MX2007014296A - Metodo para determinar la actividad de fitasa. - Google Patents

Abstract

Se proporciona un metodo para la deteccion de actividad de fitasa en una muestra, que comprende poner en asociacion un sustrato de fitasa y dicha muestra y medir el nivel de un metabolito organico de dicho sustrato de fitasa.

Description

MÉTODO PARA DETERMINAR LA ACTIVIDAD DE FITASA MEMORIA DESCRIPTIVA La presente invención se relaciona con un método para ensayar la actividad de fitasa, al uso de una clase de compuestos aromáticos de fosfato en tal método, a un equipo para realizar tal método, y a compuestos novedosos y composiciones útiles en dicho método. El fitato es la forma de almacenamiento principal de fósforo en cereales y legumbres. Sin embargo, los animales monogástricos como cerdos, aves y peces no son capaces de metabolizar o absorber el fitato (o ácido fitico) y por ello se excreta, lo que lleva a contaminación de fósforo en áreas de producción de ganado intenso. Aún mas, el ácido fítico también actúa como un agente antinutricional en animales monogástricos al quelatar metales tales como calcio, cobre y zinc. Para proporcionar suficientes fosfatos para el crecimiento y salud de estos animales, el fosfato inorgánico se añade a sus dietas. Tal adición puede ser costosa e incrementa aún más los problemas de contaminación. El fitato se convierte mediante fitasas, las cuales generalmente catalizan la hidrólisis de fitato a inositol-fostatos inferiores y fosfato inorgánico.

Las fitasas son útiles como aditivos para piensos animales en donde mejoran la disponibilidad del fósforo inorgánico para el animal y disminuyen la contaminación por fosfato en el ambiente (Wodzinski R. J., Ullah A. H., Adv Appl Microbiol. 42,263-302 (1996)). Se han descrito en la literatura una serie de fitasas de origen fúngico (Wyss M. et al. Appl. Environ. Microbiol. 65 (2), 367-373 (1999); Berka R.M. et al. Appl. Environ. Microbiol. 64 (11 ), 4423-4427 (1998); Lassen S. et.

Appl. Environ. Microbiol. 67 (10), 4701-4707 (2001 )) y bacteriano (Greiner R. et al Arch. Biochem. Biophys. 303 (1 ), 107-113 (1993); Kerovuo et al. Appl.

Environ. Microbiol. 64 (6), 2079-2085 (1998); Kim H. W. et al. Biotechnol. Lett. 25, 1231-1234 (2003); Greiner R. et al. Arch Biochem. Biophys. 341 (2), 201-206 (1997); Yoon S.J. et al. Enzyme and microbial technol. 18, 449-454 (1996); Zinin N.V. et al. FEMS Microbiol. Lett. 236,283-290 (2004))). Los métodos conocidos para ensayar la actividad de fitasa en solución se basan en la detención del ortofosfato liberado a partir de fitato en la reacción de hidrólisis catalizada por enzima. El fosfato tipicamente se detecta de manera espectrofotométrica después de una reacción con molibdato en ácido sulfúrico (Heinonen J.K., Latí R.J. Anal. Biochem. 113, 313-317 (1981 )). Este método es sensible pero requiere reactivos corrosivos (ácido sulfúrico) e inflamables (acetona) para utilizarse. También es muy poco recomendado para ensayar las preparaciones de fitasa cruda o la actividad de fitasa de muestras naturales que contienen fosfato inorgánico libre. Aún más, los métodos a base de fosfomolidrato no pueden aplicarse para detectar la actividad de fitasa de colonias microbianas vivas que crecen en el medio de cultivo sólido.

Tales ensayos "en placa" serían particularmente útiles para aislamiento y desarrollo de cepas microbianas que produzcan fitasa. Una serie de intentos para desarrollar las técnicas "en placa" para detección de la actividad de fitasa se conocen de la técnica anterior. Los métodos basados en la disolución de sales de fitato insoluble (Shieh TR y Ware JH. Appl. Microbiol. 16 (9) 1348-1351 (1968); Bae HD et al. J. Microbiol. Methods. 39, 17-22 (1999)) son más bien insensibles y sufren de señales falso positivas ocasionadas por la acidificación del medio durante el crecimiento microbiano. Los métodos basados en la estimulación de crecimiento de bacterias reporteras libres de fitasa y dependientes de fosfato en placas de nutrientes que contienen fitato como la única fuente de fósforo (Chen JC. Biotechnology techniques 12 (10) 759-761 (1998)) son lentas y tienen escasa resolución inherente debido a la difusión de fosfato durante largas incubaciones necesarias para detectar el crecimiento bacteriano. En contraste, la detención de actividad de fosfatasa en presencia de fosfato inorgánico excesivo y/o sobre la superficie de medio nutriente microbiológico sólido es simple y eficiente. Los métodos basados en sustratos de fosfatasa cromogénicas como a-naftil fosfato, p-nitrofenil fosfato y 5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato son bien conocidos dos en la técnica y los sustratos están todos disponibles comercialmente (por ejemplo con Sigma-Aldrich). Sin embargo, ninguno de estos sustratos trabaja satisfactoriamente con fitasas.

Un problema que permanece sin resolver es contar con un ensayo útil para detectar la actividad de fitasa de colonias microbianas vivas y de preparaciones de fitasa en crudo. Un problema adicional que permanece sin resolver es contar con un ensayo útil para detectar la actividad de fitasa que no involucra el uso de reactivos corrosivos y/o inflamables. La presente invención abarca/alivia los problemas de la técnica antecedente. De acuerdo con un primer aspecto, se proporciona un método para detectar la actividad de fitasa en una muestra, que comprende: i) poner dicha muestra en asociación con otro sustrato de fitasa, y ii) ii) medir el nivel de un metabolito orgánico de dicho sustrato de fitasa. De conformidad con un segundo aspecto, se proporciona un equipo para determinar la actividad de fitasa en una muestra, que comprende un sustrato de fitasa y un agente de visualización. De acuerdo con un tercer aspecto, se proporciona el uso de un compuesto que comprende un grupo aromático y una pluralidad de grupos fosfato como un sustrato de fitasa. De acuerdo con un cuarto aspecto, se proporciona el uso de un compuesto que comprende un grupo aromático y una pluralidad de grupos fosfato en un método para detectar la actividad de enzima.

De acuerdo con un quinto aspecto, se proporciona un compuesto de formula (I) como se define a continuación (i) en donde Ri, R2, R3) R4, R5 y R ß se seleccionan independientemente de H, alquilo de d.12, alcoxi de C1-12, S03H, OS03H, N02, NH2, NH (alquilo C1.12), N(alquilo C?_?2)2, OP03H2. C02H, CN, haloalquilo de CM2, O cualquier par o pares de R1, R2, R3, R , R5 y Re tomados en conjunto con los átomos de carbono a los cuales se fijan forman un anillo carboxílico o heterocíclico de C3. ?2 que puede saturado, insaturado o aromático; en donde al menos dos de R1 , R2, R3, R4, R5 y R 6 son OP03H2; o una forma de sal de la misma. De acuerdo con un sexto aspecto hay una composición que comprende un sustrato de fitasa y un agente de visualización. Para facilidad de referencia, estos y aspectos adicionales de la presente invención se discuten bajo encabezados de sección apropiados. Sin embargo, las enseñanzas bajo cada sección no necesariamente se limitan a cada sección en particular.

Actividad de fitasa Como se utiliza en la presente, el término "actividad de fitasa" se refiere a la capacidad de una muestra para catalizar la descomposición de fitato (mio-inositol-hexafosfato) para generar fósforo inorgánico (por ejemplo ortofosfato). El término fitasa como se utiliza aquí abarca tanto 3-fitasa (E.C.3.1.3.8), 4-fitasa (también llamado 6-fitasa, E.C.3.1.3.26), de 5-fitasa (E.C.3.1.3.72) según la clasificación de comité de nomenclatura de la Uión Iternacional de Bioquímica y Biología Molecular. Preferiblemente, la fitasa es 3-fitasa (E.C.3.1.3.8), 4-fitasa (E.C.3.1.3.26) o 5-fitasa (E.C.3.1.3.72). En un sentido amplio las fitasas representan un subtipo de fosfatasas, ya que catalizan la escisión de un enlace de éster de ácido fosfórico. Sin embargo, como se utiliza aquí, el término "fosfatasa" se refiere a enzimas capaces de escindir los enlaces de éster de ácido fosfórico que tienen selectividad por un sustrato distinto al fitato. Sin embargo, el experto en la técnica apreciará que una fitasa puede tener un cierto nivel de actividad de fosfatasa; por el contrario, una fosfatasa puede tener un cierto nivel de actividad de fitasa.

Muestra Como se utiliza en la presente, el término "muestra" se refiere a materia de la cual se desea evaluar la presencia o ausencia de actividad de fitasa. Ejemplos de tales muestras incluyen extractos de caldos de fermentación, preparaciones de enzima purificadas, cultivos de microorganismos (tanto en placas como en solución) y similares.

Sustrato de fitasa Como se utiliza en la presente, el término "sustrato de fitasa" se refiere a un compuesto que es capaz de ser transformado por una reacción catalizada por fitasa para generar un metabolito. Preferiblemente, el sustrato de fitasa es distinto a fitato. Preferiblemente el sustrato de fitasa es capaz de transformarse mediante una reacción catalizada por fitasa para generar un metabolito orgánico como se define a continuación. Preferiblemente el sustrato de fitasa comprende un grupo aromático. Como se utiliza aquí, "grupo aromático" se refiere a un grupo carboxíclico o heterocíclico aromático insaturado de a partir de 5 a 14, preferiblemente 6 a 14 átomos de carbono que tienen un anillo sencillo (por ejemplo fenilo) o anillos múltiples condensados (fusionados) (por ejemplo naftilo o antrilo). Grupos arilo preferidos incluyen fenilo, naftilo y similares. Como se utiliza aquí, "heteroarilo" se refiere a un grupo aromático monocíclico o bicíclico de a partir de 1 a 6 átomos de carbono y 1 a 4 heteroátomos seleccionados de oxígeno, nitrógeno y azufre dentro de al menos un anillo (si hay más de un anillo).

Tales grupos heteroarilo pueden tener un anillo individual, como grupos piridilo, pirrolilo o furilo o anillos condensados múltiples como grupos indolilo, indolizinilo, benzofuranilo o benzotienilo. Heteroarilos preferidos ¡ncluyen piridilo, pirrolilo y furilo. Se prefiere que grupo aromático sea un grupo aromático carboxíclico. Más preferiblemente, el grupo aromático es un grupo fenilo o naftilo. Más preferiblemente, el grupo aromático es un grupo fenilo. Preferiblemente, el sustrato de fitasa comprende un grupo que contiene fósforo o grupos. Grupos que contienen fósforo adecuados son fosfato, fosfito, tiofosfato, fosfonato y las formas de sales, haluros y derivados alquilo de éstos. Un grupo que contiene fósforo preferido es fosfato -OP03H2 y las formas de sal del mismo. Sales adecuadas incluyen sales de metal alcalino, sales de metal alcalino terreo y sales de amonio. Preferiblemente, el sustrato de fitasa comprende una pluralidad de grupos que contienen fósforo. Más preferiblemente, el sustrato de fitasa comprende al menos tres grupos que contienen fósforo. Más preferiblemente, el sustrato de fitasa comprende al menos cuatro grupos que contienen fósforo. Más preferiblemente, el sustrato de fitasa comprende al menos cinco grupos que contienen fósforo. Más preferiblemente, el sustrato de fitasa comprende al menos seis grupos que contienen fósforo. Más preferiblemente, el sustrato de fitasa comprende seis grupos que contienen fósforo.

En una modalidad preferida alternativa, el sustrato de fitasa comprende dos o tres grupos que contienen fósforo. Más preferiblemente, el sustrato de fitasa comprende tres grupos que contienen fósforo. En una modalidad preferida, el sustrato de fitasa comprende un grupo aromático y una pluralidad de grupos fosfato. En una modalidad particularmente preferida, el sustrato de fitasa tiene la fórmula (I): (l) en donde Ri, R2, R3, R4, R5 y R6 se seleccionan independientemente de H, alquilo de C?-?2, cicloalquilo de C1.12, alcoxi de C?.-?2> S03H, OS03H, N02, NH2, NH (alquilo CM2), N(alquilo 01.12)2, OP03H2, C02H, CN, haloalquilo de C1.12, o cualquier par o pares de R1, R2, R3, R4, R5 y R6 tomados en conjunto con los átomos de carbono a los cuales se unen forman un anillo heterocíclico o carbocíclico de C3.?2 que puede ser saturado, insaturado o aromático; en donde al menos dos de R1, R2, R3, R4, R5 y Re son OP03H2; o una forma de sal del mismo.

El alquilo como se utiliza aquí se refiere a una cadena de hidrocarburo alifático e incluye cadenas rectas y ramificadas por ejemplo de 1 a 6 átomos de carbono como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo, t-butilo, n-pentilo, isopentilo, neo-pentilo, n-hexilo, e isohexilo. El halógeno, haluro o alo se refieren a yodo, bromo, cloro y flúor. Haloalquilo, como se utiliza aquí, se refiere a un grupo alquilo como se define arriba que tiene al menos un átomo de hidrógeno reemplazado con un átomo de halógeno e incluye grupos perhaloalquilo (es decir aquellos grupos alquilo que tienen todos los átomos de carbono reemplazados por átomos de halógeno). Los grupos haloalquilo preferidos son trifluorometilo y triclorometilo. Heterocíclico, como se utiliza aquí se refiere a una estructura cíclica que comprende 1 a 5 heteroátomos seleccionados independientemente de N, S, O y P. A menos que lo limite de otra manera la definición para los grupos arilo, heteroarilo, carbocíclico, heterocíclico o cicloalquilo del presente, tales grupos pueden sustituirse opcionalmente con desde 1 a 5 sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en hidroxi, aciloxi de 1 a 6 átomos de carbono, acilo de 1 a 6 átomos de carbono, alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 6 átomos de carbono, alquenilo de 2 a 6 átomos de carbono, alquinilo de 2 a 6 átomos de carbono, alquilo sustituido 1 a 6 átomos de carbono, alcoxi sustituido de 1 a 6 átomos de carbono, alquenilo sustituido de 1 a 6 átomos de carbono, alquinilo sustituido de 1 a 6 átomos de carbono, amino, amino sustituido por 1 o 2 grupos alquilo de a partir 1 a 6 átomos de carbono, aminoacilo de 1 a 6 átomos de carbono, acilamino de 1 a 6 átomos de carbono, ácido, ciano, halo, nitro, tioalcoxi de a partir de 1 a 6 átomos de carbono, tioalcoxi sustituido de a partir de 1 a 6 átomos de carbono y trihalometilo. Sustituyentes en los grupos alquilo, alquenilo, alquinilo, tioalcoxi y alcoxi mencionados arriba incluyen halógenos, CN, OH y grupos amino.

Sustituyentes preferidos en los grupos arilo incluyen aquí alquilo de a partir de 1 a 6 átomos de carbono, alcoxi de a partir de 1 a 6 átomos de carbono, halo, ciano, nitro, trihalometilo, y tioalcoxi de a partir de 1 a 6 átomos de carbono. Preferiblemente, el sustrato de fitasa no tiene un grupo OH aromático libre (un grupo OH unido directamente a un grupo aromático). Más preferiblemente, el sustrato de fitasa no tiene un sustituyente aromático seleccionado de OH, NH2, SH o alcoxi. Más preferiblemente, el sustrato de fitasa no tiene un sustituyente aromático con propiedades donantes de electrones. Más preferiblemente, el sustrato de filtrasa no tiene un substituyente con propiedades donantes de electrones. Preferiblemente R-i, R2, R3, R4, R5 y R6 se seleccionan independientemente de H y OP03H2 en donde al menos dos de Ri, R2, R3, R4, R5 y Re son OP03H2, o formas de sal del mismo. Preferiblemente, el sustrato se selecciona de fluoroglucinol trifosfato, bencenhexaol hexafosfato, y bencenpentaol pentafostato o formas de sal de los mismos. Más preferiblemente, el sustrato es fluoroglucinol trifosfato o una forma de sal del mismo.

Metabolito orgánico Como se utiliza aquí, el término "metabolito orgánico" se refiere al producto de la reacción catalizada con fitasa del sustrato de fitasa como se define arriba que comprende al menos un átomo de carbono. En ciertos casos, puede ver más de un metabolito orgánico. Se prefiere que el metabolito orgánico que comprenda un grupo hidroxilo libre (OH). Es más preferido que el metabolito orgánico comprenda un grupo OH aromático libre (un grupo OH directamente unido a un grupo aromático). Más preferiblemente, el metabolito orgánico comprende un grupo OH fenólico libre (es decir un grupo OH directamente unido a un anillo de fenilo). Se prefiere particularmente que el sustrato de fitasa no tenga un grupo OH aromático libre, y que el metabolito orgánico tenga un grupo OH aromático libre. En una modalidad preferida, un aril fosfato (II) es el sustrato de fitasa. Este se transforma mediante la reacción catalizada por fitasa para dar el metabolito orgánico correspondiente (lll) con un OH aromático libre. Esto se representa en el esquema 1.

ESQUEMA 1 (II) (lll) en donde "Ar" representa un grupo aromático como se definió arriba. En el caso en que el sustrato de fitasa es fluoroglucinol trifosfato, un metabolito orgánico es fluoroglucinol difosfato. En el caso en el que el sustrato de fitasa es bencen pentaol pentafosfato, un metabolito orgánico es bencenpentaol tetrafosfato. En el caso en el que el sustrato de fitasa es bencenhexaol hexafosfato, un metabolito orgánico es bencenhexaol pentafosfato.

Medición El nivel del metabolito orgánico puede determinarse por cualquier medio adecuado. Esto será evidente para un experto en la técnica. Como se utiliza aquí, el término "medir el nivel" incluye detectar la presencia o ausencia de un metabolito orgánico, por ejemplo al observar un cambio de color. Técnicas adecuadas para medición incluyen: técnicas cromatográficas, como cromatografía líquida de alto desempeño (HPLC), cromatografía de gas (GC), cromatografía de capa delgada (TLC); Técnicas espectroscópicas, como espectroscopia infrarroja, espectroscopia ultravioleta, espectroscopia de resonancia magnética nuclear (NMR), espectroscopia de fluorescencia, espectrofotometría, fotometría, espectroscopia de absorción y colorimetría; Técnicas visuales como detectar un cambio de color o precipitado; otras técnicas como gravimetría. En un método altamente particularmente preferido, el paso de medición comprende hacer reaccionar un (o el) metabolito orgánico como se define arriba para definir un producto coloreado. "Producto coloreado" como se utiliza aquí quiere decir producto que absorbe radiación electromagnética en la escala de 400 a 800 nanómetros. Puede comprender más de un componente. La conversión del metabolito orgánico a un producto coloreado de otra manera es particularmente conveniente en que permite una determinación visual, colorimétrica, fotográfica, fotométrica o especio fotométrica de la presencia y nivel de actividad de fitasa.

Agente de visualización Como se utiliza aquí, el término "agente de visualización" quiere decir cualquier reactivo o combinación de reactivos que es capaz de reaccionar con un metabolito orgánico como se define arriba para generar un producto coloreado como se define arriba. Preferiblemente, el agente de visualización es capaz de reaccionar con el metabolito orgánico para generar un producto generado y no reacciona hacia el sustrato de fitasa, es decir, bajo condiciones normales reacciona sólo con el metabolito. Preferiblemente, el agente de visualización reacciona con compuestos que comprenden un grupo OH libre para generar un producto coloreado. Más preferiblemente, el agente de visualización reacciona con compuestos que comprenden un grupo OH aromático libre para generar un compuesto coloreado. Más preferiblemente, el reactivo de visualización reacciona con compuestos fenólicos para generar un producto coloreado. En una modalidad particularmente preferida, el agente de visualización es capaz de participar en una reacción de sustitución electrófila con un compuesto fenólico. Más preferiblemente, el reactivo comprende una sal de diazonio (un compuesto que comprende el grupo -N=N*). Aún más preferiblemente, el agente comprende una sal de diazonio seleccionada del grupo de sales rápidas, incluyendo sales rápidas violetas (particularmente rápida violeta B), sales rápidas negras (particularmente rápida negra K), sales rápidas azules (particularmente rápida azul B). Incluso más preferiblemente, el agente de visualización comprende rápida azul B. Más preferiblemente, el agente de visualización comprende rápida azul B y acetato de sodio. En una modalidad preferida alternativa, el agente de visualización comprende un indicador redox. El término "indicador redox" como se utiliza aquí quiere decir un reactivo capaz de participar en una reacción redox (reducción-oxidación) con un compuesto fenólico para generar un producto coloreado. Un indicador redox particularmente preferido es cloruro de tetrazolio nitro-azul. Más preferiblemente, el indicador redox comprende cloruro de tetrazolio nitro-azul y metosulfato de fenazina.

Conducción del método El experto en la técnica estará bien consciente que hay una serie de técnicas adecuadas para trabajar el método de la invención. En el sentido más amplio, la muestra como se define arriba se pone en asociación con el sustrato de fitasa como se define arriba. "Pone en asociación" como se utiliza aquí quiere decir que el sustrato de fitasa y la muestra se dejan mezclar, asociar, integrar, entrar en contacto o permitir su reacción tal que cualquier actividad de fitasa como se mantiene arriba se manifiesta así sola en la conversión de sustrato de fitasa al metabolito orgánico. El método de la invención puede llevarse a cabo en solución, por ejemplo en un recipiente de reacción microbiológica o placa de microconcentración. En este caso, una solución que comprende la muestra es añadida a una solución que comprende el sustrato de fitasa o viceversa. El experto en la técnica será capaz de determinar si compuestos adicionales como reguladores de pH, etc., son necesarios. Alternativamente, el método de la invención puede ser llevado a cabo un soporte sólido como en el caso en que colonias microbianas crecen en una placa de agar. En este caso, la colonia microbiana que comprende la placa de agar es la muestra. El sustrato de fitasa en este caso es puesto en asociación convenientemente con la muestra simplemente al superponer la placa como una solución que comprende el sustrato de fitasa. El sustrato de fitasa y la muestra pueden ponerse en asociación e incubarse por un período fijo antes de medir el nivel de metabolito orgánico. Alternativamente, el sustrato de fitasa y la muestra pueden ponerse en asociación, y el nivel de metabolito orgánico medido al paso del tipo (es decir continuamente). Cuando se utiliza un agente de visualización, éste puede añadirse en cualquier punto durante el método. Por ejemplo, una composición que comprende el agente de visualización y el sustrato de fitasa pueden añadirse a la muestra. Alternativamente, el sustrato de fitasa puede añadirse a la muestra. Alternativamente, el sustrato de fitasa puede añadirse a una composición que comprende el agente de visualización y la muestra. Alternativamente, el agente de visualización puede añadirse después de que la muestra y el sustrato de fitasa se han incubado por un período.

Equipo En un aspecto, la invención se relaciona con un equipo para determinar la actividad de fitasa en una muestra, que comprende un sustrato de fitasa y un agente de visualización. El sustrato de fitasa y agente de visualización puede estar presente en la misma composición o puede presentarse como componentes para uso simultáneo, en secuencia o separado al trabajar los métodos de la invención. Componentes adicionales como estabilizadores, reguladores de pH y conservadores también pueden estar presentes.

Compuestos de la invención Los compuestos de la presente invención pueden ser convenientemente preparados de conformidad con los métodos descritos en los siguientes esquemas de reacción o modificación de éstos utilizando materiales de partida fácilmente disponibles, reactivos y procedimientos sintéticos convencionales. También es posible hacer uso de variantes de estos pasos y proceso, que en sí son conocidos y están dentro de las habilidades preparatorias de un experto en la técnica. El esquema 2 muestra un método general para la preparación de un compuesto de polifosfato (VI) y el compuesto fenólico correspondiente (IV) mediante el intermediario protegido (V), en donde G representa un grupo protector. Grupos protectores adecuados G serán fácilmente determinados por los expertos en la técnica e incluyen bencilo, trialquilsililo (particularmente trimetilsililo y t-butildimetilsililo), y alquilo de C ß.

ESQUEMA 2 OPO(OG)jJ n OPO(OH)¿; n rr-2 6 (IV) (V) (VI) El esquema 3 muestra la preparación de trifosfofloroglucinol (IX) a partir de floroglucinol (Vil). En esta reacción, el dibencilclorofosfato se genera in situ mediante la reacción de dibencil fosfito con tetracloruro de carbono. El intermediario protegido (VIII) se hidrogena para generar el producto final.

ESQUEMA 3 OH 0P0{OBp)j * , DMAP, CCI_,, DIPfEA POI I(OBn)?, CI I-,CN HO' OH (BnO)?OPO' -OPOfOBn);, (IX) La presente invención se describirá en mayor detalle como ejemplo únicamente con referencia a las figuras anexas en las cuales: La figura 1 muestra el perfil de pH de dos preparaciones enzimáticas crudas utilizando una reacción cromogénica con trifosfo-floroglucinol. Placa superior - una fitasa de Citrobacter freundii, placa inferior -fosfatasa de Stenotropomonas tropophila. Las filas adyacentes en las dos placas contienen una serie de dilución doble de la preparación enzimática. Las columnas contienen mezclas de reacción reguladas a diferentes niveles de pH como se describió en el ejemplo 5 (el aumento entre cada dos columnas adyacentes es 0.5 unidad de pH). Las figuras 2A y 2B muestran la selección de sepas microbianas productoras de fitasa de una población mezclada de microorganismos de tierra. La figura 2A muestra el crecimiento microbiano en la superficie de un filtro de acetato de celulosa (después de recogerlos de una placa de nutrientes de agar). La figura 2B muestra el agar subyacente de la misma placa después de teñirla con hexafosfo-bencenhexaol como se describió en el ejemplo 8. La figura 3 muestra la detección de actividad de fitasa/fosfatasa en varias aislaciones microbianas. Se cultivaron catorce aislaciones bacterianas diferentes de tierra en la superficie de nutrientes agar y se tiñeron con trifosfo-floroglucinol como se describió en el ejemplo 9. Esta invención se describirá más detalladamente en los siguientes ejemplos.

Abreviaciones DMAP: Dimetilaminopiridina DIPEA: Diisopropiletilamina Bn: Bencilo TPP: Trifosfofloroglucinol OD: Densidad óptica EJEMPLOS EJEMPLO 1 Síntesis de floroglucinol trifosfato (ix) OP03H2 (IX) El floroglucinol trifosfato (IX) se sintetizó del floroglucinol disponible comercialmente utilizando el método de fosforilación de Silverberg et al. (Tetrahedron letters 37, 771-774 (1996)). El floroglucinol (2.52 g) se disolvió en 355 ml. de acetonitrilo anhidro en un matraz de fondo redondo de varios cuellos. Durante la reacción, se expulsó el aire del matraz por medio de un flujo constante de nitrógeno y la mezcla de reacción se agitó continuamente utilizando un agitador magnético. La solución se enfrió bajo -10°C utilizando un baño de hielo con sal. El tetracloruro de carbono (46 g), N,N-diisopropiletilamina (16.3 g) y se agregó N,N-dimetilaminopiridina (0.75 g) a la mezcla de reacción (en ese orden). Después, se agregó dibencilfosfita (23 g) lentamente para que la temperatura de la mezcla de reacción no permitiera elevarse a más de -10°C. Después de que se completo la adición de dibenzilfosfito, la mezcla de reacción se incubo a -10°C durante una hora. En este punto, el flujo de nitrógeno y el enfriamiento fueron discontinuos y se agregó la solución de 150 ml de 0.5M de KH2P04 en agua a la mezcla de reacción. La mezcla se extrajo con etilacetato (3 veces, 150ml.). Los extractos de etilacetato combinados se lavaron 2 veces con agua (200ml.), una vez con NaCI (200 ml) saturado y seco sobre sulfato de sodio anhidro. El etilacetato se desprendió por medio de la evaporación giratoria y el producto resultante se disolvió en 75 ml. de la mezcla de metanol-titrahidrofurano (1 :1 ). Se agregó 1 g de paladio al carbón y el hidrógeno burbujeó a través de la mezcla de reacción a presión atmosférica durante la noche. Se agregaron 200 ml. de agua a la mezcla de reacción y se ajustó el pH a 7.0 con NaOH. Los solventes se desprendieron en un evaporador giratorio bajo presión reducida. El producto fue esencialmente homogéneo de acuerdo con el análisis de HPLC utilizando un sistema Dionex DX-600 (Dionex, Sunnyvale, CA) que consiste en un auto-muestrario AS50, un contenedor térmico AS50, una bomba de gradiente GP50 y un detector electroquímico ED50 utilizando una columna de guarda lonPac AG11 (2x50mm), una columna analítica lonPac AS11-HC (2x50mm) y una columna de filtro de aniones ATC-1 , el supresor auto-regenerador se estableció a 50 mA. Se alcanzó el perfil de gradiente al mezclar (A) 200 mM de Na OH y (B) H20: 0-5 min, 40-80 mM de NaOH; 5-40 min, 80-135 mM de NaOH; 40-42 min, 135-140 mM de NaOH. Se realizó la recolección de datos y la manipulación con el software CHROMELEON 6 (Dionex).

EJEMPLO 2 Síntesis de bencenhexaol hexafosfato (X) ÍX) Se sintetizó el bencenhexaol por el método de Fatiadi et al. (J.Res.Natl. Bur. Std. 67A, 153-62 (1963)). Se mezclaron 1200 g de 30% de solución acuosa de glioxal con 6 litros de solución de agua que contiene 800 g of Na2S03 y 300 g de NaHC03. Un chorro de aire se pasó a través de la mezcla y se calentó gradualmente a aproximadamente 90°C. En este punto, se detuvo la ventilación, pero el calentamiento continuó hasta que empezó a hervir. La mezcla de reacción se dejó enfriar lentamente a temperatura ambiente. El precipitado cristalino que se formó al enfriarse se lavó una vez con 100ml. de agua de metanol (1 :1 ) y una vez con 100ml. de metanol, y se disolvió en 500ml de 2.5 M ácido clorhídrico caliente. La solución se enfrió lentamente a temperatura ambiente seguida del enfriamiento en un baño de hielo. El precipitado cristalino de tetrahidroxi para-benzoquinona se lavó con una pequeña cantidad de agua helada y se re-disolvió en 500 ml. de 2.5 M ácido clorhídrico caliente. Se agregaron 200 g de SnCI2 *2 H20 a la solución y se esperó a que hirviera. Se agregaron 500ml de HCl concentrado a la solución y se calentó para que hirviera nuevamente seguido de una adición más de 1 I de HCl concentrado. El precipitado de bencenhexaol crudo que se formó al enfriarse en hielo se re-cristalizó de 1 I de 2.5 M de HCl que contiene 5g de SnCI2 La preparación se almacenó en un degradador al vacío sobre NaOH sólido. El bencenhexaol se fosforilizó con dibencilclorofosfato esencialmente como se describió en el ejemplo 1 excepto que se utilizó 1.7 g. de bencenhexaol y se utilizó la reacción después de 1 hora a -10°C, y una hora de incubación adicional a temperatura ambiente. La pureza de bencenehexaol hexafosfato (X) se confirmó utilizando el método HPLC que se utilizó para el análisis de TPP.

EJEMPLO 3 Síntesis de otros fosfoésteres de otros polihidroxibencenos Utilizando el mismo método de fosforilación como se describió en los ejemplos 1 y 2 es posible sintetizar otros derivados de fosfoésteres de polifenoles aromáticos. Los métodos para sintetizar bencenpentaol (Chem. Commun. (Londres) 9,441 (1967)), varios bencentetraols y bencentriols (Dressier H., y Hotter S. Polyhydroxybencenes. in Encyclopaedia of chemical technology (3rd edition), Mark H:F. et al., eds. John Wiley & sons. Vol 18, pp. 670-704 (1982)), cornos se conocen. Varios polihidroxifenoles también están comercialmente disponibles.

EJEMPLO 4 Las fitasas aceptan a los polihidroxibencenos fosforilados como sustratos Los ensayos enzimáticos se llevaron a cabo en placas de micro-concentración en 100 µl de mezcla de reacción. En la mezcla de reacción para las fitasas y fosfofitasas acidas incluyeron: 10 mM de sustrato en 200 mM de solución reguladora de acetato de sodio, pH 5.5 que contiene 0.8 mM de CaCI2. Se utilizaron las mismas condiciones para las fitasas y fosfatasas alcalinas excepto porque la solución reguladora de de acetato de sodio se reemplazó con 200 mM de solución reguladora de Tris*HCI, pH 7.5. Se dejaron procesar las reacciones durante 1 hora a 37° C después de cuyo tiempo el fosfato liberado se midió por medio de una modificación de un procedimiento conocido (Heinonen J.K., Lahti R.J. Anal Biochem. 113 (2), 313-317 (1981 )). Brevemente, 200 µl de una solución de AMM preparado frescamente (7.5 N de H2S04, 15Mm de molibdato de amonio y acetona -1 :1 :2) se agregó a la mezcla de reacción 100 µl en cada pozo de placa de micro-concentración. La absorbencia a 390 nm se midió no antes de 10 minutos y no después de 30 minutos después que se agregó el reactivo AMM. Se determinó la cantidad de fosfato al crear una curva de calibración con soluciones de fosfato de concentraciones conocidas. Tanto la sitasas como las fosfatasas catalizaron la hidrólisis de fosfoésteres. Por lo tanto, la diferencia entre estos dos grupos de enzimas es cuantitativa más que cualitativa y puede definirse como eficiencia relativa en hidrólisis de fitato y simple monofosfoésteres como por ejemplo glucosa 6-fosfato o fructosa 6-fosfato. Las fosfatasas tienden a ser relativamente ineficientes en el fitato hidrolisado y por el contrario varias fitasas hidrolisan fosfatos de azúcar mono-sustituidos ineficientemente. Para probar si los polihidroxibencenos polifosforilados pueden utilizarse como copias de fitato, se probó el desprendimiento de fosfato de hexafosfo-bencenhexaol y fructosa 6-fosfato por medio de diferentes fitasas y fosfatasas. Las fistasas de Aspergilius Niger (NatuphosR), Escherichia coli (Phyzyme XPR) y Peniophora lycii (RonozymeR) así como la fosfatasa acida de papa se probaron a un pH 5.5 mientras se probaron la fosfatasa bacteriana alcalina, fosfatasa intestinal de ternera y fosfatasa de camarón a un pH 7.5. Los resultados de este experimento (Cuadro 1 ) demuestran que el bencenhexaol hexafosfato es mejor sustrato que la fructosa 6-fosfato para todas las fitasas probadas mientras que para las fosfatasas comunes lo contrario es verdad. Similarmente, el foroglucinol trifosfato es un sustrato para toda las fitasas probadas. Sin embargo, no es tan selectivo como el bencenhexaol hexafosfato debido a que también es un buen sustrato para todas las fosfatasas comunes probadas.

CUADRO 1 Relación de actividad de liberación de fosfato de diferentes enzimas con fructosa 6-fosfato y bencenhexaol hexafosfato o floroglucinol trifosfato como sustratos.

Enzima Relación de Relación de actividades actividades con con bencenhexaol floroglucinol hexafosfato y fructosa 6-P trifosfato y fructosa ß-P A. fritasa niger 280 250 (NatufosR) Fitasa E. coli 500 122 (Phyzyme XPR) Fitasa Peniophora lycii 250 2.7 (RopozymeR) Fosfatasa acida de papa 3.9 0.23 Fosfatasa bacteriana 1.0 0.01 alcalina Fosfatasa de intestino 1.0 0.01 de ternera Fosfatasa de camarón 3.8 0.1 EJEMPLO 5 Uso de floroglucinol trifosfato para la detección de actividad de fitasa o fosfatasa en ensayos líquidos Para los ensayos en una variación de pH de 3 a 5.5, 100 µl de la mezcla de reacción que contiene 2 mM de foloroglucinol trifosfato en 200 mM de solución reguladora de acetato de sodio, que contiene 0.8 mM CaCI2 están colocados en un pozo de una placa de micro-concentración y se agregaron 20 µl de una fitasa diluida adecuadamente o una solución de fosfatasa. La mezcla se incubó durante 60 minutos a 37°C seguido de la adición de 50 µl de la solución preparada de manera fresca de sal rápida azul B de 3mg/ml en 5M de acetato de sodio pH 5.3. El desarrollo de color se registró tanto espectrofotométricamente (570 nm) o fotográficamente no antes de 10 y no después de 20 minutos después de agregar la sal rápida azul B. Este método para detectar la actividad de fitasa/fosfatasa puede utilizarse en valores más bajos o más altos de pH que 3 a 5.5. En este caso, solución reguladora de acetato de sodio está reemplazada con otros reguladores adecuados. Por ejemplo, glicina*HCI es útil en el alcance de pH 1.5 a 3 y tri-maleato en un alcance de pH de 6 a 9. La figura 3 ilustra cómo puede utilizarse este método para una evaluación rápida del perfil del pH de las fitasas o fosfatasas.

EJEMPLO 6 Usos de floroglucinol trifosfato para la detección de actividad de fitasas suplementaria en muestras de alimento Las muestras de alimentos se suspendieron a 10-25 % (p/v) en 50 mM de glicina/HCI, pH 2.5 y se agitaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de dejar que el material sólido se asentara, el supernadante se removió y colocó en un tubo Eppendorf, se trató con carbono activado (Norit) a 1 % (p/v). La suspensión se agitó durante 10 minutos a temperatura ambiente y se centrifugó durante 1 minuto a 10,000 rpm. Se removieron y mezclaron 100 µl de sobrenadante en un pozo de una placa de micro-concentración con 100 µl de 20 mM de floroglucinol trifosfato en 250 mM glicina/HCI, pH 2.5. La placa de micro-concentración se incubó durante 60 min a 37° C seguido de la adición de 25 µl de 2.5 mg/ml de solución de sal rápida azul B (Sigma D9805) en 5 M de acetato de sodio de pH 5.3. La intensidad de color se registró después de 15 a 20 minutos tanto por fotometría o fotografía.

EJEMPLO 7 Usos de bencenhexaol hexafosfato para la detección de actividad de fitasa en ensayos líquidos Se colocaron 100 µl de mezcla de reacción que contiene de solución reguladora de acetato de sodio, que contiene 2 mM de bencenhexaol hexafosfato, 1 mg/ml de cloruro de tetrazolio nitro-azul y 0.02 mg/ml de fenacina metosulfato en 200 mM de acetato de sodio que contiene 0.8 mM CaCI2 en un pozo de una placa de micro-concentración y se agregaron 20 µl de una fitasa diluida adecuadamente o solución de fosfatasa. El desarrollo de color puede ser seguido visualmente y, si se desea, cuantificado al medir la OD a 570 nm.

EJEMPLO 8 Usos de bencenhexaol hexafosfato para la detección de actividad de fitasa en soportes sólidos Se cultivaron las colonias microbianas en una superficie de una placa de nutriente sobre un filtro de membrana de acetato de celulosa (tipo OE 67, Shleicher-Schüll). El filtro se removió de la superficie y el agar se puso sobre una solución agarosa (0.7%) que contiene 2 mM de bencenhexaol hexafosfato, 1 mg/ml de cloruro de tetrazolio nitro-azul y 0.02 mg/ml de fenazina metosulfato. Las placas que sobreyacen con la agarosa teñida se incubaron a 37°C hasta que se desarrolló el color después de 1 a 2 horas. Las manchas oscuras se desarrollaron en la superficie del agar de nutriente que corresponden a las colonias microbianas que secretan la actividad de fitasa (figuras 2A y 2B).

EJEMPLO 9 Usos de floroglucinol trifosfato para la detección de actividad de fitasa y/o fosfatasa en soportes sólidos Se cultivaron las colonias microbianas en la superficie de una placa de nutrientes. Una tira de papel de filtro (Whatman No. 1 ) se sumergió en una solución de 2 mM de floroglucinol trifosfato, 1 mg/ml de sal rápida azul B en 200 mM de solución reguladora de acetato de sodio, pH 5.5, se humedeció ligeramente en una toalla de papel y se colocó en la superficie de la caja de Petri en contacto con las colonias microbianas. El color azul-violeta apareció alrededor de las colonias que secretan fitasas o fosfatasas durante 2 a 5 minutos y alcanzaron el máximo en aproximadamente 30 a 60 minutos (figura 3). Todas las publicaciones mencionadas en la especificación anterior están incorporadas aquí por medio de referencia. Varias modificaciones y variaciones de los métodos descritos y del sistema de la invención serán aparentes para aquellos expertos en la técnica sin alejarse del alcance y espíritu de la invención. Aunque la invención se ha descrito en relación con las modalidades específicas preferidas, debe entenderse que la invención como se reclama no debe estar limitada a dichas modalidades específicas. De hecho, varias modificaciones de las modalidades descritas para llevar a cabo la invención, las cuales son obvias para aquellos expertos en química o campos relacionados, tienen el propósito de estar dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

Claims (34)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un método para detectar la actividad de fitasa en una muestra comprende: i) poner dicha muestra en asociación con un sustrato de fitasa y ii) medir el nivel de un metabolito orgánico de dicho sustrato de fitasa.

2.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el sustrato de fitasa comprende un grupo aromático.

3.- El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque el grupo aromático es un grupo fenilo.

4.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque el sustrato de fitasa comprende al menos un grupo que contiene fósforo.

5.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque el sustrato de fitasa comprende una pluralidad de grupos que contienen fósforo.

6.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 ó 5, caracterizado además porque cada grupo que contiene fósforo es o son un grupo o grupos de fosfato.

7.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque el sustrato de fitasa comprende un grupo aromático y una pluralidad de grupos de fosfato.

8.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque el sustrato de fitasa tiene la fórmula (I): en donde Ri, R2, R3, R4, R5 y Re son seleccionados independientemente de H, alquilo de d.?2, alcoxi de C?.12, S03H, OS03H, N02, NH2, NH(alquilo CM2), N(alquilo CM2)2, OP03H2, C02H, CN, haloalquilo de C?-?2, o cualquier par o pares de R1 ( R2, R3, R , R5 y Re tomados junto con los átomos de carbono a los cuales están unidos forman un anillo carbocíclico o heterocíclico de C3-12 el cual puede ser saturado, no saturado o aromático; en donde al menos dos de R1, R2, R3, R4, R5 y RT son OP03H3; o una sal del mismo.

9.- El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque R1, R2, R3, R , R5 y R6 están independientemente seleccionados de H y OP03H2 en donde al menos dos de R1, R2, R3> R4, R5 y Re son OP03H2 o una sal mismo.

10.- El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque al menos de Ri, R2, R3, R4, R5 y RQ es H.

11.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque el sustrato está seleccionado de floroglucinol, trifosfato, bencenhexaol hexafosfato, y bencenpentaol pentafosfato o sales del mismo.

12.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque el sustrato es bencenhexaol hexafosfato o una sal del mismo.

13.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque el sustrato de fitasa no tiene un grupo de hidroxilo libre.

14.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque el metabolito orgánico tiene un grupo libre de hidróxilo.

15.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque el paso ii) comprende hacer reaccionar el metabolito con un agente de visualización para dar un producto de color.

16.- El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque el agente de visualización está seleccionado de los agentes oxidantes, agentes reductores y agentes electrófilos.

17.- El método de conformidad la reivindicación 15, caracterizado además porque el agente de visualización comprende una sal de diazonio.

18.- El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque la sal de diazonio es una sal rápida.

19.- El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque la sal rápida está seleccionada de la rápida violeta B, rápida negra K y rápida azul B.

20.- El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque el agente de visualización comprende cloruro de tetrazolio nitro-azul.

21.- El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque el agente de visualización además comprende metosulfato de fenazina.

22.- Un equipo para determinar la actividad de fitasa en una muestra, que comprende un sustrato de fitasa y un agente de visualización.

23.- El equipo de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además por las características de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21.

24.- El equipo de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque comprende bencenhexaol hexafosfato, cloruro de tetrazolio nitro-azul y opcionalmente metosulfato de fenazina.

25.- El equipo de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque comprende una sal rápida y un compuesto como se define en la reivindicación 10.

26.- El uso de un compuesto que comprende un grupo aromático y una pluralidad de grupos de fosfato como un sustrato de fitasa.

27.- El uso que se reclama en la reivindicación 26 en donde se caracteriza por cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13.

28.- El uso de un compuesto que comprende un grupo aromático y una pluralidad de grupos de fosfato en un método para detectar la actividad enzimática.

29.- El uso que se reclama en la reivindicación 28 en donde la actividad enzimática es de actividad de fosfatasa o fitasa.

30.- El uso que se reclama en la reivindicación 28 ó 29 en donde se caracteriza por cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21.

31.- Un compuesto de la fórmula (I) en donde Ri, R2, R3, R , R5 y Re, están seleccionados independientemente de H, alquilo de C?.12, alcoxi de C1-12, S03H, OS03H, N02, NH2, NH(alquilo C1-12), N(alquilo C?-?2)2, OP03H2, C02H, CN, haloalquilo de C?_?2, o cualquier par o pares de Ri, R2, R3, R , R5 y Re tomados junto con los átomos de carbono a los cuales están unidos forman un anillo carbocíclico o heterocíclico de C3-?2 el cual puede ser saturado, np saturado o aromático; en donde al menos dos de R-i, R2, R3, R4, R5 y Re son OP03H3; o una sal del mismo.

32.- El compuesto de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizado además porque es uno de floroglucinol trifosfato, bencenhexaol hexafosfato, y bencenpentaol pentafosfato o formas de sal de la misma.

33.- Una composición que comprende un sustrato de fitasa y un agente de visualización.

34.- La composición de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada además porque se caracteriza por cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21.