DE68921385T2

DE68921385T2 - Signalerhöhung im Enzym-Nachweis.

Info

Publication number: DE68921385T2
Application number: DE68921385T
Authority: DE
Inventors: Thomas H Schulte
Original assignee: Becton Dickinson and Co
Current assignee: Becton Dickinson and Co
Priority date: 1988-08-11
Filing date: 1989-08-09
Publication date: 1995-07-27
Anticipated expiration: 2009-08-10
Also published as: ATE119205T1; FI95485B; EP0354548A2; TW204371B; US4962024A; DK392489A; FI95485C; FI893789A; DE68921385D1; FI893789A0; EP0354548B1; AU621646B2; EP0354548A3; GR3015261T3; JPH02113899A; AU3940889A; DK392489D0; ES2068860T3; MY104160A

Description

1. Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Assay eines Enzyms und darin verwendete Materialien und betrifft insbesondere ein Verfahren und Materialien für einen Assay, bei dem die Verstärkung eines nachweisbaren Signals durch Modulation der enzymatischen Katalyse einer Indikator-Reaktion erreicht wird.

2. Hintergrund der Erfindung

Obwohl die Wissenschaft von den Enzymen fast 100 Jahre alt ist und die Schlüsselrolle, die Enzyme in vielen biochemischen Reaktionen spielen, vor 40 Jahren verstanden worden sind, erfolgten die Anwendungen der Enzymologie in der klinischen Diagnose erst in jüngster Zeit. Sogar vor 20 Jahren machten diese Anwendungen nur 3 bis 5 % der Gesamtzahl von Tests aus, die in klinischen Laboratorien durchgeführt wurden, und nur vier oder fünf Enzyme wurden routinemäßig untersucht.
Im Gegensatz dazu machen Enzym-Assays heute so viel wie 25 % der gesamten Arbeitsbelastung in größeren Krankenhaus-Laboratorien aus, und nicht weniger als 20 bis 25 Enzyine können routinemäßig untersucht werden. Ausführliche Verfahren für diese Routine-Assays können in jedem Standard-Lehrbuch über klinische oder diagnostische Chemie gefunden werden.
In einem Enzym-Assay wird die Enzym-Konzentration in einer Körperflüssigkeit wie Serum, Urin und cerebrospinale Flüssigkeit dahingehend bestimmt, daß sie entweder innerhalb eines normalen Bereiches liegt oder außerhalb des normalen Bereiches liegt. In einigen Assays ist eine anormale Enzym-Konzentration das Ergebnis einer bakteriellen oder Virus-Infektion und der Assay auf ein spezifisches Enzym ist für ein spezifisches Pathogen diagnostisch. In anderen Fällen kann der bloße Nachweis eines Enzyms, das normalerweise nicht in der Flüssigkeit wie einem Serum vorhanden ist, auf eine Gewebe- oder Organ- Beschädigung hinweisen. Zum Beispiel bestimmt der Nachweis von Alkoholdehydrogenase, die leberspezifisch ist, und von Säurephosphatase, die prostataspezifisch ist, im Plasma genau eine Beschädigung in diesen betreffenden Organen. Die Messung der Aktivität von alkalischer Phosphatase ist bei der Diagnose von Leber/Galle- und Knochen-Krankheiten von Wichtigkeit.
Enzym-Assays hängen von der Enzym-Katalyse der Umwandlung eines Substrats in ein Produkt ab, das nachgewiesen oder gemessen werden kann. Falls die Konzentration des Substrats in einer Enzym-Reaktion allmählich erhöht wird, während alle anderen Faktoren konstant gehalten werden, steigt die Reaktionsgeschwindigkeit mit steigender Substrat-Konzentration an, bis ein Maximalwert erreicht wird. Jeder weitere Anstieg der Substrat-Konzentration wird zu keinem weiteren Anwachsen der Reaktionsgeschwindigkeit führen. Somit hängt die Reaktionsgeschwindigkeit ausschließlich von der Enzym-Konzentration ab, wenn das Substrat in einem ausreichenden Überschuß vorhanden ist.
Da Enzyme wahre Katalysatoren sind und im Verlauf der Reaktion nicht verändert werden, ist die Geschwindigkeit einer Enzym- Reaktion in Anwesenheit von ausreichend viel Substrat in Abhängigkeit von der Zeit konstant und hängt nur von der Enzym-Konzentration im Assay-System ab. Falls das zu analysierende Enzym in einer geringen Konzentration vorliegt, ist die Reaktionsgeschwindigkeit sehr gering und ein langer Zeitraum kann bis zur Bildung von ausreichend viel Produkt für den Nachweis notwendig sein. Dies stellt in den Fällen, ins denen die Nachweisgeschwindigkeit von entscheidender Bedeutung ist, wie zum Beispiel beim Nachweis eines Pathogens in Blut oder Urin, einen schweren Nachteil dar.
Eine andere Einschränkung bei der Enzym-Analytik besteht darin, daß in klinischen Proben häufig Substanzen auftreten, die die Empfindlichkeit des Assays durch eine Überlagerung der Enzym- Aktivität erniedrigen. Diese üblicherweise als Interferenzen bezeichneten Substanzen stören besonders bei der Analytik von Enzymen in Serum- und Urinproben.
Die Empfindlichkeit von Assays im Immunoassay ist durch verschiedene Verstärkungs-Verfahren verbessert worden. Bei der Kaskaden-Verstärkung wird die Zahl der nachweisbaren (im allgemeinen gefärbten) Moleküle durch den Einsatz von zwei oder mehr Enzymen oder Enzym-Derivaten erhöht. Das US-Patent 4 463 090 von Harris offenbart einen Kaskaden-Verstärkungs-Immunoassay, bei dem ein Aktivator aus einem großen Molekül, etwa ein an einen Liganden gekoppeltes Enzym oder ein Proenzym, ein zweites Enzym aktiviert, das mit einem Substrat reagiert, um ein nachweisbares Signal zu erzeugen, oder seinerseits ein drittes Enzym aktiviert.
Das US-Patent 4 446 231 von Self offenbart einen Enzym-Immunoassay mit einer im Kreislauf arbeitenden Verstärkung, der ein primäres und ein sekundäres Enzym-System und einen Modulator für das zweite Enzym-System enthält. Das primäre Enzym-System enthält ein an einen Liganden gekoppeltes erstes Enzym. In einer ersten Ausführungsform der Self'schen Erfindung wirkt das erste Enzym-System auf eine Modulator-Vorstufe, um einen Modulator freizusetzen. Der Modulator ist ein Cofaktor des sekundären Enzyms, der das zweite Enzym-System aktiviert, um die Reaktion eines Substrats zu einem nachweisbaren Produkt zu katalysieren. Während der Reaktion wird der Modulator in eine inaktive Form überführt, und die Reaktionsführung im Kreislauf wird durch ein drittes Enzym bewerkstelligt, das den Modulator erneut aktiviert. In einer zweiten Ausführungsform ist der Modulator ein Inhibitor des sekundären Systems und wird durch das primäre Enzym-System entfernt, wodurch das sekundäre System aktiviert wird, so daß es auf das Substrat wirkt und dadurch das nachweisbare Produkt erzeugt.
Weitere eine Signalverstärkung umfassende Immunoassays zum Nachweis von Liganden sind aus EP-A-0 245 981 und EP-A-0 271 731 bekannt.
Bogulaski et al., US-Patent Nummer 4 492 751, lehren ein im Kreislauf arbeitendes System, in dem ein Enzym-Substrat oder Coenzym mit einem Glied des spezifischen Bindungs-Paares konjugiert ist.
Es wurde gezeigt, daß eine Vielfalt von Molekülen eine spezifische Inaktivierung eines Ziel-Enzyms hervorruft. Eine Untergruppe von Inhibitoren, als "Inhibitoren auf Mechanismus- Basis" bezeichnet, sind Substrate für Enzyme, die mit einem Enzym unter Bildung einer kovalenten Bindung reagieren. Inhibitoren auf Mechanismus-Basis sind von Walsh {Tetrahedron 38, 871 (1982)} besprochen worden. Zu einer anderen Untergruppe von Inhibitoren gehören Moleküle, die als Analoge mit stabilem Übergangs-Zustand wirken. Gelb et al. haben einige Fluorketone als Inhibitoren des Übergangs-Zustandes hydrolytischer Enzyme in Biochemistry 24, 1813 (1985) beschrieben.
Enzym-Assays sind wertvolle Ergänzungen für die Liste der Analytik-Verfahren; sie sind jedoch den oben beschriebenen Einschränkungen unterworfen. Diese Erfindung ist auf verbesserte Enzym-Assays zur Lösung dieser Probleme ausgerichtet.

KURZBESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweis eines Enzyms in einer Flüssigkeit, hiernach bezeichnet als das unbekannte Enzym, umfassend:
(a) Kombinieren einer Flüssigkeit, die vermutlich ein unbekanntes Enzym, ein zweites Enzym und einen blockierten Fluorketon-Inhibitor des zweiten Enzyms enthält, wobei das unbekannte Enzym den blockierten Fluorketon-Inhibitor in einen Fluorketon-Inhibitor umwandelt und dadurch den Fluorketon-Inhibitor in die Flüssigkeit abgibt,
(b) Hinzufügen eines Substrates für das zweite Enzym zur Flüssigkeit, wobei eine Umwandlung des Substrats durch das zweite Enzym in einer Indikator-Reaktion in ein Produkt gehemmt wird, und
(c) Nachweisen des unbekannten Enzyms durch das Nachweisen eines mit der Indikatorreaktion assoziierten Signals.
Das bevorzugte zweite Enzym ist eine Esterase und das bevorzugte Substrat ist ein Chromogen, das durch die Esterase in ein Produkt einer unterschiedlichen Farbe überführbar ist. Meistbevorzugt ist das Chromogen farblos und wird durch die Esterase in ein gefärbtes Produkt überführt, wobei die Umwandlung des Chromogens in das Produkt durch den Inhibitor gehemmt wird. Ein anderer Aspekt der Erfindung beinhaltet ein Material-Kit, um das Verfahren der Erfindung im wesentlichen wie oben beschrieben durchzuführen.
In jedem Assay-System, das das Entblockieren eines Enzym- Inhibitors einschließt, unterliegen sowohl der Inhibitor als auch der blockierte Inhibitor strengen Beschränkungen, wenn der Assay maximale Empfindlichkeit erreichen soll. Gemäß der vorliegenden Erfindung ist der blockierte Inhibitor ein ausgezeichnetes Substrat für das unbekannte Enzym, ist jedoch gegenüber dem zweiten Enzym im wesentlichen nicht reaktionsfähig. In gleicher Weise ist der entblockierte Inhibitor ein potenter Inhibitor des zweiten Enzyms, hat jedoch im wesentlichen keinen Effekt auf das unbekannte Enzym. Da die Reaktionen des blockierten Inhibitors und des Inhibitors mit dem unbekannten und dem zweiten Enzym hochgradig selektiv sind, werden "Kurzschluß"-Eigenschaften, die infolge von Überkreuz- Reaktionsfähigkeiten den EIA-Kreislauf-Systemen des Standes der Technik eigen sind, im wesentlichen ausgeschaltet.
Auf diese Weise macht die Erfindung ein vielseitiges Assay-Verfahren für Enzyme verfügbar, die in sehr niedrigen Konzentrationen in einer Flüssigkeit vorhanden sind. Das Verfahren verstärkt die Assay-Empfindlichkeit bis zum 100fachen und erzielt so viele Vorteile gegenüber herkömmlichen Enzym-Assays. In sehr viel geringeren Konzentrationen vorliegende Enzyme können nachgewiesen werden. Die zur Durchführung des Assays benötigte Zeit wird in weitem Umfang reduziert, wodurch von einem klinischen Labor in einem vorgegebenen Zeitraum mehr Assays durchgeführt werden können. Oft kann das Signal mit bloßem Auge abgelesen werden, wodurch die Notwendigkeit für teure und unhandliche Ausrüstungen entfällt. Dadurch werden signifikante Einsparungen an Kosten und Platz erzielt, die die Durchführung erfindungsgemäßer Assays in kleinen klinischen Laboratorien oder sogar in einer Arztpraxis ermöglichen.

KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG

Die Zeichnung gibt das Ergebnis eines typischen Assays gemäß dem Verfahren und den Materialien der vorliegenden Erfindung wieder.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

Gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung kann ein unbekanntes Enzym, das vermutlich in einer Flüssigkeit vorliegt, durch ein Assay-Verfahren nachgewiesen werden, das wenigstens zwei Verstärkungs-Stufen umfaßt. In dieser Offenbarung bedeutet der Begriff "nachgewiesen" sowohl den Nachweis des Enzyms, d.h. seine Anwesenheit oder Abwesenheit, als auch die Messung seiner Konzentration in der Flüssigkeit.
Eine erste Stufe der Verstärkung ist das Entblockieren des Modulators für das zweite Enzym durch das unbekannte Enzym. Eine zweite Stufe der Verstärkung ist die Katalyse der Indikator-Reaktion durch das zweite Enzym. Diese Schritte der Verstärkung erfolgen nacheinander, um eine Signal-Verstärkung vom 100fachen oder höher zu erreichen, wodurch ein in der Probe vorhandenes Enzym oft mit dem bloßen Auge nachgewiesen werden kann. Falls eine zusätzliche Verstärkung erwünscht ist, können zusätzliche Enzyme bereitgestellt werden, die an einer Kaskade aufeinanderfolgender Reaktionen teilnehmen, wobei eine oder alle der Reaktionen eine weitere Signal-Verstärkung erzielen können.
Das bevorzugte Verfahren für einen Assay der Erfindung wird zunächst anhand des nachstehenden Assay-Fließdiagramms erläutert, um ein allgemeines Verständnis der Assay-Komponenten und ihrer Wechselwirkung zu vermitteln, wonach jede Komponente im einzelnen erörtert wird.
Im vorstehenden Fließdiagramm sind die folgenden Definitionen maßgebend, wobei ein Bindestrich eine chemische Bindung bezeichnet, ein ausgezogener Pfeil eine chemische Umwandlung bezeichnet und ein gestrichelter Pfeil eine Hemmung des zweiten Enzyms und dadurch das Inhibieren der Indikator-Reaktion bezeichnet.
L - zu untersuchende Flüssigkeit
UE - unbekanntes Enzym
E&sub2; - zweites Enzym
B-I - blockierter Inhibitor
I - freier Inhibitor für das zweite Enzym
B - blockierende Gruppe für den Inhibitor
Sub - Substrat
P - Produkt
Aus dem Fließdiagramm kann entnommen werden, daß die Flüssigkeit, die vermutlich das unbekannte Enzym enthält, mit dem blockierten Inhibitor und dem zweiten Enzym kombiniert wird.
Jedes unbekannte, in der Flüssigkeit enthaltene Enzym entfernt die blockierende Gruppe und setzt den freien Inhibitor frei. Ein Substrat für das zweite Enzym wird hinzugefügt und wird in der Indikator-Reaktion durch das zweite Enzym in ein nachweisbares Produkt umgewandelt, wobei die katalytische Aktivität des zweiten Enzyms durch den freien Inhibitor gehemmt wird. Die Konzentration des Produkts ist der Konzentration des freien Inhibitors und damit der Konzentration des unbekannten Enzyms umgekehrt proportional.
Das tatsächliche gemessene Signal kann eine Farbe sein, die mit der Indikator-Reaktion zusammenhängt, beispielsweise die Farbe des Produkts, oder die Geschwindigkeit der Bildung desselben, oder die Farbe des Substrats oder die Rate des Verschwindens desselben.
Wendet man sich nun einer eingehenden Beschreibung der Assay-Komponenten zu, so kann das unbekannte Enzym einer beliebigen Quelle entstammen. Beispielsweise kann es in einer Körperflüssigkeit vorhanden sein, oder es kann aus einer Körperflüssigkeit isoliert und anschließend in eine andere Flüssigkeit wie einen Puffer eingeführt werden. In anderen Fällen kann das unbekannte Enzym aus einer anderen Quelle als einer Körperflüssigkeit stammen, etwa beispielsweise einer Kultur von Mikroorganismen oder einem Zellextrakt derselben. Andererseits muß das unbekannte Enzym nicht aus einer lebenden Quelle stammen, sondern kann zum Beispiel ein synthetisches Enzym sein.
Jedes beliebige Enzym, das eine blockierende Gruppe von einem blockierten Inhibitor für ein zweites Enzym zu entfernen vermag, kann durch das Verfahren der Erfindung nachgewiesen werden.
Bevorzugte unbekannte Enzyme sind im allgemeinen Hydrolasen wie Phosphatasen, Peptidasen, Esterasen und Glycosidasen. Beispielhaft für geeignete unbekannte Enzyme, die durch das Verfahren der Erfindung nachgewiesen werden können, sind Trypsin, Thrombin, Säuger-Leberesterase, Acetylcholinesterase, β-Galactosidase, β-Glucuronidase, alkalische Phosphatase, saure Phosphatase und Leucinaminopeptidase.
Der blockierte Fluorketon-Inhibitor ist ein blockierter Inhibitor, der gegenüber dem zweiten Enzym nicht reaktionsfähig ist, bis seine blockierende Gruppe durch das unbekannte Enzym entfernt wird und der Inhibitor in das Assay-Medium hinein freigesetzt wird. Somit hängt die Wahl der Komponenten des blockierten Inhibitors von dem unbekannten Enzym und dem zweiten Enzym ab, die eingesetzt werden sollen. Die blockierende Gruppe sollte eine sein, die mit dem Inhibitor kovalent über eine Bindung konjugiert sein kann, die durch das unbekannte Enzym im wesentlichen selektiv gespalten werden kann, und die Inhibitor-Komponente sollte die Aktivität des zweiten Enzyms hemmen, während sie auf das unbekannte Enzym im wesentlichen keinerlei Wirkung ausübt. Die blockierende Gruppe sollte nach der Abspaltung vom blockierten Inhibitor im wesentlichen gegenüber allen anderen Komponenten des Assays unwirksam sein. Dementsprechend werden die Natur des zweiten Enzyms und seines Substrats vor der weiteren Beschreibung des blockierten Inhibitors und des Inhibitors besprochen.
Bei dem Assay der Erfindung ist das zweite Enzym im allgemeinen eine Hydrolase, die das Substrat in das Produkt umwandelt. Geeignete Hydrolasen sind beispielsweise Phosphatasen, Peptidasen wie Trypsin, Chymotrypsin und Pepsin, oder vorzugsweise Esterasen wie Acetylcholinesterase (AchE) und Butylcholinesterase. Das meistbevorzugte zweite Enzym ist eine Carboxyesterase wie Kaninchen-Leberesterase (RLE).
Das Substrat kann eine beliebige Substanz sein, die eine Gruppe enthält, die in der Indikator-Reaktion durch das zweite Enzym abgespalten werden kann, um ein Produkt zu liefern, das durch ein mit Farbe zusammenhängendes Signal nachweisbar ist. Somit ist in einer Ausführungsform der Erfindung das nachgewiesene Signal die Entwicklung oder das Verschwinden einer Farbe oder ein Übergang von einer Farbe in eine andere. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung kann das Signal eine Veränderung der Geschwindigkeit sein, mit der das Substrat in das Produkt umgewandelt wird; beispielsweise kann beobachtet werden, daß die Farbe eines Substrats über eine spezifizierte Zeit hinweg unverändert bleibt. Dementsprechend können Messungen des Signals entweder unter kinetischen oder unter thermodynamischen Bedingungen durchgeführt werden. Kinetische Messungen bestimmen die Geschwindigkeit der Änderung, die im Laufe der Zeit stattfindet, und werden im allgemeinen in der Weise durchgeführt, daß eine Reihe von Messungen zu verschiedenen Zeiten nach dem Kombinieren der Assay-Reagentien durchgeführt wird. Thermodynamische Messungen bestimmen das Ausmaß der Veränderung, die dann stattgefunden hat, wenn das Gleichgewicht zwischen dem Substrat und dem Produkt der Indikator-Reaktion erreicht ist. Messungen können entweder instrumentell oder vorzugsweise mit bloßem Auge vorgenommen werden.
Es wird bevorzugt, daß das Substrat farblos ist, bis es durch das zweite Enzym gespalten wird, um ein gefärbtes Produkt zu ergeben. Geeignete Substrate sind Indoxylester und, vorzugsweise, Ester von Nitrophenolen wie o- und p-Nitrophenylacetate oder -butyrate. Diese Substrate sind farblos, bis die Abspaltung der Acetyl- oder Butyryl-Gruppe durch Carboxyesterase unter Bildung gefärbter Nitrophenole stattfindet. Wenn das Substrat ein Ester eines Nitrophenol ist, ist dementsprechend das Signal, das gemessen wird, die Hemmung der Bildung einer Farbe.
Es ist offensichtlich, daß das Verfahren der vorliegenden Erfindung auch in dar Fluorimetrie eingesetzt werden kann. In dieser Ausführungsform der Erfindung vermag das zweite Enzym ein nicht-fluorogenes Substrat in ein fluorogenes Produkt umzuwandeln, worin das gemessene Signal die Hemmung der Fluoreszenz ist.
Wie oben erwähnt, spaltet das unbekannte Enzym die blockierende Gruppe vom blockierten Inhibitor ab, um den Inhibitor des zweiten Enzyms bereitzustellen. Geeignete Enzym-Inhibitoren und blockierte Enzym-Inhibitoren sind in den nachstehenden allgemeinen Formeln I bis IV dargestellt, worin die Natur der später beschriebenen Gruppe B bestimmt, ob die Verbindung ein Inhibitor oder ein blockierter Inhibitor ist.
In den Formeln I bis IV kann R&sub1; H, ein verzweigtes oder unverzweigtes Niederalkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder
sein, worin R&sub2; ein Niederalkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen sein kann; R&sub3; kann H, Nitro, Alkoxy, Halogen und dergleichen sein; R&sub4; kann eine Alkyl-Gruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoff-Atomen oder eine Alkenyl- oder Alkinyl-Gruppe mit 2 bis 10 Kohlenstoff-Atomen sein, die gegebenenfalls mit einer Aryl-Gruppe oder einer mit einer Nitro-, Hydroxyl-, Mercapto-, Alkoxy-, Halogenalkyl-, Hydroxyalkyl-, Mercaptoalkyl-Gruppe substituierten Aryl-Gruppe substituiert ist; Y und Z können unabhängig voneinander H oder F sein, wobei wenigstens einer von Y und Z F ist; X kann O, S oder NR&sub5; sein, worin R&sub5; H oder R&sub2; sein kann; n kann 1 bis 6 sein; m kann 2 bis 6 sein; A kann F oder CF&sub3; sein; und B kann H, eine Phosphorsäure oder deren Salz; eine Glycosyl-Gruppe; ein Aminosäure-Rest wie ein Lysin- oder Arginin-Rest, der über die Aminosäurecarboxyl-Gruppe kovalent mit X konjugiert ist, eine Acyl-Gruppe mit 2 bis 4 Kohlenstoff- Atomen wie eine Acetyl- oder Butyryl-Gruppe oder ein Peptid der Formel
sein, wobei R&sub6; (CH&sub2;)&sub4;NH&sub2;,
oder Benzyl ist.
R&sub7; kann H oder ein verzweigtes oder unverzweigtes Niederalkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen sein; R&sub8; kann H, ein verzweigtes oder unverzweigtes Niederalkyl oder Hydroxy-Niederalkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoff-Atomen, CH&sub2;COOH oder (CH&sub2;)&sub2;COOH sein; R&sub9; kann ein verzweigtes oder unverzweigtes Niederalkyl oder Niederalkoxy mit 1 bis 4 Kohlenstoff-Atomen, Phenyl oder Benzyloxy sein; und q kann 0 bis 10 sein.
Wenn B H ist, repräsentieren die Formeln I bis IV Enzym- Inhibitoren. Wenn B irgendeine andere, von H verschiedene Gruppe ist, repräsentieren die Formeln I bis IV blockierte Enzym-Inhibitoren. Wenn B eine Phosphorsäure oder deren Salz ist, ist beabsichtigt, daß B die Formel
hat, wobei P an X gebunden ist und n wie oben angegeben sein kann.
Der Inhibitor und der blockierte Inhibitor entsprechend den Formeln I bis IV kann durch irgendeine Sequenz herkömmlicher chemischer Reaktionen hergestellt werden, die der Fachmann sich vorstellen kann. Geeignete und zweckmäßige Methoden sind in den nachstehenden Beispielen angegeben. Die folgende Liste wirksamer Enzym-Inhibitoren soll nur beispielhaft aufgefaßt werden. Name NMR-Daten Ki(M)^ (Esterase) 1,1,1-Trifluor-3-(4-hydroxyphenyl)-propanon 1,1,1-Trifluor-3-(3-hydroxyphenyl)-2-propanon 1,1,1-Trifluor-4-(4-hydroxyphenyl)-2-butanon 1,1,1-Trifluor-4(3-hydroxyphenyl)-2-butanon 1,1,1-Trifluor-5-(4-hydroxyphenyl)-2-pentanon 1,1,1-Trifluor-5-(3-hydroxyphenyl)-2-pentanon 1,1,1-Trifluor-6-(4-hydroxyphenyl)-2-hexanon 1-Phenyl-3,3-difluor-10-hydroxy-4-decanon 1,1,1-Trifluor-5-hydroxy-2-pentanon 1,1,1-Trifluor-6-hydroxy-2-hexanon 1,1,1-Trifluor-8-hydroxy-2-octanon 1-Hydroxy-5,5-difluor-8,8-dimethyl-4-nonanon 1,1,1,2,2-Pentafluor-5-(4-hydroxyphenyl)-3-pentanon 1,1,1-Trifluor-4-(3-hydroxyphenyl)-3-trans-buten-2-on N,N-Dimethyl-N-[2-(hydroxy)-ethyl]-5,5,5-trifluor-4-oxo-pentanaminiumhydroxid-Salz N,N-Dimethyl-N-[4-(hydroxy)-butyl]-5,5,5-trifluor-4-oxo-pentanaminiumhydroxid-Salz PLE Schweine-Leberesterase (E.C. 3.1.1.1) RLE Kaninchen-Leberesterase (E.C. 3.1.1.1) AChE Acetylcholinesterase (E.C. 3.1.1.7)
In einer speziellen Anwendung der Erfindung ist das unbekannte Enzym alkalische Phosphatase, das zweite Enzym ist RLE oder AChE und der blockierte Inhibitor ist das fluorierte Keton mit der Formel V. Falls in der unbekannten Flüssigkeit alkalische Phosphatase vorhanden ist, verursacht sie die Spaltung der Phosphatester-Bindung in V und ergibt den Inhibitor mit der Formel VI. Der Assay wird durch das Hinzufügen von o-Nitrophenylbutyrat oder o-Nitrophenylacetat, VII, beendet. alkalische Phosphatase
Wenn der Inhibitor VI infolge der Gegenwart der alkalischen Phosphatase in der unbekannten Flüssigkeit gebildet wird, wird die Aktivität der Esterase gehemmt, und das farblose Substrat VII wird nicht in das gefärbte Produkt VIII überführt. Wenn in der unbekannten Flüssigkeit keine alkalische Phosphatase vorhanden ist, wird kein Inhibitor VI gebildet und das gefärbte Produkt VIII bildet sich, weil die Esterase nicht gehemmt wird.
Bis jetzt sind zwei Stufen der Enzym-Verstärkung beschrieben worden. Falls eine zusätzliche Signal-Verstärkung gewünscht wird, kann ein vielstufiger Kaskaden-Verstärkungs-Assay ausgeführt werden, worin ein Vielzahl von Reagenzien im Medium des Assays nacheinander letztendlich zur Signal-Verstärkung führt. Um diese Ausführungsform der Erfindung zu beschreiben, ist es praktisch, das oben beschriebene unbekannte Enzym als ein primäres Enzym zu betrachten, das ein Reagenz im Assay-Medium enzymatisch in ein sekundäres Enzym umwandelt, das den Modulator für das oben beschriebene zweite Enzym entblockiert. Weiterhin kann das sekundäre Enzym oder jedes nachfolgende Enzym mit zusätzlichen Reagenzien reagieren, um zusätzliche Enzyme verfügbar zu machen, die die Kaskade enzymatischer Reaktionen fortsetzen können, bis der Modulator entblockiert ist. Alternativ kann das zweite Enzym, anstatt die Indikator- Reaktion direkt zu katalysieren, ein Reagenz im Assay-Medium in ein drittes Enzym umwandeln, das der Katalysator für die Indikator-Reaktion ist. Durch die geeignete Auswahl von Reagenzien, die dem Assay-Medium hinzugefügt werden, kann jede beliebige Zahl an Verstärkungsstufen ausgeführt werden.
Verstärkung tritt in jeder Ausführungsform der bis hierher beschriebenen Erfindung auf, da das unbekannte Enzym, das zweite Enzym oder jedes andere Enzyme als ein wahrer Katalysator wirkt, worin ein einzelnes Enzym-Molekül auf eine im wesentlichen unbegrenzte Anzahl von blockierten Inhibitoren oder Substrat-Molekülen einwirken kann, ohne verbraucht zu werden. Daher wäre theoretisch ein Molekül des zweiten Enzyms ausreichend, um das unbekannte Enzym durch das Verfahren der Erfindung nachzuweisen. In der Praxis hängt der Nachweis der Mengen des zweiten Enzyms, des Substrats und des hinzuzufügenden blockierten Inhibitors und die Anzahl der Verstärkungs-Stufen vom Grad der gewünschten Verstärkung ab und fällt durchaus in den Zuständigkeitsbereich eines Fachmanns.
Es ist offensichtlich, daß eine fast unbegrenzte Zahl von Assay-Konfigurationen vorstellbar ist, die zum Nachweis des unbekannten Enzyms geeignet sind. Die Enzym-Konzentration kann dadurch bestimmt werden, daß die Größe des. bei der unbekannten Probe erzeugten Signals mit der Größe des gemessenen Signals bei einem Assay in einem Bereich bekannter Konzentrationen des Liganden verglichen wird, der unter im wesentlichen gleichen Bedingungen analysiert wird. Wenn das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung der Enzym-Konzentration eingesetzt werden soll, ist es vorteilhaft, die Signal-Intensität mittels eines geeigneten Instruments, etwa eines Spektralphotometers, beispielsweise eines Spektralphotometers Beckman DU7, Beckman Instruments, Inc., Irvine, Kalifornien, abzulesen.
Ein anderer Aspekt der Erfindung ist ein Reagens-Kit oder eine Packung von Stoffen zur Durchführung eines Assays auf ein unbekanntes Enzym gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung. Der Kit kann ein zweites Enzym, einen blockierten Modulator für das zweite Enzym und ein Substrat für das zweite Enzym enthalten. Der Kit kann ebenfalls Standards für das unbekannte Enzym, beispielsweise eine oder mehrere Proben vorbestimmter Konzentration, enthalten, oder er kann andere Enzyme und Enzym-Substrate umfassen, die bei der Durchführung des Assays nützlich sind. Er kann Lösungen wie Kochsalz-Lösung oder Puffer enthalten. Die Komponenten des Kits können in getrennten Behältern, wie beispielsweise Ampullen, geliefert werden, oder zwei oder mehr der Komponenten können in einem einzigen Behälter vereinigt werden.

EXPERIMENTELLES

Analytische Routine-Techniken

Silicagel-Flash-Chromatographie wurde auf ICN-Silicagel von 32- 63 mesh bei 0,21 bis 0,98 bar (3 bis 7 psi) durchgeführt. Analytische Dünnschicht-Chromatographie (TLC) wurde auf aluminiumkaschierten Silicagel-Platten der Größe 0,25 mm x 5 cm x 20 cm von EM Scientific durchgeführt. Präparative TLC wurde auf Silicagel-Platten der Größe 2,0 mm x 20 cm x 20 cm mit Glas-Rückseite von EM Scientific durchgeführt. Die Schmelzpunkte wurden auf einer Thomas-Hoover-Kapillar-Schmelzpunkts-Apparatur bestimmt und sind unkorrigiert. Die NMR-Spektren wurden mit einem IBM WP-200SY-Spektralphotometer aufgenommen, und die chemischen Verschiebungen sind in ppm relativ zu Tetramethylsilan angegeben. HPLC wurde auf einem Waters 510-Zweipumpen- System mit UV-Nachweis unter Einsatz von einem von zwei Lösungsmittel-Systemen auf einer Brownlee AX-300 Säule von 7 mm x 250 mm durchgeführt. System A) wurde zu Beginn 5 min bei 30 mM NH&sub4;OAc, pH 6,5, gehalten, darauffolgte 30 min ein linearer Gradient bis zu 2,0 M NH&sub4;OAc, und anschließend wurde 5 min bei 1,0 M NH&sub4;OAc gehalten. System B) benutzte 40 min ein isokratisches Puffer-System von 30 mM NH&sub4;OAc, pH 6,5. Die Fließgeschwindigkeiten betrugen 1,0 ml/min. Die Gaschromatographie (GC) wurde auf einem Gas-Chromatographen H.P. 5840A, der mit einem FID und einem automatischen Injektor ausgerüstet war, unter Verwendung einer 30 M DB-1 Megabore -Säule, die von J&W Scientific, Inc., bezogen wurde, durchgeführt. Die GC- Bedingungen waren folgende:
3 min Halten bei 100 ºC, anschließend Gradient von 10 ºC/min bis 250 ºC, anschließend 3,0 min Halten bei 250 ºC, bei einer Fließgeschwindigkeit von 16,0 ml/min.
Die Hemmkonstanten wurden in 50 mM Tris, pH = 8,0, gemessen. Enzym und Inhibitor wurden 20 min bei Umgebungstemperatur inkubiert. Das Substrat für das Enzym wurde dann hinzugefügt, und die Geschwindigkeit der Hydrolyse wurde spektralphotometrisch verfolgt. Das Substrat für PLE und RLE war o-Nitrophenylbutyrat, und das Substrat für AChE war Acetylthiocholin und Ellman's Reagens.

BEISPIEL I

Diammonium-[4-(3-oxo-4,4,4-trifluorbutyl)phenyl]phosphat

A. Ethyl-3-(4-methoxyphenyl)-2-(1-oxo-2,2,2-trifluorethyl)propionat

Ein 1-Liter-Vierhals-Rundkolben, der mit Rückflußkühler, Tropftrichter, Argon-Einlaß und Magnetrührer ausgerüstet war, wurde mit 7,17 g (0,149 mol) einer 50-proz. Öl-Dispersion von Natriumhydrid und 300 ml trockenem Ethylether beschickt. 9 ml absolutes Ethanol wurde langsam zu der gerührten Lösung hinzugefügt. Nach dem die Wasserstoff-Entwicklung beendet war, wurde eine Mischung von 25 g (0,136 mol) Ethyl-4,4,4-trifluormethylacetoacetat und 21,3 g (0,136 mol) 4-Methoxybenzylchlorid während eines Zeitraums von 1 h hinzugefügt. Die Mischung wurde dann über Nacht zum Rückfluß erhitzt. Die Reaktionsmischung wurde danach abgekühlt, mit Wasser und 1N HCl extrahiert, getrocknet (wasserfreies MgSO&sub4;), und das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt. Die rohe Reaktionsmischung, 33,5 g, wurde auf einer Silicagel-Säule von 60 mm x 300 mm mit einem 1:3-Gemisch aus Ethylacetat:Hexan chromatographiert. Gleichartige Fraktionen wurden vereinigt und lieferten 9,0 g (27 %) des gewünschten Produkts als Öl. NMR (CDCl&sub3;) - δ: 2,12 (m, 3H); 2,67 (m, 2H); 3,85 (m, 3H); 3,90 (s, 3H); 7,24 (q, 4H).

B. 1,1,1-Trifluor-4-(4-hydroxyphenyl)-2-butanon.

Ein 100-ml-Rundkolben, der mit Rückflußkühler, Magnetrührer und Argon-Einlaß ausgerüstet war, wurde mit 2,05 g (6,7 mmol) Ethyl-3-(4-methoxyphenyl)-2-(1-oxo-2,2,2-trifluoroethyl)propionat, 20 ml 31-proz. HBr in AcOH und 10 ml Wasser beschickt. Diese Mischung wurde über Nacht auf 120 ºC erhitzt, unter vermindertem Druck konzentriert und zwischen Dichlormethan und Wasser partitioniert. Die organische Schicht wurde mit wäßrigem Bisulfit und mit gesättigtem Natriumbicarbonat extrahiert, getrocknet (wasserfreies MgSO&sub4;), und das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt. Die rohe Reaktionsmischung wurde auf einer Silicagel-Säule von 50 mm x 300 mm mit 1:1 Ethylacetat:Hexan chromatographiert. Gleichartige Fraktionen wurden vereinigt, und das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt, wonach 600 mg (41 %) als klares Öl erhalten wurden. NMR (CDCl&sub3;) - δ: 2,95 (m, 4H); 4,90 (bd, 1H); 6,93 (dd, 4H, J = 4,60 Hz).

C. Diethyl-[4-(3-oxo-4,4,4-trifluorbutyl)phenyl)phosphat

Ein 10-ml-Einhals-Rundkolben, der mit Argon-Einlaß und Magnetrührer ausgerüstet war, wurde in ein Eisbad gestellt und mit 400 mg (1,8 mmol) 1,1,1-Trifluor-4-(4-hydroxyphenyl)-2-butanon, 400 mg (2,4 mmol) Diethylchlorphosphat, 0,15 ml trockenem Pyridin und 5 ml Dichlormethan bei 5 ºC beschickt. Die Mischung wurde über Nacht bei Umgebungstemperatur gerührt, zur Entfernung von Pyridin-HCl filtriert, mit 0,2 N HCl extrahiert, mit Wasser extrahiert und getrocknet (wasserfreies MgSO&sub4;). Die Entfernung des Lösungsmittels unter vermindertem Druck ergab eine Roh-Ausbeute von 600 mg eines braunen Öls. Präparative TLC unter Verwendung von 1:1 Ethylacetat:Hexan lieferte 600 mg (92 %) eines klaren Öls. NMR (CDCl&sub3;) - δ: 1,50 (m, 6H); 3,0 (m, 4H); 4,20 (m, 4H); 7,15 (s, 4H).

D. Diammonium-[4-(3-oxo-4,4,4-trifluorbutyl)phenyl]phosphat

Ein 25-ml-Einhals-Rundkolben, der mit Argon-Einlaß und Magnetrührer ausgerüstet war, wurde mit 5,0 ml Dichlormethan, 140 mg (0,4 mmol) Diethyl-[4-(3-oxo-4,4,4-trifluorbutyl)phenyl]phosphat und 2,0 ml Bromtrimethylsilan beschickt. Nachdem diese Mischung 3 h bei Umgebungstemperatur gerührt worden war, wurden 10 ml Methanol hinzugefügt, und die flüchtigen Stoffe wurden unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde in Wasser gelöst, und der pH-Wert wurde mit 1,0 N NaOH auf 7,3 eingestellt. Die wäßrige Lösung wurde mit Ethylether extrahiert und lyophilisiert, wonach 190 mg eines weißen festen Stoffs erhalten wurden. Dieses Material wurde in 10 ml NH&sub4;OAc-Puffer gelöst und mittels HPLC unter Einsatz des Systems A) gereinigt. Die Ausbeute des Produkts nach der Lyophilisierung betrug 50 mg (37 %); Schmp. 235-240 ºC. NMR (D&sub2;O) - δ: 1,90 (m, 2H); 2,56 (m, 2H); 4,65 (s, DOH); 6,88 (dd, 4H; J = 6,82 Hz).

BEISPIEL II

1-Hydroxy-5,5-difluor-8,8-dimethyl-4-nonanon

A. Ethyl-2,2-difluor-5,5-dimethylhexanoat

Ein 100-ml-Dreihals-Rundkolben, der mit Tropftrichter, Argon- Einlaß, Eisbad und Magnetrührer ausgerüstet war, wurde mit 8,0 ml Dichlormethan und 2,21 g (20 mmol) Ethyl-2-oxo-5,5-dimethylhexanoat beschickt. Diethylaminoschwefeltrifluorid, 2,11 g (13 mmol) in 5 ml Dichlormethan, wurde zu der Reaktionsmischung während eines Zeitraums von 15 min hinzugefügt, und die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei Umgebungstemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde zwischen Wasser und Dichlormethan partitioniert, die organische Schicht wurde getrocknet (wasserfreies MgSO&sub4;), und das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt. Der ölige Rückstand wurde bei 83-88 ºC unter 26,6 mbar (20 mmHg) destilliert, wonach 1,0 g (25 %) erhalten wurden. NMR (CDCl&sub3;) - δ: 0,95 (s, 9H); 1,40 (m, 4H); 2,10 (m, 2H); 4,35 (q, 2H).

B. 2,3,4,5-Tetrahydro-2-oxo-3-[(5,5-dimethyl-2,2-difluor-1- oxo)hexyl]furan

Ein 25-ml-Dreihals-Rundkolben, der mit Trockenrohr, Tropftrichter, Heizmantel und Magnetrührer ausgerüstet war, wurde mit 0,24 g (5,0 mmol) Natriumhydrid in einer 50-proz. Öl-Dispersion beschickt. Das Natriumhydrid wurde mit trockenem Hexan gewaschen (2 x 10 ml), und 5 ml Ethylether wurden dem Kolbeninhalt zugesetzt. Eine Mischung aus 5 Tropfen absolutem Ethanol und 5 ml Ether wurde langsam zu der Natriumhydrid-Suspension hinzugefügt. Nach Beendigung der Wasserstoff-Entwicklung wurde eine Mischung aus 1,0 g (5 mmol) Ethyl-2,2-difluor-5,5-dimethylhexanoat und 0,43 g (5,0 mmol) γ-Butyrolacton in 5 ml Ethylether während eines zeitraums von 20 bin hinzugefügt. Die Lösung wurde 3 h zum Rückfluß erhitzt und bei Umgebungstemperatur über Nacht rühren gelassen. Die Reaktionsmischung wurde mit 1 N HCl partitioniert, die organische Schicht wurde mit Wasser gewaschen (2 x 50 ml), getrocknet (wasserfreies MgSO&sub4;), und das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt. Der ölige Rückstand, 0,88 g, wurde aus einem Hexan: Ethylacetat-Gemisch umkristallisiert und ergab 0,66 g (53 %). NMR (CDCl&sub3;) - δ: 0,95 (s, 9H); 1,35 (m, 2H) ; 2,00 (m, 3H); 2,50 (m, 2H); 3,00 (m, 1H); 4,25 (m, 1H); 4,5 (m, 1H).

C. 1-Hydroxy-5,5-difluor-8,8-dimethyl-4-nonanon

Ein 10-ml-Einhals-Rundkolben, der mit Argon-Einlaß. Magnetrührer und Rückflußkühler ausgerüstet war, wurde mit 1,0 ml Eisessig, 4 Tropfen konzentrierter HCl und 200 mg (0,81 mmol) 2,3,4,5-Tetrahydro-2-oxo-3-[ (5,5-dimethyl-2,2-difluor-1-oxo)hexyl]furan beschickt. Die Reaktionsmischung wurde unter einer Argon-Decke über Nacht auf 110 ºC erhitzt. Die Reaktion wurde mit Ethylether extrahiert, und der Ether wurde mit Wasser rückgewaschen, getrocknet (wasserfreies MgSO&sub4;), und das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde auf einer Silicagel-Säule von 10 mm x 60 mm mit einem 9:1-Gemisch aus Hexan:Ethylacetat chromatographiert, wonach ein klares Öl erhalten wurde. NMR (CDCl&sub3;) - δ: 0,95 (s, 9H); 1,45 (t, 2H); 2,00 (m, 6H); 3,12 (bs, 1H); 4,15 (m, 1H).

BEISPIEL III

N,N-Dimethyl-N-[2-(hydroxy)ethyl]-5,5,5-trifluor-4-oxopentanaminiumhydroxid-Salz

A. 2,3,4,5-Tetrahydro-2-oxo-3-[(2,2,2-trifluor-1,1-dihydroxy)ethyl]furan

Ein 3-Liter-Dreihals-Rundkolben, der mit Rückflußkühler, Tropftrichter, Argon-Einlaß, Magnetrührer und Heizmantel ausgerüstet war, wurde mit 36 g (0,75 mol) einer 50-proz. Dispersion von Natriumhydrid in Öl beschickt. Das Natriumhydrid wurde mit trockenem Hexan (2 x 200 ml) gewaschen und dann in 800 ml Ethylether und 2 ml absolutem Ethanol suspendiert. Eine Mischung aus 60,2 g (0,7 mol) γ-Butyrolacton und 99,4 g (0,7 mol) Ethyltrifluoracetat in 750 ml Ether wurde zu der Suspension mit einer Geschwindigkeit hinzugefügt, bei der die Reaktion unter leichtem Rückfluß gehalten wurde. Die Mischung wurde weitere 2 h zum Rückfluß erhitzt und dann über Nacht bei Umgebungstemperatur gerührt. Die Reaktion wurde in einem Eisbad abgekühlt, und 1 N HCl (250 ml) wurde hinzugefügt. Die organische Schicht wurde abgetrennt, mit Wasser (2 x 200 ml) gewaschen, getrocknet (wasserfreies MgSO&sub4;), und das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde aus Hexan:Ethylacetat umkristallisiert, wonach 64,0 g (45,4 %) erhalten wurden; Schmp. 87-90 ºC. NMR (DMSO-d&sub6;) - δ: 2,33 (m, 2H); 3,09 (t, 1H, J = 7 Hz); 4,20 (m, 2H); 7,00 (s, 1H); 7,52 (s, 1H).

B. Herstellung von 1,1,1-Trifluor-5-hydroxy-2-pentanon

Ein 500 ml-Dreihals-Rundkolben, der mit Rückflußkühler, Tropftrichter, Heizmantel und Magnetrührer ausgerüstet war, wurde mit 61,5 g (0,31 mol) 2,3,4,5-Tetrahydro-2-oxo-3-[(2,2,2-1 trifluor-1,1-dihydroxy)ethyl]furan, 6,4 ml konz. HCl, 10 ml Wasser und 80 ml Essigsäure beschickt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht auf 125 ºC erhitzt. Weitere 3,0 ml konz. HCl und 5,0 ml Wasser wurden hinzugefügt, und die Reaktionsmischung wurde weitere 10 h erhitzt. Die Reaktionsmischung wurde zwischen Wasser und Ethylether partitioniert, wobei die Wasserschicht mit festem Natriumbicarbonat (100 g) neutralisiert wurde. Die Ether-Lösung wurde mit Wasser (2 x 20 ml) gewaschen, getrocknet (wasserfreies MgSO&sub4;), und das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt, wonach 60 g (45 %) eines blaßgelben Öls erhalten wurden. NMR (CDCl&sub3;) - δ: 2,14 (m, 4H); 4,03 (m, 1H); 4,20 (m, 1H).

C. 1,1,1-Trifluor-5-brom-2-pentanon

Ein 500 ml-Dreihals-Rundkolben, der mit Tropftrichter, Magnetrührer, Eis-Salz-Bad und Argon-Einlaß ausgerüstet war, wurde mit 125 ml trockenem Dimethylformamid, 29 g (35,7 mmol) Trifluor-5-hydroxy-2-pentanon beschickt. Dieses Gemisch wurde auf -5 ºC gekühlt, und 11,5 g (71,6 mmol) Brom wurden tropfenweise während eines Zeitraums von 2 h hinzugefügt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei Umgebungstemperatur gerührt und dann bei einem Druck von 2,66 mbar (2,0 mm Hg) über eine 30 cm-Vigreux-Kolonne destilliert. Zwei Fraktionen wurden aufgefangen, die erste Fraktion von 27 ºC bis 35 ºC, und die zweite Fraktion von 35 ºC bis 70 ºC. Die zweite Fraktion wurde zwischen Wasser und Ethylether partitioniert, die organische Schicht wurde mit Wasser (3 x 100 ml) gewaschen, getrocknet (wasserfreies MgSO&sub4;) und unter vermindertem Druck bei Umgebungstemperatur eingedampft, wonach 40 g einer farblosen öligen Mischung aus Dimethylformamid, Ether und dem gewünschten Produkt erhalten wurde, die ohne weitere Reinigung bei der nächsten Reaktion eingesetzt wurde.

D. N,N-Dimethyl-5,5,5-trifluor-4-oxopentanamin

Ein 500 ml-Dreihals-Rundkolben, der mit Tropftrichter, Argon-Einlaß, Magnetrührer und Eis-Salz-Bad ausgerüstet war, wurde mit 21,5 g (0,45 mol) wasserfreiem Dimethylamin bei -8 ºC beschickt. Zu dieser Mischung wurden 19,4 g (88,5 mmol) 1,1,1- Trifluor-5-brom-2-pentanon in Dimethylformamid und Ethylether tropfenweise bei -10 ºC hinzugefügt. Die Suspension wurde 2,5 h bei -10 ºC gerührt. Das Lösungsmittel wurde dann von dem Niederschlag dekantiert. Der Niederschlag wurde mit Ethylether (3 x 200 ml) gewaschen, die organischen Schichten wurden vereinigt, mit Wasser (2 x 30 ml) gewaschen, getrocknet (wasserfreies MgSO&sub4;) und unter vermindertem Druck eingedampft, wonach 15,0 g (92 %) eines blaßgelben Öls erhalten wurden. NMR des HCl-Salzes (CDCl&sub3;) - δ: 1,89 (s, 4H); 2,90 (s, 6H); 3,21 (t, 2H).

E. N,N-Dimethyl-N-[2-(methoxy)ethyl]-5,5,5-trifluor-4-oxopentanaminiumhydroxid-Salz

Ein 25 ml-Einhals-Rundkolben wurde mit 2,95 g (21,2 mmol) 2-Bromethylmethylether, 0,33 g (1,77 mmol) N,N-Dimethyl-5,5,5- trifluor-4-oxopentanamin und 2,5 ml Dimethylformamid beschickt, und die Mischung wurde 3 d bei Umgebungstemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt, und das bernsteinfarbene Öl wurde auf einer Dowex -1-Säule (15 mm x 200 mm) in der Hydroxid-Form mit 200 ml Wasser chromatographiert. Das Eluat aus der Säule wurde lyophilisiert, wonach 0,28 g (60 %) eines bernsteinfarbenen Öls erhalten wurden, das das Produkt in Form seines Hydroxid-Salzes war. NMR (D&sub2;O) - δ: 1,94 (m, 2H); 3,13 (s, 6H); 3,39 (s, 3H); 3,41 (m, 2H); 3,60 (m, 2H); 3,88 (bs, 2H). Das Material wurde in der nächsten Reaktion ohne weitere Reinigung verwendet.

F. N,N-Dimethyl-N-[2-(hydroxy)ethyl)-5-,5,5-trifluor-4-oxopentanaminiumhydroxid-Salz

Ein 10 ml-Rundkolben, der mit Argon-Einlaß und Rückflußkühler ausgerüstet war, wurde mit 0,275 g (1,1 mmol) N,N-Dimethyl-N- [2-(methoxy)ethyl]-5,5,5-trifluor-4-oxopentanaminiumhydroxid- Salz, 4,0 ml Wasser und 8,0 ml 30-proz. HBr in Essigsäure beschickt. Die Mischung wurde 5 h auf 120 ºC erhitzt, abgekühlt, und das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde zusammen mit 20 ml Wasser verdampft, und das resultierende Öl wurde auf einer Dowex -1-Säule (15 mm x 200 mm) in der Hydroxid-Form chromatographiert. Das Eindampfen des Eluats unter vermindertem Druck lieferte 0,17 g (63 %) des Produkts in Form des Hydroxid-Salzes. NMR (D&sub2;O) - δ: 1,90 (m, 4H); 3,13 (s, 6H); 3,30 (m, 2H); 3,48 (m, 2H); 4,01 (bs, 2H).

BEISPIEL IV

N,N-Dimethyl-N-[2-(phosphonooxy)ethyl]-5,5,5-trifluor-4-oxopentanaminium-ammoniumsalz

Ein 10 ml-Dreihals-Rundkolben, der mit Tropftrichter, Argon- Einlaß, Magnetrührer und Eis-Salz-Bad ausgerüstet war, wurde mit 0,093 ml (1,0 mmol) Phosphoroxychlorid und 0,5 ml Trimethylphosphat beschickt. Zu dieser Mischung wurden 70,0 mg (0,2 mmol) N,N-Dimethyl-N-[2-(hydroxy)ethyl]-5,5,5-trifluor-4- oxopentanaminiumhydroxid-Salz tropfenweise bei -10 ºC hinzugefügt. Die Mischung wurde 30 min gerührt und dann über Nacht in einen Gefrierschrank gestellt. Die Mischung wurde mit Ethylether und anschließend mit Petrolether (4 x 50 ml) verrieben, wonach ein harzartiger Niederschlag erhalten wurde. Dieser Niederschlag wurde mit Eis bedeckt, mit 1 N NaOH auf einen pH- Wert von 6,0 neutralisiert und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Der resultierende feste Stoff, 107 mg, wurde in 30 mM NH&sub4;OAc-Puffer bei pH 7,0 gelöst und durch HPLC mit System B) gereinigt. Das Produkt, das bei 12 min eluierte, wurde durch Lyophilisieren des Puffers isoliert, wonach 9,0 mg (11 %) als farbloses Harz erhalten wurden. NMR (D&sub2;O) - δ: 1,90 (m, 4H); 3,14 (s, 6H); 3,42 (m, 2H); 3,60 (m, 2H); 4,19 (bs, 2H).
Zusammenfassend macht die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis oder der Bestimmung eines unbekannten Enzyms verfügbar, das in einer Flüssigkeit vorliegt. Die Flüssigkeit wird mit einem zweiten Enzym und einem blockierten Inhibitor in Berührung gebracht, wodurch das unbekannte Enzym die blockierende Gruppe entfernt, um einen Inhibitor für das zweite Enzym verfügbar zu machen. Es wird ein Substrat für das zweite Enzym hinzugefügt. Der Inhibitor hemmt die Umwandlung des Substrates in ein Produkt durch das zweite Enzym und führt so zu einem nachweisbaren Signal. Der Nachweis des Signals legt die Anwesenheit oder Abwesenheit des unbekannten Enzyms in der Probe fest. Durch Messen der Größe des Signals kann die Konzentration des Enzyms bestimmt werden. Der Inhibitor und das zweite Enzym stellen zwei Stufen der Verstärkung bereit, wodurch das Signal 100fach oder mehr verstärkt wird, was die Erfassung des Signals mit bloßem Auge in einer bis zu 100-fach kürzeren Zeit als bei einem konventionellen Enzym-Assay ermöglicht.

Claims

1. Verfahren zum Nachweis eines Enzyms in einer Flüssigkeit, umfassend:

(a) Kombinieren einer Flüssigkeit, die vermutlich ein unbekanntes Enzym, ein zweites Enzym und einen blockierten Fluorketon-Inhibitor des zweiten Enzyms enthält, wobei das unbekannte Enzym den blockierten Fluorketon-Inhibitor in einen Fluorketon-Inhibitor umwandelt und dadurch den Fluorketon-Inhibitor in die Flüssigkeit abgibt,

(b) Hinzufügen eines Substrates für das zweite Enzym zur Flüssigkeit, wobei eine Umwandlung des Substrats durch das zweite Enzym in einer Indikator-Reaktion in ein Produkt gehemmt wird, und

(c) Nachweisen des unbekannten Enzyms durch das Nachweisen eines mit der Indikatorreaktion assoziierten Signals.

2. Verfahren nach Anspruch 1, weiterhin umfassend das Nachweisen der Konzentration des unbekannten Enzyms in der Flüssigkeit durch das Messen der Signalgröße und durch das Vergleichen dieser Größe mit der Größe eines mit einem Produkt assoziierten Signals, wenn die Schritte (a) bis (c) mit einer flüssigen Probe wiederholt werden, die eine bekannte Menge des unbekannten Enzyms enthält.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das unbekannte Enzym eine Hydrolase ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das zweite Enzym eine Hydrolase ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Substrat aus der aus einem Ester eines Nitrophenols und einem Ester von Indoxyl bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

6. Verfahren zum Nachweis eines Enzyms in einer Flüssigkeit, umfassend:

(a) Kombinieren einer ersten Flüssigkeit, die vermutlich ein unbekanntes Enzym enthält, mit einer Esterase und einem blockierten Fluorketon-Inhibitor der Esterase, wobei das unbekannte Enzym den blockierten Fluorketon-Inhibitor in einen Fluorketon-Inhibitor umwandelt und dadurch den Fluorketon-Inhibitor in die Flüssigkeit abgibt,

(b) Hinzufügen eines Chromogens zur Flüssigkeit, wobei der Fluorketon-Inhibitor die Umwandlung des Chromogens in ein gefärbtes Produkt durch die Esterase hemmt,

(c) Messen der Größe der Hemmung und

(d) Nachweisen der Konzentration des unbekannten Enzyms in der Flüssigkeit durch das Vergleichen der Größe mit der Größe der Hemmung der Bildung eines gefärbten Produktes, wenn die Schritte (a) bis (c) mit einer flüssigen Probe wiederholt werden, die eine bekannte Menge des unbekannten Enzyms enthält.

7. Material-Kit zur Durchführung eines Assays für ein unbekanntes Enzym, umfassend eine Flüssigkeit, die eine bekannte Menge eines unbekannten Enzyms enthält, ein zweites Enzym, ein Substrat für das zweite Enzym und einen blockierten Fluorketon-Inhibitor für das zweite Enzym.

8. Kit nach Anspruch 7, weiterhin umfassend eine flüssige Probe, die im wesentlichen frei vom unbekannten Enzym ist.