3 (S, 9H), 3,7 (m, 2H), 4,0 (m, 2H), 4,15 (m, 1H), 4,3 (m, 2H), 4,4 (m, 1H), 5,2 (m, 2H), 7,3 (ABq, 2H), 8,25 (ABq, 2H)
  • MS (FAB) m/e 675; exakte Masse berechnet für C&sub3;&sub1;H&sub5;&sub2;N&sub2;O&sub1;&sub2;P 675,3258; gefunden 675,3267
  • 1c: ¹H-NMR (CDCl&sub3;) δ 0,9 (t, 3H), 1,25 (S, 6H), 1,3 (S, 12H), 1,6 (m, 2H), 2,25 (t, 2H), 2,55 (S, 2H), 2,75 (S, 2H), 3,4 (S, 9H), 3,75 (m, 2H), 4,0 (m, 2H), 4,15 (m, 1H), 4,3 (m, 2H), 4,4 (m, 1H), 5,25 (m, 1H), 7,3 (ABq, 2H), 8,3 (ABq, 2H)
  • MS (FAB) m/e 675; exakte Masse berechnet für C&sub3;&sub1;H&sub5;&sub2;N&sub2;O&sub1;&sub2;P 675,3258; gefunden 675,3245
  • 1d: ¹H-NMR (CDCl&sub3;) δ 0,9 (t, 3H), 1,3 (S, 12H), 1,6 (m, 2H), 2,25 (t, 2H), 2,75 (t, 2H), 2,9 (t, 2H), 3,3 (S, 9H), 3,75 (m, 2H), 4,0 (m, 2H), 4,15 (m, 1H), 4,3 (m, 2H), 4,4 (m, 1H), 5,25 (m, 1H), 7,3 (ABq, 2H), 8,3 (ABq, 2H)
  • MS (FAB) m/e 633; exakte Masse berechnet für C&sub2;&sub8;H&sub4;&sub6;N&sub2;O&sub1;&sub2;P 633,2788; gefunden 633,2800
  • 1e: ¹H-NMR (CDCl&sub3;) δ 0,9 (t, 3H), 1,3 (S, 12H), 1,42 (S, 3H), 1,45 (S, 3H), 1,6 (m, 2H), 2,25 (t, 2H), 2,8 (S, 2H), 3,3 (S, 9H), 3,75 (m, 2H), 4,0 (m, 2H), 4,15 (m, 1H), 4,35 (m, 2H), 4,4 (m, 1H), 5,25 (m, 2H), 7,3 (ABq, 2H), 8,3 (ABq, 2H)
  • MS (FAB) m/e 661; exakte Masse berechnet für C&sub3;&sub0;N&sub5;&sub0;N&sub2;O&sub1;&sub2;P 661,3101; gefunden 661,3079
    • Assays
  • Alle Assays mit der Verbindung 1a wurden in 0,4 ml Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8, 10 mM CaCl&sub2; und 100 mM KCl) gemessen.
  • Figur 2 zeigt eine graphische Darstellung der spezifischen Aktivität für 20 ng Phospholipase A&sub2;, welche aus Kobragift (Naja naja naja) erhalten wurde, als eine Funktion der Konzentration der Verbindung 1a in gemischten Micellen, die Triton X-100 und Phospholipid in einem Verhältnis von 3,2:1 enthalten, bei 40ºC. Siehe Dennis, J. Lipid Research 14, 152 (1973) und Deems und Dennis, Methods in Enzymology 71, 703 (1981). In gemischten Micellen, die Triton und Phospholipid im Verhältnis 4:1 enthalten, waren die relativen V's für die Verbindung 1a und 1,2-Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC) unter Verwendung eines titrimetrischen Assays bei einer Substratkonzentration von 5 mM 1:3. Der p-Nitrophenolesterteil fördert eine gesteigerte Bindung an hydrophobe Reste in der Nähe des aktiven Zentrums der PLA&sub2;, was dazu führt, daß im Vergleich zu DPPC für die Verbindung 1a eine niedrigere Konzentration an Substrat benötigt wird, um eine Halbsättigung zu erreichen.
  • Figur 3 zeigt eine graphische Darstellung der Anfangsgeschwindigkeiten (ausgedrückt als ΔO.D. bei λ400 nm während 20 s), die mit Phospholipase A&sub2; (spezifische Aktivität 1470 Mmol min&supmin;¹ mg&supmin;¹) beobachtet wurden. Die graphische Darstellung war mit Proteinkonzentrationen von 0,5 ng bis 100 ng unter Verwendung gemischter Micellen (Triton/Phospholipid = 1,8:1), welche 0,4 mM Verbindung 1a enthielten, bei 40ºC linear.
  • Die Reaktionsgeschwindigkeit der Hydrolyse ist eine Funktion des Anteils der molaren Fraktion des Substrates in den Triton/Phospholipid-gemischten Micellen; die Geschwindigkeit verringert sich 3-fach, wenn das Oberflächenverhältnis von 1,6:1 auf 3:1 auf 4,5:1 auf 7:1 steigt. Unilamellare Vesikel (SUVs), welche durch Beschallung der Verbindung 1a, gefolgt von einer Zentrifugation, hergestellt wurden, wurden durch Phospholipase A&sub2; schnell hydrolysiert. Für eine 400 µM SUV-Lösung war V gleich 265 µmol/min/mg im Vergleich zu 550, gemessen für 400 µM der Verbindung 1a in 3,2:1 Triton-gemischten Micellen.
  • Die Zeitverläufe für die Inaktivierung der Phospholipase A&sub2;, erhalten aus Kobragift durch Vorinkubation der Verbindungen 1a (offene Dreiecke), 1b (gefüllte Kreise), 1c (offene Vierecke), 1d (geschlossene Dreiecke) und 1e (offene Kreise) sind in Figur 4 gezeigt. Die Bedingungen waren 1) Präinkubation einer 260:1-Mischung an Inhibitor 1 mit PLA&sub2; in 1 ml einer Lösung, welche 5 µg/ml PLA&sub2;, 100 µM Vesikel der Verbindung 1a-1e, 20 mM Tris- HCl, pH 8, 10 mM CaCl&sub2; und 0,1 M KCl enthält, bei 20ºC, 2) titrimetrische Messung der Hydrolysegeschwindigkeit, initiiert durch die Zugabe eines 20 µl Aliquotes der obigen Lösung zu 1,7 ml an 40ºC Assaymedium, welches 5 mM 1,2- Dipalmitoylphosphatidylcholin, 10 mM CaCl&sub2; und 20 mM Triton X-100 enthält. Tabelle 1 EFFIZIENZ DER HYDROLYSE UND INHIBITION
  • a Teilungsverhältnis (P), ausgedrückt als Mole freigesetzten Farbstoffs/Mol inaktiviertes Enzym
  • Die Tabelle 1 enthält die Anfangs-Geschwindigkeitskonstanten für die Freisetzung von p-Nitrophenol (ArOH) aus den Substraten 1a-1e während der ersten 5% der Hydrolyse. Tabelle 1 enthält außerdem die Cyclisierungsgeschwindigkeiten für die fünf freigesetzten Fragmente 2a-2e. Es ist offensichtlich, daß Succinatderivate schlechtere Substrate sind als ihre Glutaratentsprechungen, entweder aufgrund des induktiven Effektes des Esters, welcher näher an der stereospezifischen, mit Nummer 2 bezifferten Esterbindung ist, oder aufgrund von sterischen Effekten des Carbonylsauerstoffs, dort wo die γ-Position einer Fettsäure wäre. Germinale Methyle, entweder in der β- oder γ-Position, verzögern die Hydrolysegeschwindigkeit; der Effekt ist für die β-Position jedoch 50-fach größer.
  • Die Effizienz der enzymatischen Deaktivierung kann als die Teilungsrate (P), wie in Tabelle 1 gezeigt, ausgedrückt werden. Nach dieser Analyse sind die Dimethylglutarate 1b und 1c und Dimethylsuccinate 1e effizientere Suicidinhibitoren. Wahrscheinlich fördern germinale Methylgruppen die Bindung von 2 an das Enzym effizienter. Im Durchschnitt prozessiert das Enzym 10-20 Substrate, bevor es deaktiviert wird. Inhibitor 1d ist weniger effizient, wird aber schneller prozessiert. Das Ausmaß der Inhibition ist eine Funktion der Vorinkubationsbedingungen, d.h. der Temperatur und des physikalischen Status des Substrates (Micellen im Vergleich zu Vesikeln). Bedingungen, welche die Assoziation des Abgangsfragmentes mit PLA&sub2; fördern, verringern P. Für 100 µM 1d in 8,2:1 Triton/Phospholipid-gemischten Micellen stieg P auf &supmin;250 von &supmin;35 für Vesikel, was die größere Neigung von 2d vom Enzym weggezogen zu werden, widerspiegelt. Die Erhöhung der Temperatur von 20ºC auf 40ºC während der Präinkubation von PLA&sub2; mit 1b oder 1d hatte auf den Zeitverlauf wenig Auswirkung, erhöhte aber P. Wahrscheinlich fördern Micellen und höhere Temperaturen die Abdiffusion des Hydrolyseproduktes 2 vom Enzym, was zur Folge hat, daß das cyclische Anhydrid in der Hauptlösung erzeugt wird und mit H&sub2;O reagiert. Die Gesamtrate der Inaktivierung ist nicht nur eine Widerspiegelung der Geschwindigkeit der intramolekularen Cyclisierung und Empfindlichkeit gegenüber der enzymatischen Hydrolyse, sondern auch der Diffusionsgeschwindigkeit von 2 vom Enzym.
  • Der Einfluß der Inhibitorkonzentration ist in Figur 5 für 1d gezeigt. Die Inhibition einer 70 nM Lösung an PLA&sub2; ist relativ schnell, sogar bei 20 mM (gefüllte Vierecke), 5 mM (gefüllte Dreiecke), und 1,7 µM (gefüllte Kreise). Bei 1d-Konzentrationen von 0,5 µM (offene Kreise) oder weniger wurde 1d verbraucht, bevor PLA&sub2; inaktiviert wurde. Unter der Voraussetzung, daß das Verhältnis von Inhibitor zu PLA&sub2; 40 übersteigt, kann die Inhibition sogar bei niedrigen Konzentrationen beobachtet werden, was darauf hinweist, daß K für diese Inhibitoren sehr niedrig ist. Im Gegensatz dazu inhibieren 8,2:1 Triton/Phospholipid-gemischte Micellen von 1d nicht unterhalb 20 µM. Die Erniedrigung der Oberflächenkonzentration des Inhibitors erniedrigt die Geschwindigkeit der Inhibition.
  • Der Leser wird außerdem auf die vorhandene Literatur hingewiesen, welche relevante Einzelheiten zu Verfügung stellt, z.B. in Bezug auf spezifische alternative Assays zur Messung der Aktivität und in Bezug auf das Ersinnen pharmazeutisch annehmbarer Präparate und Methoden für die effiziente Behandlung von Krankheitszuständen, wobei hierin das Wesen der vorliegenden Erfindung bereitgestellt wurde, um grundlegend bei derartigen klinischen Anstrengungen beizutragen. Siehe z.B. die U.S. Patente 4 826 958, 4 833 152, 4 616 089, 4 788 304, 4 447 445, und WO 86/06100 (23. Oktober 1986).
  • Die vorangegangene Beschreibung beschreibt in Einzelheiten spezifische Methoden, welche angewandt werden können, um die vorliegende Erfindung auszuführen. Dadurch, daß spezifische Methoden ausführlich beschrieben wurden, welche initial dazu verwendet wurden, um die hier genannten Inhibitoren (Inaktivatoren) und Substrate zu charakterisieren, herzustellen und zu verwenden, und durch eine weitere Offenbarung, betreffend spezifische Modellsysteme, wird der Fachmann gut genug wissen, wie alternative verläßliche Methoden ersonnen werden, um zu der gleichen Information zu kommen und um diese Information auf andere hydrolytische Enzymsysteme auszuweiten.
    • Beschreibung für den folgenden Vertragsstaat: DK Technisches Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung verwendet in all ihren Formen als eine fundamentale Aussage eine neue Klasse von Inhibitoren (Inaktivatoren) hydrolytischer Enzyme und Enzymsubstrate für Essays. Diese Inhibitoren und Substrate wirken als die Gesamtheit von drei Teilen. Ein Teil kann von dem aktiven Zentrum (den aktiven Zentren) eines gegebenen hydrolytischen Enzymes erkannt werden, so daß das Enzym, wenn es in Kontakt mit dem Inhibitor gebracht wird, hydrolytisch mit begleitender Beseitigung dieses Teiles wirkt. Ein zweiter Teil, ist ein abspaltbarer Teil, wie z.B. ein Markerchromophor, der bestimmt und gemessen werden kann, und der dritte Teil ist ein verbleibender Teil, welcher den ersten und zweiten Teil miteinander verbindet, und der nach der Beseitigung des ersten und zweiten Teiles eine cyclische Konfiguration annimmt, die im Falle der Inhibitoren seine weitere Reaktion mit dem Enzym zur Folge hat, wodurch das Enzym durch die Ausbildung kovalenter Bindungen an dem aktiven Zentrum (den aktiven Zentren) irreversibel inaktiviert wird. Die neuen Inhibitoren und Substrate hydrolytischer Enzyme gemäß der vorliegenden Erfindung schaffen daher Wege, um die Aktivität hydrolytischer Enzyme zu bestimmen und Wege zur Modulation der Aktivität hydrolytischer Enzyme bei der Kontrolle oder Behandlung von verschiedenen Krankheitszuständen oder Leiden, bei denen eine solche Aktivität hydrolytischer Enzyme beteiligt ist.
    • Hintergrund der Erfindung
  • In einem Sonderbericht, welcher in Chemical and Engineering News 61, 48 (1983), publiziert wurde, diskutiert Abeles allgemein eine Klasse von Enzyminaktivatoren, die als "Suicidenzyminaktivatoren" oder "Mechanismus-basierende Inaktivatoren" bezeichnet werden. Diese Inaktivatoren, ob Naturstoffe oder künstliche Produkte, haben eine Konfiguration, die dem natürlichen Substrat eines natürlichen Enzymes ähnelt und deshalb von dem aktiven Zentrum des Enzymes erkannt wird. Wenn das Enzym mit dieser erkennbaren Konfiguration reagiert, wird der Inaktivator chemisch modifiziert, und dadurch in eine Verbindung umgewandelt, die mit dem Enzym reagiert und zu einer folgenden Enzyminaktivierung führt, die in der Regel ihrer Natur nach irreversibel ist. Durch die Reaktion mit dem Suicidsubstrat (Inaktivator) führt das Enzym seine eigene Zerstörung herbei. Der Autor postuliert, daß die Entwicklung von Inhibitoren oder Inaktivatoren spezifischer Enzyme dadurch nützlich sein kann, daß sie eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von Medikamenten, die mit der normalen Enzymaktivität interferieren können, spielt. Wo solche Enzyme als bei Krankheitszuständen beteiligt identifiziert wurden, wäre die Verwendung von solchen Inhibitoren oder Inaktivatoren nützlich, um die Enzymaktivität in der Behandlung oder Prävention des gegebenen Krankheitszustandes, in dem das Enzym beteiligt ist, zu modulieren.
  • Forschungsanstrengungen haben sich auf die Wirkung oder den Mechanismus von Phospholipasen, wie z.B. der Phospholipase A&sub2;, welche in der Regulation von vielen wichtigen zellulären Funktionen beteiligt ist, konzentriert. Siehe Lapetina, Kapitel 21 "Phospholipase", Annual Reports in Medicinal Chemistry 19, 213 Academic Press Inc. (1984).
  • Begleitende Forschungsziele zur Inaktivierung oder Inhibition der Phospholipase-Enzymaktivität können unter anderem Chang et al., Biochemical Pharmacology 36, 2429 (1987) entnommen werden. Siehe ebenso Dennis Biotechnology 5, 1294 (1987). Diese Kommentare stellen eine Übersicht der Struktur und Biochemie bestimmter Phospholipasen zur Verfügung und führen den Leser zu anderen Artikeln, in denen eine ausführlichere Behandlung dieser Klasse hydrolytischer Enzyme gefunden werden kann. Die Autoren schlagen vor, daß die Phospholipase-Aktivierung einen Geschwindigkeits-bestimmenden Schritt in dem gesamten Prozess der Lipidmediatorsynthese darstellt, von der man gefunden hat, daß sie beim Vorhandensein von verschiedenen Krankheitszuständen oder Leiden beteiligt ist. Insbesondere nimmt man an, daß die Phospholipase A&sub2; (PLA&sub2;) das Enzym ist, welches für die Freisetzung freier Arachidonsäure, von der man glaubt, daß sie in der Kontrolle der Biosynthese von Prostaglandin, Leukotrien und verwandter Eicosanoide bei Entzündungen und sonstigen Krankheitszuständen beteiligt ist, aus den Membranphospholipiden verantwortlich ist.
  • Sie fügen hinzu, daß die Inhibition der PLA&sub2;-Aktivität einen attraktiven therapeutischen Ansatz für das Design von neuen Medikamenten für die Behandlung von solchen Entzündungen und anderen Gewebeverletzungen darstellen könne. Die Autoren stellen für eine große Anzahl von Phospholipase- A&sub2;-Enzymen die Quellen und Strukturreferenzen zu Verfügung und diskutieren den Mechanismus der Aktivierung dieser Enzyme. Schließlich stellen sie eine Analyse der Konsequenz solcher Enzymaktivitäten zur Verfügung und liefern daher eine Basis für ein Ziel für Drugdesign-Forschern, nämlich die Herstellung neuer Klassen von Medikamenten-Entitäten, die bei der Behandlung oder Kontrolle von verschiedenen Krankheitszuständen oder Leiden durch Einflußnahme auf die Ebene der Phospholipase oder anderer hydrolytischer Enzymaktivitäten nützlich sein können.
  • Somit vermittelt offensichtlich PLA&sub2;, nachdem es aktiviert wurde, eine Verschiedenheit von pathophysiologischen Reaktionen wahrscheinlich durch seine Produkte, nämlich Lysophospholipide und Arachidonsäure, und mehrere starke biologisch aktive Substanzen, wie z.B. Prostaglandine, Leukotriene, usw. Wenn das Phospholipidsubstrat einen Alkylether oder eine plasmalogene Funktion enthält, schließen die Produkte der PLA&sub2;-Wirkung außerdem lysoPAF (PAF = Blutplättchen-aktivierende Faktoren) oder Analoga ein, die, wenn sie acetyliert werden, PAF und Analoga produzieren, die ebenfalls starke biologisch aktive Substanzen sind. Man nimmt an, daß diese Produkte oder Coprodukte der PLA&sub2;-Aktivierung zytotoxische Substanzen sind und an verschiedenen entzündlichen und allergischen Leiden des Menschen beteiligt sind. Diese und andere Daten lassen vermuten, daß PLA&sub2; sehr wahrscheinlich bei Entzündungen und Gewebsverletzungen, die mit verschiedenen Krankheiten assoziiert sind, beteiligt ist.
  • Erhöhte PLA&sub2;-Spiegel wurden außerdem bei rheumatoiden arthritischen Leiden, Psoriasis, pankreatischem und septischem Schock gefunden. Man nimmt ebenso an, daß bei myocardialer Ischämie eine PLA&sub2;-Aktivierung beteiligt ist. PLA&sub2; könnte außerdem in der Lungenpathophysiologie, insbesondere bei Asthma, in kritischer Weise beteiligt sein.
  • All diese Daten weisen darauf hin, daß eine Inhibition oder Inaktivierung von PLA&sub2; ein vielversprechender Ein-Schritt-Ansatz sein könnte, um mit der Bildung der Produkte und Coprodukte einer solchen Aktivierung zu interferieren, die bei verschiedenen Krankheitszuständen beteiligt sind, so daß dies zu der möglichen Milderung des Krankheitsprozesses führt.
  • Eine ziemlich detaillierte Charakterisierung von Phospholipase- Enzymen wird auch von Dennis, The Enzymes XVI, 307, Academic Press Inc. (1983), geliefert. Dieser Artikel liefert Charakterisierungsdaten für und Reinigung von mehreren Phospholipasen, die Kinetik und Reaktionen, von denen man glaubt, daß diese Phospholipasen verantwortlich sind, die biologischen Wirkungen und die Identifikation von Sequenzen und konformationeller Struktur, die auf eine aktive Stelle (aktive Stellen) hinweist.
  • Phospholipase-A&sub2;-Inhibition und Modifikation bei Manoalid war Gegenstand der U.S. Patente 4 447 445 und 4 616 089. Manoalid ist ein mariner Naturstoff, welcher aus Schwämmen isoliert wird, und von welchem man zeigte, daß er anti-entzündliche Aktivität in vivo hat. Die Erforschung dieses Naturstoffs ergab, daß er auf der Ebene der Phospholipase A&sub2; wirkt, und es wurde gezeigt, daß er ein Inhibitor sowohl der Kobra- als auch der Bienengiftphospholipase A&sub2; (PLA&sub2;) ist. Siehe Lombardo et al., J. Biol. Chem. 260, 7234 (1985) und Deems et al. Biochem. Biophys. Acta, 917, 258 (1987). Die von diesem weiterführende Forschung über synthetische Analoga ist in Reynolds et al., J. Am. Chem. Soc. 110, 5172 (1988) beschrieben. Diese Studien zeigen, daß Manoalid eine zeitabhängige irreversible Inaktivierung von PLA&sub2; verursacht, wie durch die Modifikation von Lysinresten gezeigt wurde. Ein die Verwendung von Manoalid begleitender Nachteil ist seine nicht-spezifische Reaktivität mit einer Vielzahl von Proteinen.
  • Ermutigt durch dieses Ziel, endogene Substrate zu produzieren, die die hydrolytische Enzymaktivität, wie z.B. der Phospholipase, modulieren könnten, ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, Substanzen zu produzieren, die mit Krankheitszuständen oder Leiden über molekulare Interaktion von spezifischen hydrolytischen Enzymaktivitäten über Suicidinaktivierung oder die Inhibitor-mechanistische Ebene interferieren können. Basierend auf derartiger Forschung und Untersuchung unter Verwendung von Phospholipase A&sub2; als Modell konzentriert sich die vorliegende Forschung auf das Design von neuen Inhibitoren (Inaktivatoren) hydrolytischer Enzyme, die über die Erkennung durch das aktive Zentrum eines solchen Enzymes wirken und in der Inhibition der Enzymfunktionalität resultieren. Daher führen die genannten Inhibitoren zu einem funktionalen Suicid der enzymatischen Aktivität.
    • Zusammenfassung der Erfindung
  • In ihren verschiedenen Aspekten zusammengenommen, beruht die vorliegende Erfindung auf einer fundamentalen Aussage, welche auf einer neuen Klasse von Inhibitoren (Inaktivatoren) und Substraten hydrolytischer Enzyme beruht. Diese neuen Verbindungen wirken nach Erkennung als Substrat und Prozessierung durch ein spezifisches hydrolytisches Enzym durch irreversible Inaktivierung des genannten Enzymes. Gleichzeitig wird ein Nebenprodukt dieser Reaktion in Form eines nachweisbaren und meßbaren Teiles gebildet, der als Mittel verwendet werden kann, um das Maß der hydrolytischen Enzymaktivität in einer Probe zu messen. Dies ist die Grundlage für einen Test zur Messung der hydrolytischen Enzymaktivität. Wenn sie auf diese Weise verwendet werden, sind die inhibitorischen Eigenschaften der Verbindungen auf das Mindestmaß herabgesetzt. Durch die hierin genannten neuen Verbindungen ist ebenso ein Weg für die Behandlung von verschiedenen Krankheitszuständen oder Leiden durch die Modulation der hydrolytischen Enzymaktivität, welche im speziellen Krankheitszustand oder Leiden, welches behandelt werden soll, beteiligt ist, bereitgestellt. Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin zugehörige Wege und zu dem Assay gehörige Kits und Behandlungsmethoden, welche oben definiert wurden.
  • Unter einem ersten Gesichtspunkt ist die Erfindung auf neue Inhibitoren (Inaktivatoren) und Substrate hydrolytischer Enzyme gerichtet, die durch die folgende allgemeine Formel (I) dargestellt werden:
  • worin R Sauerstoff oder Imino bedeutet,
  • jedes X unabhängig Sauerstoff, Schwefel oder Imino bedeutet,
  • A eine Einheit ist, die von einem Phospholipase-A&sub2;-Enzym so erkannt wird, daß das Enzym die Bindung, die AX mit C(O)Y verknüpft, hydrolysiert,
  • B Komponente einer spaltbaren Einheit BX ist, und
  • Y ein Alkylen oder Alkenylen oder Alkylen oder Alkenylen, das mit einer oder mehreren Niedrigalkylgruppe(n), umfassend 1 bis 4 Kohlenstoffatome, substituiert ist, ist.
  • In einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung ist R Sauerstoff und jedes X ist Sauerstoff.
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist BX ein spaltbarer Teil, der gegenüber einem Nachweis empfindlich ist.
  • Entsprechend einer vorteilhaften Bereitstellung dieser Ausführungsform ist B ein Chromophor oder eine andere nachweisbare Gruppe. Vorzugsweise ist BX ausgewählt aus der Gruppe, bestehend p-Nitrophenol, Azophenolen, Azonaphtholen und Hydroxycumarinen, wie in Figur 7, Teil B, dargestellt.
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist Y entweder:
  • n-Propylen
  • 1,1-Dimethyl-n-propylen
  • 2,2-Dimethyl-n-propylen
  • Ethylen,oder
  • 1,1-Dimethylethylen.
  • In einer anderen vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung sind die neuen Inhibitoren (Inaktivatoren) und Substrate hydrolytischer Enzyme in einer pharmazeutisch annehmbaren Form.
  • In einer weiteren vorteilhaften Anwendungsform der Erfindung ist AX 1-Decanoylglycerin-3-phosphorylcholin. Die neuen Inhibitoren (Inaktivatoren) und Substrate hydrolytischer Enzyme gemäß der vorliegenden Erfindung, wie oben in Formel (I) dargestellt, können spezifischer dargestellt werden als eine bevorzugte Untergruppierung an Verbindungen der folgenden Formel (II):
  • worin jedes A und B wie oben definiert ist und C2,3 einen Linkertyp repräsentiert, der wenigstens zwei oder drei Kohlenstoffatome hat, die gesättigt oder ungesättigt, unsubstituiert oder substituiert sein können.
  • Im Hinblick auf jede Verbindungsklasse, die oben durch die Formeln (I) und (II) dargestellt ist, ist B vorzugsweise eine chromophore Gruppe, wie z.B. p-Nitrophenyl.
  • Weiterhin bevorzugt innerhalb der Klasse neuer Verbindungen, wie oben durch die Formeln (I) und (II) repräsentiert und wie oben weiterhin definiert in Bezug auf die genauere Definition der Gruppe B, ist Gruppe A vorzugsweise ausgewählt aus einer Gruppierung, die ein Glyceringrundgerüst hat, in denen ein Sauerstoffatom mit dem Linker der obigen repräsentativen Verbindungen verbunden ist; andere an das Glyceringrundgerüst gebundene Atome sind verbunden: eines, entweder Sauerstoff, Stickstoff oder Schwefel mit einer Alkyl- oder einer Fettsäurekette und eines, ein Sauerstoff über einen Phosphodiester oder eine andere geeignete Verknüpfung mit einer polaren Gruppe, z.B. Cholin. Die Fettsäurekette kann eine gesättigte oder ungesättigte Kette sein, die der Substratspezifität, falls es eine gibt, des in Frage kommenden spezifischen hydrolytischen Enzymes entsprechen wird.
  • Unter einem zweiten Gesichtspunkt beinhaltet die vorliegende Erfindung einen Assay zur Messung der spezifischen hydrolytischen Enzymaktivität in einer Probe, wie z.B. einer Probe, die einem Menschen entnommen wurde, wobei der Assay besteht aus (a) Zurverfügungstellung einer Probe, welche die mutmaßliche hydrolytische Enzymaktivität hat, (b) in Kontakt bringen der genannten Probe mit einer wie oben definierten Verbindung (in der BX ein spaltbarer Teil ist, der für einen Nachweis empfänglich ist) auf eine Art und unter Bedingungen, so daß das genannte Enzym, wenn es in der genannten Probe vorhanden ist, mit der genannten Verbindung reagiert und (c) die Messung und den Nachweis der Menge der genannten hydrolytischen Aktivität über die Abspaltung und den Nachweis und die Messung des Teils BX von der genannten Verbindung als Folge der Reaktion der genannten Verbindung mit dem genannten hydrolytischen Enzym.
  • Unter einem dritten Gesichtspunkt ist die Erfindung auf einen Kit gerichtet, welcher für die Verwendung zum Nachweis des Vorhandenseins oder der Abwesenheit eines hydrolytischen Enzymes in einer biologischen Probe gerichtet ist, wobei der genannte Kit eine wie oben definierte Verbindung (in der BX ein abspaltbarer Teil ist, der für einen Nachweis empfänglich ist) enthält.
  • Die neuen Inhibitoren (Inaktivatoren) hydrolytischer Enzyme gemäß der vorliegenden Erfindung können ebenfalls in einem Verfahren und auf eine Weise zur Behandlung eines pathologischen Krankheitszustandes oder eines Leidens, welches durch eine spezifische hydrolytische Enzymaktivität vermittelt wurde, verwendet werden, die es beinhaltet, einem Patienten, der für den genannten pathologischen Krankheitszustand oder das Leiden empfindlich ist oder diese erleidet, eine Menge des neuen oben dargestellten Inhibitors (Inaktivators) eines hydrolytischen Enzymes zu verabreichen, die ausreichend ist, die oben genannte hydrolytische Enzymaktivität irreversibel zu inaktivieren oder zu inhibieren, wobei der genannte Inhibitor (Inaktivator) eines hydrolytischen Enzymes in einer pharmazeutisch annehmbaren Form verabreicht wird.
  • Entsprechend ist unter einem vierten Gesichtspunkt die Erfindung auf die Verwendung einer Verbindung für die Herstellung eines Medikamentes für die Inhibition der Phospholipase A&sub2; gerichtet, worin die genannte Verbindung die folgende Formel (I) hat:
  • worin R Sauerstoff oder Imino bedeutet,
  • jedes X unabhängig Sauerstoff, Schwefel oder Imino bedeutet,
  • A eine Einheit ist, die von einem Phospholipase-A&sub2;-Enzym so erkannt wird, daß das Enzym die Bindung, die AX mit C(O)Y verknüpft, hydrolysiert,
  • eine Komponente einer spaltbaren Einheit BX ist,
  • Y ein Alkylen oder Alkenylen oder Alkylen oder Alkenylen, das mit einer oder mehreren Niedrigalkylgruppe(n), umfassend 1 bis 4 Kohlenstoffatome, substituiert ist, ist.
  • Bei einem bevorzugten Weg, um diese Verwendung auszuführen, ist R Sauerstoff und jedes X ist Sauerstoff.
  • Bei einem anderen vorteilhaften Weg diese Verwendung auszuführen ist Y entweder:
  • n-Propylen
  • 1,1-Dimethyl-n-propylen
  • 2,2-Dimethyl-n-propylen
  • Ethylen, oder
  • 1,1-Dimethylethylen.
  • Bei einem weiteren anderen vorteilhaften Weg, um diese Verwendung auszuführen, ist AX 1-Decanoylglycerol-3-phosphorylcholin.
  • Die wie oben definierte Erfindung schließt in ihren verschiedenen Formen alle verwandten Weisen und Methoden in Form pharmazeutischer Kits ein, die auf eine Art und Weise zusammengesetzt und nützlich sind, daß sie dem Assay und dem Aspekt der Behandlungsmethode der vorliegenden Erfindung verwandt sind.
  • Die vorliegende Erfindung ist auf die Art und Weise, von der angenommen werden kann, daß sie biologisch funktioniert, mechanistisch beschrieben. Es versteht sich jedoch von selbst, daß der Mechanismus als solcher nicht notwendigerweise in den Aufgabenbereich eingeschlossen ist, sollte er sich im Detail tatsächlich vom vorgeschlagenen Mechanismus unterscheiden.
    • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung wird mit Hilfe eines Modellsystems, in dem besondere neue Inhibitoren (Inaktivatoren) und Substrate hydrolytischer Enzyme in Verbindung mit Phospholipase A&sub2; verwendet werden, beschrieben. Der Ansatz dieser Erfindung, wie er durch das Modeilsystem beschrieben wird, kann verallgemeinert werden und wird verallgemeinert, um die Entwicklung von verschiedenen anderen spezifischen Inhibitoren und Substraten hydrolytischer Enzyme in Assays oder Behandlungsmaßnahmen für andere hydrolytische Enzyme zu erleichtern. Bei derartigen anderen hydrolytischen Enzymen sind Phospholipasen, Lipasen, Esterasen, Proteasen usw. eingeschlossen. Die therapeutischen Anwendungen für derartige Inhibitoren für diese Klasse von Enzymen erstrecken sich über Zustände von Entzündung, Bluthochdruck, Lipidmetabolismus, Fettsucht, usw. Die Assays, die auf dem Ansatz der Erfindung beruhen, sind selektiv, billig und geeignet für die wichtigen Enzyme innerhalb dieser Klassen.
  • Das wesentliche Merkmal der hier genannten neuen Verbindungen ist die Verwendung einer bifunktionellen Brücke zur Verbindung in einem Molekülganzen, welches funktionell die notwendigen strukturellen Merkmale, die für die Erkennung durch eine aktive Stelle (aktive Stellen) eines spezifischen hydrolytischen Enzyms benötigt werden und einer Abgangsgruppe, die neben der Reaktion der hier genannten neuen Verbindungen mit einem spezifischen hydrolytischen Enzym detektiert und gemessen werden kann, beinhaltet. In bevorzugten Ausführungsformen ist die Brücke eine dibasische Säure, die in der Lage ist, ein cyclisches Anhydrid zu bilden. Als Folge der enzymatischen Hydrolyse der Bindung, welche die Brücke mit dem Teil, welcher die enzymatische Spezifität trägt, verbindet, nimmt man an, daß das Carboxylatanion des resultierenden Hydrolyseproduktes als ein nucleophiler Katalysator wirkt, um die Esterbindung, welche die Abgangsgruppe und die Brücke verbindet, zu spalten, so daß ein cyclisches Anhydrid entsteht. Die Reaktivität des Anhydrides mit dem aktiven Zentrum schafft eine kovalente Bindung zwischen den beiden, wodurch die enzymatische Aktivität inaktiviert oder wenigstens inhibiert wird. Die Reaktivität des Anhydrids ist ausreichend groß, so daß, sollte es aus dem aktiven Zentrum des Enzyms diffundieren, die überwältigende Wahrscheinlichkeit ist, daß es mit Wasser reagieren würde, bevor es auf ein anderes Protein treffen würde.
  • Daher stellt man sich bei mechanistischer Betrachtung vor, daß das Carboxylatanion des entstehenden Hydrolyseproduktes, welches als Folge der enzymatischen Hydrolyse der Bindung entsteht, welche die Brücke mit der die enzymatische Spezifität tragenden Einheit verbindet, als nucleophiler Katalysator wirkt, um die Bindung, welche die Abgangsgruppe und die Brücke verbindet, zu spalten. Das Nettoergebnis ist die Erzeugung eines reaktiven cydischen Anhydrides am katalytischen Zentrum. Die Acylierung einer nucleophilen Gruppe des Enzymes durch ein Anhydrid inaktiviert das Enzym irreversibel.
  • Die Rate der Anhydridbildung kann moduliert werden durch 1) Einstellung des pka der Abgangsgruppe, und 2) Einführung eines Alkyls oder anderer Substituenten an den dazwischenliegenden Atomen der Brücke, oder 3) Inkorporation der dazwischenliegenden Atome der Brücke in eine cyclische Struktur, wie z.B. eine aromatische Gruppierung.
  • Beispiele möglicher Brückenstrukturen, dargestellt innerhalb vollständiger Verbindungsstrukturen, sind in Figur 6 dargestellt. Die Ausgangsmaterialien, welche derartige Brücken enthalten, oder mit welchen solche Brücken konstruiert werden können, sind dem Fachmann verfügbar - siehe z.B. den Aldrich Chemical Co. Katalog.
  • Die generellen Vorteile der neuen Verbindungen gemäß dieser Erfindungen sind die allgemeine Anwendbarkeit und die hohe Spezifität für das Zielenzym, aufgrund 1) des Substratdesigns, und 2) des Auftretens der enzymatischen Acylierung, hauptsächlich innerhalb des Enzymsubstratkomplexes, welcher die cyclische Verbindung erzeugte.
  • Die gleichen strukturellen Merkmale werden benötigt, damit dieses Verfahren in einem Assay verwendet werden kann, mit Ausnahme der Notwendigkeit, daß der Teil B ein chromophorer Farbstoff oder anderer Marker ist, und daß der Ringschluß ausreichend langsam ist, damit das Anhydrid erzeugt wird, nachdem das Enzym und die initialen Hydrolyseprodukte voneinander diffundierten.
  • Die entsprechenden mechanistischen Prinzipien finden Anwendung, wenn die Brücke ein Carbonyl/Amid ist.
  • Die chromophoren oder andere bestimm- und meßbare Gruppierungen sind dem Fachmann gut bekannt. Entsprechende Beispiele sind p-Nitrophenol, Azophenole, Azonaphthole, Hydroxycumarine. Strukturbeispiele für entsprechende Gruppierungen sind in Abbildung 7, Teil B, gegeben.
  • Beispiele möglicher Strukturen für A (dargestellt mit der abgeleiteten Bindung zu dem Molekülrest) sind in Abbildung 7, Teil A, angegeben. Im Design eines Teiles A, der für ein gegebenes hydrolytisches Enzym spezifisch ist, wird das Wissen um die Substratspezifität des gegebenen hydrolytischen Enzymes ausgenutzt. Entsprechende Beispiele können der vorhandenen Literatur entnommen werden und schließen Chymotrypsin, Lipase, Proteasen und Phospholipase A&sub2; ein.
  • Die Proteasen können in vier Hauptklassen eingeteilt werden, welche die Art des katalytischen Zentrums wiederspiegeln. Zwei Klassen fördern die Hydrolyse von Peptidbindungen durch nucleophile Katalyse, welche die Bildung eines Acylenzym-Intermediates zur Folge hat. Bei diesen handelt es sich um die Serin- und Cysteinproteasen, welche entweder die Hydroxylgruppe eines Serinrestes oder das Thiol eines Cysteinrestes am aktiven Zentrum verwenden, um die Peptidbindung des Substrates zu spalten. Diese Enzyme prozessieren Nicht-Peptidbindungen und entsprechendermaßen wurden chromogene Assays erfunden. Entsprechendermaßen ermöglichte diese Substratflexibilität die Entwicklung einer Mannigfaltigkeit von Mechanismus-basierenden Inhibitoren.
  • Die verbleibenden zwei Klassen verwenden ein aktiviertes Wassermolekül, welches am aktiven Zentrum gebunden ist, um eine Peptidbindung zu spalten. Normalerweise werden lediglich Peptidbindungen prozessiert; als Folge davon waren chromogene Assays, die die Freisetzung eines Farbstoffes als Funktion der Enzymaktivität zur Folge haben, nicht möglich. Bei diesen beiden Klassen handelt es sich um Metalloproteasen und Asparaginproteasen. Für diese beiden Klassen sind gute Mechanismus-basierende Inhibitoren nicht bekannt, was die strengen Ansprüche an die Substraterkennung widerspiegelt.
  • Im allgemeinen kann man sich vorstellen, daß das aktive Zentrum aller Proteasen in einer Spalte liegt, die eine Anzahl von Bindungstaschen haben kann, um nicht nur die Seitenketten der Aminosäurereste aufzunehmen, welche die zu spaltende Peptidbindung umfassen, sondern auch die Seitenketten der Aminosäurereste, die vor und nach der zu spaltenden Peptidbindung liegen. Die hohe Substratspezifität spiegelt nicht nur die Bindungsansprüche in der Nachbarschaft des aktiven Zentrums wider, sondern auch diese der zusätzlichen Bindungsstellen. Stellen, die an Seitenkettenreste binden, die in Richtung des N-Terminus des Substrates liegen, sind als s&sub1;-sn fortlaufend weg vom aktiven Zentrum markiert; entsprechend sind Stellen, die Reste in Richtung des Zielterminus binden, als s1'-sn' markiert. Proteasen können entweder Exopeptidasen (spalten die erste oder letzte Peptidbindung des Substrates) oder Endopeptidasen (spalten eine Peptidbindung, welche im Substrat eingebettet ist) sein.
  • Um die Aktivität der Proteasen in Bezug auf die Substraterkennung zu modulieren, muß der Inhibitor geeignete Funktionalitäten enthalten, so daß "A" die notwendigen s1'-sn' besetzt. "Y" und "B" würden die s&sub1;-Stelle besetzen. Einige Endopeptidasen benötigen die Besetzung der s&sub2;- und s&sub3;-Stellen. In diesen Fällen muß die Struktur von "Y" Merkmale einschließen, welche diese Anforderungen an die Substraterkennungen erfüllen. Am einfachsten wird dies dadurch erreicht, daß Y eine substituierte Asparagin- oder Glutaminsäure ist.
  • Das folgende ist eine teilweise Auflistung von therapeutisch nützlichen Zielen, geordnet nach Enzymklassen.
  • Metalloproteasen
  • 1) Collagenase, Arthritis
  • 2) Elastase, Emphysem, Entzündung
  • 3) Angiotensin-umwandelndes Enzym, Bluthochdruck Asparaginproteasen
  • 1) HIV-Protease, AIDS-Proliferation
  • 2) Renin, Bluthochdruck
  • 3) Pepsin, Ulkus
  • Cysteinproteasen
  • 1) Cathepsin B, Entzündung
  • Serinproteasen
  • 1) Trypsin, Pankreatitis
  • 2) Granulocytenelastase, Entzündung
  • 3) Thrombin, Coronarinfarkt
  • Für jedes der obigen Enzyme würde das Design von Suicidinhibitoren durch bekannte Substratanforderungen und zweitens, falls verfügbar, Röntgenstrukturdaten, geleitet werden. Z.B. erkennt Renin die Sequenz HisProPheHisLeuValIleHis und spaltet die Leu-Val-Bindung. Das Ersetzen des Leu-Restes durch einen Asparaginsäurerest, in welchem die endständige Carboxylgruppe mit der Abgangsgruppe "B" verestert war, würde ein Substrat erzeugen, das als Folge des Prozessierens ein cyclisches Anhydrid erzeugen würde, das als Folge der Acylierung des Renins dieses inaktivieren könnte. Siehe Barrett & Salvesen Hrg. Proteinase Inhibitors Bd. II Elsevier, Amsterdam (1986) und Hydrolytic Enzymes Hrg. Neuberger & Brocklehurst, Elsevier, Amsterdam (1987).
  • Die Chemie für die Herstellung der neuen hier genannten Inhibitoren (Inaktivatoren) und Substrate hydrolytischer Enzyme ist dem erfahrenen organischen Chemiker generell bekannt. Wenn man z.B. eine dibasische Säure einer bevorzugten Ausführungsform verwendet, können beide Teile A und B über übliche Veresterungsreaktionen angefügt werden. Das dibasische Säurenausgangsmaterial ist dem Fachmann entweder bekannt oder kann durch Standarddibasische Acidifizierungsverfahren hergestellt werden.
  • Unter Vorgabe der modularen Art der
  • Einheit kann die synthetische Sequenz entweder sein: 1) die Reaktion von AXH mit einer aktivierten dibasischen Säure, gefolgt von der Aktivierung und der Reaktion mit BXH, oder 2) der Synthese von
  • BX -Y-CO&sub2;H,
  • unter Verwendung des Verfahrens von Gaetjens, et al, Amer. Chem. Soc. 82, 5328 (1960), gefolgt von der Aktivierung und der Reaktion mit AYH.
  • Werden die hier genannten neuen Verbindungen aus denen ausgewählt, in denen R NH und/oder jedes X Schwefel oder NH ist, finden erneut organisch-chemische Standardreaktionen Anwendung. Kurz zusammengefaßt, ist R z.B. NH, kann Chlorwasserstoff durch eine Dichlormethanlösung geleitet werden, welche eine äquimolare Mischung an 4-Cyanobuttersäure und p-Nitrophenol enthält, um den Iminoether zu erzeugen. Die Behandlung dieser Verbindung mit Oxalsäuredichlorid in Dichlormethan, gefolgt von der Beseitigung des Oxalsäuredichlorides im Vakuum und dann der Zugabe des Teiles AXH und eines Äquivalentes an Base, führt zur Erzeugung der gewünschten Verbindung.
  • Wenn eines der X Schwefel oder Stickstoff ist, würde man dem Verfahren folgen, wie es unten für die X = Sauerstoff-Verbindungen beschrieben ist, mit Ausnahme des Austausches von AOH gegen ASH oder ANH&sub2; oder BOH gegen BSH oder BNH&sub2;.
  • Nachdem das spezielle Modellsystem, welches in der vorliegenden Forschung zur Bereitstellung der hier genannten generischen Klasse von Inhibitoren hydrolytischer Enzyme beschrieben wurde, und nachdem die Methodik zur Herstellung derartiger Inhibitoren, welche auf üblichen gut bekannten organisch-chemischen Reaktionen basiert, bereitgestellt wurde, und nachdem ein Assaysystem erläutert wurde, wobei dieses Modellsystem im Falle der Phospholipase A&sub2; verwendet werden kann, und nachdem Informationen geliefert wurden, die für die Herstellung eines pharmazeutisch annehmbaren Präparats derartiger Verbindungen zur Verwendung in der Behandlung von in Verbindung stehenden Krankheitszuständen oder Leiden nützlich sind, ist die vorliegende Offenbarung ausreichend, um jemanden dazu zu befähigen, andere hier genannte Inhibitoren (Inaktivatoren) und Substrate herzustellen und Assays, Behandlungsmethoden und Kits usw. für ihre Anwendung in einer äquivalenten pharmazeutisch basierenden Behandlung zu ersinnen. Daher werden Forscher, die die vorhandene Literatur und Techniken und das vorliegende Konzept verwenden, gut genug wissen, wie Inhibitoren (Inaktivatoren) und Substrate gemäß der vorliegenden Erfindung für spezifische hydrolytische Enzyme, die entweder bekannt sind oder noch zu entdecken sind, hergestellt und designt werden. Somit würde man 1) die strukturellen Merkmale des natürlichen Substrates variieren, um die Grundanforderungen zu bestimmen, 2) eine Verbindung synthetisieren, welche diese Merkmale enthält (verkörpert in Teil A), 3) A und Y (die Brücke) kovalent verbinden, und 4) B an die basische Einheit AY anheften.
    • 1. Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • Figur 1 ist eine schematische Darstellung des Mechanismus, durch welchen eine Anzahl der hier genannten neuen Inhibitoren (Inaktivatoren) hydrolytischer Enzyme in Bezug auf ihre Reaktivität mit einem hydrolytischen Enzym wirken. Im Detail sind fünf (5) derartige neue Verbindungen (1a-1e) dargestellt, die vermittelt über die Glyceringrundgerüst-basierende Seitenkette (Teil A, wie oben definiert) für Phospholipase-hydrolytische Enzyme, wie in Abbildung 1 als PLA&sub2; dargestellt, spezifisch sind. Der erste Schritt der dargestellten Reaktion zeigt die Spaltung der Teil A Glycerin-basierenden enzymspezifischen Seitenkette durch PLA&sub2; mit dem Ergebnis, daß sie abgespalten wird und ein Carboxylatanion zurückläßt, welches am anderen Ende der Brücke die para-Nitrophenol-chromophore Gruppierung enthält. Als Folge eines nachfolgenden-nicht-enzymatisch katalysierten intramolekularen Ringschlusses wird diese chromophore Gruppierung zum Nachweis und zur Messung abgespalten und läßt eine cyclisierte Verbindung zurück, welche dazu dient, über eine nucleophile Reaktion PLA&sub2; zu acylieren, um eine Art von PLA&sub2; zu erzeugen, die durch kovalente Bindungsreaktion inaktiviert ist.
  • Figur 2 zeigt eine graphische Darstellung der spezifischen Aktivität der Phospholipase A&sub2;, welche aus Kobragift (Naja naja naja) erhalten wurde, als Funktion der Konzentration der Verbindung 1a (siehe Abbildung 1) in gemischten Micellen, die Triton X-100 und Phospholipid im Verhältnis von 3,2:1 enthalten, bei einer Temperatur von 40ºC.
  • Figur 3 zeigt die Geschwindigkeit der Hydrolyse (ΔO.D.λ400 in 20 s) von 0,4 mM Verbindung 1a in 1,8:1 Triton:Phospholipid-gemischten Micellen bei 40ºC als Funktion der Menge an PLA&sub2; (siehe Figur 1).
  • Figur 4 zeigt die Zeitverläufe für die Inaktivierung von Phospholipase A&sub2;, welche aus Kobragift erhalten wurde, durch die Vorinkubation der Verbindungen 1a bis 1e (siehe Figur 1).
  • Figur 5 zeigt den Effekt der Inhibitorkonzentration auf die Phospholipase-A&sub2;-Aktivität für die Verbindung 1d (siehe Abbildung 1).
  • Figur 6 stellt mögliche Brückenteile (Y) dar, die hierin verwendet werden können.
  • Figur 7 zeigt mögliche A-Teile (Part A) und B-Teile (Part B), die hierbei verwendet werden können.
    • 2. Definitionen
  • Mit den Begriffen, die sich auf den Linker (bzw. die Brücke) beziehen, der oben als Y in den obigen Formeln dargestellt wurde, ist ein Teil gemeint, der zwei Funktionen erfüllt: Er besitzt an beiden Enden geeignete Funktionalitäten, so daß er zur Bindung mit den Teilen A und B in der Lage ist. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform erfolgt diese Bindung über eine Carboxylatfunktionalität. Die zweite Anforderung ist, daß er strukturelle Merkmale enthält, die als Folge der enzymatischen Spaltung der Seitengruppierung A und dem gleichzeitigen Abgang von B die Bildung einer cyclischen Verbindung favorisieren würde. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform würde die Brücke wenigstens zwei oder drei Kohlenstoffatome enthalten, gesättigt oder ungesättigt, substituiert oder nicht-substituiert. Die Brücke kann Teil eines aromatischen Systemes sein, wie es durch eine Phenyl- oder Naphthalingruppierung dargestellt ist. Die einzigen vorhersehbaren Einschränkungen sind die, daß der Linker als Folge der Spaltung der Seitengruppierungen A und B in in situ-chemischer Nähe zum Zielenzym intramolekular binden würde, so daß sich eine cyclische Verbindung bildet. Im Falle der bevorzugten Ausführungsform wäre die endgültige cyclische Verbindung ein Anhydrid (siehe z.B. Abbildung 1).
  • Mit dem Begriff, welcher sich auf einen Teil bezieht, der in der Lage ist, an eine aktive Stelle zu binden, ist ein aktives-Zentrum-spezifischer Teil gemeint, der durch ein spezielles hydrolytisches Enzym erkannt werden kann. Im Falle von Lipasen könnte ein solcher Teil ein Glyceringrundgerüst enthalten, in dem eines der Sauerstoffatome mit der Brücke verbunden ist und die anderen beiden Sauerstoffe mit einer gesättigten oder ungesättigten Acyl- oder Alkylkette verbunden wären, welche für das fragliche Enzym geeignet sind. Im Falle der Phospholipase-hydrolytischen Enzyme würde eines der beiden anderen Sauerstoffatome mit einem Phosphodiester verbunden werden, welcher eine polare Gruppe, z.B. Cholin, Ethanolamin, Serin, Inosit, Glycerin, Methyl, usw. hat.
  • Im Falle der Begriffe, die sich auf den spaltbaren Teil B beziehen, der bestimmt und gemessen werden kann, bestehen zwei Anforderungen: 1) daß er spezifisch spaltbar ist, wie z.B. in Figur 1 gezeigt, und 2) daß, um ein Medikament zu sein, die Reaktion im Vergleich zur Diffusion schnell sein muß; für einen Assay, daß er meßbar und bestimmbar ist.
  • Mit dem Begriff "modulieren" in Bezug auf verschiedene Krankheitszustände oder Leiden, ist die Beeinflussung der hydrolytischen Enzymaktivität gemeint, wenn eine solche Aktivität beim Ausbruch oder bei der Aufrechterhaltung oder der Neigung für einen gegebenen Krankheitszustand oder Leidenssymptome beteiligt ist. Im Falle von bevorzugten Ausführungsformen können verschiedene inflammatorische Leiden gemildert werden durch die Verwendung eines Phospholipase-A&sub2;-Inhibitors gemäß der vorliegenden Erfindung, so daß die Wirkung des genannten Enzymes in Bezug auf die Bildung von Produkten oder Coprodukten entweder selber oder nach weiteren Reaktionen Entzündungszustände hervorzurufen, vermindert oder begrenzt wird.
  • Mit Begriffen, die sich auf den Nachweis und die Messung der hydrolytischen Enzymaktivität über eine geeignete Gruppierung beziehen, ist jede Gruppierung gemeint, die spaltbar und nachweisbar und meßbar ist, wie z.B. das oben gezeigte p-Nitrophenol. Im allgemeinen würde man Spektrophotometer verwenden. Jedoch können in bestimmten Anwendungen andere Nachweisverfahren, wie z.B. Fluorometer oder Scintillationszähler, vorteilhaft sein.
  • Mit "Niedrigalkyl" oder "Alkyl" sind alle Isomere gemeint, die 1 bis 4 Kohlenstoffatome enthalten.
    • 3. Beispiele Herstellung von Modell-Phospholipase-A&sub2;-spezifischen Inhibitoren und Substraten
  • Die Verbindung 1a (siehe Abbildung 1) wurde durch Acylierung kommerziell erhältlichen 1-Decanoyl-2-lysophosphatidylcholins mit einem Überschuß an Glutarsäureanhydrid und Triethylamin in Dichlormethan bei 40ºC hergestellt. Nach der Reinigung auf einem Silicagel unter Verwendung von Essigsäure:Wasser:Methylalkohol Trichlormethan im Verhältnis 1:4:30:65 wurde das Halbsäureprodukt in die Verbindung 1a umgewandelt durch sequentielle Behandlung in Methylenchlorid bei 20ºC mit 1) einem Überschuß an Oxalsäuredichlorid, 2) der Entfernung flüchtiger Verbindungen im Vakuum in Methylenchlorid und 3) einem Überschuß an p-Nitrophenol/Triethylamin. Die Verbindung 1a wurde durch zwei selektive Fällungen, die durch die 50-fache Verdünnung einer konzentrierten Methylenchloridlösung mit Diethylether induziert wurde, gereinigt. Um die letzten Spuren an p-Nitrophenol zu beseitigen, wurde ein Äquivalent an Triethylamin zu der Methylenchloridlösung zugegeben, um die Wasserstoffbindung des Phenoles an das Phospholipid zu zerstören. Die Hydrolyse der Verbindung 1a scheint auf Silicagel, Florisil und Aluminium katalysiert zu werden. Die präparative HPLC unter Verwendung einer C&sub1;&sub8;-Säule mit Methanol als Elutionsmittel ergab 1a frei von Spurenverunreinigungen. Das NMR und die Hochauflösungs-Spektren waren strukturell in Übereinstimmung mit Verbindung 1a.
  • ¹H-NMR (CDCl&sub3;), δ 0,86 (t, 3H), 1,29 (S, 12H), 1,6 (m, 2H), 2,05 (t, ZH), 2,28 (m, 2H), 2,5 (m, 2H), 2,7 (m, 2H), 2,35 (s, 9H), 3,72 (m, 2H), 3,95 (m, 2H), 4,15 (m, 1H), 4,3 (m, 2H), 4,4 (m, 1H), 5,2 (m, 1H), 7,3 (ABq, 2H), 8,25 (ABq, 2H), MS (FAB) m/e 647; exakte Masse berechnet für C&sub2;&sub9;H&sub4;&sub8;N&sub2;O&sub1;&sub2;P 647,2945; gefunden 647,2952
  • Für Teil-A-Gruppierungen, welche Peptidfunktionalitäten enthalten, würden mildere Kondensationsbedingungen angewendet werden.
  • Verbindungen 1b bis 1e (siehe Abbildung 1 und die obige Beschreibung) wurden unter Verwendung des gleichen Verfahrens, welches oben für die Herstellung der Verbindung 1a beschrieben wurde, hergestellt. Im Gegensatz zu Verbindung 1a konnten diese Ester auf Silicagel unter Verwendung von Trichlormethan/Methylalkohol im Verhältnis 2:1 als Elutionsmittel chromatographisch getrennt werden. Spurenverunreinigungen konnten durch HPLC unter identischen Bedingungen, wie für 1a angewandt, entfernt werden. Die NMR und Hochauflösungs-Massenspektren waren in Übereinstimmung mit allen vier Strukturen:
  • 1b: ¹H-NMR (CDCl&sub3;) δ 0,9 (t, 3H), 1,3 (S, 12H), 1,4 (S, 6H), 1,6 (m, 2H), 2,05 (t, 2H), 2,25 (t, 2H), 2,45 (t, 2H), 3,3 (S, 9H), 3,7 (m, 2H), 4,0 (m, 2H), 4,15 (m, 1H), 4,3 (m, 2H), 4,4 (m, 1H), 5,2 (m, 2H), 7,3 (ABq, 2H), 8,25 (ABq, 2H)
  • MS (FAB) m/e 675; exakte Masse berechnet für C&sub3;&sub1;H&sub5;&sub2;N&sub2;O&sub1;&sub2;P 675,3258; gefunden 675,3267
  • 1c: ¹H-NMR (CDCl&sub3;) δ 0,9 (t, 3H), 1,25 (S, 6H), 1,3 (S, 12H), 1,6 (m, 2H), 2,25 (t, 2H), 2,55 (S, 2H), 2,75 (S, 2H), 3,4 (S, 9H), 3,75 (m, 2H), 4,0 (m, 2H), 4,15 (m, 1H), 4,3 (m, 2H), 4,4 (m, 1H), 5,25 (m, 1H), 7,3 (ABq, 2H), 8,3 (ABq, 2H)
  • MS (FAB) m/e 675; exakte Masse berechnet für C&sub3;&sub1;H&sub5;&sub2;N&sub2;O&sub1;&sub2;P 675,3258; gefunden 675,3245
  • 1d: ¹H-NMR (CDCl&sub3;) δ 0,9 (t, 3H), 1,3 (S, 12H), 1,6 (m, 2H), 2,25 (t, 2H), 2,75 (t, 2H), 2,9 (t, 2H), 3,3 (S, 9H), 3,75 (m, 2H), 4,0 (m, 2H), 4,15 (m, 1H), 4,3 (m, 2H), 4,4 (m, 1H), 5,25 (m, 1H), 7,3 (ABq, 2H),
  • MS (FAB) m/e 633; exakte Masse berechnet für C&sub2;&sub8;H&sub4;&sub6;N&sub2;O&sub1;&sub2;P 633.2788; gefunden 633,2800
  • 1e: ¹H-NMR (CDCl&sub3;) δ 0,9 (t, 3H), 1,3 (S, 12H), 1,42 (S, 3H), 1,45 (S, 3H), 1,6 (m, 2H), 2,25 (t, 2H), 2,8 (S, 2H), 3,3 (S, 9H), 3,75 (m, 2H), 4,0 (m, 2H), 4,15 (m, 1H), 4,35 (m, 2H), 4,4 (m, 1H), 5,25 (m, 2H), 7,3 (ABq, 2H), 8,3 (ABq, 2H)
  • MS (FAB) m/e 661; Exakte Masse berechnet für C&sub3;&sub0;N&sub5;&sub0;N&sub2;O&sub1;&sub2;P 661,3101; gefunden 661,3079
    • Assays
  • Alle Assays mit der Verbindung 1a wurden in 0,4 ml Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8, 10 mM CaCl&sub2; und 100 mM KCl) gemessen.
  • Abbildung 2 zeigt eine graphische Darstellung der spezifischen Aktivität für 20 ng Phospholipase A&sub2;, welche aus Kobragift (Naja naja naja) erhalten wurde, als eine Funktion der Konzentration der Verbindung 1a in gemischten Micellen, die Triton X-100 und Phospholipid in einem Verhältnis von 3,2:1 enthalten, bei 40ºC. Siehe Dennis, J. Lipid Research 14, 152 (1973) und Deems und Dennis, Methods in Enzymology 71, 703 (1981). In gemischten Micellen, die Triton und Phospholipid im Verhältnis 4:1 enthalten, waren die relativen V's für die Verbindung 1a und 1,2-Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC) unter Verwendung eines titrimetrischen Assays bei einer Substratkonzentration von 5 mM 1:3. Der p-Nitrophenolesterteil fördert eine gesteigerte Bindung an hydrophobe Reste in der Nähe des aktiven Zentrums der PLA&sub2;, was dazu führt, daß im Vergleich zu DPPC für die Verbindung 1a eine niedrigere Konzentration an Substrat benötigt wird, um eine Halbsättigung zu erreichen.
  • Figur 3 zeigt eine graphische Darstellung der Anfangsgeschwindigkeiten (ausgedrückt als ΔO.D. bei λ400 nm während 20 s), die mit Phospholipase A&sub2; (spezifische Aktivität 1470 Mmol min&supmin;¹ mg&supmin;¹) beobachtet wurden. Die graphische Darstellung war mit Proteinkonzentrationen von 0,5 ng bis 100 ng unter Verwendung gemischter Micellen (Triton/Phospholipid = 1,8:1), welche 0,4 mM Verbindung 1a enthielten, bei 40ºC linear.
  • Die Reaktionsgeschwindigkeit der Hydrolyse ist eine Funktion des Anteils der molaren Fraktion des Substrates in den Triton/Phospholipid-gemischten Micellen; die Geschwindigkeit verringert sich 3-fach, wenn das Oberflächenverhältnis von 1,6:1 auf 3:1 auf 4,5:1 auf 7:1 steigt. Unilamellare Vesikel (SUVs), welche durch Beschallung der Verbindung 1a, gefolgt von einer Zentrifugation, hergestellt wurden, wurden durch Phospholipase A&sub2; schnell hydrolysiert. Für eine 400 µM SUV-Lösung war V gleich 265 µmol/min/mg im Vergleich zu 550, gemessen für 400 µM der Verbindung 1a in 3,2:1 Triton-gemischten Micellen.
  • Die Zeitverläufe für die Inaktivierung der Phospholipase A&sub2;, erhalten aus Kobragift durch Vorinkubation der Verbindungen 1a (offene Dreiecke), 1b (gefüllte Kreise), 1c (offene Vierecke), 1d (geschlossene Dreiecke) und 1e (offene Kreise) sind in Abbildung 4 gezeigt. Die Bedingungen waren 1) Präinkubation einer 260:1-Mischung an Inhibitor 1 mit PLA&sub2; in 1 ml einer Lösung, welche 5 µg/ml PLA&sub2;, 100 µM Vesikel der Verbindung 1a-1e, 20 mM Tris- HCl, pH 8, 10 mM CaCl&sub2; und 0,1 M KCl enthält, bei 20ºC, 2) titrimetrische Messung der Hydrolysegeschwindigkeit, initiiert durch die Zugabe eines 20 µl Aliquotes der obigen Lösung zu 1,7 ml an 40ºC Assaymedium, welches 5 mM 1,2- Dipalmitoylphosphatidylcholin, 10 mM CaCl&sub2; und 20 mM Triton X-100 enthält. Tabelle 1 EFFIZIENZ DER HYDROLYSE UND INHIBITION
  • a Teilungsverhältnis (P), ausgedrückt als Mole freigesetzten Farbstoffs/Mol inaktiviertes Enzym
  • Die Tabelle 1 enthält die Anfangs-Geschwindigkeitskonstanten für die Freisetzung von p-Nitrophenol (ArOH) aus den Substraten 1a-1e während der ersten 5% der Hydrolyse. Tabelle 1 enthält außerdem die Cyclisierungsgeschwindigkeiten für die fünf freigesetzten Fragmente 2a-2e. Es ist offensichtlich, daß Succinatderivate schlechtere Substrate sind als ihre Glutaratentsprechungen, entweder aufgrund des induktiven Effektes des Esters, welcher näher an der stereospezifischen mit Nummer 2 bezifferten Esterbindung ist, oder aufgrund von sterischen Effekten des Carbonylsauerstoffs, dort wo die γ-Position einer Fettsäure wäre. Germinale Methyle, entweder in der β- oder γ-Position, verzögern die Hydrolysegeschwindigkeit; der Effekt ist für die β-Position jedoch Sofach größer.
  • Die Effizienz der enzymatischen Deaktivierung kann als die Teilungsrate (P), wie in Tabelle 1 gezeigt, ausgedrückt werden. Nach dieser Analyse sind die Dimethylglutarate 1b und 1c und Dimethylsuccinate 1e effizientere Suicidinhibitoren. Wahrscheinlich fördern germinale Methylgruppen die Bindung von 2 an das Enzym effizienter. Im Durchschnitt prozessiert das Enzym 10-20 Substrate, bevor es deaktiviert wird. Inhibitor 1d ist weniger effizient, wird aber schneller prozessiert. Das Ausmaß der Inhibition ist eine Funktion der Vorinkubationsbedingungen, d.h. der Temperatur und des physikalischen Status des Substrates (Micellen im Vergleich zu Vesikeln). Bedingungen, welche die Assoziation des Abgangsfragmentes mit PLA&sub2; fördern, verringern P. Für 100 µM 1d in 8,2:1 Triton/Phospholipid-gemischten Micellen stieg P auf &supmin;250 von &supmin;35 für Vesikel, was die größere Neigung von 2d vom Enzym weggezogen zu werden, widerspiegelt. Die Erhöhung der Temperatur von 20ºC auf 40ºC während der Präinkubation von PLA&sub2; mit 1b oder 1d hatte auf den Zeitverlauf wenig Auswirkung, aber erhöhte P. Wahrscheinlich fördern Micellen und höhere Temperaturen die Abdiffusion des Hydrolyseproduktes 2 vom Enzym, was zur Folge hat, daß das cyclische Anhydrid in der Hauptlösung erzeugt wird und mit H&sub2;O reagiert. Die Gesamtrate der Inaktivierung ist nicht nur eine Widerspiegelung der Geschwindigkeit der intramolekularen Cyclisierung und Empfindlichkeit gegenüber der enzymatischen Hydrolyse, sondern auch der Diffusionsgeschwindigkeit von 2 vom Enzym.
  • Der Einfluß der Inhibitorkonzentration ist in Figur 5 für 1d gezeigt. Die Inhibition einer 70 nM Lösung an PLA&sub2; ist relativ schnell, sogar bei 20 mM (gefüllte Vierecke), 5 mM (gefüllte Dreiecke), und 1,7 µM (gefüllte Kreise). Bei 1d-Konzentrationen von 0,5 µM (offene Kreise) oder weniger wurde 1d verbraucht, bevor PLA&sub2; inaktiviert wurde. Unter der Voraussetzung, daß das Verhältnis von Inhibitor zu PLA&sub2; 40 übersteigt, kann die Inhibition sogar bei niedrigen Konzentrationen beobachtet werden, was darauf hinweist, daß K für diese Inhibitoren sehr niedrig ist. Im Gegensatz dazu inhibieren 8,2:1 Triton/Phospholipid-gemischte Micellen von 1d nicht unterhalb 20 µM. Die Erniedrigung der Oberflächenkonzentration des Inhibitors erniedrigt die Geschwindigkeit der Inhibition.
  • Der Leser wird außerdem auf die vorhandene Literatur hingewiesen, welche relevante Einzelheiten zu Verfügung stellt, z.B. in Bezug auf spezifische alternative Assays zur Messung der Aktivität und in Bezug auf das Ersinnen pharmazeutisch annehmbarer Präparate und Methoden für die effiziente Behandlung von Krankheitszuständen, wobei hierin das Wesen der vorliegenden Erfindung bereitgestellt wurde, um grundlegend bei derartigen klinischen Anstrengungen beizutragen. Siehe z.B. die U.S. Patente 4 826 958, 4 833 152, 4 616 089, 4 788 304, 4 447 445, und WO 86/06100 (23. Oktober 1986).
  • Die vorangegangene Beschreibung beschreibt in Einzelheiten spezifische Methoden, welche angewandt werden können, um die vorliegende Erfindung auszuführen. Dadurch, daß spezifische Methoden ausführlich beschrieben wurden, welche initial dazu verwendet wurden, um die hier genannten Inhibitoren (Inaktivatoren) und Substrate zu charakterisieren, herzustellen und zu verwenden, und durch eine weitere Offenbarung, betreffend spezifische Modellsysteme, wird der Fachmann gut genug wissen, wie alternative verläßliche Methoden ersonnen werden, um zu der gleichen Information zu kommen und um diese Information auf andere hydrolytische Enzymsysteme auszuweiten.

Claims (9)

1. Verbindung der Formel
worin
R Sauerstoff oder Imino bedeutet,
jedes X unabhängig Sauerstoff, Schwefel oder Imino bedeutet, A eine Einheit ist, die von einem Phospholipase-A2-Enzym so erkannt wird, daß das Enzym die Bindung, die AX mit C(O)Y verknüpft, hydrolysiert,
B eine Komponente einer spaltbaren Einheit BX ist,
Y ein Alkylen oder Alkenylen oder Alkylen oder Alkenylen, das mit einer oder mehreren Niedrigalkylgruppe(n), umfassend 1 bis 4 Kohlenstoffatome, substituiert ist, ist, zur therapeutischen Verwendung.
2. Verbindung nach Anspruch 1, worin R Sauerstoff bedeutet und jedes X Sauerstoff bedeutet.
3. Verbindung nach Anspruch 1, worin Y n-Propylen bedeutet.
4. Verbindung nach Anspruch 1, worin Y 1,1-Dimethyl-n-propylen bedeutet.
5. Verbindung nach Anspruch 1, worin Y 2,2-Dimethyl-n-propylen bedeutet.
6. Verbindung nach Anspruch 1, worin Y Ethylen bedeutet.
7. Verbindung nach Anspruch 1, worin Y 1,1-Dimethylethylen bedeutet.
8. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, worin AX 1- Decanoylglycerin-3-phosphorylcholin bedeutet.
9. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Herstellung eines Medikaments zur Hemmung der Phospholipase A&sub2;.
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