TW204371B

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Publication number: TW204371B
Application number: TW078106780A
Authority: TW
Original assignee: Becton Dickinson Co
Priority date: 1988-08-11
Filing date: 1989-09-01
Publication date: 1993-04-21
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Description

Ab B6 —^04^1 五、發明說明（1 ) 1，本發明之範囷。本發明有關酵素之分析以及其中所使用的物質，而且尤其有關於分析之一種方法及物質，在此分析中，可偵測的信號之增强係藉著指示劑反應之酵素催化之調節作用來達成。

2本發明之背景。雖然酵素科學幾乎有一百年歷史，而且酵素在許多生化反應中所扮演的重要角色於40年前就被I解，但是酵素學應用於臨床㈣却是最近的事。就在最近20年前，這些應用大約只占了在臨床實驗室中所進行之測試總數之3…，而且只經例行性分析。 I 相反地，現今酵素分析占了大型醫院實驗室中全部工作的Μ ’而且多至20 - 25種酵素可經例行性分析。這些例行性分析之詳細何標準麥考書中=有關臨床或”化學之饪之二St析…液，例如血清，尿液及，脊教液中在某些分析中，^〜 ^或疋超^常範固。結果而㈣料濃度是細菌或病毒戚梁的 Π有Γ特殊酵素之分析對於特球病原而言，在珍斷存在於^ *測知—酵素不正常地存在於菝液，例如血清表示Μ可做為組織或器官损傷之如，酒精去氫酵素其是肝職專— 鱗酸魅K的以及駿性辨锻啤其疋前列腺專一性的表示在這些蕊官中之组計號中發現，則各別 •織知傷。鹼性磷騣酶活性之測量甲 4(210X297«爱） 78. 8. 3,000 ...................................................琴 f請先閑讀背面之注意事项再填窝本頁} .訂. •線…：在殄靳行膽系異常及骨骼異常方两有其重要性。測分析係根據基質.變成產物之酵素催化，其可經所有或二量。假如在酵素反應中，基質濃度逐漸增加，加而因子保持不變，則反應速率隨著基^濃廣的增度將：加，直至達到最大值。任何進-步地增加基質滾 1左、法激起反應速率再增加。因此，當基質以充分過在時，反懕速率只依酵素濃度而定。，：為酵素是真正的催化劑，而且在反應當中不被改變 .所以在充分的基質存在下，酵素反應的速率是恒定的如2在分析系統中，反應速率只因酵素濃度而定。假热•的酵素以低濃度存在’反應速率將是朴常低 ’而且可能需要—段長時間來形成足夠的▲物以備測訂 g尿液11 —測知的速度是基本要素的例子中，如決定血、中病原存在的例子中，這是—個嚴重的缺點。在酵素分析中，另一個限制是在臨床樣品中，經常存著干擾酵素活性而降低分析敏威性的物質。這些物質線 :般歸因於干擾，在血清及尿液樣品之酵素分析中是朴常麻煩的β 在免疫分析中，分析的敏或性已經藉著各種擴增步驟經濟部中央標準局印製提高。在階段式擴增作用中，可測知的（色的）分子之數目接其土疋有顏 …使用兩種或更多的酵素或酵素衍買。專利權屬於哈里斯（Harri s )的美國利案號4,463,090揭示了 —種階段式擴增作用之免疫分甲 4(210x297 公沒） 3,0〇〇 4

五、發明說明（3) 析’其中大分子催化劑，例如踌素或是和配體偶合的原酵素’活化第二酵素，此第二酵素與基質反應以生成可測知的信號，或者依次活化第三酵素。專利權屬於謝爾夫（Self )的美國專利案號 4,446,231揭示了 —種循環擴增作用的酵素免疫分折，其包括第—及第二酵素系統以及第二酵素系统調節劑。第一酵素系統包括一種和—配體偶合的第—酵素。在謝街夫之發明的第一個實例中，第一酵素系统作用在調節劑前趨物以释故出調節劑，此調節剩是第二酵素的—個輔助因子’其活化第二酵素系统以催化使基質變成可測知的產物之反應。在此反應期間，調節劑經轉化成不活化形式，而且循環是由再活化該調節劑之第三酵素來完成。在第二個實例中，調節劑是第二系統的—個抑制劑 ’而且藉著第-酵素系统移去，由是第二系统經活化以作用在基質上，而且因此產生可測知的產物。專利權屬於波古斯拉斯基（Boguslaski )等人的美國專利案號4,492,751揭示循環系统，其宁酵素基赏或輔酵素經接合至特殊速結的配錡之某一成員。許多分子已經顯示出引起標的酵素之特珠的不活化作用。一小組抑制剩，稱做機制基準的抑制劑，是酵素之基質，其和酵素反應以形成一共價鍵。機制基準的抑制劑巳由瓦史（祖Sh ),寫了評論（屈， 871(1982))。另一小組抑制劑包括其作用有如穗定的過 ...................................................^.................................^.................................^ (請先閲讀背面之注意事項再填窝本頁) 甲 4(210X297 公犮）

經濟部中央標準局印製渡態（transition state )相似物之分子。焦伯（ elb )等人在生物化學24，1813 (198 5)中巳揭示某些氟酮（fluor〇加七加郎）有如水解酵素之過渡態抑制劑。酵素分析在分析技街的目錄中是赛责的附加項目；然而他們谷易受上述的限制所支配。本發明則專注在經改良的酵素分析，其可解決這些問題。發明概要本發明的—個特點是—種在液菝中之酵素分析的方法，此酵素在下文中被解释成未知酵素。經懷疑含有此未知酵素的液體和封阻調節劑及第二酵素合倂在—起。未知酵素移去封阻基以提供調節劑给第二酵素。而後加入 :二酵素的基質。基質經第二酵素轉化成產物，此產物 =供可測知的信號。藉著第二酵素來使基赏變成產物的 :化受調節劑之調節。基質至直物的反應在下文中經解释成指示劑反應。本發明的較佳封阻調節劑是封阻抑制劑，其經由未知酵素轉化成抑㈣’較佳的第二酵素是料（邮吻 )，較佳的基質是色原（chr_gen =—。最佳的是，色原是無Π : «醇轉化成有顏色的產物，色原轉化成為產*的轉化作用受到抑制劑之抑制。本發明之另—特點包括—物質組套，其f行大體描述 .......................if31.................................t................................漆 (請先聞讀背面之注意事續再填窝本瓦) (

甲 4(210X297 么、没 78· 8· 3,〇〇〇

043*V

五、發明說明（5) 如上之本發明之方法。在包括酵素抑制劑未封阻的任何分析系統中，嚴重的拘束戚會降臨到抑制劑及經封阻的抑制劑兩者上，假如此分析要達到最大敏或度。根據本發明，經封阻的抑制劑是未知酵素之—種良好的基質，但它在本質上是不與第-酵素反應的。同樣地，未封阻的抑制劑是第二酵素之—種有力的抑制劑，但是本質上對未知酵素沒有影響。因為經封阻的抑制劑及抑制劑和未知及第二酵素之應，各別地是高度選揮性的，所以源於交叉反應而出在先前的循環性酵素免疫.分析（EIA )之·,短路，，性大體上被消除了。因此’本發明提供了 —變通的方法，俾分析以低濃存在於液禮中的雜音_。+、、本不法心间分析敏威度至胱倍- :以提供了許多優於傳統酵素分析之好處。以更低濃度在的酵素可經決定。進行分析所需的時間大大地縮短，此允許-臨床實驗室在—给定的時間内進行更多的分析0往往信號可由肉眼朴土& ”咖 ^ ^ ^ 』眼計讀，去除了對昂贵及麻烦的儀 =之需求。因此可賴著地節相銷及空間，使得根據療宣中進行。心床實驗至内，甚至發生的囷式之簡單説明附圖描述了根、。發月之方法及物質之典型分析結反現質度診果 ...................................................餐· (請先閃請背面之注意事項再填窝本页) •訂· .緣· 甲 4(21〇x 297 公沒） 78. 8. 3,000 ,043'Vi A6 B6 五、發明說明（6 ) 較佳f例之詳述雖然本發明藉著許多不同形式的赏例來充货祥細敍述本發明較佳實例，吾人要了解，本揭示將被命為是本發明原理之模苑、《^ 解及描述的實例。本發明之範圍將藉著附加的中圖範團及其相當語句來界限。口根據本發明之方法，經懷疑存在於液體宁之未知酵素可藉著至少包括兩個擴增階段之分析方法來決定。在本揭示中’街語《經冰金” - 段决尤表不酵素之測知，例如酵素之存在與否，或表示液體中酵素濃度的計量❶ 第—個擴增階段是利用未知酵素對第二酵素調節劑之去封阻作用。第二個擴增階段是利用第二酵素對指示劑反應之催化作用。這些擴増步驟繼續地發生以提供丨⑻倍或更高的信號擴增作用，因此存在於樣品中之酵索經；可以用肉眼來測知。假如需要額外的放大作用，則要提供額外的酵素以麥與—暗段式的連續反應，其中任—或所有的反應可提供進—步的信號擴增作用。本發明較佳之分析方法首先將麥考以下之分析流程表來以#田述，以提供對分析組成及它們的相互作用之一般性了解，而後各組成將予詳細討論。 B - Μ

EU/L Μ + Β

Sub Έ 2

04b'V 五、發明說明（7 ) (請先W請背面之注意事項存填寫本頁) 在:迷之流程表中，⑨用以下之定義，其中短線表示一于鍵實心箭號表示_化學轉化，虚線箭號表示第 —酵素之調節，亦卽指示劑反應之調節。 L •經分析之液體 EU •未知酵素 E2 •第二酵素 Β·Μ -經封阻之調節劑 Μ 第二酵素之游離調節劑 Β -調節劑之封阻基

Sub -基質 p - i 物。程表可看出’被懷疑含有未知酵素之液體，與經封阻的調節劑及第二酵素入、任何未知酵素移去二起。存在於液孩中之第二酵素之一基基，而且釋放出游離調節劑。藉著第二酵素轉化削反應中，基質輝京锝化成可測知的產物性藉著游離調節劑來調節—酵素之催化活之水平成正物之水平是與游離調節劑或反比，亦#卩與夫知反比，各別依據調節削是、' 波度成正比或量之真正信號可以是與抑制劑而定。經計，▲物顏色或是其形成之速：色，例如失之速率。或者疋基質顏色或其消現在轉到分心成切木知酵素可得自饪何 _ 甲4(21 Ox 297公邛 3. 〇0〇 -04^*

五、發明說明（8) 來源。例如，它可能存在於禮體液》而且隨後轉至不同，的液它例子中，未知酵素可能得自一微生物培養物，或是其中之，未知酵素可能不是來自—活成的酵素。任何能夠從第二_素<經封之酵素，可以藉著本發明之方要通行的説法以範園最庚的可酵素種類，假如可能的話，包液中，或者它可能分離自禮，例如缓衡液中。在其植液以外之來源，例如， —細胞羊取物。另一方面植，例如，它可能是—合阻的調節劑移走一封阻基法來決定。（我們在此需能街語來描述可被分析的括各種類之一或二個例子請先閲請背面之注意事项再填I本頁) 裝· 較佳的未知酵素一相z .訂· 肢肽酶，晦梅，糖物是水解酵素’例如鱗酸酶，決定之逋當：知=以及其它。可經由本發明之方法 i乳類特殊例子疋胰蛋白醉，凝血酶， -葡萄糖苷賤膽驗知酶…半乳糖.酶’力胺基胜肽酶。 ’磷酸酶，酸性磷酸酶以及白胺酸 •線· 經封阻的調節劑可第二酵素調節剛之铷：、何能夠藉著未知酵素轉化成經濟部中央標準局印製，卽調節劑以π 較佳的封阻調節劑有兩個成分 J Λ及封阻1 β 的抑制劑，立跃佳的封阻調節劑是一經封阻對第 TSjf- ^ ^ 由未知酵素移 —素是不反應的，.直到其封阻基經

，經封阻的且彳p制劑經释故至分析嫖體中。因此 q抑制劑之_ A 、成之選擇乃根據未知酵素及使用甲4(210X 297公沒

78. 8. 3,000 .後齐苹 λ- 4ί1'.·ί:?τ~.-·ρ义甲 4 (210X297 公犮） ^043'V ---- 五、發明說明（9 ) 的第—酵素。封阻基必須是能夠以一化学徤共償連接於抑制劑者，此鍵可以藉著未知酵素充分選擇性地切除，而且抑制劑組成必射p制第二酵素之活性，但是本質上對未知酵素不具影響。封阻基從經封阻的抑制劑切除後，本質上必須對所有其它的分析成分不加干擾。因此，第一酵素及其基質之性質將於進一步描述經封阻的抑制劑及抑制剞之前加以討論。在本發明之分析中，第二酵素一般而言是—水解酵素，其把基質轉化成產物。合適的水解酵素是，例如，磷醆酶，胜肽酶如胰職酶，凝乳胰臟酶及胃蛋白酶，或者較佳的疋睹酶如匕賊膽驗赌酶（AChE )及丁基膽驗暗酶最佳的第—酵素是—幾基赌酶，例如免叶職驗酶（ RLE ) 〇基質可以是饪何含有—基囷的物質，此基困在指示劑反應中經由第二酵素切除以提供一產物，此產物藉著— 與顏色相關連的信號而成為可測知肖。因此，在本發明之貢例中’經測知的信號是一顏色之出現或消失，或者是從一種顏色改變成另—種顏色。在本發明之另〜實例中，信號可以是基質轉化成產物之速半變化，例如， —基質之顏色經觀察可在一特定長度的時間係持不變。因此，信號之計量可在動力穗態或熱力學狀況下進行，動力計量決定變化的速率，此變化在一段期間發生，而且—般而言是合倂分析試劑後，在不同時間藉著進行= 78· 8· 3,〇〇〇 ...................................................裝.................................訂.................................線 (請先閲讀背面之注意事項再填窝本頁)

,043'V 、發明說明（丨〇 ) 系列的計量來完成決定速率變化。動力学計量決h ..................................................... (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 的程度，當指示劑反應的基贅及產物之間達成平衡S化變化的程度犹決定了。計量可以利用儀器或是，較佳，利用肉眼來進行。者在利用第二酵素切斷基質以生成—有色產物之前，基 :較好是無色。合適的基質是吲嘌氧基賭以及，較佳的是’硝基酚赌類，例如鄭位及對位硝基酚醋酸鹽或丁酸鹽。這些基質是無色的，直至利用羧基赌酶切去或丁败基β生成有色的对基酚。因此，當調節剩是一抑 ::以及基質是—确基_，被計量之信號成之抑制。 •訂. 明顯的是，縈光測定法可利用在本發明之方法中。在本發明之此實例中，第二酵爹可以h 質轉化成…生成光生成性基之^“性產#丨中破計量之信號是聲光之凋節。對本發明之此實例而言，是抑制#1 Λί » g ^ 較好的疋，調節劑 π p削劑以及第二酵索是賭酶。，線. 如同以上所述，未知酵素從經私βΒ 基以提供第m 的抑制剩切去封阻阻的料Γ ㈣。合心酵㈣_及經封 =酵素抑制劑以圖示如下之化學U來表示，其是經封：：：質（描述於後）決定此化合物是抑制劑或 π經封租的抑制劑：平4 (210x297公犮 78· 8· 3,〇〇〇 -12 -〇43lVi A6 B6 五、發明說明（11)

(CH2I -(ch2) ACFj (CM21 i acf2 - c - (CH2I 丨

(CH2I n - 在化學式I 17中，R, •可以是氩原子，的低級烷基，分支的或未分支的，或者 6碳原子 /R2 -Ηζ—〇2 \r2 其中R2可以是1至6碳原子的低級烷基；Rs可以是氫原子，硝基，烷氧基，齒素及其它；艮4可以是1至丨〇碳原子之烷基，或是2至10碳原子之烯基或炔基，其利用一芳香基隨意取代，或者是用一硝基，經基，競基，烷氧基，鹵烷基，羥烷基，兢烷基取代之芳杳基；γ及 Z各別在可以是Η或F，其中Y及Z至少有一個是F ; X可以是〇，S或NR5 ，其宁Re可以是Η或R2 ; η可以是1至6 ; m可以是2至6 ; Α可以是F或CF3 ;以及B可以是Η，磷醆或其鹽類，糖基，胺基醆殘基，例 ...................................................裝.................................訂.................................線 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 〒 4(210 >< 297公餞） 78. 8. 3,000 五、發明說明（12) 如離胺醆或魚精胺醆殘基，其經由胺基酸羧基共價結合至X，2至4碳原子之醯基，，例如乙醒基或丁驢基，或者是肢肽，其化學式：

NH 其中 R6 是(CH2I4NH2. |CH2I3NH - cf或是笨基 R,可以是11或1至6破原子之低級烷基，分支或未分支；Re可以是H , i至4硖原子之低級烷基或低級羥烷基，分支或个分支，或是CH2C〇〇H或（Cl ; h可以是1至*破原子之低級烷基或丧?：^£=^低級烷氧基，分支或未分支，篆基或笨氡基；…是… 當B是Η時，化学式I至 Η以外之任何基團時，化学抑制劑。當Β是磷酸或其鹽汉代表酵素抑制劑。當Β是夫1至汉代表經封阻的酵索類時’意味著Β具有化學式 L〇4b'Vi A6 B6 五、發明說明（13) 其中Ρ祓鍵結至X，而旦η可以是如上所述者。依據化学式I至汉之抑制劑及經封陴的抑制劑，可以藉著熟練傳統化学反應的人所能恝像出之任何方式來合成。合適的以及方便的方法描述於以下例子中。下列有效的酵素抑制劑之目銶只當做模式。名稱核磁共振数據 Ki值(ΜΤ 1 (醏酶） 1. 1, 1， 1，-三氟 - 3 - ( (C0C13) - 3.9l(».2H). 5.21(ba.lHi. e.90(d.2HK 7.10(4.2K) 2.0 κ l〇~G. RLE 4 - 羥笨基 ) 丙西同 2. 1， 1， 1 -三氟 - 3 - ( (COC13)- 4.00(·*2Η). 4.80(b*.lH), > 10-4, PL£ 3 - 羥笨基 ) _ 2 - 丙西同 β.βΟ(»,3κ), 7.30(-,ΙΗ) 3. 1， 1， 1 -三氟 _ 4 - ( (COC13)- 2.95(-.4Η), 4.90(bs.lH), 2.0 κ 10-8, RLE 4 羥笨基 ) - 2 - 丁酮 6.92(d<i.4H)J=4.60H^ 4. 1， 1， 1 -三氟 4 - ( (COC13)- 2.94(t,2H>, 3.05(t,2H), 1.0 κ 10-7, RLF. 3 羥笨基 ) - 2 - 丁酮 5.70(6··ΙΗ). 6.βΟ(·.3Η), 7.15<«tH) 氟} 三基 -篆 1羥 1’ · 1，4 ui 5 2 戍西同 (COC13)-2.68(t.2H). 7.IO(d(2H) 1.9l(t.2H). 2.59(t.2H). 5.23(b.,!H)% 6.95(d.2H). 10-8. RLt TX 3 6· 1， 1 -三氟羥笨基） 5 -2 - 戍西同 <C〇C13) - 1.95(p.2H), »70(t.2H). 2.95(t.2H), 5.^0(b«.lH>. 6.7〇(·.3Ι〇. 7.30<·.1Η> 10-7, 7. 1，1，1 -三氟 -6 - ( (COCI3)- 2.70<q.2M). 4 -羥笨基 ) -2 - 己酮 7.02(d.2H> 8. 1 -笨基- 3, 3 -二氟- (COCI3)-2.25(··2Κ)· 10 -羥基- 4 -癸酮 3.l5(b..|«), 5.55(ϋ·,|Ηί. 677(4.210 !.35(·,^Η)4 4UI. •/«

2.0 κ Ι0*Η. HU ...................................................裝.................................訂.................................線 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 氟三酮-戍 II 1，2 II 9· 羥基 (COC13)-^.20(.,28) 2.1S(«,4K), 4.03<b*,lH). 10-4. 基經 I 6 I氟三嗣 "己 II 1，2 (C0C13)-2.2Q(m.AH) 10-7. 11. 1, 1, 2 辛三氟酮 8 -經基 <C0C13) · 1·: 2.75(1 0 · 1.80(··8Η)· 2 .2Η). 3.β5(·.2Η) 甲 4(210X 297 公羚） 78. 8. 3, 000 五、發明說明（14 )

l2.U經全甲I 4 氣- 壬酮 n 1 1, 1, 2, 2 -五氟-5 - 3· (’ 4 ·經笨基）_ 3 戍 -3 基04续基丁 4键氟- 甲}-物甲>-物三}酮二基氟化二基氟化 -基--經三氧 •經三氧 1篆2 N ( i N( -L0 - -15， I - 5 , l·* 丁N2 & 錢N4 & 欽 14.15.16. 4 、式 3 C5,戍 :代 N JA. -基· C5,戍 -*代 N 3氧 •基· A6 B6 λ 9d)« I·45( 1#2H)a 3:n〇»·.⑻· <.IS卜.2H> (C〇Ct3) ~ S.90(b*«lM)* β.90(4«ΐΗ) jsl6Ki. 7.25(·.4Η). 7.95(d.lH) ¢020) * 3.13(*,6H)% 3,3〇(..2Η)β 3.4β(«·2Η). 4.0l<b*.2H). {020)- Ι.95(·.4Η). 2.54(·,4Η) 3.10(s.6H)v 3.3S(«.2H). 3.SS(«,2H)4 5.25(b*.tH) 1.2 κ 10-6. Pt£ 8.0 it 10-7. RL£ 1.6 tc 10>7. RL£ S.O κ 10-9. ACh€ 6.5 x 10-8. 拄：PLE ·锗肝臟醏酶（E · C · 3，1. 1. 1 ) RLE.兎旰臟醏酶（Ε· C· 3. 1· 1. 1 ) AChE.已醯膽鹼醏酶（E. C · 3. 1. 1. 7 ) 在本發明之一特殊應用中，未知酵素是鹼性磷酸gg酶，第二酵素是免肝臟醏酶或I醚膽鹼赌酶，經封阻的抑制劑是化學式V之氟化鋼。假如檢性碟酸g》酵存在於未知液體中，其引起磷醆暗鍵之切開以生成化學式诃之抑制劑。藉著添加鄰位确笨基丁酸鹽或都位确笨基暗酸抽，1，分析就完戍了。 ^ ..............................................i$t.................................t................•…〆........線 (請先閲讀背面之注意事項再填窝本頁) 經濟部中央標準局印製甲 4(210 X 297 公发） 78. 8. 3,000 204讲 A6 B6 五、發明說明（15) CH·, CH, CF- 1ch2i . 令CF: CH, (CH2I3 - Η - (CH2)3〇h CHi a CH- N〇2 免肝職時酶或匕酸膽驗暗酶 ............*.....................................政 ί請先¾讀背由<注意事项再填窝本頁〕

VII

VIII 假如抑制剞y[是由於鹼性磷醆賭酶存而形成，則醏酶的活性技抑制，而且無色的基賀硼不η 轉化成有色的產物砸。假如沒有鹼性磷醆醋酶存在於未知液體中，則無抑·形成，冑色的產物规也因此形成了，因為S|*酶未祓抑制。到目前為止’酵素擴增作用之兩個階段已經被描述。又如需要附加的信號擴增作用，則段式擴增分析，I中,“、Μ 夕陌段之階反應，最後導捋p Μ 八夕钗珠劑繼續瓦後等敌信號增强。在描把上试必土 z A▲ 贫a k個實例時會地訂線把上述4未知酵素，傲堂京看做矛—酵素是很w风π，m ^ 把分析媒體中才诘η 队〜’弟一酵枝Τ < Α剞以酶促轉化述的第二酵素之嗔〜、，後者把呼京之過即剞去封阻。再者何其後的酵素，可以* κ+ 矛—酵素，或和附加的試割反應以提供另外的酵素上饪酵甲 4(210X297 公沒） 78. 8. 3,000 17 A6 B6 素此酵素則繼續進行除段式酵素反應，渡至調節劑被去封阻。另外，第：酵素{直接催化指示劑反應，而是把分㈣試㈣化成第三酵素，此酵素是指示劑反應之催化劑。藉著適^的試劑選緙而把試劑加至分析嫖體中，則可以達成任何欲求之擴增階段數目。擴〜作用發生於任何先前描述過的發明實例中，因為未知酵素，第二酵素或饪何其他酵素，如真正的催化劑在作用’其中單獨酵素分子可以各别地作用在本赏上是無數個的封阻調節劑或基質分子而不祓消耗。因此，理論上’藉著本發明之方法，分子的第二酵素足以侦測未知酵素。實際上，第二酵素，基質及經封阻的抑制劑之訂洛加量’以及所使用之擴增陵段次數之決定，乃是根據想要達到的擴增作用水平，而且這方面之決定不會超出 —般技衡水平。明顯的是，有無數種適合於決定未知酵素之分析结構可破想像出來〇在本質上相同的狀況下，籍著未知酵素線所產生之信號大小，和分析某範心已定出含量之未知酵素所產生之信號大小相Μ較，可決定㈣Μ度。經濟部中央標準局印製當本發明之方法用來決定酵素濃度時，利用遥當的儀器，例如分光光度計，如，貝克曼歸分光光度計（加洲愛爾文，貝克曼儀器公司）來記讀信號强度是比較方便的。甲 4(210X297 公犮） 18 78. 8. 3,000

-043lV 五、發明說明（17 ) 本發明之另-觀點是”試劑組套或本發明之方·行未知酵素之分析。組套可據酵素Hr經封组切制，弟- 赏。組套也可包括未知酵素之標準物，例：了酵素，基 ::已經決定之樣品，或者包括有益於完:分析：。組ίΓΠ質。它可包括溶液，例如食鹽水或緩衝液組套《成分可置於各別的容器中，例如，小離心管（或者兩種或多種成公經組合置於—單獨容器實驗例行性分析技衡-瞬時釋色層分析（piashsiiic^ Chr〇.at〇grophy )在 32 - 63 網孔（3 _ 7 〆）之’ 廳歸上進行。分析性薄層色層分析（TLC )在厚度為〇·25公厘，以銀落為底之矽攀板（5 X 20公分）（麟自EH scientlf lc )上進行。製備性溥層色層分析在厚度為2·0公厘，以玻璃為底之歸板（20 X 20公分） (購自EM Sicentmc )上進行。嫁點在湯娘士胡佛（ Thomas Hoover )毛細熔點測試儀器上進行測量，而且未經校正。核磁共振光譜以_工测分光光度計來記錄，而且化学位移（ppm為單位）以相對於三甲基石夕烷者記錄之。高效性液相色層分析（HPLC )則在— 具UV侦測之瓦特氏（Waters ) 5/0雙幫浦系統中進行使用下列兩種置於-布朗李（Brownlee ) A >： 3〇〇 (請先S-讀背面之注意事項再填窝本頁) :裝. .訂， •線. ψ 4(21〇x 297 公沒） -19 78· 8. 3,000 五、發明說明（丨8 ) A6 B6 經濟部中央標準局印製 7 X 25 0公厘管柱中之—溶劑系统·•系統a )首先以 30福醋醆餒（NH4〇AC ) ( pH 6.5 )維持5分鐘，接著以直線梯度至2.0 Μ之醋酸銨沖提30分鐘，隨後以 1.0Μ睹醆銨維持5分鐘。系統β )使用邓咖暗酸銨 (pH 6 · 5 )缓衡系统。流速是χ . 〇公撮/分鐘。氣相. 色層分析是在一 Η·Ρ· 584〇a氣相色層分析儀進行，此儀器配備有FID以及自動注射器，使用購自J&w Scientific公司之3〇 M D3-l Megabore管柱〇氣相色产分析條件如下：在10TC維持3分鐘，接著以10 *c /分鐘之梯度加熱至2 50 ·(：，隨後在250 *C維持3分鐘，流速是 16 ·0公撮/分鐘。抑制常數在50 nM之三羥甲基胺基甲烷緩衡液（Tris buffer, PH 8.0 )中測量。酵素及抑制劑在室温下網^育2〇分鐘。酵素基質隨後加入，而且水解速率以分光光度計測量。豬肝臟醏酶及兎肝臟醏酶之基質是鄭位_稍笨基丁酸鹽，G醯膽鹼醏酶之基質是醯基硫膽鹼和愛耳是 (Ellman's )試劑。賁例1 〔4 - (3 -氧代_ 4, 4, 4 -三氟丁基）笨基〕鱗酸二銨 A 3_(_4 -甲氧笨基）_-2 - (1-氧代 _2, 2，2 -三氟G基）丙酸G醋 —個1升而具有4頸之圓底燒瓶，其經安较了逆流凝

3,0〇〇請先聞讀背面之注意事項再填寫 1 裝訂 s. 線五、發明說明（19 ) (請先閲讀背面之注意事項再填窝本頁) 縮器，液滴漏斗，惠氣人口，以及磁性攪拌$，此燒瓶充裝分散在油中之也化納7·17克（〇 i49M )以及300公振之無水已醚。9公撮絕對酒精缓緩地加至攪拌中之溶液。在氪氧停止放出後，25免（〇 i36 m ) 〇基4, 4, 4 -三氟甲基匕醯乙醆鹽和21·3免（〇136M )4 -甲氧笨氣之混合物，於—小時期間加入。然後混合物以逆流加熟過夜。反應混合物經冷却，以水，i N 鹽酸’無水硫酸鎮羊取，溶剞在減签下除去β 33.5克粗免·的反應混合物’在60 X 300公厘之辟膠·管柱上，以1 :3之G基暗酸鹽：己院·混合物進行色居分析。相似的部分經合併在一起，而且得到9克（27% )的油狀產物· 。核磁共振 NHR (CDC!13) 2.12 (m, 3tl), 2·67 (m, 2Η), 3·85 (m, 311), 3.90 (s, 311), 7·24 (q, 4Η). B I Ll-三氟-e - (4-經笨基）-2- 丁綱 —個100公撮的圓底燒瓶，經安裝了逆流凝縮器，磁性攪拌器·以及氬氣入口，此燒瓶充裝2.05免（6.7 M)G基3 - (4 -甲軋笨基）-2 - (1 -氧代-2, 2，2 -三氟匕基）丙酸鹽，溶於酒精中之31 %溴化氫20公撮，以及10公撮的水。此混合物以120 *C加熱過夜，在減壓下滚縮，而且在二氣甲烷及水之間加以分離。有機層以水成二硫化物，飽和的重硖醆納，無水破酸鎂萃舣，而且溶劑在減壓下除去。粗製的反應混合物在 50X 3 00公厘之矽疹管柱上，以1 :1之己酸鹽：己烷甲 4(2l〇x 297公釐） 21 78. 8. 3,〇〇〇 B6 真，發明說明（20 進行色層分析。相似的部分合併在一起，而且溶劑在滅壓下移去，以生成清澈之油狀產物6〇〇毫免（41 % 。核磁共振瞭（⑽3)χ· 2·95(〜 4η), 4·9〇(μ，如， 6.93{dd, 411) J=4,60Hz. C二G基C4_(3 -軋化_4, 4, 4_三氟丁基）笨基〕磷醆鹽 —個10公摄之一頸圓底燒瓶，經安裝了氬氡入口及磁性挽拌器·，而且置於冰浴中，在5.c充裝4〇〇毫克（ 1.8 mM )之1，；!，卜三氟_ 4 - ( 4 -羥笨基）_ 2 _ 丁酮，400毫克（2.4aM )之二匕基氣化磷酸鹽，· 0.15公撮之無水吡啶，以及5公摄之二氣甲烷。混合物在室溫下攪拌過夜，過濾以除去吡啶氣化氮，以 0.2 N &化氣萃取，《水萃取，而且乾燥（無水硫駿鎮 )。在減壓下除去溶劑以得到—棕色油狀粗製產物6〇〇毫克。利用i : i之G酸鹽：[院溶劑系統之製樣㈣層色層分析，可製得一清澈之油狀產物600毫免（92% ^其核共振临，㈣，3.0(m, 4H), 〇 4.20(mf 4H), 7.15 (S/ 4H). 〇〔4 - (3 -氧代-4, 4, 4 -三氟-丁基）笨基〕經濟部中央標準局印製填酸二按 -個25公撮之―㈣錢取，經安装了^人口及磁性攪拌器，充裝5.0公撮之二氣甲烷，14〇毫克（〇 * 蝴）之二己基C 4 - (3 -氧代_ 4,4,4 _三氟丁基甲 4(21〇x 297¾:衮） 22 - 78. 8. 3,000

經濟部中央標準局印製 )篆基〕磷酸鹽以及2 · 0公撮之溴化三甲基矽院。此混合物在室溫攪拌3小時後，加入10公撮甲醇，而且揮發性物質在減壓下除去。殘留物溶於水中，而且以1〇ν 之氫氡化鈉調pH值至7.3。水溶液以乙醚萃取，而且經令凍乾燥以得到白色固體物1 90毫免。此物質溶於公援之30πΜ醋酸銨緩衡液中，而且藉著高故性液相色層分析使用系统Α來纯化。凍乾後之產物重量是5〇毫免 (37 % )。其熔點是235 240 °C。核磁共振晴（D2〇)fic-；u9C)(m, 2iI), 2.56(nw 2H), 4.65(s，贿、 6·88(«Μ, 82Ηζ· 賁例2 1 _經基-5，5 -—氣-8,8 -二甲基_ 4 -壬西同 A G基23 2 -二氟-5, 5-二甲基己酸鹽 —個100公檨之三頸圓底燒瓶，經安裝了液滴漏斗，氬氡入口，水浴，以及磁性攪拌器，充裝8·0公撳之二象甲烷以及2.21免（20mM)之G基2 _氧代_ 5,5 _二甲基己酸鹽。溶於5公撮二氯甲烷之二己基胺基硫三氟化物2.11免（13 mM )以15分鐘時間加至反應混合物，在室溫下挽拌此現合物過夜。此反應混合物在水和二氯甲烷之間枝分離，把有機層加以乾燥（無水硫酸鎮），而且在減壓下移去溶劑。油狀殘i留物在83_咫.C蒸餾，得到1.0免（25% )產物。其核磁共振瓜肛（CDC13)义_ 0.95(s, 9Η), 1·40 (m, 411), 2·1〇 (m，叫，4·35 (q, 2Η)· .............................................(·.：裝.................................4?....................(-........線： C請先閱讀背面之注意事項再填窝本頁) 甲 4(210X297 公沒） 23 78. 8. 3,000

A - 五、發明說明（22) (請先間讀背面之注意事項再填窝本頁) B 2 , 3, 4, 5 _ 四氬 _ 2 _ 氧代 _ 3 _ 〔（ 5, 5 ·二甲基_ 2_· 2 _二氟_ } _氧代）己基〕呋喃 —個25公撮之三頸圓底繞瓶，經安裝了乾燥試管，液滴漏斗，加熱罩，以及磁性搅拌器，充裝〇 24免（ .訂· 5 · 0 HJM )分散於50 %油中之氬化鈉。氬化鈉以無水己院清洗（兩次，每次丨〇公撮），而且把5公摄之g醚加至二角燒瓶中。5滴絕對乙醉和5公撮匕縫之混合物缓緩地加至氩化鈉懸浮液中。氬氣停止故出後，1〇克（ 5·0χηΜ之2,2 -二氟-5,5 _二甲基-己酸匕鞋•和溶於5公掇d之〇·43克（5.0 mM ) 丁酸内醏之混合物，以20分鐘時間加入。溶液經逆流3小畤，而且在室溫攬拌過夜。反應混合物用1 N氣化氬分離，有機層用水清洗（兩次》每次50公撖），經乾垛（無水破酸鎂），而且在減恩下移去溶劑。油狀殘留物〇88克，從己烷 :酸鹽混合物結晶出產物〇·66克（53% )。產物之核磁共振 nmr (CDCl3)cC_ 〇·95(3, 9H), , •線· 2.00(m, 3Η), 2.50(m, 2Η), 3.00(m, 1Η), 4.25(m, 1Η), 4·5(πι,1Η), C 1-羥基-5，5-二氟-8, 8 -二甲基-4-壬酮 —個10公撮之一類圓底燒瓶，經安裝了氬氣入口，磁性挽拌器，以及逆流凝缩器，充裝1()公振之食醋， 4滴濃鹽酸以及2〇〇毫免（〇Si刪）之2,3, 4,5 -四乳-2 -氧代-3 - (5, 5 -二甲基-2,2 -二氟-1 vf_. -氧代己基）吹喃。反應混合物以l1〇»c加熱過夜。反 78. 8. 3,000 甲 4(210X297公S ) 24 A6 B6 五、發明說明（23 ) 應混合物用。醚萃取，而且。醚用水交叉清洗，經乾燥 (無水硫酸鎂），㈤且在減壓下除去溶劑。&留物在ι〇 X60公厘之料管柱上，使用9 :丄之己烷：c醆鹽混合物進行色層分析，得到清澈油狀物。核磁共板㈣（-Vf 5(sm45(t,2H),2.oo(、m,6H), 3.12(bs, III), 4.15(^, in). 實例3 N,N--T^.n.C2. -5, 5, 5 -二氟_ 4 _軋代五按，氬氧化物鹽氟_1, 1-二羥基）乙基〕呋喃一個3公升的三頸圓底燒瓶，經安裝了逆流凝縮器，液滴漏斗，氬氡入口，磁性搅拌器，以及加热罩，充裝 36免（0.75 Μ )溶於50 %油中之氬化鈉。氩化鈉用無水己烷清洗（兩次，每次200公摄），然後懸浮在8〇〇公振之Cj鍵以及22公振之純粹酒精中。丁酸鹽内赌 60.2克（0.7 Μ )和溶於75 0公撮c醚之0基三氛匕酸鹽99.4克（0.7 Μ )之混合物，以係持反應輊微逆流之速率，加至懸浮液中。混合物再經逆流2小時，而後在室&挽拌過夜。反應在冰浴中呤却，而且加入i ν 鹽駿250公撮。有機層被分離，以水清洗（兩次，每次 200公撮），經乾燥（無水硫酸鎮），而且在滅壓下移去溶劑。殘留物從己烷：醆鹽結晶出產物64 ·〇克（ ...................................................«.. (請先閲讀背面之注意事項再填窝本頁) .訂· •線甲 4(21〇x 297公釐） -25 78. 8. 3,000

五 A6 B6 、發明說明（24 ) 經濟部中央標準局印製 45·4 % ),其熔點是87〜兕.c。核磁共振 nmr (DMSO-d ) «C _ ? 〇〇fm ^ , • ), 3.09(t,lH)j=7H2, 4.20(m,2H) 7.〇〇(s,1H), 7.52(s, III)· B ’ ’ —氟_5_羥基-2-戍綱之製備 -個5 OG公振之三頸圓底燒瓶，經安裝了逆流凝縮器，加熱罩，以及磁性挽拌器，充裝61.5 U 0·31 M ) 之 2, 3, 4, 5 n 2 _ 氧代 _ 3 _ ( 2, 2 2 _ 三象· 1, 1 一羥基基）呋喃，6·4公撮之濃鹽醆，公撮之水’以及80公撮之匕駿。反應混合物以i2「C加熱過夜。錢再加人3公振之滚㈣以及5公振之水，而昱反應混合物再加熱10小時。反應混合物在水和。醚之閼被分離，而水層用固蹬重硖醆鈉（100皂）中和。匕醚溶液用水洗務（兩& , β yv λ ΙΛ Ν (兩次，每次20公撮）’經乾燥（無水硫酸鎂），而且在減壓下移去溶劑，得到6〇免"5%卜炎黃色油狀產物。核磁共振_ (CDC1 )义 4.03(1^, 1H), 4.20(0,, 1H). ·細，4H), C L L 1 -三氟 5 -漠· - 2 -戍酮一個50〇公振之三頸圓底燒瓶，經安逛7 即底現肌版安裝了液滴漏斗，磁性攪拌器，冰-鹽浴，以及氬氣入口 , 无裝125公撮之無水二甲基甲醒胺，29免（35. 7 mM )之=β \ 一' Λ - 5 羥基_ 2 _戊酮。混合物冷却至_ 5。而且11.5 g (71·6 dim )的溴在兩小時期間一滴滴吔加入。在室漾下搅拌過夜後，反應混合物經由_ 3〇 Α 管枉在2.0 甲 4(210><297公衮） -26 78. 8. 3,〇〇〇請先閲讀背 © 之注意事项再填窝才一 1\ 裝钉線 A6 B6 五、發明說明（25) 公厘水銀柱罄力下蒸餾。兩個部分經收集；第—部分來自27 _ 35 ΐ者，第二部分來自35 __ 7(rc者。第二部分在水和G醚之間被分離，有機層用水洗滌（三次，每次⑽ 公撮），經乾燥（無水硫駿糕），而且在室溫下減磨蒸發，得到一無色油狀混合物，其由二甲基甲醮胺，匕韃，及欲求之產物組成’未經進一步纯化之產物用於下— 個反應。 D 1^，1^-二甲基-5,5,5-三氟_4_軋代戍，一個500公撮之三頸圓底燒瓶，經安裝了液滴漏斗氬氣入口，磁性攪拌器，以及冰-鹽浴，在_ 8.c充较 21.5克（0.45 Μ )之無水一甲胺。然後在-1〇°(3把溶_ 於二甲基甲醒胺之1，1，1 -三氟-5，溴-2 -戊酮 19.4克（88.5 raM )和Li魅一滴滴地加至藏合物。懸浮液在-KTC攬拌2 · 5小時》溶劑則從沉嚴物上清液移去。沉澱物以已縫洗條（三次，每次200公撮），有機舞合併在一起，以水洗條（二次，每次30公撮），經乾綠 (無水硫醆鎂），而且滅壓下蒸發，得到15.9免 % )之淡黃色油狀物。其鹽酸鹽核磁共振 nmr (CDCl^ ) ^ 1.98(s, 411), 2.90(s, 6H), 3.21(t, 2ίΤ).

E N，N -二甲基- Ν·〔2·甲軋基）匕基〕-5 5，5 -三氟-4 -氧代戊鉄，氬氧化物鹽 —個25公撮之一頸圓底燒瓶，充裝2.95免（21.2 mM )之 2 ‘臭 C* 基甲鍵，0.33 克（1.77 mM )之 N ...................................................裝.................................tr.................................«.. (請先閃讀背面之注意事项再填寫本頁〕甲 4(210X297 公釐） 27 五、發明説明（26 ) N -二甲基-(夂5，5，-二氟-4 -氡代戍胺）以及 2.5公摄之二甲基甲ST胺，混合物在室溫挽将3天。在滅I下移去溶劑，而且號拍色油狀物在一氩氧化物型 Dow肛-i管柱（15 X 200公厘）（含2〇〇公撮水）上進行色層分析。來自管柱之流出物經凍乾產生琥珀色油狀物0.28克（60%)，此產物是氫氧化物鹽。核磁共振耐2H), 3.13(s, 6η), Μ%，卸， 3.41(m# 2H), 3.6〇(m, 2H), 3.88(bs, 211).. 此物質用於下一個反應而未經進一步纯化。 F 1^，^-二甲基-1^-〔2-羥基）匕基〕-5，5, 5 ·三氟-4 -氧代戊餘，氟氧化物鹽 —個10公撮之圓底燒瓶，經安裝了氬氣入口以及逆流經濟部中央標準局印製，凝粮器，充裝0.275 g ( ΐ·ι應）n，N -二甲基-1^-〔2-(甲氧基）1基〕-5,5,5-三氟-4-氧代戍缺，氬氧化物鹽，4.0公撮水及8.0公撮溶於C·酸之30 %溴化氬。此混合物在1 2〇〇c加熱5小時，冷却，而且在減譽下移去溶劑。殘留物以水共同蒸發（3次，每次20公撮），而且產生之油狀物在—氬氧化物型 Dcmex-i (丨5 X 200公厘）管柱上進行色層分析。在減恩下蒸·發流出物，得到氬氧化物鹽產物0.27克（63% ) 。核磁共振 nmr (D2〇)^- 4H), 3.13(s, 6H), 3.30 (m,2H), 3.48 (m, 2H), 4.〇l(bS/ 2H). 78. 8. 3,000 f請先閑讀背面之注意事項再填寫f 〇 -- 甲 4(210X297 公沒) 28 A6 B6 五、發明説明（27 ) 賁例4 N，N -二甲基-N - C 2 -(磷酸氧基）匕基〕-5, 5，5 -三氟-4 -氧代戊鉄，接鹽一個10公撮之三頸燒瓶，經安裝了液滴漏斗，氬氣入口，磁性挽拌器·，以及冰鹽浴，充裝0.093公振（1.0 mM )磷酸氧氣化物以及0.5公振三甲基碟酸鹽。在 -C 把 70.0 毫克（〇.2ώΜ )N , N -二甲基-n _〔 2 -(經基）基〕-5,5,5 -二氟-4 -氧代戊按，數氧化物鹽一滴滴地加至這個混.合物中。混合物經挽拌3〇分鐘，然後置於一冷凍器過夜。混合物先後以匕醚及石油縫研磨（四次，每次50公撮），得到樹脂狀沉澱物。此沉澱物以冰覆蓋，用i N氩軋化鈉中和至pH6〇，而且在減壓下蒸發至乾。產生.之固體物1〇7毫皂，溶於 PH 7.0之30 mM醋酸餒緩衡液，而且藉著高效性色層分析以系統B來純化。在第12分鐘流出之產物，藉著缓衝液之凍乾而分離出9·°毫克（】D無色樹脂。核磁共振 nmr (D„〇) rC _ i Qn, . 2 ^ 4H), 3.14(s, 6H), 3.42(n, 2H), 3-6〇(m, 2H), 4.X9(bs/ 2H). 概要s之，本發明招也、 …未…二=法以伯測及決定存在於液接觸，因此未知酵索移：：索及經封阻之調節劑劑。第二酵素h 去封阻基以提供第二酵素之調節化基質成為'ά質隨後加入。調節劑調節第二酵索轉丞只咏為一產物，生成可測知的信號。信號之侦測甲 4 (210X297 公沒） 78. 8. 3,000 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝· .訂· .線， '29

酵素之濃度可被決定。調節劑與第二酵素提供兩個擴增階段，因此倍號經擴增100倍或更多倍，使得肉眼觀察出信號之時間比利用傳統的酵素分析表少了 100倍。實例5〜8 材料：卵清蛋白缓衝液A : 5bM礎酸鉀及ImM氛化pH 7.3 缓衝液B : 50πΜ二乙醇胺及0·5ηΜ氮化鎂缓衝液 C : 5 0 m M t r i s H C 1， ρ Η 8 . 0 /3 -半乳耱脊鱗，2.3X10< mg/ML於緩衝液A中飴性磷酸酶，0.4 ng/ML於缓衝液B中 a-C, 7.0X10^ mg/ML 於緩衝液 C 中 4-(4-(/6 -半乳糖灰喃糖基）苯基）-1，1，卜三氣_2_丁酮， 300ϋΜ於缓衝液A中（封阻抑制劑1) 4-(4-(H-乙醯苯基丙胺醛胺基）苯基）-1,1,1-三氣-2-丁酮 ,100 w Μ於緩衝液C中（封阻抑制劑2 ) 經濟部中央梂準局貝工消赀合作杜印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 4-(4 -磷苯基）-1,1,1-三氣-2-丁酮，300U Μ於緩衝液Α中 (封阻抑制劑3 ) 二氛靛苯基丁酸酯，200wn於50mM Tris中。實例5 偵檢/3 -半乳糖替酶之活性 -30- 本紙张尺度边《1中《國家標if(CNS>肀4規格(210X297公龙) 經濟部中央檁準局β工诂费合作社印製 W於_ 五、發明説明（^ / k ^ >9 _ 補充於緩衝液A中製備含lxi0-3Dg/Ml之RLE及0.2 mg/ML 卵清蛋白之溶液。將0.9 ML整分移入塑膠管（管1), 且0.8 ML整分移入另10支管（管2至11)。緩衝液A ( 100w L)中/3 -半乳耱替酶加入管1，而1 : 5逐次稀釋液被编成管2至10。整分（50WL)該液被移至撖滴度板之井。每値井内加入封陴抑制劑1 (50i/L), 20分鐘後再加入 100//L受質溶液。再三分鐘後，加入25w之1 —丙醇。每値井之吸收度在620ηιη波長被測定。實驗結果如附圖1。實例6 偵檢鹾α -胰凝乳蛋白酶之活性以如例5所用方法，經由cx -胰凝乳蛋白酶之作用於封阻抑制劑，抑制被受質及RLE著色，而《-胰凝乳蛋白之活性被測定。實驗結果如附圖1。實例7 偵檢齡性磷酸酶之活性以如例V所用方法，經由鹼性碟酸酶之作用於封阻抑制劑，抑制被受質及RLE著色，而鹺性磷酸酶之活性被測定。實驗結果如附圖1。實例8 偵檢；3 -半乳耱替酶之活性於缓衝液A中製備含lX10_3mg/ML之RLE及0.2 mg/ML 卵清蛋白之溶液。該缓衝液A 為12管（每支0.5 ml). -31 - (請先閲讀背面之注意事項#填寫本頁) 本紙張尺度逍《]中國Β家楳iMCNS) 規格（210x29741) 五、發明説明（ η補充 2- a Λ 6 η 6 1 ml之尿和lnl之缓衝掖A混合。0.5 ML造溶液逐次稀釋（1:2)於12支管。從毎一支管各取0·5 ML整份移至撤滴定度盤之6列并。在720分鐘（列A及B) , 40分鎗（列D 及E)及60分鐘（列G及HY) , 50//L之300 uM封p且抑制劑溶液加入并1至Π。管柱12接收50W緩衝液A 。在t = 80 分鐘，100mL之受質溶液加入各并内。3分鐘後，加50 "1 1 _丙醇。每痼并之吸收度在620 πβ波長被測定。結果如附圖2。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫木頁) 裝- 線- 經濟部中央楳準局β工消费合作社印31 32-

Claims

μ Ο AT Β7 C7 D7

六、中猜專.丨_丨见® 第78106780號「分析酵素中之加強倍號的方法」專利案 (82年2月修正） 1. 一種測定在液髖中之酵素之方法，包括： (a) 將懷疑含有糖苜酶或磔酸酶之液體和羧基酯醏及羧基酯St之封阻過的抑制劑結合.該耱苔酶或磷酸酶將封阻過的氣酮抑制劑水解成氣酮抑制劑： (b) 將該羧基醋酶之受質加入該液體中.該氣酮抑制受質被羧基酯SS水解成有色産物；其中受質偽S自硝基苯酯及吲η«氣基酯；及 (c) il著偵檢一與該有色産物相關聪之倍號來測定該糖苷 i毎或礎酸酶。 2. 如申請專利範圍第1項之方法，其進一步包括測定該液發中之糖蒈SS或磷酸酶之獯度.乃藉箸測量該倍號之大小，並且把它和一種與産物相關聯之信號大小相比較/ 此時將含有該糖苷酶或磷酸酶預定S之液鼸樣品重後進行步驟（a )至（c )。 3. —種測定在液髖中之酵素之方法，包括·· (a) 將懷疑含有糖苷醐或磷酸酶之第一液體與酯酶及酯酶之封阻過的氣酮抑制劑結合，該糖¥SS或磔酸K將封阻過的氣酮抑制劑水解成《酮抑制劑； (b) 將色原加至該液體中，該«酮抑制劑抑制色原被酯水解成有色産物； (功先聞請背面之注意事項再填"本百) 本纸張K度適用中國a家邙孕（CNS)f 4規〖3(210X297公釐）六，申謓專刊苑園 A 7 B7 C7 D7 有含將當度濃之 is 酸礎及或 ; 酶小¥ 大耱之之用中作體制液抑該董定計測大驟之步物行産進色複有重成品形樣制歷抑液舆之小 5大定該預較酶比酸，磷時或彳酶(C 苷至糖 } 該(a 括包套組：質暖物液之之析酶分酸酶磷酸或雔酶或 ¥ 酶耱苷量。耱定定行預而進有小種含 1 I 4. 酯，基劑氣制晬抑吲酮及氣酯及的苯 ; 過基質阻硝受封自 ·, 之之選酶酶酶俱酯酯酯質基基基受羧羧羧中 i1T3 t I 1 - 其含不上質本 1 括包尚其丨 0 套品組樣之髏項液 4之第酶圍酸範磔利或專酶諳蒈申耱如該 5 (功先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} -¾.. 經濟部中央標準局員工消費合作社印t •線· 木紙it尺度適;1丨十《«家你平（CNS) 规格（2丨Ο X 2(J7公垃）