FI95485B - Määritysmenetelmä ja materiaalisarja nesteessä olevan entsyymin määrittämiseksi - Google Patents

Description

95485 Määritysmenetelmä ja materiaalisarja nesteessä olevan entsyymin määrittämiseksi 5 Tämä keksintö kohdistuu entsyymin testaamiseen sekä siinä käytettyihin aineisiin ja erityisemmin se kohdistuu menetelmään ja materiaaleihin, jotka on tarkoitettu testeihin, joissa havaittava signaali saavutetaan indikaattorireaktion entsymaattisen katalyysin moduloinnilla.

10

Vaikka entsyymioppi on lähes 100 vuotta vanha ja päätehtävä, että entsyymit toimivat monissa biokemiallisissa reaktioissa, ymmärrettiin 40 vuotta sitten, ovat entsymologian sovellutukset kliiniseen diagnoosiin paljon uudempia. Niinkin äs-15 kettäin kuin 20 vuotta sitten nämä sovellutukset olivat vain noin 3-5 % kliinisessä laboratoriotutkimuksessa suoritettujen testien kokonaislukumäärästä ja vain neljää tai viittä entsyymiä testattiin rutiininomaisesti.

20 Nykyisin entsyymitestit voivat päinvastoin olla niinkin paljon kuin 25 % suurien sairaalalaboratorioiden kokonaistyöpanoksesta ja niinkin monta kuin 20-25 entsyymiä voidaan testata rutiininomaisesti. Näiden rutiinitestien yksityiskohtaiset menettelyt voidaan löytää mistä tahansa kliinisen 25 tai diagnostisen kemian standardioppikirjasta.

• · I

Entsyymitestissä määritetään minkä tahansa ruumiin nesteen, kuten seerumin, virtsan ja aivo-selkäydinnesteen, entsyymi-pitoisuus olevaksi joko normaalilla alueella tai normaalin 30 alueen ulkopuolella. Joissakin testeissä epänormaali entsyymipitoisuus johtuu bakteeri- tai virusinfektiosta ja spesifinen entsyymitesti on diagnostinen spesifiselle pato-geenille. Muissa tapauksissa pelkkä entsyymin, jota ei esiinny tavallisesti nesteessä, kuten seerumissa, havait-35 seminen voi osoittaa kudos- tai elinvauriota. Esimerkiksi alkoholidehydrogenaasin, joka on maksaspesifinen, ja hapan fosfataasin, joka on prostataspesifinen, havaitseminen plasmasta määrittää tarkasti näiden kudosten vaurion vastaavasti. Alkalisen fosfataasin toiminnan mittaamisella on 2 95485 merkitystä diagnostoitaessa maksa-sappi- ja luusairauksia.

Entsyymitestit riippuvat substraatin muuttumisen entsyymikatalyysistä tuotteeksi, joka voidaan havaita tai mitata.

Jos substraatin pitoisuus entsyymireaktiossa lisääntyy as-5 teittäin ja muut tekijät pysyvät vakioina, reaktionopeus lisääntyy substraattipitoisuuden lisääntyessä, kunnes maksimiarvo saavutetaan. Mikään muu lisääntyminen substraat-tipitoisuudessa ei lisää reaktionopeutta. Täten jos substraattia on läsnä riittävänä ylimääränä, reaktionopeus 10 riippuu pelkästään entsyymipitoisuudesta.

Koska entsyymit ovat todellisia katalyyttejä, eivätkä ne muutu reaktion aikana, entsyymireaktion nopeus on riittävän substraatin läsnäollessa vakio ajan kanssa ja se riippuu pelkästään testijärjestelmässä olevasta ensyymipitoisuudes-15 ta. Jos analysoitavaa entsyymiä on läsnä pienenä pitoisuutena, reaktionopeus on hyvin pieni, ja tarvitaan pitkä ajanjakso, jotta muodostuu riittävä havaintotuote. Tämä on vaikea haitta niissä tapauksissa, joissa havainnon nopeus on oleellinen, kuten esimerkiksi määritettäessä patogeenin 20 läsnäoloa veressä tai virtsassa.

Toinen entsyymianalyysin rajoitus on se, että substanssien kliinisissä näytteissä on usein läsnä substansseja, jotka alentavat testin herkkyyttä interferoimalla entsyymitoimin-• ·· nan kanssa. Nämä subtanssit, joita yleensä nimitetään in- 25 terferensseiksi, ovat erityisen kiusallisia analysoitaessa entsyymejä veri- ja virtsanäytteistä.

Immuunitestin testiherkkyyttä on lisätty erilaisilla vahvistusmenetelmillä. Kaskadivahvistuksessa havaittavissa .· olevien (yleensä värjättyjen) molekyylien määrää lisätään 30 käyttämällä yhtä tai useampaa entsyymiä tai entsyymijohdan-naista. US-patentissa no 4 463 090 selostetaan kaskadivah-vi s tus immuuni testiä, jossa suuri molekyyliaktivaattori, kuten ligandiin liitetty entsyymi tai proentsyymi, aktivoi toisen entsyymin, joka reagoi substraatin kanssa tuottaen 35 havaittavan signaalin tai joka puolestaan aktivoi kolmannen 3 95485 entsyymin.

US-patentissa no 4 446 231 selostetaan jaksoittaista vah-vistusentsyymi-immuunitestiä, joka sisältää primäärisen ja sekundäärisen entsyymijärjestelmän sekä modulaattorin tois-5 ta entsyymijärjestelmää varten. Primäärinen järjestelmä sisältää ensimmäisen entsyymin liitettynä ligandiin. US-patentin 4 446 321 mukaisessa ensimmäisessä suoritusmuodossa ensimmäinen entsyymijärjestelmä toimii modulaattoripre-kursorissa vapauttaen modulaattorin. Modulaattori on sekun-10 däärisen entsyymin kofaktori, joka aktivoi toisen entsyymi-järjestelmän katalysoimaan substraatin reaktion havaittavaksi tuotteeksi. Reaktion aikana modulaattori muutetaan ei-aktiiviseen muotoon ja jaksottaminen suoritetaan kolmannella entsyymillä, joka aktivoi uudelleen modulaattorin.

15 Toisessa suoritusmuodossa modulaattori on toisen järjestelmän inhibiittori ja primäärinen entsyymi poistaa sen, jolloin sekundäärinen järjestelmä aktivoituu vaikuttamaan sub-traattiin ja tuottaa siten havaittavan tuotteen.

US-patentissa no 4 492 751 opetetaan jaksoittainen järjes-20 telmä, jossa entsyymisubstraatti tai koentsyymi konjugoi-daan spesifisesti sitoutuvan parin jäseneen.

Erilaisten molekyylien on osoitettu aiheuttavan kohde-entsyymin spesifisen inaktivoinnin. Inhibiittorien osajoukko ovat entsyymisubstraatit, jotka reagoivat entsyymin kanssa 25 muodostaen kovalenttisen sidoksen. Walsh (Tetrahedron 38, 871 (1982)) on tarkastellut mekanismiperustaisia inhibiit-toreita. Toinen inhibiittorien alajoukkko sisältää molekyylit, jotka toimivat vakaina transitiotila-analogeina. Gelb et ai. ovat kuvanneet Biochemistry 2£:ssä, 1813 (1985) 30 eräät fluoroketonit hydrolyyttisten entsyymien transitioti-lainhibiittoreiksi.

Entsyymitestit ovat arvokkaita lisiä analyyttisten tekniikoiden joukkoon; kuitenkin edellä kuvatut rajoitukset kohdistuvat niihin. On parannettu edelleen entsyymitestejä, 35 joilla ratkaistaan nämä ongelmat ja siihen tämä keksintö 4 95485 kohdistuu.

Eräänä esillä olevan keksinnön kohteena on nesteessä olevan entsyymin testausmenetelmä, jota entsyymiä nimitetään jäljempänä tuntemattomaksi entsyymiksi. Neste, jonka oletetaan 5 sisältävän tuntematonta entsyymiä, yhdistetään suojattuun modulaattoriin ja toiseen entsyymiin. Tuntematon entsyymi poistaa suojaryhmän saaden aikaan toisen entsyymin modulaattorin. Sitten lisätään toisen entsyymin substraatti. Substraatti muutetaan toisella entsyymillä tuotteeksi, joka 10 saa aikaan havaittavan signaalin, substraatin muuttamisen tuotteeksi toisella entsyymillä ollessa moduloitu modulaattorilla. Substraatista tuotteeksi -reaktiota nimitetään jäljempämä indikaattorireaktioksi.

Esillä olevan keksinnön mukainen edullinen suojattu modu-15 laattori on suojattu inhibiittori, joka muutetaan tuntemattomalla entsyymillä inhibiittoriksi. Edullinen toinen entsyymi on esteraasi ja edullinen substraatti on kromogeeni, joka on muutettavissa esteraasilla eriväriseksi tuotteeksi. Kromogeeni on edullisimmin väritön ja se muutetaan esteraa-20 silla värilliseksi tuotteeksi kromogeenin muuttumisen tuotteeksi ollessa inhiboitu inhibiittorilla.

Keksinnön toinen kohde käsittää materiaalisarjan keksinnön mukaisen menetelmän suorittamiseksi oleellisesti, kuten ·· edellä kuvattiin.

25 Missä tahansa testausjärjestelmässä, joka sisältää entsyymi-inhibiittorin suojauksen poistamisen, on asetettu ankaria rajoituksia sekä inhibiittorille että suojatulle inhibiittorille, jos testin on saavutettava maksimaalinen herk-: kyys. Esillä olevan keksinnön mukaisesti suojattu inhi- 30 biittori on erinomainen tuntemattoman entsyymin substraatti, mutta se on oleellisen reagoimaton toiseen entsyymiin. Samaten suojaamaton inhibiittori on toisen entsyymin tehokas inhibiittori mutta sillä ei ole oleellista vaikutusta tuntemattomaan entsyymiin. Koska suojatun inhibiittorin ja 35 inhibiittorin reaktiot tuntemattoman ja toisen entsyymin 5 95485 kanssa ovat vastaavasti erittäin selektiivisiä, "lyhyet piirit", jotka ovat tunnusomaisia tekniikan tason mukaisille jaksoittaisille EIA-järjestelmille ja jotka johtuvat risti-käisreaktiivisuuksista, ovat oleellisesti eliminoituja.

5 Täten keksintö saa aikaan monipuolisen menetelmän nesteessä hyvin pieninä pitoisuuksina olevien entsyymien testaamiseksi. Menetelmä parantaa testiherkkyyttä 100-kertaisesti saaden siten aikaan monia etuja verrattuna konventionaalisiin 10 entsyymitesteihin. Paljon pienempinä pitoisuuksina läsnäolevat entsyymit voidaan määrittää. Testin suorittamiseen tarvittava aika lyhenee suuresti, jolloin useamman testin suorittaminen tulee mahdolliseksi annettuna aikana kliinisessä. Signaali voidaan lukea usein paljaalla silmällä, joten kal-15 liiden ja vaivalloisten varusteiden tarve eliminoituu. Täten saavutetaan merkittäviä kustannusten ja tilan säästöjä, jotka mahdollistavat keksinnön mukaisten testien suorittamisen pienissä kliinisissä laboratorioissa tai jopa lääkärin vastaanotolla.

20

Kuvio kuvaa tavallisen testin tuloksia, joka testi on suoritettu keksinnön mukaisella menetelmällä ja materiaaleilla.

Koska keksintö toteutetaan monilla erimuotoisilla suoritus-25 muodoilla, on kuvattu yksityiskohtaisesti keksinnön edulli-·;· siä suoritusmuotoja ja on ymmärrettävä, että esillä olevaa selostusta on pidettävä keksinnön periaatteiden esimerkkinä, eikä sen ole tarkoitettu rajoittavan keksintöä esitettyihin ja kuvattuihin suoritusmuotoihin. Oheen liitetyt patentti-30 vaatimukset määrittävät keksinnön piirin.

: Keksinnön mukaisen menetelmän mukaisesti tuntematon entsyy- * _ mi, jonka oletetaan olevan läsnä nesteessä, voidaan määrittää testausmenetelmällä, joka sisältää vähintään kaksi vah-35 vistusvaihetta. Tässä selostuksessa termi "määritetään" tarkoittaa joko entsyymin havaitsemista, s.o. sen läsnäoloa 6 95485 tai puuttumista, tai sen pitoisuuden nesteessä mittaamista.

Ensimmäinen vahvistusvaihe on toisen entsyymin modulaattorin suojauksen poistaminen tuntemattomalla entsyymillä. Toinen vahvistusvaihe on indikaattorireaktorin katalysoimi-5 nen toisella entsyymillä. Nämä vahvistusvaiheet tapahtuvat jaksoittaisesti 1 00-kertaisen tai suuremman signaalivahvistuksen aikaansaamiseksi, jolloin näytteessä oleva entsyymi voidaan usein havaita pelkällä silmällä. Jos halutaan lisä-vahvistusta, voidaan varustaa lisäentsyymeitä, jotka osal-10 listuvat jaksoittaisten reaktioiden kaskadiin, jolloin mikä tahansa reaktio tai kaikki reaktiot voivat aikaansaada signaalin lisävahvistuksen.

Keksinnön mukaista edullista testausmenetelmää kuvataan ensin viitaten testin jäljempänä olevaan kulkukaavioon tes-15 tin komponenttien ja niiden vuorovaikutuksen yleiseksi ymmärtämiseksi, minkä jälkeen kutakin komponenttia selostetaan yksityiskohtaisesti.

EU/L

B-M-> M + B

N

\ \

-V

20 E2

Sub-> P

Edellä olevassa kulkukaaviossa käytetään seuraavia määrityksiä, joissa yhdysviiva tarkoittaa kemiallista sidosta, yhtenäinen nuoli osoittaa kemiallista muuttumista ja kat-25 konuoli osoittaa toisen entsyymin modulaatiota ja siten in-dikaattorireaktion modulaatiota.

L - testattava neste EU - tuntematon entsyymi E2 - toinen entsyymi 30 B-M - suojattu modulaattori M - vapaa modulaattori toista entsyymiä varten B - suojaava ryhmä modulaattoria varten *

Sub - substraatti l· au t (Il II III:··::: 7 95485 P - tuote

Edellä olevasta kulkukaaviosta nähdään, että neste, jonka oletetaan sisältävän tuntematonta entsyymiä, yhdistetään suojattuun modulaattoriin ja toiseen entsyymiin. Mikä ta-5 hansa nesteessä oleva tuntematon entsyymi poistaa suojaavan ryhmän ja vapauttaa vapaan modulaattorin. Toisen entsyymin substraatti lisätään ja toinen entsyymi muuttaa sen indi-kaattorireaktiossa havaittavaksi tuotteeksi toisen entsyymin katalyyttisen toiminnan ollessa moduloitu vapaalla mo-10 dulaattorilla. Tuotteen määrä on joko suoraan tai käänteisesti verrannollinen vapaan modulaattorin määrään ja siten tuntemattoman entsyymin määrään riippuen siitä, onko modulaattori vastaavasti aktivaattorina inhibiittorissa. Varsinainen mitattu signaali voi olla väri, joka liittyy indi-15 kaattorireaktioon, kuten esimerkiksi tuotteen väri tai sen muodostumismäärä tai substraatin väri tai sen häviämismää-rä.

Siirryttäessä nyt testikomponenttien yksittäiseen kuvaukseen, voi tuntematon entsyymi olla mistä tahansa lähtees-20 tä. Se voi olla esimerkiksi ruumiin nesteessä tai se voidaan eristää ruumiin nesteestä ja viedä seuraavaksi erilaiseen nesteeseen, kuten puskuriin. Muissa tapauksissa tuntematon entsyymi voi olla muusta lähteestä kuin ruumiin nesteestä, kuten esimerkiksi mikro-organismiviljelmästä tai • 25 sen solu-uutteesta. Toisaalta tuntematon entsyymi ei voi olla elävästä lähteestä, esimerkiksi se voi olla synteettinen entsyymi.

Mikä tahansa entsyymi, joka voi poistaa suojaavan ryhmän .. toisen entsyymin suojatusta modulaattorista, voidaan mää- 30 rittää keksinnön mukaisella menetelmällä. (Me tarvitsemme väylän, joka kuvaa laajimmissa mahdollisissa termeissä ent-syymiluokat, jotka voidaan testata mukaan lukien, jos mahdollista, yksi tai kaksi esimerkkiä kustakin luokasta.)

Edulliset tuntemattomat entsyymit ovat tavallisesti hydro-' 35 laaseja, kuten fosfataasit, peptidaasit, esteraasit, glyko- 8 95485 sidaasit ja niiden kaltaiset. Erityisiä esimerkkejä sopivista tuntemattomista entsyymeistä, jotka voidaan määrittää keksinnön mukaisella menetelmällä ovat trypsiini, trombiini, nisäkkäiden maksaesteraasi, asetyylikoliiniesteraasi, 5 B-galaktosidaasi, B-glukuronidaasi, aikalinen fosfataasi, hapan fos£ataasi ja leusiiniaminopeptidaasi.

Suojattu modulaattori voi olla mitä tahansa materiaalia, joka voidaan muuttaa tuntemattomalla entsyymillä toisen entsyymin modulaattoriksi. Edullisessa suojatussa modulaatio torissa on kaksi komponenttia, modulaattori ja suojaava ryhmä. Edullisin suojattu modulaattori on suojattu inhibiittori, joka ei reagoi toiseen entsyymiin, ennen kuin sen suojaava ryhmä on poistettu tuntemattomalla entsyymillä ja inhibiittori on vapautettu testiväliaineeseen. Täten suo-15 jatun inhibiittorin komponenttien valinta riippuu tuntemattomasta entsyymistä ja käytettävästä toisesta entsyymistä. Suojaavan ryhmän pitäisi olla sellainen, joka voidaan kon-jugoida kovalenttisesti inhibiittoriin sidoksella, joka voidaan hajottaa oleellisen selektiivisesti tuntemattomal-20 la entsyymillä ja inhibiittorikomponentin pitäisi inhiboida toisen entsyymin toiminta samalla, kun sillä ei ole oleellista vaikutusta tuntemattomaan entsyymiin. Suojaavan ryhmän pitäisi olla suojatusta inhibiittorista lohkaisemisen jälkeen vaaraton kaikille muille testikomponenteille. Tä-25 ten toisen entsyymin luonne ja sen substraatti selostetaan ennen suojatun inhibiittorin ja inhibiittorin lisäselostus-ta.

Keksinnön mukaisessa testissä toinen entsyymi on tavallisesti hydrolaasi, joka muuttaa substraatin tuotteeksi. So-30 pivia hydrolaaseja ovat esimerkiksi fosfataasit, peptidaa-sit, kuten trypsiini, kymotrypsiini ja pepsiini, tai edeul-lisesti esteraasit, kuten asetyylikoliiniesteraasi (AChE) ja butyylikoliiniesteraasi. Edullisin toinen entsyymi on karboksiesteraasi, kuten kanin maksaesteraasi (RLE).

35 Substraatti voi olla mikä tahansa substanssi, joka sisältää ryhmän, joka voidaan hajottaa indikaattorireaktiossa toi-

il Mi.k MU lii · Η : I

9 95485 sella toisella entsyymillä tuotteen saamiseksi, joka tuote on havaittavissa signaalilla, johon liittyy väri. Täten keksinnön eräässä suoritusmuodossa havaittu signaali on värin kehittyminen tai katoaminen tai muutos toisesta vä-5 ristä toiseksi. Keksinnön toisessa suoritusmuodossa signaali voi olla muutos nopeudessa, jolla substraatti muuttuu tuotteeksi, esimerkiksi substraatin värin voidaan katsoa pysyvän muuttumattoma määrätyn pituisen ajan. Täten signaalin mittaukset voidaan tehdä joko kineettisissä tai termo-10 dynaamisissa olosuhteissa. Kineettiset mittaukset määrittävät muutoksen nopeuden, joka muutos kestää määrätyn ajanjakson, ja ne suoritetaan tavalliseststi tekemällä sarja mittauksia erilaisina aikoina testireagenssien yhdistämisen jälkeen. Termodynaamiset mittaukset määrittävät muutoksen 15 laajuuden, joka muutos tapahtuu, kun tasapaino on saavutettu substraatin ja indlkaattorireaktion tuotteen välillä. Mittaukset voidaan tehdä joko laitteilla tai edullisesti paljain silmin.

On edullista, että substraatti on väritöntä, kunnes se ha-20 jotetaan toisella entsyymillä värillisen tuotteen saamiseksi. Sopivia substraatteja ovat indoksyyliesterit ja edullisesti nitrofenolien esterit, kuten orto- ja paranitrofe-nyyliasetaatit tai -butyraatit. Nämä substraatit ovat värittömiä asetyyli- tai butyryyliryhmien hajottamiseen kar-25 boksyesteraasilla saakka, jolloin saadaan värillisiä nitro-:’· fenoleita. Täten jos. modulaattori on inhibiittori ja sub straatti on nitrofenolin esteri, signaali, joka mitataan, on värin muodostuksen inhibitio.

On ilmeistä, että keksinnön mukaisessa menetelmässä voidaan 30 käyttää fluorimetriaa. Keksinnön tässä suoritusmuodossa toinen entsyymi voi muuttaa ei-fluorogeenisen substraatin fluorogeeniseksi tuotteeksi, jolloin mitattu signaali on fluoresenssin modulaatio. Keksinnön tätä suoritusmuotoa varten on edullista, että modulaattori on inhibiittori ja 35 toinen entsyymi on esteraasi.

Kuten edellä mainittiin, tuntematon entsyymi lohkaisee suo- 10 95485 jaavan ryhmän suojatusta inhibiittorista aikaansaaden toisen entsyymin inhibiittorin.

Sopivia entsyymi-inhibiittoreita ja suojattuja entsyymi-inhibiittoreita on esitetty yleisissä kaavoissa I-IV, jotka 5 on esitetty jäljempänä, jolloin ryhmän B luonne, kuten jäljempänä kuvataan, määrittää, onko yhdiste inhibiittori vaiko suojattu inhibiittori: Y Z O R2

Il » »I

Rl -(CH2)n-C-C-C-(CH2)n X-B ACF2-C-(CH2)n-N-{CH2)m-X-B

10 y i z i2

I II

Ϊ J T

ACF2-C- (CH2 )n-ζ -X-B R4-C-C-(CH2)n-X-B

15 III IV

Kaavoissa I-IV R-| voi olla H, 1-6 hiiliatominen haaroittunut tai haaroittumaton alempi alkyyli tai • /R2 -N—-R2 20 XR2 » · i « jolloin R2 voi olla 1-6 hiiliatominen alempi alkyyli, R3 voi olla H, nitro, alkoksi, halogeeni ja sen kaltainen, R4 voi olla 1-10 hiiliatominen alkyyliryhmä tai 2-10 hiiliatominen alkenyyli- tai alkynyyliryhmä, joka on optionaalises-.. 25 ti substituoitu aryyliryhmällä, tai aryyliryhmä, joka on substituoitu nitro-, hydroksyyli-, merkapto-, alkoksi-, ha-loalkyyli-, hydroksialkyyli-, merkaptoalkyyliryhmällä, Y ja Z voivat olla itsenäisesti H tai F, jolloin vähintään toinen Y:stä ja Z:sta on F, X voi olla O, S tai NR5, jol-30 loin R5 voi olla H tai R2, n voi olla 1-6, m voi olla 2-6, A voi olla F tai CF3 ja B voi olla H, fosforihappo tai -suola, glykosyyliryhmä, aminohappotähde, kuten lysiini- 11 95485 tai arginiinitähde, joka on kovalenttisesti konjugoitu X:äan arainohappokarboksyyliryhmän välityksellä, 2-4 hiiliatominen asyyliryhmä, kuten asetyyli- tai butyryyliryhmä, tai kaavan; 5 -C-CH-NH-C-CH-NH4C-CH-NH|aC-Rq

A Rg A R7 <4 i8 O

peptidi, jolloin Rg on (CH2)4NH2- (CH2>3NH-C^tai bentsyy- nh2 10 li, R7 voi olla H tai 1-6 hiiliatominen haarautunut tai haaroittumaton alempi alkyyli, Rq voi olla H, 1-4 hiiliatominen haarautunut tai haaroittumaton alempi alkyyli tai hydroksi-alempi-alkyyli, CH2COOH tai (CH2)2COOH, Rg voi olla 1 -4 hiiliatominen haarautunut tai haaroittumaton alem-15 pi alkyyli tai alempi alkoksi, fenyyli tai bentsyylioksi ja q voi olla 0-10.

Jos B on H, kaavat I-IV esittävät entsyymi-inhibiittoreita. Jos B on mikä tahansa muu ryhmä kuin H, kaavat I-IV esittävät suojattuja entsyymi-inhibiittoreita. Jos B on fosfori-20 happo tai sen suola, on tarkoitus, että B;llä on kaava;

O

4-°*n &· jossa P on sitoutunut X;ään ja n voi olla kuten edellä ku-25 vattiin.

Kaavojen I-IV mukainen inhibiittori tai suojattu inhibiittori voidaan syntetoida konventionaalisten kemiallisten reaktioiden millä tahansa jaksolla kuten alan asiantuntija voi ymmärtää. Sopivia ja helppoja menetelmiä on annettu 30 jäljempännä olevissa esimerkeissä. Seuraavan tehokkaiden entsyymi-inhibiittorien luettelon on tarkoitettu olevan vain esimerkinomainen.

12 95485

Ki (M)a

Nimitys nmr-tiedot (esteraasi)

1. 1,1,1-trifluari-3-(4- (CDC13) - 3,91(s,2H), 2,0 x 10-&, RLE

hydixiksi-fenyyli)- 5,21(bs,lH), 6,90(d, 5 propancni 2H), 7,10(d,2H) 2. 1,1,1-trifluari-3-(3- (CECI3) - 4,00(s,2H), > 10"4, Pi£ hydroksi-fenyyli)-2- 4,80(bs,1H), 6,80(m, propanoni 3H), 7,30(m,lH)

3. 1,1,1 -trifluari-4-(4- (CDCI3) - 2,95(m,4H), 2,0 x 10"8, RLE

10 hydrcksi-fenyyli)-2- 4,90(bs,1H), 6,92(dd, butancni 4H), J - 4,60 Hz 4. 1,1,1-trifluari-4-(3- (CDCI3) - 2,94(t,2H), 1,0 x 10-7, rle hydix»ksi-fenyyli)-2- 3,05(t,2H), 5,70(bs, batancni 1H), 6,80(m,3H), 7,15 15 (m,lH)

5. 1,1,1-trifluori-5-(4- (CDCI3) - 1,91(t,2H), 1,0x10-8, REB

hydrdksi-fenyyli)-2- 2,59(t,2H), 2,68(t,2H), pentanoni 5,23(bs,1H), 6,95(d,2H), 20 7,10(d,2H)

6. 1,1,1-trifluari-5-(3- (CDCI3) - 1,95(p,2H), 1,7 x 10"7, RLE

hydroiksi-fenyyli)-2- 2,70(t,2H), 2,95{t,2H), pentanoni 5,40(bs,lH), 6,70(m,3H), 7,30(m,lH)

25 7. 1,1,1-trifluori-6-(4- (CDCI3) - 1,63(m,4H), 2,0 x 10"8, RLE

hydrc»ksi-fenyyli)-2- 2,59(q,2H), 2,70(q,2H), heksancni 5,55(bs,lH), 6,77(d,2H), 7,02(d,2H) 8. 1-fenyyli-3,3-di- (CDCI3) -1,35(ra,4H), 30 fluori-10-hydrcksi-4- 1,65(m,4H), 2,25(m,2H), dekanoni 2,70(q,2H), 2,75(t,2H), 3,15(bs,1H), 3,55(t,2H), .. 7,25(m,5H) 9. 1,1,1-trifluari-5- (CDCI3) - 2,15(m,4H), 3,0 x 10~4, pie 35 hydrck.si-2-pentanoni 4,03(te,lH), 4,20(m,2H) 10. 1,1,1-trifluori-6- (CDCI3) - 1,85(m,4H), 4,0 x 10~7, Pi£ hydrdksi-2-heksaricni 2,10(bs,1H), 2,30(m,4H) 11. 1,1,1-trifluori-8- {CDCI3) - 1,30-1,80(m, • hydirc»ksi-2-oktancni 8H), 2,40(bs,lH), 2,75(t, 40 2H), 3,65(m,2H)

12. 1 -hydroksi-5-5-difluo- (CDCI3) - 0,95(s,9H), 1,2 x 10"6, PUE

ri-8,8-dimetyyli-4-no- 1,45(t,2H), 2,00(m,6H) noni 3,12(bs,lH), 4,15(m,2H)

13. 1,1,1,2,2-pentafluari- (CDCI3) - 2,94(m,2H), 8,0 x 10"7, RLE

45 5-(4-hydrcksi-fenyyli)- 3,04(m,2H), 4,75(bs,lH), v 3-pentanoni 6,90(d,2H), 7,10(m,2H) ii 1» t mm m t *1 * 13 95485

14. 1,1,1 -txlfluari-4- (CDCI3) - 5,90(bs,lH), 1,6 x 10-7, RLE

(3-hydroksi-fenyyli)- 6,90(d,1H), J - 16 Hz, 3-trans-2-buten-2-oni 7,25(m,4H), 7,95(d,lH) J - 16 Hz

5 15. N,N-dimetyyli-N-[2- (EfcO) - 1,90(ra,4H), 5,0 x 10"9, AQiE

(hydraksi)etyyli]- 3,13(s,6H), 3,30(ra,2H) 5.5.5- trifluori-4- 3,48(m,2H), 4,01(bs,2H) cksopentaaniaminium, hydroksidisuola

10 16. N, N-dimetyyl i-N- [ 4- (D2O) - 1,95(m,4H), 6,5 x 10"8, AChE

(hydroksi)butyylij- 2,54(m,4H), 3,10(s,6H) 5.5.5- trifluori-4- 3,35(m,2H), 3,55(m,2H) oksopentaaniaminium, 5,25(bs,1H) hydroksidisuola 15 “PEG, sian maksaesteraasi (E.C. 3.1.1.1) RLE, kanin maksaesteraasi (E.C. 3.1.1.1) AChE, asetyylikoliiniesteraasi (E.C. 3.1.1.7)

Keksinnön erityisessä sovellutuksessa tuntematon entsyymi on alkalinen fosfataasi, toinen entsyymi on RLE tai AChE 20 ja suojattu inhibiittori on kaavan V mukainen fluorattu ketoni. Jos alkalista fosfataasia on läsnä tuntemattomassa nesteessä, se aiheuttaa V:n fosfaattiesterisidoksen hajoamisen tuottaen kaavan VI mukaisen inhibiittorin. Testi täydennetään lisäämällä o-nitrofenyylibutyraattia tai o-nit-25 rofenyyliasetaattia, VII.

O CH3 O CH3 alkalinen fosfataasi

CF3-C-(CH2)3-N-(CH2)3OPO3H2-> CP3-C-(CH2)3“N-(CH2)3OH

30 CH3 CH3

V VI

» •«

O

14 95485

O-C-CH3 OH

RLE tai

5 AQlE

NO2 NC>2

VII VIII

Jos inhibiittori VI muodostetaan alkalisen fosfataasin tuntemattomassa nesteessä läsnäolon takia, esteraasin toiminta 10 inhiboidaan ja väritöntä substraattia VII ei muuteta värilliseksi tuotteeksi. Jos alkalista fosfataasia ei ole läsnä tuntemattomassa nesteessä, ei muodosteta inhibiittoria VI ja talloin muodostuu värillinen tuote VIII, koska esteraa-sia ei inhiboida.

15 Täten on kuvattu kaksi entsyymivahvistusvaihetta. Jos halutaan signaalin lisävahvistusta, voidaan suorittaa monivaiheinen kaskadivahvistustesti, jolloin useat testiväliai-neessa olevat reagenssit reagoivat jaksoittain johtaen lopuksi signaalin vahvistamiseen. Kuvattaessa keksinnön tätä 20 suoritusmuotoa, on sopivaa pitää edellä kuvattua tuntematonta entsyymiä primäärisenä entsyyminä, joka muuttaa entsymaattisesti testiväliaineessa olevan reagenssin sekundää- » · riseksi entsyymiksi, joka vapauttaa modulaattorin edellä mainittua toista entsyymiä varten. Lisäksi sekundäärinen 25 entsyymi, tai mikä tahansa myöhempi entsyymi, voi reagoida lisäreagenssien kanssa saaden aikaan lisäentsyymeitä, jotka voivat jatkaa entsymaattisten reaktioiden kaskadia, kunnes Γ: modulaattori on vapautettu. Vaihtoehtoisesti toinen entsyy mi, sen sijaan että katalysoidaan indikaattorireaktio suo-30 raan, voi muuttaa testiväliaineessa olevan reagenssin kolmanneksi entsyymiksi, joka on indikaattorireaktion katalyytti. Valikoimalla sopivasti testiväliaineeseen lisättävät reagenssit voidaan suorittaa mikä tahansa haluttu luku-V määrä vahvistuvaiheita.

il . au 1 tiili Iisa: 15 95485

Vahvistaminen tapahtuu missä tahansa tähän mennessä kuvatussa tämän keksinnön suoritusmuodossa, koska tuntematon entsyymi, toinen entsyymi tai mikä tahansa muu entsyymi toimii todellisena katalyyttinä, jolloin yksi ainoa entsyy-5 mimolekyyli voi toimia oleellisesti rajoittamattomassa määrässä suojattua modulaattoria tai substraattimolekyylejä vastaavasti ilman että sitä kulutetaan. Täten teoriassa toisen entsyymin yksi molekyyli olisi riittävä havaitsemaan tuntemattoman entsyymin keksinnön mukaisella menetelmällä. 10 Käytännössä toisen entsyymin, substraatin ja lisättävän suojatun modulaattorin määrien määrittäminen ja käytettävien vahvistuvaiheiden määrä riippuu halutun vahvistuksen tasosta ja ne ovat alan asiantuntija toimialaan kuuluvia.

On ilmeistä, että voidaan tarkastella lähes rajoittamatonta , 15 määrää testikonfiguraatioiita, jotka sopivat tuntemattoman entsyymin määrittelyyn. Entsyymipitoisuus voidaan määrittää vertaamalla tuntemattomalla entsyymillä generoidun signaalin suuruutta signaalin suuruuteen, joka signaali on mitattu oleellisesti samanlaisissa olosuhteissa testatun tunte-20 mattoman entsyymin ennalta määriteltyn määrien alueen testauksessa. Jos keksinnön mukaista menetelmää käytetään entsyymipitoisuuden määrittelyyn, on edullista lukea signaalin intensiteetti sopivalla laitteella, kuten spektrofotomet-rillä, esim. Beckman DU7 Spectrophotometer, Beckman Instru-25 ments, Inc., Irvine, Kalifornia.

Keksinnön toisena kohteena on reagenssisarja tai materiaa-lipakkaus tuntemattoman entsyymin testaamiseksi keksinnön mukaisella menetelmällä. Sarja voi sisältää toisen entsyymin, suojatun modulaattorin toista entsyymiä varten ja sub-; 30 straatin toista entsyymiä varten. Sarja voi sisältää myös standardit tuntematonta entsyymiä varten, kuten esimerkiksi yhden tai useampia näytteitä ennalta määritellystä pitoisuudesta, tai se voi sisältää muita entsyymejä ja entsyy-misubstraatteja, jotka ovat käyttökelpoisia suoritettaessa 35 testiä. Se voi sisältää liuoksia, kuten suolaliuosta tai puskureita. Sarjan komponentit voidaan asettaa erilaisiin säiliöihin, esimerkiksi lääkepulloihin, tai kaksi tai use- 95485 16 arapia komponentteja voidaan yhdistää yhteen säiliöön. Kokeet

Rutiininomaiset analyyttiset tekniikat - Leimahduskupiidi-oksidigeelikromatografia suoritettiin ICN-piidioksidigee-5 Iissä 32-63 meshiä 20,684-48,263 kPaissa. Analyyttinen TLC suoritettiin 0,25 mm:n 5 x 20 cm alumiinitaustaisilla pii-dioksidigeelilevyillä, jotka olivat EM Scientificistä. Valmistava TLC suoritettiin 2,0 mmjn 20 cm x 20 cm lasitaus-taisilla piidioksidilevyillä, jotka olivat EM Scientificis-10 tl. Sulamispisteet suoritettiin Thomas Hoover -kapillaari-sulamispistelaitteistolla ja niitä ei korjattu. NMR-spekt-rit tallennettiin IBM WP-200SY -spektrofotometrissä ja kemialliset kerrokset annettiin ppmsnä suhteessa trimetyyli-silaaniin. HPLC suoritettiin Waters 510 -kaksipumppujärjes-15 telmällä UV-havainnoinnilla käyttäen toista kahdesta liuo-tinjärjestelmästä Brownlee AX300 7 x 250 mm pylväässä: Järjestelmä A) alkupitäminen 5 minuuttia 30 mM:ssa NH4Ac:a, pH

6,5, mitä seurasi lineaarinen gradientti 2,0 M NH4Ac:iin yli 30 minuutin ajan, mitä seurasi pitäminen 1,0 M 20 NH4Ac:ssa 5 minuuttia. Virtausnopeudet olivat 1,0 ml/mi-nuutti. Kaasukromatografia suoritettiin H.P. 5840A Gas Chromatographissa, joka on varustettu FIDjllä ja automaattisella injektorilla, käyttämällä 30 M DB-1 Megapore -pylvästä, joka hankittiin J&W Scientific, Inc.:stä, GC-olosuh-25 teet olivat seuraavat: kolmen minuutin pitäminen 100 °C:s-sa, mitä seurasi 10 °C / minuutti gradientti 250 °C:een, mitä seurasi 3,0 minuutin pitäminen 250 °C:ssa 16 ml / minuutti virtausnopeudessa.

Inhibitiovakiot mitattiin 50 mMissa Tris, pH - 8,0. Entsyy-30 miä ja inhibiittoria inkuboitiin ympäristön lämpötilassa 20 minuuttia. Sitten entsyymisubstraatti lisättiin ja hyd-rolyysin määrää seurattiin spektrofotometrisesti. PLE:n ja RLE:n substraatti oli o-nitrofenyylibutyraatti ja AChE:n substraatti oli asetyylitiokoliini ja Ellmanin reagenssi.

35 Esimerkki I • . ™

Diammoniura-[4-(3-okso-4,4,4-trifluoributyyli)fenyyli]-fos- 17 95485 faatti A. Etyyli-3-(4-metoksifenyyli)-2-(1-okso-2,2,2-trifluori-etyyli)propionaatti 1 litran nelikaulaiseen pyöreäpohjäiseen pulloon, johon 5 oli kiinnitetty palautusjäähdytin, tiputussuppilo, argonin syöttö ja magneettisekoitin, panostettiin 7,17 g (0,149 M) natriumhydridin 50-%:ista öljydispersiota ja 300 ml kuivaa etyylieetteriä. Sekoitettuun liuokseen lisättiin hitaasti yhdeksän ml absoluuttista etanolia. Sen jälkeen kun vedyn 10 kehittyminen pysähtyi, seosta, jossa oli 25 g (0,136 M) etyyli-4,4,4-trifluorimetyyli-asetoasetaattia ja 21,3 g (0,136 M) 4-metoksibentsyylikloridia, lisättiin 1 tunnin ajan. Sitten seosta kuumennettiin refluksoiden yön yli. Sitten reaktioseos jäähdytettiin, uutettiin vedellä, 1 N 15 HClilla, kuivattiin (vedetön MgSC>4) ja liuotin poistettiin alennetussa paineessa. Raaka reaktiotuote, 33,5 g, kromato-grafoitiin 60 x 300 mm piidioksidigeelipylväässä 1:3 etyyliasetaatti jheksaaniseoksen kanssa. Samanlaiset fraktiot yhdistettiin ja saatiin 9,0 g (27 %) haluttua tuotetta ol-20 jynä. nmr (CDCI3) - δ 2,12(m,3H), 2,67(m,2H), 3,85(M,3H), 3,90(s,3H), 7,24(q,4H).

B. 1,1,1-trifluori-e-(4-hydroksifenyyli)-2-butanonl 100 ml:n pyöreäpohjaiseen pulloon, johon on kiinnitetty palautusjäähdytin, magneettinen sekoittaja ja argonin syöt-: 25 to, panostettiin 2,05 g (6,7 mM) etyyli-3-(4-metoksi-fenyy li )-2-( 1 -okso-2,2,2-trif luorietyyli) propionaatt ia, 20 ml 31-5&:ista HBr AcOHissa ja 10 ml vettä. Tätä seosta kuumennettiin yön yli 120 °C:ssa, se konsentroitiin alennetussa paineessa ja se ositettiin dikloorimetaanin ja veden kes-30 ken. Orgaaninen kerros uutettiin vesipitoisella bisulfii-tilla, kyllästetyllä natriumbikarbonaatilla, kuivattiin (vedetön MgS04) ja liuotin poistettiin alennetussa painee-essa. Raaka reaktioseos kromatografoitiin 50 x 300 mm piidioksidigeelipylväässä, jossa oli 1:1 etyyliasetaatti:hek-35 saania. Samanlaiset fraktiot yhdistettiin ja liuotin poistettiin alennetussa paineessa 600 mg (41 %) tuotetta saarni-seksi kirkkaana öljynä, nmr (CDCI3) - δ 2,95(m,4H), 18 95485 4,90(bd,lH), 6,93(dd,4H) J - 4,60 Hz.

C. Dietyyli-[4-(3-okso-4,4,4-trifluoributyyli) fenyyli]fosfaatti 10 tulin yksikaulainen pyöreäpohjäinen pullo, johon kiinni-5 tetty argonin syöttö ja magneettisekoitin, sijoitettiin jääkylpyyn ja siihen panostettiin 400 mg (1,8 mM) 1,1,1-trif luori-4-( 4-hydroksifenyyli)-2-butanonia, 400 mg (2,4 mM) dietyylikloorifosfaattia, 0,15 ml kuivaa pyridiiniä ja 5 ml dikloorimetaania 5 °C:ssa. Seosta sekoitettiin yön yli 10 ympäristön lämpötilassa, se suodatettiin pyridiini-HCl:n poistamiseksi, se uutettiin 0,2 N HCl:lla, uutettiin vedellä ja kuivattiin (vedetön MgS04). Liuottimen poistaminen alennetussa paineessa antoi raakasaantona 600 mg ruskeaa öljyä. Valmistava TLC käyttämällä 1:1 etyyliasetaatti:hek-15 saania antoi 600 mg (92 %) kirkasta öljyä, nmr (CDCI3) - 6 1,50(m,6H), 3,0(m,4H), 4,20(m,4H), 7,15(s,4H).

D. Di ammonium-14—{3-okso-4,4,4-trifluoributyyli)fenyyli)-fosfaatti 25 ml:n yksikaulaiseen pyöreäpohjaiseen pullooon, johon on 20 kiinnitetty argonin syöttö ja magneettisekoitin, panostettiin 5,0 ml dikloorimetaania, 140 mg (0,4 mM) dietyyli-[4-(3-okso-4,4,4-trifluoributyyli)fenyyli]-fosfaattnia, ja 2,0 ml bromitrimetyylisilaania. Kun seosta oli sekoitettu 3 tuntia ympäristön lämpötilassa, lisättiin 10 ml metanolia * 25 ka haihtuvat materiaalit poistettiin alennetussa paineessa.

Jäännös liuotettiin veteen ja pH säädettiin 7,3:ksi 1,0 N NaOHilla. Vesiliuos uutettiin etyylieetterillä ja lyofi-loitiin 190 mg:n valkeata kiintoainetta saamiseksi. Tämä materiaali liuotettiin 10 ml:aan 30 mM NH4Äc-puskuria ja 30 puhdistettiin HPLC:lla käyttäen järjestelmää A. Tuotteen saanto oli lyofiloinnin jälkeen 50 mg (37 £). sp 235-240 °C. nmr (D2O) - δ 1,90(m,2H), 2,56(m,2H), 4,65(s,DOH), 6,88(dd,4H) J - 6,82 Hz.

Esimerkki II

35 1-hydroksi-5,5-difluori-8,8-dimetyyli-4-nonanoni il ISt.: älli: I i i St 19 95485 A. Etyyli-2,2,-dlfluori-5,5-dimetyyliheksanoaatti 100 ml:n kolmikaulaiseen pyöreäpohjaiseen pulloon, johon oli kiinnitetty tiputussuppilo, argonin syöttö, jääkylpy ja magneettisekoitin, panostettiin 8,0 ml dikloorimetaania 5 ja 2,21 g (20 mM) etyyli-2-okso-5,5-dimetyyliheksanoaattia. Dietyyliaminosulfuuritrifluoridia, 2,11 g (13 mM), 5 ml:s-sa dikloorimetaania lisättiin reaktioseokseen 15 minuutin aikana ja seosta sekoitettiin yön yli ympäristön lämpötilassa. Reaktioseos ositettiin veden ja dikloorimetaanin 10 kesken, orgaaninen kerros kuivattiin (vedetön MgS04) ja liuotin poistettiin alennetussa paineessa. Öljyinen jäännös tislattiin 83-88 °C:ssa 20 mm:ssä 1,0 g:n (25 %) saamiseksi. nmr (CDCI3) - öO,95(s,9H), 1,40(m,4H), 2,10(m,2H), 4,35(q,2H).

15 B. 2,3,4,5-tetrahydro-2-okso-3-[(5,5-dimetyyli-2,2-difluo-ri-1-okso)heksyyli]furaani 25 ml:n kolmikaulaiseen pyöreäpohjaiseen pulloon, johon oli kiinnitetty kuivausputki, tiputussuppilo, kuumennusvaippa ja magneettisekoitin, panostettiin 0,24 ml (5,0 mM) natri-20 umhydridiä 50-%:isessa öljydispersiossa. Natriumhydridi pestiin kuivalla heksaanilla (2 x 10 ml) ja pulloon lisättiin 5,0 ml etyylieetteriä. Seosta, jossa oli 5 tippaa absoluuttista etanolia ja 5 ml eetteriä, lisättiin hitaasti natriumhydridisuspensioon. Kun vedyn kehittyminen loppui, 25 seosta, jossa oli 1,0 g (5,0 mM) etyyli-2,2-difluori-5,5-* dimetyyliheksanoaattia ja 0,43 g (5,0 mM) -butyrolaktonia 5,0 ml:ssa etyylieetteriä, lisättiin 20 minuutin aikana. Liuosta refluksoitiin 3 tuntia ja sen annettiin sekoittua yön yli ympäristön lämpötilassa. Reaktioseos ositettiin 1 30 N HClillä, orgaaninen kerros pestiin vedellä (2 x 50 ml), kuivattiin (vedetön MgS04) ja liuotin poistettiin alennetussa paineessa. Öljyinen jäännös, 0,88 g, kiteytettiin heksaani:etyyliasetaattiseoksesta, 0,66 g (53 %). nmr (CDCI3) - ö0,95(s,9H), 1,35(m,2H), 2,00(m,3H), 3,00(m,lH), 35 4,25(m,lH), 4,5(m,1H).

C. 1-hydroksi-5,5-difluori-858,5-dimetyyli-4-nonanoni 10 ml:n yksikaulaiseen pyöreäpohjaiseen pulloon, johon oli 20 95485 kiinnitetty argonin syöttö, magneettisekoitin ja palautus-jäähdytin, panostettiin 1 ,0 ml jääetikkaa, 4 tippaa konsentroitua HCl:a ja 200 mg (0,81 mM) 2,3,4,5-tetrahydro-2-okso-3- (5,5-di-metyyli-2,2-diluoro-1 -oksoheksyyli) f uraania.

5 Reaktioseosta kuumennettiin 110 °C:ssa yön yli argonipeiton alaisena. Reaktio uutettiin etyylieetterillä, ja eetteri ristipestiin vedellä, kuivattiin (vedetön MgS04) ja liuotin poistettiin alennetussa paineessa. Jäännös kromatografoi-tiin 10 x 60 mm piidioksidigeelipylväässä käyttämällä 9:1 10 heksaanietyyliasetaattiseosta kirkkaan öljyn saamiseksi, nmr (CDC13) - δ 0,95(s,9H), 1,45(t,2H), 2,00(m,6H), 3,12(bs,lH), 4,1 5(m,lH).

Esimerkki III

N,N-dimetyyli-N-[2-(hydroksi)etyyli]-5,5,5-trifluori-4-ok-15 sopentaaniaminium, hydroksidisuola A.2,3,4,5-tetrahydro-2-okso-3-[(2,2,2-trifluori-1,1-dihyd-roksi)etyyli]furaani 3 l:n kolraikaulaiseen pyöreäpohjaiseen pulloon, johon oli kiinnitetty palautusjäähdytin, tiputussuppilo, argonin 20 syöttö, magneettisekoitin ja kuumennusvaippa, panostettiin 36 g (0,75 M) natriumhydroksidin 50-%:ista öljydispersiota. Natriumhydroksidi pestiin (2 x 200 ml) kuivalla heksaanilla ja suspendoitiin sitten 800 ml:aan etyylieetteriä ja 22 ml:aan absoluuttista etanolia. Seosta, jossa oli 60,2 g * 25 (0,7 M) -butyrolaktonia ja 99,4 g (0,7 M) etyylitrifluori- asetaattia 750 ml:ssa eetteriä, lisättiin suspensioon määränä, joka piti reaktion lievässä refluksoinnissa. Seosta refluksoitiin lisäksi kaksi tuntia ja sitten sitä sekoitettiin ympäristön lämpötilassa yön yli. Reaktio jäähdytettiin 30 jääkylvyssä ja 1 N HCl:a (250 ml) lisättiin. Orgaaninen kerros erotettiin, pestiin vedellä (2 x 200 ml), kuivattiin (vedetön MgS04) ja liuotin poistettiin alennetussa paineessa. Jäännös kiteytettiin heksaani:etyyliasetaatista 64,0 g;n (45,4 %) saamiseksi, sp. - 87-90 °C. nmr (DMS0-d6 δ -35 2,33(m,2H), 3,09(t,1H) J - 7 Hz, 4,20(m,2H), 7,00(s,1H), 7,52(s,1H).

• · « 21 95485 B. 1,1,1-trifluori-5-hydroksi-2-pentanonin valmistaminen 500 ml:n kolmikaulaiseen pyöreäpohjaiseen pulloon, johon oli kiinnitetty palautusjäähdytin, kuumennusvaippa ja magneettinen sekoitin, panostettiin 61,5 g (0,31 M) 2,3,4,5- 5 tetrahydro-2-okso-3-(2,2,2-trifluori-1,1-dihydroksi-etyy- li)furaania, 6,4 ml konsentroitua HCl:a, 10 ml vettä ja 80 ml etikkahappoa. Reaktioseota kuumennettiin 125 °C:ssa yön yli. Toiset 3,0 ml konsentroitua HCl:a ja 5,0 ml vettä lisättiin ja reaktioseosta kuumennettiin lisäksi 10 tuntia.

10 Reaktio ositettiin veden ja eetterin kesken, jolloin vesi-kerros neutraloitiin kiinteällä natriumbikarbonaatilla (100 g). Eetteriliuos pestiin vedellä (2 x 20 ml), kuivattiin (vedetön MgS04), ja liuotin poistettiin alennetussa paineessa 60 g:n (45 %) keltaista öljyä saamiseksi, nmr 15 (CDC13) - 62,14(m,4H), 4,03{m,1H), 4,20(m,lH).

C. 1,1,1-trifluori-5-bromi-2-pentanoni 500 ml:n kolmikaulaiseen pyöreäpohjaiseen pulloon, johon on kiinnitetty tiputussuppilo, magneettinen sekoitin, jää-suolakylpy ja argonin syöttö, panostettiin 125 ml kuivaa 20 dimetyyliformamidia, 29 g (35,7 mM) trifluori-5-hydroksi-2-pentanonia. Tämä seos jäähdytettiin -5 °C:een ja 11,5 g (71,6 raM) bromia lisättiin tipoittain kahden tunnin aikana. Yön yli ympäristön lämpötilassa sekoittamisen jälkeen seos tislattiin 30 cm:n vigreaux-pylvään läpi 2,0 mm:n paineessa 25 Kerättiin kaksi fraktiota: ensimmäinen fraktio 27-35 °C:sta ja toinen 35-70 °C:ssa. Toinen fraktio ositettiin veden ja etyylieetterin kesken, orgaaninen kerros pestiin vedellä (3 x 100 ml), kuivattiin (vedetön MgS04) ja haihdutettiin alennetussa paineessa ympäristön lämpötilassa 40 g:n väri-30 töntä dimetyyliformamidin, eetteri, öljyseosta ja haluttua . tuotetta saamiseksi, joka käytettiin seuraavassa reaktios sa ilman lisäpuhdistusta.

D. N,N-dimeetyyli-5,5,5-trifluori-4-oksopentaaniamilni 500 ml:n kolmikaulaiseen pyöreäpohjaiseen pulloon, johon 35 oli kiinnitetty tiputussuppilo, argonin syöttö, magneetti-sekoitin ja suolakylpy, panostettiin 21,5 g (0,45 M) vedetöntä dimetyyliamiinia -8 °C:ssa. Tähän seokseen lisättiin 22 95485 tipoittain 19,4 g (88,5 πιΜ) 1 ,1 ,1 -trifluori-5-bromi-2-pen-tanonia dimetyyliformamidissa ja etyylieetterissS -10 °C:s-sa. Suspensiota sekoitettiin 2,5 tuntia -10 °C:ssa. Sitten liuotin dekantoitiin presipitaatista. Presipitaatti pestiin 5 etyylieetterillä (3 x 200 ml), orgaaniset kerrokset yhdistettiin, pestiin vedellä (2 x 30 ml), kuivattiin (vedetön MgS04) ja haihdutettiin alennetussa paineessa 15 g:n (92 %) vaaleankeltaista öljyä saamiseksi. HCl-suolan nmr (CDCI3)-« 1,89(s,4H), 2,90(s,6H), 3,21(t,2H).

10 E. N,N-dimetyyli-N-[ 2-metoksi)etyyli]-5,5,5-trifluori-4-oksopentaaniaminium, hydroksidisuola 25 ml:n yksikaulaiseen pyöreäpohjaiseen pulloon panostettiin 2,95 g (21,2 mM) 2-bromietyylimetyylieetteriä, 0,33 g (1,77 mM) N,N-dimetyyli-(5,5,5-trif luori-4-oksopentaani-15 amiinia) ja 2,5 ml dimetyyliformamidia ja seosta sekoitettiin ympäristön lämpötilassa 3 päivää. Liuotin poistettiin alennetussa paineessa ja meripihkaöjy kromatografoitiin Do-wex-1 (15 X 200 mm) -pylväässä hydroksidimuodossa, jossa oli 200 ml vettä. Pylväästä peräisin oleva effluentti lyo-20 filoitiin, jotta saatiin 0,28 g (60 %) meripihkaöljyä, joka oli tuote hydroksidisuolana. nmr (D2O) - δ 1,94(m,2H), 3,13(s,6H), 3,39(s,3H), 3,39(s,3H), 3,41(m,2H), 3,60(m,2H), 3,88(bs,2H). Materiaali käytettiin seuraavassa reaktiossa ilman lisäpuhdistusta.

25 F. N,N-dimetyyli-N-[2-hydroksi)etyyli]-5,5,5-trifluori-4-oksopentaaniaminium, hydroksidi suola 10 ml:n pyöreäpohjaiseen pulloon, johon oli kiinnitetty argonin syöttö ja palautusjäähdytin, panostettiin 0,275 g (1,1 mM) N,N-dimetyyli-N-[2-metoksi)etyylil-5,5,5-trifluo-. 30 ri-4-oksopentaaniaminiumia, hydroksidisuolaa, 4,0 ml vettä ja 8,0 ml 30-%:ista HBr:a etikkahapossa. Seosta kuumennettiin 120 °C:ssa 5 tuntia, se jäähdytettiin ja liuotin poistettiin alennetussa paineessa. Jäännös koevaporoitiin 3 x 20 ml:11a vettä ja saatu öljy kromatografoitiin Dowex-35 1 (15 X 200 mm) -pylväässä hydroksidimuodossa. Effluentin haihduttaminen alennetussa paineessa tuotti 0,17 g (63 %) tuotetta hydroksidisuolana. nmr (D2O) - δ 1,90(m,4H), -Λ . ΛΛ t mill II·*» 23 95485 3,13(s,6H), 3,30(m,2H), 3,48(m,2H), 4,01(bs,2H).

Esimerkki IV

N,N-dimetyyli-N-[2-fosfono-oksi)etyyli 1-5,5,5-trifluori-4-oksopentaaniaminium, ammonium suola 5 10 ml:n kolmikaulaiseen pyöreäpohjaiseen pulloon, johon oli kiinnitetty tiputussuppilo, argonin syöttö, magneettisekoi-tin ja suolakylpy, panostettiin 0,093 ml (1,0 mM) fosfori-oksikloridia ja 0,5 ml trimetyylifosfaattia. Tähän seokseen lisättiin 70,0 mg (0,2 mM) N,N-dimetyyli-N-[2-(hydrok-10 sietyyliJ-5,5,5-trifluori-4-oksopentaaniarainiumia, hydrok-sisuolaa tipoittain -10 °C:ssa. Seosta sekoitettiin 30 minuuttia ja sitten se sijoitettiin jäädyttimeen yön ajaksi. Seosta trituroitiin etyylieetterilla, mitä seurasi petroli-eetteri (4 x 50 ml) hartsimaisen presipitaatin saamiseksi.

15 Tämä presipitaatti peitettiin jäällä, neutraloit!iin pHihon 6,01 N NaOHjlla ja haihdutettiin kuivaksi alennetussa paineessa. Saatu kiintoaine, 107 mg, liuotettiin 30 mM NH4AC-puskuriin pH:ssa 7,0 ja puhdistettiin HPLC-järjestelmällä B. Tuote, joka eluoitui 12 minuutissa, eristettiin lyofi-20 loimalla puskuri, jotta saatiin 9,0 g (11 %) väritöntä hartsia, nmr (D2O) - δ 1,90(m,4H), 3,14(s,6H), 3,42(m,2H), 3,60(m,2H), 4,19(bs,2H).

Yhteenvetona keksintö saa aikaan menetelmän nesteessä olevan tuntemattoman entsyymin havaitsemiseksi tai määrittäml-25 seksi. Neste saatetaan kosketuksiin toisen entsyymin ja suojatun modulaattorin kanssa, jolloin tuntematon entsyymi poistaa suojaavan ryhmän saaden aikaan toisen entsyymin modulaattorin. Toisen entsyymin substraatti lisätään. Modulaattori moduloi substraatin muuttumisen toisen entsyymin . 30 avulla tuotteeksi, joka johtaa havaittavaan signaaliin.

Signaalin havaitseminen vahvistaa tuntemattoman entsyymi-näytteen läsnäolon tai puuttumisen. Signaalin voimakkuuden mittaamisella voidaan määrittää entsyymipitoisuus. Modulaattori ja toinen entsyymi saavat aikaan kaksi vahvistus-35 vaihetta, jolloin sigannali vahvistuu 100-kertaisesti tai ,, sen yli, mikä mahdollistaa signaalin havaitsemisen paljaal- « 24 95485 la silmällä aikana joka on 100-kertaa lyhyempi, kuin konventionaalisessa entsyymitestissä.

il SB i lii! I ! tst • ·

Claims (9)

95485

1. Nesteessä olevan entsyymin määrittämismenetelmä, tunnettu siitä, että se käsittää: a) nesteen, jonka oletetaan sisältävän tuntematonta entsyymiä, 5 yhdistämisen toiseen entsyymiin ja sanotun toisen entsyymin suojattuun fluoriketoni-inhibiittoriin, jolloin sanottu tuntematon entsyymi muuttaa sanotun suojatun fluoroketoni-inhibiittorin fluoroketoni-inhibiittoriksi vapauttaen sanotun fluoroketoni-inhibiittorin sanottuun nesteeseen; 10 b) sanotun toisen entsyymin substraatin lisäämisen nesteeseen, jolloin sanottu toinen entsyymi muuttaa sanotun substraatin indikaattorireaktiossa tuotteeksi, jolloin sanottu fluoroketoni-inhibiittori inhiboi sanotun toisen entsyymin; ja c) sanotun tuntemattoman entsyymin määrittämisen havaitsemalla 15 signaali, joka liittyy sanottuun indikaattorireaktioon.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että se käsittää lisäksi sanotussa nesteessä olevan tuntemattoman entsyymin pitoisuuden määrittämisen mittaamalla sanotun 20 signaalin voimakkuus ja vertaamalla sanottua voimakkuutta tuotteeseen liittyvän signaalin voimakkuuteen, kun vaiheet a)-c) toistetaan nestenäytteellä, joka sisältää ennalta määrätyn määrän sanottua tuntematonta entsyymiä.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, . ·:, että sanottu tuntematon entsyymi on hydrolaasi.

4. Patenttivaatimuksen l mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sanottu toinen entsyymi on hydrolaasi. 30

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, • ; : että sanottu substraatti valitaan ryhmästä, joka koostuu nit- rofenoliesteristä ja indoksyyliesteristä.

6. Nesteessä olevan entsyymin määrittämismenetelmä, tunnettu siitä, että se käsittää: a) ensimmäisen nesteen, jonka oletetaan sisältävän tuntematonta entsyymiä, yhdistämisen esteraasiin ja sanotun esteraasin 95485 suojattuun fluoroketoni-inhibiittoriin, jolloin sanottu tuntematon entsyymi muuttaa sanotun suojatun fluoroketoni-inhibiittorin fluoroketoni-inhibiittoriksi vapauttaen siten sanotun fluoroketoni-inhibiittorin sanottuun nesteeseen; 5 b) kromogeenin lisäämisen sanottuun nesteeseen, jolloin sanottu f luoroketoni- inhibiittori inhiboi sanotun kromogeenin muuttumisen sanotun esteraasin avulla värilliseksi tuotteeksi; c) sanotun inhiboinnin suuruuden mittaamisen; ja d) sanotun tuntemattoman entsyymin pitoisuuden määrittämisen 10 sanotussa nesteessä vertaamalla sanottua suuruutta värillisen tuotteen muodostumisen inhibition suuruuteen, kun vaiheet a)-c) toistetaan nestenäytteellä, joka sisältää ennalta määritetyn määrän sanottua tuntematonta entsyymiä.

7. Materiaalisarja tuntemattoman entsyymin testaamiseksi, tunnettu siitä, että se käsittää toisen entsyymin, sanotun toisen entsyymin substraatin ja sanotun toisen entsyymin suo-j atun fluoroketoni- inhibiittorin.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen sarja, tunnettu siitä, että se käsittää lisäksi vähintään yhden nesteen, joka sisältää ennalta määritetyn määrän sanottua tuntematonta entsyymiä.

9. Patenttivaatimuksen 7 mukainen sarja, tunnettu siitä, 25 että se käsittää lisäksi nestenäytteen, jossa ei ole oleelli-;· sesti sanottua tuntematonta entsyymiä. « . · 4 I : IN.k liiti 1 1 1 β 95485