CN106706520A - 一种模拟动物胃环境内植酸酶解磷含量测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明适用于饲料原料及加工工艺技术领域，提供了一种模拟动物胃环境内植酸酶解磷含量测定方法，以解决在畜禽生产中无法客观评定植酸酶使用效果的问题；该测定方法首先将底物各原料混合后粉碎，添加待测植酸酶与所述底物混合，同时作空白对照，分别加入到胃蛋白酶盐酸溶液中，水浴冷却后测定溶液pH，准确移取上清液至离心管中，并准确量取剩余上清液，将离心管中的上清液离心得上清液A，再准确移取1mL上清液A，加入钒钼酸胺显色剂，用分光光度计比色测定，最后从磷标准曲线中查得磷的浓度,计算添加待测植酸酶底物多释放的水溶性磷含量。本发明通过底物多释放水溶性磷的多寡来判定植酸酶的作用大小，选择质佳的植酸酶，有效减少外源磷的使用量。

Description

一种模拟动物胃环境内植酸酶解磷含量测定方法

技术领域

本发明涉及饲料原料及加工工艺技术领域，尤其涉及一种模拟动物胃环境内植酸酶解磷含量测定方法。

背景技术

磷是畜禽日粮中仅次于能量、蛋白质及钙的重要营养物质，是动物体生长发育所必需的常量矿物质元素，参与体内许多生理功能和生物化学反应。常用植物性饲料中60％-70％的磷是以植酸或者植酸盐的有机磷形式存在，反刍动物瘤胃微生物可以产生大量的植酸酶，可以很好地利用植酸磷，而单胃动物对植酸磷的利用效率很低，食入的磷有75％都随粪便排出，需要通过在饲料中添加磷酸氢钙等无机磷的形式进行补充，不仅增加成本，还会造成环境污染。

植酸酶在动物胃中可以将植酸磷释放，提高植物性饲料中磷的利用效率，减少外源磷的使用量，节省成本，并减少环境污染。另外，植酸往往还会和其他养分(如锌、铁等)以络合物的形式存在，不易解离，使用植酸酶可以提高此部分养分的使用效率。现在，随着饲料工业的快速发展，饲料用植酸酶制剂的应用也越来越广泛，不同公司采用不同的生产菌种、基因来源生产植酸酶，其使用方式及活性评定方法各有差异，因此在畜禽生产中无法客观的评定植酸酶的使用效果。植酸酶是一种蛋白质，进入动物胃中会被胃蛋白酶降解，饲料中植酸酶在胃中的有效利用率及有效解磷含量是个未知数，目前还没有人测定过。因此，通过体外模拟胃环境来测定植酸酶的有效解磷含量，对于快速评定植酸酶质量，选择质佳的植酸酶是极为重要的。

植物性饲料中的磷通常是以植酸磷形式存在，植酸磷很难被单胃动物利用，因此，植物性饲料中总磷的消化利用率很低，需要外源补充磷。植酸酶在动物胃中可以将植酸磷释放，提高植物性饲料中磷的利用效率，减少外源磷的使用量，节省成本，并减少环境污染。

植酸往往还会和其他养分(如锌、铁等)以络合物的形式存在，不易解离，使用植酸酶可以提高此部分养分的使用效率。再者，有证据表明，NSP酶等外源酶作用的发挥效果有赖于植酸酶的支持；在没有使用植酸酶的情况下，NSP酶作用效果不佳。故而，选择质佳的植酸酶对于提高饲粮质量是极为重要的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种模拟动物胃环境内植酸酶解磷含量测定方法，通过底物多释放水溶性磷的多寡来判定植酸酶的作用大小，进而选择质佳的植酸酶，有效减少外源磷的使用量。

为实现本发明的上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种模拟动物胃环境内植酸酶解磷含量测定方法，包括以下步骤：首先将底物各原料混合后粉碎，所述底物是由以下原料按照质量百分比组成：玉米60％、豆粕20％、棉粕10％及DDGS 10％，添加待测植酸酶与所述底物混合，同时作空白对照，分别加入到胃蛋白酶盐酸溶液中，40℃恒温水浴，冷却至室温后再测定溶液pH，准确移取12mL上清液至离心管中，并准确量取剩余上清液，将离心管中的上清液离心，得上清液A，再准确移取离心管中上清液A 1mL，加入钒钼酸胺显色剂，再加蒸馏水定容，摇匀静置，用分光光度计比色测定，最后从磷标准曲线中查得磷的浓度,计算在模拟胃环境中添加植酸酶饲料底物多释放的水溶性磷含量。

一种模拟动物胃环境内植酸酶解磷含量测定方法，其具体实现步骤如下：

(1)首先制备底物：所述底物由如下原料按照质量百分比组成:玉米60％、豆粕20％、棉粕10％及DDGS 10％；按照上述配比称取各原料混合后粉碎，并过40目筛；

(2)分别称取3～7g所述步骤(1)制备的底物，各置于250mL碘量瓶中,按1000FYT/kg的酶活添加量添加0.1～1mg的待测植酸酶加入到其中一个碘量瓶中，同时平行做空白对照(底物中不加入待测植酸酶)；

(3)然后将100mL胃蛋白酶盐酸溶液缓慢加入至碘量瓶中制成消化液，缓慢搅拌后测定消化液的pH，当pH大于3.5，用pH 2.0的盐酸溶液将消化液调整至3.0～3.5之间，严密封口，所述盐酸溶液为取质量分数为36％的浓盐酸0.83mL，定容至1000mL；

(4)40℃恒温水浴摇床2h，冷却至室温后再测定溶液pH，pH应保持在4.0～4.5之间；

(5)准确移取12mL碘量瓶中的上清液至离心管中，同时，准确量取碘量瓶中剩余上清液的体积，将上清液4000rpm离心10min，得上清液A；

(6)准确移取离心管中1mL上清液A至50mL比色管中，加入10mL钒钼酸胺显色剂，加蒸馏水定容至50mL，摇匀静置10min；

(7)用分光光度计400nm比色测定，从磷标准曲线中查得磷的浓度(待测植酸酶磷浓度C1和空白对照磷浓度C2)；

(8)磷标准曲线的绘制：准确移取磷标准溶液0mL、2.0mL、4.0mL、6.0mL、8.0mL、10.0mL分别置于50mL容量瓶中，分别加入钒钼酸铵显色剂10mL，用水稀释至刻度，摇匀，静置10min，在400nm波长下用分光光度计测各溶液的吸光度，以磷含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制磷标准曲线；

(9)计算在模拟胃环境中添加植酸酶饲料底物多释放的水溶性磷含量p，公式为：

其中，C1：待测植酸酶磷浓度(μg/mL)；C2：空白对照磷浓度(μg/mL)；v1：添加待测植酸酶碘量瓶中剩余上清液的体积(mL)；V2：空白对照碘量瓶中剩余上清液的体积(mL)；m：底物样品重量(g)。

进一步地，所述步骤的植酸酶为非耐高温型，固态颗粒状，酶活为5000～50000FYT/g。

进一步地，所述胃蛋白酶盐酸溶液：将胃蛋白酶与盐酸溶液混合，混合后pH为2.0，胃蛋白酶的质量百分比浓度为0.2％，所述盐酸溶液为取质量分数为36％的浓盐酸0.83mL，定容至1000mL，pH为2.0。

进一步地，所述钒钼酸胺显色剂的配制具体步骤为：称取偏钒酸铵1.25g，加水200mL，加热溶解不能沸腾，冷却后加质量分数为65％的浓硝酸250mL溶解制成溶液A；另外称取钼酸铵25g，加水400mL加热溶解，冷却，制成溶液B，将溶液A和溶液B混合，定容至1000mL。

进一步地，所述磷标准溶液的配制具体步骤为：取105℃烘至恒重的磷酸二氢钾0.2195g溶于蒸馏水中，加质量分数为65％的浓硝酸3mL，定容至1000mL。

进一步地，与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明提供的模拟胃环境内植酸酶解磷含量测定方法，在模拟胃环境条件下测定底物释放水溶性磷含量，通过底物释放水溶性磷的多寡来判定植酸酶的作用大小，选择质佳的植酸酶，提高植物性饲料中磷的利用效率，减少外源磷的使用量，节省成本，并减少环境污染。

植酸磷是一个含六个磷酸基团的环状化合物，在大多数油籽和豆科植物中占干物质的1％-5％。通常将植酸磷列入抗营养因子，因为它不仅与植物中40％-70％的磷结合，而且植酸磷还与其它二价和三价金属元素如钙、镁、锌和铁等金属离子螯合形成极难溶解的化合物，动物很难吸收。反刍动物瘤胃微生物产生大量的植酸酶，可以很好地利用植酸磷，而单胃动物对植酸磷的利用效率很低，食入的磷有75％都随粪便排出，需要通过在饲料中添加磷酸氢钙等无机磷的形式进行补充。

植酸酶是一类特殊的磷酸单酯酶，对植酸磷的降解率有一个很宽的pH范围,有研究表明，植酸酶在酸性条件下活性较强，主要在胃中发挥作用。植酸酶在胃中可有效分解存在于饲料中的植酸，将植酸和植酸盐中的磷酸基团逐一水解,最终释放出肌醇和无机磷，提高植酸磷的利用率，同时由于解除了植酸的抗营养作用,可以提高单胃动物对淀粉、脂肪和蛋白质等营养物质的利用率,并且释放被植酸鳌合的各种矿物元素,促进了动物矿质营养的平衡,改善动物的组织结构，促进动物生长。

植酸酶是一种蛋白质，进入胃中会被胃蛋白酶降解，无法准确估测植酸酶的有效利用率，因此通过模拟胃环境，在体外条件下测定底物释放水溶性磷含量，通过底物释放水溶性磷的多寡来判定植酸酶的有效利用率，对于选择质佳的植酸酶具有重要的意义。

附图说明

图1是本发明的磷标准曲线图。

具体实施方式

下面结合具体附图及实施例进一步详细说明本发明。

本发明实施例中的试验试材：

1、试验材料：植酸酶，非耐高温型，固态颗粒状，酶活为5000～50000FYT/g。

2、试验试剂和药品。

(1)胃蛋白酶盐酸溶液：将胃蛋白酶与盐酸溶液混合，混合后pH为2.0，胃蛋白酶的质量百分比浓度为0.2％。配制时需小心缓慢搅拌，防止胃蛋白酶失活。

(2)钒钼酸胺显色剂：称取偏钒酸铵1.25g，加水200mL，加热溶解(不能沸腾)，冷却后加质量分数为65％的浓硝酸250mL溶解制成溶液A；称取钼酸铵25g，加水400mL加热溶解，冷却后制成溶液B，将溶液A与溶液B混合，定容至1000mL。

(3)磷标准溶液：将105℃烘至恒重的磷酸二氢钾0.2195g溶于蒸馏水中，加质量分数为65％的浓硝酸3mL，定容至1000mL。

(4)盐酸溶液：0.83mL的浓盐酸(质量分数为36％)，定容至1000mL，pH为2.0。

(5)底物：由如下原料按照质量百分比组成:玉米60％、豆粕20％、棉粕10％及DDGS10％。

3、仪器：恒温水浴摇床(SHZ-A，上海浦东物理光学仪器厂)，低速离心机(LD5-2B，雷勃尔)，可见分光光度计(721，上海菁华科技仪器有限公司)。

实施例1

一种模拟动物胃环境内植酸酶解磷含量测定方法，其具体实现步骤如下：

(1)按照底物上述配比称取底物各组分,将底物原料分别粉碎混合后全部通过40目筛，分别称取5g(准确至0.0001g)(m)，各置入250mL碘量瓶中；

(2)按1000FYT/kg的酶活添加量，取5000FYT/g的1mg(精准至0.1mg)某厂家待测植酸酶加入到其中一个碘量瓶中，同时平行做空白对照(底物中不添加待测植酸酶)；

(3)向碘量瓶中缓慢加入胃蛋白酶盐酸溶液100mL制成消化液，缓慢搅拌后测定消化液的pH，若发现pH大于3.5，应用pH 2.0的盐酸溶液将消化液调整至3.0～3.5之间，严密封口；

(4)将严密封口的碘量瓶放入提前预热的恒温水浴摇床，40℃水浴2h；

(5)水浴结束后将碘量瓶冷却至室温，测定溶液pH；一般情况下，pH在4.0～4.5之间。若超过此范围，则此次测定失败，需重新测定；

(6)准确移取碘量瓶中的上清液12mL，转移至15mL的离心管中。同时，准确量取碘量瓶中剩余上清液的体积；

(7)将离心管置于离心机中，平衡后4000rpm离心10min，得上清液A；

(8)准确移取1mL离心管中的上清液A至50mL比色管中，加入10mL钒钼酸胺显色剂，加蒸馏水定容至50mL，摇匀静置10min；

(9)用分光光度计400nm比色测定，从磷标准曲线中查得磷的浓度(C1和C2)；

(10)磷标准曲线的绘制：准确移取磷标准溶液0mL、2.0mL、4.0mL、6.0mL、8.0mL、10.0mL分别置于6个50mL容量瓶中，分别加入钒钼酸铵显色剂10mL，用水稀释至刻度，摇匀，静置10min，在400nm波长下用分光光度计测各溶液的吸光度。以磷含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制磷标准曲线，如图1所示；

(11)结果计算

在模拟胃环境中添加植酸酶饲料底物多释放的水溶性磷含量(P)，公式为：

其中，C1：待测植酸酶磷浓度(μg/mL)；C2：空白对照磷浓度(μg/mL)；v1：添加待测植酸酶碘量瓶中剩余上清液的体积(mL)；V2：空白对照碘量瓶中剩余上清液的体积(mL)；m：底物样品重量(g)；

(12)试验结果

试验结果如表1所示，表明待测植酸酶能明显提高水溶性磷的释放量。

表1植酸酶解磷含量测定结果

实施例2

一种模拟动物胃环境内植酸酶解磷含量测定方法，其具体实现步骤如下：

(1)按照底物上述配比称取底物各组分,将底物原料分别粉碎混合后全部通过40目筛，分别称取3g(准确至0.0001g)(m)，各置入250mL碘量瓶中；

(2)按1000FYT/kg的酶活添加量，取10000FYT/g的0.3mg(精准至0.1mg)某厂家待测植酸酶加入到其中一个碘量瓶中，同时平行做空白对照(底物中不加入待测植酸酶)；

(3)向碘量瓶中缓慢加入胃蛋白酶盐酸溶液100mL，缓慢搅拌后测定消化液的pH，若发现pH大于3.5，应用pH 2.0的盐酸溶液将消化液调整至3.0～3.5之间，严密封口；

(4)将严密封口的碘量瓶放入提前预热的恒温水浴摇床，40℃水浴2h；

(5)水浴结束后将碘量瓶冷却至室温，测定溶液pH；一般情况下，pH在4.0～4.5之间；若超过此范围，则此次测定失败，需重新测定；

(6)准确移取碘量瓶中的上清液12mL，转移至15mL的离心管中。同时，准确量取碘量瓶中剩余上清液的体积；

(7)将离心管置于离心机中，平衡后4000rpm离心10min，得上清液A；

(8)准确移取1mL离心管中的上清液A至50mL比色管中，加入10mL钒钼酸胺显色剂，加蒸馏水定容至50mL，摇匀静置10min；

(9)用分光光度计400nm比色测定，从磷标准曲线中查得磷的浓度(C1和C2)。

(10)磷标准曲线的绘制：准确移取磷标准溶液0mL、2.0mL、4.0mL、6.0mL、8.0mL、10.0mL分别置于6个50mL容量瓶中，分别加入钒钼酸铵显色剂10mL，用水稀释至刻度，摇匀，静置10min，在400nm波长下用分光光度计测各溶液的吸光度。以磷含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制磷标准曲线，如图1所示；

(11)结果计算

在模拟胃环境中添加植酸酶底物多释放的水溶性磷含量(P)，公式为：

其中，C1：待测植酸酶磷浓度(μg/mL)；C2：空白对照磷浓度(μg/mL)；v1：待测植酸酶碘量瓶中剩余上清液的体积(mL)；V2：空白对照碘量瓶中剩余上清液的体积(mL)；m：底物样品重量(g)；

(12)试验结果

试验结果如表2所示，表明待测植酸酶能明显提高水溶性磷的释放量。

表2植酸酶解磷含量测定结果

实施例3

一种模拟动物胃环境内植酸酶解磷含量测定方法，其具体实现步骤如下：

(1)按照底物上述配比称取底物各组分,将底物原料分别粉碎混合后全部通过40目筛，分别称取7g(准确至0.0001g)(m)，各置入250mL碘量瓶中；

(2)按1000FYT/kg的酶活添加量，取50000FYT/g的0.14mg(精准至0.1mg)待测植酸酶加入到其中一个碘量瓶中，同时平行做空白对照(底物中不添加待测植酸酶)；

(3)向碘量瓶中缓慢加入胃蛋白酶盐酸溶液100mL，缓慢搅拌后测定消化液的pH，若发现pH大于3.5，应用pH 2.0的盐酸溶液将消化液调整至3.0～3.5之间，严密封口。

(4)将严密封口的碘量瓶放入提前预热的恒温水浴摇床，40℃水浴2h；

(5)水浴结束后将碘量瓶冷却至室温，测定溶液pH；一般情况下，pH在4.0～4.5之间；若超过此范围，则此次测定失败，需重新测定；

(6)准确移取12mL碘量瓶中的上清液，转移至15mL的离心管中。同时，准确量取碘量瓶中剩余上清液的体积；

(7)将离心管置于离心机中，平衡后4000rpm离心10min，得上清液A；

(8)准确移取1mL离心管中的上清液A至50mL比色管中，加入10mL钒钼酸胺显色剂，加蒸馏水定容至50mL，摇匀静置10min；

(9)用分光光度计400nm比色测定，从磷标准曲线中查得磷的浓度(C1和C2)；

(10)磷标准曲线的绘制：准确移取磷标准溶液0mL、2.0mL、4.0mL、6.0mL、8.0mL、10.0mL分别置于6个50mL容量瓶中，分别加入钒钼酸铵显色剂10mL，用水稀释至刻度，摇匀，静置10min，在400nm波长下用分光光度计测各溶液的吸光度。以磷含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制磷标准曲线，如图1所示；

(11)结果计算

在模拟胃环境中添加植酸酶底物多释放的水溶性磷含量(P)，公式为：

其中，C1：待测植酸酶磷浓度(μg/mL)；C2：空白对照磷浓度(μg/mL)；v1：添加待测植酸酶碘量瓶中剩余上清液的体积(mL)；V2：空白对照碘量瓶中剩余上清液的体积(mL)；m：底物样品重量(g)；

(12)试验结果

试验结果如表3所示，表明待测植酸酶能明显提高水溶性磷的释放量。

表3植酸酶解磷含量测定结果

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种模拟动物胃环境内植酸酶解磷含量测定方法，包括以下步骤：首先将底物各原料混合后粉碎，所述底物由以下原料按照质量百分比组成：玉米60％、豆粕20％、棉粕10％及DDGS 10％，添加待测植酸酶与所述底物混合，同时作空白对照，分别加入到胃蛋白酶盐酸溶液中，40℃恒温水浴，冷却至室温后再测定溶液pH，准确移取12mL上清液至离心管中，并准确量取剩余上清液，将离心管中的上清液离心，得上清液A，再准确移取离心管中上清液A 1mL，加入钒钼酸胺显色剂，再加蒸馏水定容，摇匀静置，用分光光度计比色测定，最后从磷标准曲线中查得待测植酸酶磷浓度和空白对照中磷浓度,计算在模拟胃环境中添加植酸酶饲料底物多释放的水溶性磷含量。

2.如权利要求1所述的一种模拟动物胃环境内植酸酶解磷含量测定方法，其具体实现步骤如下：

(1)首先制备底物：所述底物由如下原料按照质量百分比组成:玉米60％、豆粕20％、棉粕10％及DDGS 10％；按照上述配比称取各原料混合后粉碎，并过40目筛；

(2)分别称取3～7g所述步骤(1)制备的底物各置于250mL碘量瓶中，按1000FYT/kg的酶活添加量添加0.1～1mg的待测植酸酶加入到其中一个碘量瓶中为处理组，同时平行做空白对照，即底物中不添加待测植酸酶；

(3)然后将100mL胃蛋白酶盐酸溶液缓慢加入至碘量瓶中制成消化液，缓慢搅拌后测定消化液的pH，当pH大于3.5，用pH 2.0的盐酸溶液将消化液调整至3.0～3.5之间，严密封口，所述盐酸溶液为取质量分数为36％的浓盐酸0.83mL，定容至1000mL；

(4)40℃恒温水浴摇床2h，冷却至室温后再测定溶液pH，pH应保持在4.0～4.5之间；

(5)准确移取12mL碘量瓶中的上清液至离心管中，同时，准确量取碘量瓶中剩余上清液的体积，将上清液4000rpm离心10min，得上清液A；

(6)准确移取离心管中1mL上清液A至50mL比色管中，加入10mL钒钼酸胺显色剂，加蒸馏水定容至50mL，摇匀静置10min；

(7)用分光光度计400nm比色测定，从磷标准曲线中查得磷的浓度，即待测植酸酶磷浓度C1和空白对照磷浓度C2,；

(8)磷标准曲线的绘制：准确移取磷标准溶液0mL、2.0mL、4.0mL、6.0mL、8.0mL、10.0mL分别置于50mL容量瓶中，分别加入钒钼酸铵显色剂10mL，用水稀释至刻度，摇匀，静置10min，在400nm波长下用分光光度计测各溶液的吸光度，以磷含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制磷标准曲线；

(9)计算在模拟胃环境中添加植酸酶饲料底物多释放的水溶性磷含量p，公式为：

$P=\frac{C1\×(V1+12)}{m}-\frac{C2\×(V2+12)}{m}$

其中，C1：待测植酸酶磷浓度(μg/mL)；C2：空白对照磷浓度(μg/mL)；v1：添加待测植酸酶碘量瓶中剩余上清液的体积(mL)；V2：空白对照碘量瓶中剩余上清液的体积(mL)；m：底物样品重量(g)。

3.如权利要求1或2所述的一种模拟动物胃环境内植酸酶解磷含量测定方法，其特征在于，所述的待测植酸酶为非耐高温型，固态颗粒状，酶活为5000～50000FYT/g。

4.如权利要求1或2所述的一种模拟动物胃环境内植酸酶解磷含量测定方法，其特征在于，所述胃蛋白酶盐酸溶液是将胃蛋白酶与盐酸溶液混合，混合后pH为2.0，胃蛋白酶的质量百分比浓度为0.2％，所述盐酸溶液为取质量分数为36％的浓盐酸0.83mL，定容至1000mL，pH为2.0。

5.如权利要求1或2所述的一种模拟动物胃环境内植酸酶解磷含量测定方法，其特征在于，所述钒钼酸胺显色剂的配制具体步骤为：称取偏钒酸铵1.25g，加水200mL，加热溶解不能沸腾，冷却后加质量分数为65％的浓硝酸250mL溶解制成溶液A；另外称取钼酸铵25g，加水400mL加热溶解，冷却，制成溶液B，将溶液A和溶液B混合，定容至1000mL。

6.如权利要求2所述的一种模拟动物胃环境内植酸酶解磷含量测定方法，其特征在于，所述磷标准溶液的配制具体步骤为：取105℃烘至恒重的磷酸二氢钾0.2195g溶于蒸馏水中，加质量分数为65％的浓硝酸3mL，定容至1000mL。