JP2008545385A

JP2008545385A - フィターゼ活性を決定するための方法

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Publication number: JP2008545385A
Application number: JP2008511820A
Authority: JP
Inventors: ヴィジャクマール，; アンドレイミアスニコフ，
Original assignee: ダニスコエイ／エス
Priority date: 2005-05-16
Filing date: 2006-05-15
Publication date: 2008-12-18
Also published as: TNSN07428A1; WO2006123254A2; EP1888771A2; GB0509956D0; ZA200708787B; MX2007014296A; CN101175861A; CA2600689A1; US20090098589A1; WO2006123254A3; KR20070099700A; BRPI0609558A2; AU2006248654A1; MA29992B1; RU2007146389A

Abstract

サンプル中のフィターゼ活性の検出のための方法が提供され、この方法は、フィターゼ基質とこのサンプルとを合わせる工程、およびこのフィターゼ基質の有機代謝産物のレベルを測定する工程を包含する。また、サンプル中のフィターゼ活性を検出するためのキットが提供され、このキットは、フィターゼ基質および可視化剤を含む。また、芳香族基および複数のホスファート基を含む化合物のフィターゼ基質としての使用が提供される。また、芳香族基および複数のホスファート基を含む化合物の、酵素活性を検出するための方法における使用が提供される。

Description

本発明は、フィターゼ活性をアッセイするための方法、このような方法におけるある種の芳香族ホスファート化合物の使用、このような方法を実施するためのキット、ならびにこのような方法において有用な新規な化合物および組成物に関する。

フィタートは、穀類および豆果におけるリンの主要な保存形態である。しかし、単胃腔動物（例えば、ブタ、家禽および魚）は、フィタート（またはフィチン酸）を代謝することも吸収することもできず、したがって、排泄されて、その家畜生産の領域に三価リン汚染をもたらす。さらに、フィチン酸はまた、単胃腔動物において、カルシウム、銅および亜鉛のような金属をキレートすることによって、抗栄養剤として作用する。

これらの動物の成長および健康のために十分なホスファートを提供するために、無機ホスファートが、これらの食餌に添加される。このような添加は、高価である場合があり、そしてさらに汚染問題を増大し得る。

フィタートは、フィターゼ（通常、フィタートの加水分解を触媒する）により、低級イノシトール−ホスファートおよび無機ホスファートに変換される。フィターゼは、動物の飼料に対する添加物として有用であり、ここで、フィターゼは、動物に対して有機リンのアベイラビリティを向上し、そして環境のホスファート汚染を低減する（非特許文献１）。

真菌（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４）および細菌（非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０）起源の多くのフィターゼが、文献に記載されている。

溶液中のフィターゼ活性をアッセイするための公知の方法は、酵素触媒加水分解反応においてフィタートから放出されるオルトホスファートの検出に基づく。ホスファートは、代表的に、スルフリル酸中のモリブデンとの反応後に分光光度測定により検出される（例えば、非特許文献１１）。この方法は、感度が高いが、腐食性試薬（スルフリル酸）および引火性試薬（アセトン）が使用される必要がある。また、この方法は、粗フィターゼ調製物もしくは無機ホスファートを含有する天然サンプル中のフィターゼ活性をアッセイするためにはあまり適さない。さらに、ホスホモリブデンベースの方法は、固体培養培地上で増殖している生微生物コロニーのフィターゼ活性を検出するためには適用できない。

このような「プレート上（ｏｎ−ｐｌａｔｅ）」アッセイは、フィターゼ産生微生物株の単離および開発のために特に有用である。フィターゼ活性の検出のための「プレート上」技術を開発するための多くの試みが、先行技術において公知である。不溶性フィチン酸塩の溶解に基づく方法（非特許文献１２；非特許文献１３）は、比較的感度が鈍く、微生物増殖の間の培地の酸化によって起こる擬陽性シグナルの不都合を有する。フィタートを唯一のリン供給源として含有する栄養プレート上のホスファート依存性かつフィターゼ非含有レポーター細菌の刺激および増殖に基づく方法（非特許文献１４）は、遅く、そして細菌増殖を検出するために必要とされる長いインキュベーションの間のホスファートの拡散に起因して、本質的に解像度が低い。

対照的に、過剰な無機ホスファート存在下および／または固体微生物栄養培地の表面上のホスファターゼ活性の検出は、単純かつ効率がよい。呈色ホスファターゼ基質（例えば、α−ナフチルホスファート、ｐ−ニトロフェニルホスファートおよび５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ホスファート）に基づく方法は、当該分野で周知であり、そして基質は、全て（例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから）購入可能である。しかし、これらの基質のいずれも、フィターゼ類に対し十分に機能しない。
ＷｏｄｚｉｎｓｋｉＲ．Ｊ．，ＵｌｌａｈＡ．Ｈ．，ＡｄｖＡｐｐｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９６年，第４２巻，ｐ．２６３−３０２ＷｙｓｓＭ．ら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９９年，第６５巻，第２号，ｐ．３６７−３７３ＢｅｒｋａＲ．Ｍ．ら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９８年，第６４巻，第１１号，ｐ．４４２３−４４２７ＬａｓｓｅｎＳ．ら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２００１年，第６７巻，第１０号，ｐ．４７０１−４７０７ＧｒｅｉｎｅｒＲ．ら，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，１９９３年，第３０３巻，第１号，ｐ．１０７−１１３Ｋｅｒｏｖｕｏら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９８年，第６４巻，第６号，ｐ．２０７９−２０８５ＫｉｍＨ．Ｗ．ら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．，２００３年，第２５巻，ｐ．１２３１−１２３４ＧｒｅｉｎｅｒＲ．ら，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，１９９７年，第３４１巻，第２号，ｐ．２０１−２０６ＹｏｏｎＳ．Ｊ．ら，Ｅｎｚｙｍｅａｎｄｍｉｃｒｏｂｉａｌｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９６年，第１８巻，ｐ．４４９−４５４ＺｉｎｉｎＮ．Ｖ．ら，ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，２００４年，第２３６巻，ｐ．２８３−２９０ＨｅｉｎｏｎｅｎＪ．Ｋ．，ＬａｈｔｉＲ．Ｊ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８１年，第１１３巻，ｐ．３１３−３１７ＳｈｉｅｈＴＲおよびＷａｒｅＪＨ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９６８年，第１６巻，第９号，ｐ．１３４８−１３５１ＢａｅＨＤら，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．，１９９９年，第３９巻，ｐ．１７−２２ＣｈｅｎＪＣ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９８年，第１２巻，第１０号，ｐ．７５９−７６１

未解決のままである問題は、生微生物コロニーおよび粗フィターゼ調製物のフィターゼ活性の検出のために有用なアッセイの供給である。

未解決のままであるさらなる問題は、腐食性試薬および／または引火性試薬の使用を包含しない、フィターゼ活性を検出するために有用なアッセイの供給である。

本発明は、先行技術の問題に取り組み、先行技術の問題を改善する。第１の局面にしたがって、サンプル中のフィターゼ活性を検出するための方法が提供され、この方法は、以下：
ｉ）このサンプルをフィターゼ基質と合わせる工程、および
ｉｉ）このフィターゼ基質の有機代謝産物のレベルを測定する工程
を、包含する。

第２の局面にしたがって、サンプル中のフィターゼ活性を検出するためのキットが提供され、このキットは、フィターゼ基質および可視化剤を含む。

第３の局面にしたがって、芳香族基および複数のホスファート基を含む化合物のフィターゼ基質としての使用が提供される。

第４の局面にしたがって、芳香族基および複数のホスファート基を含む化合物の、酵素活性を検出するための方法における使用が提供される。

第５の局面にしたがって、以下に定義される式（Ｉ）の化合物またはその塩形態が提供される：

ここで、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５およびＲ_６は、Ｈ、Ｃ_１−１２アルキル、Ｃ_１−１２アルコキシ、ＳＯ_３Ｈ、ＯＳＯ_３Ｈ、ＮＯ_２、ＮＨ_２、ＮＨ（Ｃ_１−１２アルキル）、Ｎ（Ｃ_１−１２アルキル）_２、ＯＰＯ_３Ｈ_２、ＣＯ_２Ｈ、ＣＮ、Ｃ_１−１２ハロアルキルから独立して選択されるか、またはＲ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５およびＲ_６の任意の一対もしくは任意の複数の対は、これらが結合している炭素原子と一緒になってＣ_３−１２炭素環もしくは複素環を形成し、これらの環は飽和であっても、不飽和であっても、芳香族であってもよく；
ここで、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５およびＲ_６の少なくとも２つは、ＯＰＯ_３Ｈ_２である。

第６の局面にしたがって、フィターゼ基質および可視化剤を含む組成物が、存在する。

参照を容易にするために、本発明のこれらのおよびさらなる局面は、ここで、適切な節の見出しの下で考察される。しかし、各節の下の教示は、各特定の節に必ずしも限定されない。

（フィターゼ活性）
本明細書中で使用される場合、用語「フィターゼ活性」とは、サンプルがフィタート（ミオイノシトール−６ホスファート）の分解を触媒して無機リン（例えば、オルトホスファート）を生じる能力をいう。用語フィターゼは、本明細書中で使用される場合、３−フィターゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．３．８）、４−フィターゼ（６−フィターゼとも呼ばれる、Ｅ．Ｃ．３．１．３．２６）、または５−フィターゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．３．７２）（ｔｈｅＮｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅＣｏｍｍｉｔｔｅｅｏｆｔｈｅＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＵｎｉｏｎｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙに従って分類される）のいずれをも包含する。好ましくは、このフィターゼは、３−フィターゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．３．８）、４−フィターゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．３．２６）もしくは５−フィターゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．３．７２）である。

広い意味において、フィターゼは、ホスファターゼのサブタイプを意味し、リン酸エステル結合の切断を触媒する。しかし、本明細書中で使用される場合、用語「ホスファターゼ」は、フィタート以外の基質に対する選択性を有する、リン酸エステル結合を切断し得る酵素を意味する。しかし、当業者は、フィターゼが一定のレベルのホスファターゼ活性を有し得、反対に、ホスファターゼが一定レベルのフィターゼ活性を有し得ることを理解する。

（サンプル）
本明細書中で使用される場合、用語「サンプル」は、フィターゼ活性の存在もしくは非存在を確かめることが望まれるものをいう。このようなサンプルの例としては、発酵培養液、精製酵素調製物、微生物の培養物（プレート上および溶液中の両方）などが挙げられる。

（フィターゼ基質）
本明細書中で使用される場合、用語「フィターゼ基質」は、フィターゼ触媒反応によって変換されて代謝産物を生じ得る化合物を意味する。

好ましくは、このフィターゼ基質は、フィタート以外である。

好ましくは、このフィターゼ基質は、フィターゼ触媒反応によって変換されて、以下で規定されるような有機代謝産物を生じ得る。

好ましくは、このフィターゼ基質は、芳香族基を含む。

本明細書中で使用される場合、「芳香族基」は、５〜１４個、好ましくは６〜１４個の炭素原子の不飽和芳香族炭素環基もしくは不飽和芳香族複素環基を意味し、１つの環（例えば、フェニル）または複数の縮合した（縮合）環（例えば、ナフチルもしくはアントリル）を有する。本明細書中で使用される場合、「ヘテロアリール」は、（１つより多くの環が存在する場合）少なくとも１つの環の中に１〜６個の炭素原子および酸素、窒素および硫黄から選択される１〜４個のヘテロ原子を有する、単環式もしくは二環式の芳香族基を意味する。

このようなヘテロアリール基は、１つの環を有し得る（例えば、ピリジル基、ピロール基もしくはフリル基）か、または多数の縮合環を有し得る（例えば、インドリル基、インドリジニル基、ベンゾフラニル基またはベンゾチエニル基）。好ましいヘテロアリールとしては、ピリジル、ピロールおよびフリルが挙げられる。

この芳香族基は、炭素環芳香族基であることが好ましい。より好ましくは、この芳香族基は、フェニル基もしくはナフチル基である。最も好ましくは、この芳香族基は、フェニル基である。

好ましくは、このフィターゼ基質は、単数または複数の三価リン（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｕｓ）含有基を含む。好適な三価リン含有基は、ホスファート、ホスファイト、チオホスファート、ホスホネート、およびその塩形態、ハロゲン化物およびアルキル誘導体である。好ましい三価リン含有基は、ホスファート−ＯＰＯ_３Ｈ_２およびその塩形態である。好適な塩形態としては、アルカリ金属塩類、アルカリ土類金属塩類、およびアンモニウム塩類が挙げられる。

好ましくは、このフィターゼ基質は、複数の三価リン含有基を含む。より好ましくは、このフィターゼ基質は、少なくとも３つの三価リン含有基を含む。より好ましくは、このフィターゼ基質は、少なくとも４つの三価リン含有基を含む。より好ましくは、このフィターゼ基質は、少なくとも５つの三価リン含有基を含む。より好ましくは、このフィターゼ基質は、少なくとも６つの三価リン含有基を含む。より好ましくは、このフィターゼ基質は、６つの三価リン含有基を含む。

代替の好ましい実施形態において、このフィターゼ基質は、２つもしくは３つの三価リン含有基を含む。より好ましくは、このフィターゼ基質は、３つの三価リン含有基を含む。

好ましい実施形態において、このフィターゼ基質は、芳香族基および複数のホスファート基を含む。

特に好ましい実施形態において、このフィターゼ基質は、以下の式（Ｉ）を有するか、またはその塩形態である：

ここで、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５およびＲ_６は、Ｈ、Ｃ_１−１２アルキル、Ｃ_１−１２シクロアルキル、Ｃ_１−１２アルコキシ、ＳＯ_３Ｈ、ＯＳＯ_３Ｈ、ＮＯ_２、ＮＨ_２、ＮＨ（Ｃ_１−１２アルキル）、Ｎ（Ｃ_１−１２アルキル）_２、ＯＰＯ_３Ｈ_２、ＣＯ_２Ｈ、ＣＮ、Ｃ_１−１２ハロアルキルから独立して選択されるか、またはＲ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５およびＲ_６の任意の一対もしくは任意の複数の対は、これらが結合している炭素原子と一緒になってＣ_３−１２炭素環もしくは複素環を形成し、これらの環は飽和であっても、不飽和であっても、芳香族であってもよく；ここで、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５およびＲ_６の少なくとも２つは、ＯＰＯ_３Ｈ_２である。

アルキルは、本明細書中で使用される場合、脂肪族炭化水素鎖を意味し、直鎖および分枝鎖を含む（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ネオ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、およびイソヘキシルのような１〜６個の炭素原子の脂肪族炭化水素鎖）。

ハロゲン、ハロゲン化物もしくはハロは、ヨウ素、臭素、塩素およびフッ素を意味する。

ハロアルキルは、本明細書中で使用される場合、ハロゲン原子と置換される少なくとも１つの水素原子を有する、上で規定されるようなアルキル基を意味し、そしてペルハロアルキル基（すなわち、ハロゲン原子によって置換されている全ての炭素原子を有するアルキル基）を含む。好ましいハロアルキル基は、トリフルオロメチルおよびトリクロロメチルである。

複素環は、本明細書中で使用される場合、Ｎ、Ｓ、ＯおよびＰから独立して選択される１〜５個のヘテロ原子を含む環状構造を意味する。

本明細書中でアリール基、ヘテロアリール基、炭素環基、複素環基もしくはシクロアルキル基についての定義によって限定されない限り、このような基は、必要に応じて、ヒドロキシ、１〜６個の炭素原子のアシロキシ、１〜６個の炭素原子のアシル、１〜６個の炭素原子のアルキル、１〜６個の炭素原子のアルコキシ、２〜６個の炭素原子のアルケニル、２〜６個の炭素原子のアルキニル、１〜６個の炭素原子の置換アルキル、１〜６個の炭素原子の置換アルコキシ、１〜６個の炭素原子の置換アルケニル、１〜６個の炭素原子の置換アルキニル、アミノ、１〜６個の炭素原子のアルキル基１つまたは２つによって置換されているアミノ、１〜６個の炭素原子のアミノアシル、１〜６個の炭素原子のアシルアミノ、アジド、シアノ、ハロ、ニトロ、１〜６個の炭素原子のチオアルコキシ、１〜６炭素原子の置換チオアルコキシ、およびトリハロメチルからなる群より独立して選択される１〜５個の置換基によって置換されている。

上述のアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、チオアルコキシ基およびアルコキシ基上の置換基としては、ハロゲン、ＣＮ基、ＯＨ基、およびアミノ基が挙げられる。本明細書中のアリール基上の好ましい置換基としては、１〜６個の炭素原子のアルキル、１〜６個の炭素原子のアルコキシ、ハロ、シアノ、ニトロ、トリハロメチル、および１〜６個の炭素原子のチオアルコキシが挙げられる。

好ましくは、フィターゼ基質は、遊離の芳香族ＯＨ基（芳香族基に直接結合するＯＨ基）を有さない。より好ましくは、フィターゼ基質は、ＯＨ、ＮＨ_２、ＳＨもしくはアルコキシから選択される芳香族置換基を有さない。より好ましくは、フィターゼ基質は、電子供給特性を有する芳香族置換基を有さない。より好ましくは、フィターゼ基質は、電子供給特性を有する置換基を有さない。

好ましくは、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５およびＲ_６は、ＨおよびＯＰＯ_３Ｈ_２から独立して選択され、ここで、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５およびＲ_６の少なくとも２つは、ＯＰＯ_３Ｈ_２であるか、またはその塩形態である。

好ましくは、基質は、フロログルシノール３ホスファート、ベンゼンヘキサオール６ホスファート、およびベンゼンペンタオール５ホスファートまたはそれらの塩形態から選択される。最も好ましくは、基質は、フロログルシノール３ホスファートまたはその塩形態である。

（有機代謝産物）
本明細書中で使用される場合、用語「有機代謝産物」は、少なくとも１つの炭素原子を含む、上で規定されるフィターゼ基質のフィターゼ触媒反応の生成物を意味する。特定の場合、１種以上の有機代謝産物が存在し得る。

この有機代謝産物は、遊離のヒドロキシル（ＯＨ）基を含むことが、好ましい。この有機代謝産物は、遊離の芳香族ＯＨ基（芳香族基に直接結合するＯＨ基）を含むことが、より好ましい。より好ましくは、この有機代謝産物は、遊離のフェノールＯＨ基（フェニル環に直接結合するＯＨ基）を含む。

フィターゼ基質は遊離の芳香族ＯＨ基を有さず、そして有機代謝産物は遊離の芳香族ＯＨ基を有することが、特に好ましい。

好ましい実施形態において、アリールホスファート（ＩＩ）が、フィターゼ基質である。これは、フィターゼ触媒反応によって変換されて、遊離の芳香族ＯＨを有する対応する有機代謝産物（ＩＩＩ）を生じ得る。これは、スキーム１に表される。

ここで、「Ａｒ」は、上で規定される芳香族基を表す。

フィターゼ基質がフロログルシノール３ホスファートである場合、有機代謝産物は、フロログルシノールジホスファートである。フィターゼ基質がベンゼンペンタオール５ホスファートである場合、有機代謝産物は、ベンゼンペンタオールテトラホスファートである。フィターゼ基質がベンゼンヘキサオール６ホスファートである場合、有機代謝産物は、ベンゼンヘキサオール５ホスファートである。

（測定）
有機代謝産物のレベルは、任意の好適な手段によって決定され得る。これらは、当業者に明らかである。

本明細書中で使用される場合、用語「レベルの測定」は、有機代謝産物の存在または非存在を、例えば色の変化を観察することによって検出することを含む。

測定のための好適な技術としては、以下が挙げられる：
クロマトグラフィー技術、例えば高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）；
分光技術、例えば赤外線分光法、紫外線分光法、核磁気共鳴分光法（ＮＭＲ）、蛍光分光法、分光測光法、測光法、吸収分光法および測色法；
可視技術、例えば色変化もしくは沈降；
他の技術、例えば重量測定法。

特に非常に好ましい方法において、測定工程は、上で規定される有機代謝産物を反応させて、有色生成物を生じる工程を含む。

「有色生成物」は、本明細書中で使用される場合、４００ｎｍ〜８００ｎｍの範囲で電磁気放射を吸収する生成物を意味する。これは、１種以上の構成成分を含み得る。

この様式における有機代謝産物の有色生成物への変換は、フィターゼ活性の存在およびレベルの可視決定、測色決定、写真決定、分光決定もしくは分光測光決定を可能にするのて、特に有利である。

（可視化剤）
本明細書中で使用される場合、用語「可視化剤」は、上で規定されるような有機代謝産物と反応して上で規定されるような有色生成物を生じ得る任意の試薬もしくは試薬の組み合わせを意味する。

好ましくは、可視化剤は、有機代謝産物を反応して有色生成物を生じ得、そしてフィターゼ基質に対しては反応性ではない；すなわち、通常の条件下で、代謝産物とのみ反応する。

好ましくは、可視化剤は、遊離のＯＨ基を含む化合物と反応して、有色生成物を生じる。より好ましくは、可視化剤は、遊離の芳香族ＯＨ基を含む化合物と反応して有色化合物を生じる。最も好ましくは、可視化剤は、フェノール化合物と反応して、有色生成物を生じる。

特に好ましい実施形態において、可視化剤は、フェノール化合物の求電子的置換反応に関与し得る。より好ましくは、この試薬は、ジアゾニウム塩（−Ｎ≡Ｎ^＋基を含む化合物）を含む。なおより好ましくは、可視化剤は、Ｆａｓｔ塩の群より選択されるジアゾニウム塩を含み、このＦａｓｔ塩の群は、ＦａｓｔＶｉｏｌｅｔ塩類（特にＦａｓｔＶｉｏｌｅｔＢ）、ＦａｓｔＢｌａｃｋ塩類（特にＦａｓｔＢｌａｃｋＫ）、ＦａｓｔＢｌｕｅ塩類（特にＦａｓｔＢｌｕｅＢ）を含む。なおより好ましくは、可視化剤は、ＦａｓｔＢｌｕｅＢを含む。最も好ましくは、可視化剤は、ＦａｓｔＢｌｕｅＢおよび酢酸ナトリウムを含む。

代替の好ましい実施形態において、可視化剤は、酸化還元指示薬を含む。用語「酸化還元指示薬」は、本明細書中で使用される場合、フェノール化合物の酸化還元（還元−酸化）反応に関与して有色生成物を生じ得る試薬を意味する。特に好ましい酸化還元指示薬は、ニトロブルー塩化テトラゾリウムである。より好ましくは、酸化還元指示薬は、ニトロブルー塩化テトラゾリウムおよびフェナジンメトスルファートを含む。

（方法の実施）
等業者は、本発明の方法を実施するための多くの好適な技術が存在することを十分に理解する。広い意味において、上で規定されるようなサンプルは、上で規定されるようなフィターゼ基質と合わせられる。「合わせられる」は、本明細書中で使用される場合、フィターゼ基質とサンプルとが混合されるか、一緒になるか、混ざるか、接触されるか、さもなければフィターゼ基質から有機代謝産物への変換において上で規定されるような何らかのフィターゼ活性が顕在化するように反応させられることを意味する。

本発明の方法は、溶液中で、例えば微生物反応容器において、もしくはマイクロタイタープレートにおいて実施され得る。この場合、サンプルを含む溶液が、フィターゼ基質を含む溶液に添加されるか、またはその逆である。当業者は、さらなる構成成分（例えば、緩衝液など）が必要であれば、決定することができる。

あるいは、本発明の方法は、例えば微生物コロニーが寒天プレート上で増殖される場合に、固体支持体上で実施され得る。この場合、微生物コロニーを含む寒天プレートが、サンプルである。この場合、有利にも、フィターゼ基質は、このフィターゼ基質を含む溶液をこのプレート上に重層することによって、簡単にサンプルと合わせられる。

フィターゼ基質およびサンプルは、合わせられ得、そして有機代謝産物のレベルの測定の前に、一定時間の間インキュベートされ得る。あるいは、フィターゼ基質およびサンプルは、合わせられ得、そして有機代謝産物のレベルは、経時的に（すなわち、連続的に）測定され得る。

可視化剤が使用される場合、これは、この方法の任意の時点で添加され得る。例えば、可視化剤およびフィターゼ基質を含む組成物が、サンプルに添加され得る。あるいは、フィターゼ基質が、可視化剤およびサンプルを含む組成物に添加されてもよい。あるいは、可視化剤が、サンプルおよびフィターゼ基質が一定時間インキュベートされた後に添加されてもよい。

（キット）
１つの局面において、本発明は、サンプル中のフィターゼ活性を決定するためのキットに関し、このキットは、フィターゼ基質および可視化剤を含む。このフィターゼ基質および可視化剤は、同じ組成物中に存在してもよく、または本発明の方法の実施における同時の使用、逐次的な使用または別個の使用のための成分として存在してもよい。さらなる構成成分（例えば、安定化剤、緩衝液および保存剤）もまた、存在し得る。

（本発明の化合物）
本発明の化合物は、以下の反応スキームもしくは容易に利用可能な出発物質、試薬および従来の合成手順を用いるその変法に従って、簡便に調製され得る。また、これらのプロセス工程の変形であって、それ自体当業者に公知でありかつ当業者の従来技術の範囲内である変形の使用も、可能である。

スキーム２は、ポリホスファート化合物（ＶＩ）の対応するフェノール化合物（ＩＶ）からの保護された中間体（Ｖ）を介した一般的な調製方法を示し、ここで、Ｇは、保護基を表す。好適な保護基Ｇは、当業者によって容易に決定され、これらとしては、ベンジル、トリアルキルシリル（特にトリメチルシリルおよびｔ−ブチルジメチルシリル）、およびＣ_１−６アルキルが挙げられる。

スキーム３は、フロログルシノール（ＶＩＩ）からのトリホスホフロログルシノール（ＩＸ）の調製を示す。この反応において、ジベンジルクロロホスファートは、ジベンジルホスファイト四塩化炭素との反応によってインサイチューで生成される。保護された中間体（ＶＩＩＩ）は、水素添加されて最終生成物を生じる。

本発明は、添付の図面を例示の目的のみで参照してさらに詳述される。

本発明は、本明細書中で、以下の実施例においてさらに詳述される。

（略称）
ＤＭＡＰ：ジメチルアミノピリジン；
ＤＩＰＥＡ：ジイソプロピルエチルアミン；
Ｂｎ：ベンジル
ＴＰＰ：トリホスホフロログルシノール
ＯＤ：光学濃度。

（実施例１．フロログルシノール３ホスファート（ＩＸ）の合成）

フロログルシノール３ホスファート（ＩＸ）を、市販のフロログルシノールからＳｉｌｖｅｒｂｅｒｇら（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎｌｅｔｔｅｒｓ３７，７７１−７７４（１９９６））のリン酸化方法を用いて合成した。フロログルシノール（２．５２ｇ）を、多首丸底フラスコ中で３５５ｍｌの無水アセトニトリルに溶解した。反応の間、一定の窒素流れによってフラスコから空気を排除し、そしてこの反応混合物を、磁気スターラーを用いて連続的に撹拌した。この溶液を、−１０℃未満まで氷−塩浴を用いて冷却した。四塩化炭素（４６ｇ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１６．３ｇ）およびＮ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（０．７５ｇ）を、この反応混合物に（この順番で）加えた。次に、ジベンジルホスファイト（２３ｇ）を、この反応混合物の温度を−１０℃より上に上げないように、ゆっくりと添加した。ジベンジルホスファイトの添加が完了した後、この反応混合物を、−１０℃で１時間インキュベートした。この時点で、窒素流れおよび冷却を止め、そして１５０ｍｌの０．５ＭＫＨ_２ＰＯ_４水溶液をこの反応混合物に加えた。この混合物を、酢酸エチル（３回、１５０ｍｌ）で抽出した。合わせた酢酸エチル抽出物を、水（２００ｍｌ）で２回、飽和ＮａＣｌ（２００ｍｌ）で１回洗浄し、そして無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。酢酸エチルを、ロータリーエバポレーションにより除去し、そして得られた生成物を、７５ｍｌのメタノール−テトラヒドロフラン混合物（１：１）中に溶解した。１ｇの活性炭担持パラジウムを加え、そして大気圧で一晩、水素をこの反応混合物を通してゆっくりとバブリングした。２００ｍｌの水をこの反応混合物に加え、そしてＮａＯＨでｐＨを７．０に調整した。溶媒を、ロータリーエバポレーター上で減圧下で除去した。この生成物は、ＤｉｏｎｅｘＤＸ−６００システム（Ｄｉｏｎｅｘ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）（ＡＳ５０オートサンプラー、ＡＳ５０サーマルエンクロージャー、ＧＰ５０勾配ポンプならびにｌｏｎＰａｃＡＧ１１（２×５０ｍｍ）ガードカラム、ｌｏｎＰａｃＡＳ１１−ＨＣ（２×２５０ｍｍ）分析カラムおよびＡＴＣ−１アニオントラップカラムを用いるＥＤ５０電気化学検出器からなり、自己再生サプレッサー（ｓｅｌｆｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｎｇｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ）を５０ｍＡに設定した）を用いたＨＰＬＣ分析によると、本質的に均一であった。勾配プロフィールを、以下を混ぜることによって達成した：（Ａ）２００ｍＭＮａＯＨおよび（Ｂ）Ｈ_２Ｏ：０〜５分、４０〜８０ｍＭＮａＯＨ；５〜４０分、８０〜１３５ｍＭＮａＯＨ；４０〜４２分、１３５〜１４０ｍＭＮａＯＨ。データ収集および操作を、ＣＨＲＯＭＥＬＥＯＮ６（Ｄｉｏｎｅｘ）ソフトウェアによって行った。

（実施例２．ベンゼンヘキサオール６ホスファート（Ｘ）の合成）

ベンゼンヘキサオールを、Ｆａｔｉａｄｉら（Ｊ．Ｒｅｓ．Ｎａｔｌ．Ｂｕｒ．Ｓｔｄ．６７Ａ，１５３−６２（１９６３））の方法によって合成した。１２００ｇの３０％グリオキサール水溶液を、８００ｇのＮａ_２ＳＯ_３および３００ｇのＮａＨＣＯ_３を含有する水溶液６ｌと混合した。空気の流れをこの混合物に通し、そしてこれを徐々に約９０℃まで加熱した。この時点で、エアレーションを中止したが、加熱は沸騰が始まるまで続けた。この反応混合物を、ゆっくりと室温まで冷却した。冷却の際に形成された結晶沈殿物を、１００ｍｌのメタノール−水（１：１）で１回および１００ｍｌのメタノールで１回洗浄し、そして５００ｍｌの熱い２．５Ｍ塩酸中に溶解した。この溶液を、ゆっくりと室温まで冷却し、その後、氷浴上で冷却した。テトラヒドロキシパラ−ベンゾキノリンの結晶沈殿物を、少量の氷冷した水で洗浄し、そして５００ｍｌの熱い２．５Ｍ塩酸中に再溶解した。２００ｇのＳｎＣｌ_２＊２Ｈ_２Ｏをこの溶液に加え、そして沸騰させた。５００ｍｌの濃ＨＣｌをこの溶液に加え、そして再び沸騰するまで加熱し、その後、１ｌの濃ＨＣｌをもう１回加えた。氷上での冷却の際に形成した粗ベンゼンヘキサオール沈殿物を、５ｇのＳｎＣｌ_２を含有する１ｌの２．５ＭＨＣｌから再結晶化させた。この沈殿物を、真空デシケーター（ｄｅｓｅｃｒａｔｏｒ）中、ＮａＯＨ上で保存した。ベンゼンヘキサオールを、１．７ｇのベンゼンヘキサオールを使用し、そして−１０℃での反応の１時間後、室温でのさらなる１時間のインキュベーションを用いた他は、本質的に実施例１に記載のように、ジベンジルクロロホスファートでリン酸化した。ベンゼンヘキサオール６ホスファート（Ｘ）の純度を、ＴＰＰの分析のために用いたのと同じＨＰＬＣ方法を用いて確認した。

（実施例３．他のポリヒドロキシベンゼンのホスホエステルの合成）
実施例１および実施例２に記載のリン酸化方法と同じ方法を用いて、他の芳香族ポリフェノールのホスホエステル誘導体を合成することが可能である。ベンゼンペンタオールを合成する方法（Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．（Ｌｏｎｄｏｎ）９，４４１（１９６７））、種々のベンゼンテトラオールおよびベンゼントリオールを合成する方法（ＤｒｅｓｓｉｅｒＨ．，およびＨｏｔｔｅｒＳ．Ｐｏｉｙｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｅｎｅｓ．，Ｅｎｃｙｃｌｏｐａｅｄｉａｏｆｃｈｅｍｉｃａｌｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（第３版），ＭａｒｋＨ．Ｆ．ら編，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆ｓｏｎｓ．Ｖｏｌ１８，ｐｐ．６７０−７０４（１９８２））が、周知である。幾種かのポリヒドロキシフェノールもまた、市販されている。

（実施例４．リン酸化ポリヒドロキシベンゼンは、フィターゼによって基質として受容される）
酵素アッセイを、マイクロタイタープレート内の１００μｌの反応混合物中で実施した。酸フィターゼおよび酸ホスファターゼについての反応混合物は、以下を含んだ：０．８ｍＭＣａＣｌ_２含有２００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）中の１０ｍＭの基質。アルカリフィターゼおよびアルカリホスファターゼについては、酢酸ナトリウム緩衝液を２００ｍＭＴｒｉｓ＊ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）と置換した他は同じ条件であった。放出されたホスファートを公知の手順（ＨｅｉｎｏｎｅｎＪ．Ｋ．，ＬａｈｔｉＲ．Ｊ．ＡｎａｌＢｉｏｃｈｅｍ．１１３（２），３１３−３１７（１９８１））の変法によって測定した後、この反応を、３７℃で１時間進行させた。簡潔にいうと、２００μｌの新鮮に調製したＡＭＭ溶液（７．５ＮＨ_２ＳＯ_４、１５ｍＭモリブデン酸アンモニウムおよびアセトン−１：１：２）を、各マイクロタイタープレートウェル中の１００μｌ反応混合物に加えた。３９０ｎｍにおける吸光度を、ＡＭＭ試薬の添加後１０分以後３０分以前に測定した。ホスファートの量を、既知の濃度のホスファート溶液のキャリブレーションカーブを作成することよって、決定した。

フィターゼおよびホスファターゼの両方とも、ホスホエステルの加水分解を触媒する。したがって、これらの２つの群の間の相違は、定性的ではなく定量的であり、そしてフィタートおよび（例えばグルコース６−ホスファートまたはフルクトース６−ホスファートような）単純なモノホスホエステル類における相対効率として規定され得る。ホスファターゼは、フィタートの加水分解において比較的非効率的である傾向があり、そして反対に、ほとんどのフィターゼは、モノ−置換糖ホスファート類の加水分解において非効率的である。ポリリン酸化ポリヒドロキシベンゼンがフィタートの模倣物として使用され得るか否かを試験するために、本発明者らは、ヘキサホスホ−ベンゼンヘキサオールから放出されたホスファートおよびフルクトース６−ホスファートを、いくつかのフィターゼおよびホスファターゼによって試験した。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ（Ｎａｔｕｐｈｏｓ（登録商標））、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ（ＰｈｙｚｙｍｅＸＰ（登録商標））およびＰｅｎｉｏｐｈｏｒａｌｙｃｉｉ（Ｒｏｎｏｚｙｍｅ（登録商標））由来のフィターゼ、ならびにジャガイモ酸ホスファターゼを、ｐＨ５．５でアッセイし、一方、アルカリ細菌ホスファターゼである仔牛腸ホスファターゼおよび小エビ（ｓｈｒｉｍｐ）ホスファターゼを、ｐＨ７．５でアッセイした。この実験の結果（表１）は、ベンゼンヘキサオール６ホスファートは、試験した全てのフィターゼについてフルクトース６−ホスファートよりもずっとよい基質であり、一方、代表的なホスファターゼについては、逆であったことを実証した。同様に、フロログルシノール３ホスファートは、全ての試験したフィターゼ類について、よい基質である。しかし、これは、ベンゼンヘキサオール６ホスファートほど選択的ではない。何故なら、これは、全ての代表的なホスファターゼ類についてもまた、よい基質であるからである。

（表１．フルクトース６−ホスファートおよびベンゼンヘキサオール６ホスファートまたはフロログルシノール３ホスファートを基質として用いた、異なる酵素のホスファート放出活性の比）

（実施例５．液体アッセイにおけるフィターゼ活性またはホスファターゼ活性の検出のためのフロログルシノール３ホスファートの使用）
３〜５．５の範囲のｐＨでのアッセイのために、０．８ｍＭＣａＣｌ_２含有２００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液中２ｍＭフロログルシノール３ホスファート含有反応混合物１００μｌを、マイクロタイタープレートのウェル内に入れ、そして２０μｌの好適に希釈したフィターゼ溶液もしくはホスファターゼ溶液を加えた。この混合物を、６０分間３７℃でインキュベートし、その後、５Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．３）中３ｍｇ／ｍｌＦａｓｔＢｌｕｅＢ塩の新鮮に調製した溶液５０μｌを加えた。発色を、ＦａｓｔＢｌｕｅＢ塩の添加後１０分以後２０分以前に、分光光度法（５７０ｎｍ）または写真のどちらかによって記録した。フィターゼ／ホスファターゼ活性を検出するこの方法をまた、３〜５．５より低いかまたはより高いｐＨにおいても使用し得る。この場合、酢酸ナトリウム緩衝液を、他の好適な緩衝液に置き換える。例えば、グリシン＊ＨＣｌは、１．５〜３のｐＨ範囲で有用であり、Ｔｒｉｓ−マレアートは、６〜９のｐＨ範囲で有用である。図３は、フィターゼもしくはホスファターゼのｐＨプロフィールの迅速な評価のためにこの方法を使用する方法を説明する。

（実施例６．飼料サンプルにおける補充フィターゼ活性の検出のための、フロログルシノール３ホスファートの使用）
飼料サンプルを、５０ｍＭグリシン／ＨＣｌ（ｐＨ２．５）中に懸濁して０〜２５％（ｗ／ｖ）にし、室温で３０分間撹拌した。固体物質を静置した後、上清を除去して、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに入れて１％（ｗ／ｖ）活性炭素（Ｎｏｒｉｔ）で処理した。この懸濁液を、１０分間室温で撹拌し、そして１分間１０，０００ｒｐｍで遠心分離した。１００μｌの上清を除去し、そしてマイクロタイタープレートのウェル中で、２５０ｍＭグリシン／ＨＣｌ（ｐＨ２．５）中２０ｍＭフロログルシノール３ホスファート１００μｌと混合した。このマイクロタイタープレートを、６０分間３７℃でインキュベートし、その後、５Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．３）中ＦａｓｔＢｌｕｅＢ塩（ＳｉｇｍａＤ９８０５）の溶液２５μｌを添加した。色の強度を、測光法または写真によって１５〜２０分後に記録した。

（実施例７．液体アッセイにおけるフィターゼ活性の検出のためのベンゼンヘキサオール６ホスファートの使用）
２ｍＭベンゼンヘキサオール６ホスファート、１ｍｇ／ｍｌニトロブルー塩化テトラゾリウムおよび０．８ｍＭＣａＣｌ_２含有２００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液中０．０２ｍｇ／ｍｌフェナジンメトスルファートを含む反応混合物１００μｌを、マイクロタイタープレートのウェル内に入れ、そして好適に希釈したフィターゼ溶液またはホスファターゼ溶液２０μｌを加えた。発色を視覚的に追跡し得、所望の場合、５７０ｎｍにおけるＯＤを測定することによって定量し得る。

（実施例８．固体支持体上のフィターゼ活性についてのベンゼンヘキサオール６ホスファートの使用）
微生物コロニーを、酢酸セルロース膜フィルター（ＯＥ６７型、Ｓｈｌｅｉｃｈｅｒ−Ｓｃｈｕｅｌｌ）を重ねた栄養プレートの表面上で増殖させた。このフィルターを表面から除き、そして寒天に２ｍＭベンゼンヘキサオール６ホスファート、１ｍｇ／ｍｌニトロブルー塩化テトラゾリウムおよび０．０２ｍｇ／ｍｌフェナジンメトスルファートを含有するアガロース溶液（０．７％）を重層した。染色アガロースを重ねたプレートを、１〜２時間まで、発色するまで３７℃でインキュベートした。栄養寒天の表面上に発色した暗色スポットは、フィターゼ活性を分泌する微生物コロニーに対応する（図２）。

（実施例９．固体支持体上のフィターゼ活性および／またはホスファターゼ活性の検出のためのフロログルシノール３ホスファートの使用）
微生物コロニーを、栄養プレートの表面上で増殖させた。一片の濾紙（ＷｈａｔｍａｎＮｏ１）を、２００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）中２ｍＭフロログルシノール３ホスファート、１ｍｇ／ｍｌＦａｓｔＢｌｕｅＢ塩の溶液中に浸し、ペーパータオルで軽く拭いて、シャーレの表面上に微生物コロニーと接触させて置いた。２〜５分以内に、フィターゼまたはホスファターゼを分泌するコロニーの周りに青紫色が現れ、約３０〜６０分で最大値に達する。

上記明細書中で言及した全ての刊行物は、本明細書中で参考として援用される。上記の本発明の方法および系の種々の変法および変形は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、当業者に明らかである。本発明は、特定の好ましい実施形態に関連して記載されているが、特許請求されている本発明は、このような特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことが、理解されるべきである。実際に、本発明を実施するための記載された様式の種々の変形であって、化学または関連分野における当業者に対して明らかである変形は、特許請求の範囲の範囲内であることが意図される。

図１は、トリホスホ−フロログルシノールによる呈色反応を用いた、２種の粗酵素調製物のｐＨプロフィールを示す。上のプレート：Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒｆｒｅｕｎｄｉｉ由来のフィターゼ、下のプレート：Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｏｍｏｎａｓｔｒｏｐｏｐｈｉｌａ由来のホスファターゼ。２つのプレート上の隣接する行は、酵素調製物の２倍希釈系列を含む。列は、実施例５で記載される通りの種々のｐＨに緩衝化された反応混合物を含む（各隣接する２列間の増分は０．５ｐＨ単位である）。図２は、土壌微生物の混合集団からのフィターゼ産生微生物株の選択を示す。左側は、（栄養寒天プレートから取り除いた後の）酢酸セルロースフィルターの表面上の微生物増殖を示す。右側は、実施例８で記載されるようにヘキサホスホ−ベンゼンヘキサオールで染色した後の同じプレートの下側の寒天を示す。図３は、いくつかの微生物単離物におけるフィターゼ／ホスファターゼ活性の検出を示す。土壌由来の１４個の種々の単離物を、栄養寒天の表面上で増殖し、そして実施例９で記載されるようにトリホスホ−フロログルシノールで染色した。

Claims

サンプル中のフィターゼ活性を検出するための方法であって、該方法は、以下：
ｉ）該サンプルをフィターゼ基質と合わせる工程、および
ｉｉ）該フィターゼ基質の有機代謝産物のレベルを測定する工程
を、包含する方法。
前記フィターゼ基質は、芳香族基を含む、請求項１に記載の方法。
前記芳香族基は、フェニル基である、請求項２に記載の方法。
前記フィターゼ基質は、少なくとも１つの三価リン含有基を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
前記フィターゼ基質は、複数の三価リン含有基を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
前記三価リン含有基もしくは前記三価リン含有基の各々は、ホスファート基である、請求項４または請求項５のいずれか１項に記載の方法。
前記フィターゼ基質は、芳香族基および複数のホスファート基を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
前記フィターゼ基質は、式（Ｉ）：

またはその塩形態を有し、ここで、
Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５およびＲ_６は、Ｈ、Ｃ_１−１２アルキル、Ｃ_１−１２アルコキシ、ＳＯ_３Ｈ、ＯＳＯ_３Ｈ、ＮＯ_２、ＮＨ_２、ＮＨ（Ｃ_１−１２アルキル）、Ｎ（Ｃ_１−１２アルキル）_２、ＯＰＯ_３Ｈ_２、ＣＯ_２Ｈ、ＣＮ、Ｃ_１−１２ハロアルキルから独立して選択されるか、またはＲ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５およびＲ_６の任意の一対もしくは任意の複数の対は、これらが結合している炭素原子と一緒になってＣ_３−１２炭素環もしくは複素環を形成し、これらの環は飽和であっても、不飽和であっても、芳香族であってもよく；
ここで、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５およびＲ_６の少なくとも２つは、ＯＰＯ_３Ｈ_２である、
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５およびＲ_６は、ＨおよびＯＰＯ_３Ｈ_２から独立して選択され、ここでＲ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５およびＲ_６の少なくとも２つは、ＯＰＯ_３Ｈ_２であるか、またはその塩形態である、請求項８に記載の方法。
Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５およびＲ_６の少なくとも１つは、Ｈである、請求項９に記載の方法。
前記基質は、フロログルシノール３ホスファート、ベンゼンヘキサオール６ホスファート、およびベンゼンペンタオール５ホスファートまたはそれらの塩形態から選択される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
前記基質は、ベンゼンヘキサオール６ホスファートまたはその塩形態である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
前記フィターゼ基質は、遊離のヒドロキシル基を有さない、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
前記有機代謝産物は、遊離のヒドロキシル基を有する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
前記測定工程ｉｉ）は、前記代謝産物を可視化剤と反応させて有色生成物を得る工程を包含する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
前記可視化剤は、酸化剤、還元剤、および求電子剤から選択される、請求項１５に記載の方法。
前記可視化剤は、ジアゾニウム塩を含む、請求項１５に記載の方法。
前記ジアゾニウム塩は、Ｆａｓｔ塩である、請求項１７に記載の方法。
前記Ｆａｓｔ塩は、ＦａｓｔＶｉｏｌｅｔＢ、ＦａｓｔＢｌａｃｋＫおよびＦａｓｔＢｌｕｅＢから選択される、請求項１８に記載の方法。
前記可視化剤は、ニトロブルー塩化テトラゾリウムを含む、請求項１５に記載の方法。
前記可視化剤は、フェナジンメトスルファートをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
サンプル中のフィターゼ活性を決定するためのキットであって、フィターゼ基質および可視化剤を含む、キット。
請求項１〜２１のいずれか１項に記載の特徴によって特徴付けられる、請求項２２に記載のキット。
ベンゼンヘキサオール６ホスファート、ニトロブルー５塩化テトラゾリウムおよび必要に応じてフェナジンメトスルファートを含む、請求項２２に記載のキット。
Ｆａｓｔ塩、および請求項１０に記載の化合物を含む、請求項２２に記載のキット。
芳香族基および複数のホスファート基を含む化合物の、フィターゼ基質としての使用。
請求項８〜１３のいずれか１項の特徴によって特徴付けられる、請求項２６に記載の使用。
芳香族基および複数のホスファート基を含む化合物の、酵素活性を決定するための方法における使用。
前記酵素活性は、ホスファターゼ活性もしくはフィターゼ活性である、請求項２８に記載の使用。
請求項１〜２１のいずれか１項に記載の特徴によって特徴付けられる、請求項２８もしくは請求項２９に記載の使用。
式（Ｉ）：

の化合物、またはその塩形態であって、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５およびＲ_６は、Ｈ、Ｃ_１−１２アルキル、Ｃ_１−１２アルコキシ、ＳＯ_３Ｈ、ＯＳＯ_３Ｈ、ＮＯ_２、ＮＨ_２、ＮＨ（Ｃ_１−１２アルキル）、Ｎ（Ｃ_１−１２アルキル）_２、ＯＰＯ_３Ｈ_２、ＣＯ_２Ｈ、ＣＮ、Ｃ_１−１２ハロアルキルから独立して選択されるか、またはＲ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５およびＲ_６の任意の一対もしくは任意の複数の対は、これらが結合している炭素原子と一緒になって、Ｃ_３−１２炭素環もしくは複素環を形成し、これらの環は飽和であっても、不飽和であっても、芳香族であってもよく；
ここで、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５およびＲ_６の少なくとも２つは、ＯＰＯ_３Ｈ_２である、
化合物、またはその塩形態。
フロログルシノール３ホスファート、ベンゼンヘキサオール６ホスファート、およびベンゼンペンタオール５ホスファートまたはそれらの塩形態のうちの１つである、請求項３１に記載の化合物。
フィターゼ基質および可視化剤を含む、組成物。
請求項１〜２１のいずれか１項に記載の特徴によって特徴付けられる、請求項３３に記載の組成物。
実施例のいずれか１つを参照して本明細書中で記載されるのと実質的に同じ方法。
実施例のいずれか１つを参照して本明細書中で記載されるのと実質的に同じキット。
実施例のいずれか１つを参照して本明細書中で記載されるのと実質的に同じ使用。
実施例のいずれか１つを参照して本明細書中で記載されるのと実質的に同じ化合物。
実施例のいずれか１つを参照して本明細書中で記載されるのと実質的に同じ組成物。