CN110403066A - 饲用核苷酸型酵母水解物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物应用领域，具体涉及一种饲用核苷酸型酵母水解物及其制备方法和应用。本发明所述酵母水解物通过酵母乳自溶，复合酶酶解得到，所述酵母水解物包含蛋白质、核酸和核苷酸，所述核苷酸为非外源性的，以酵母水解物干物质质量计，所述蛋白质的含量≥48％，所述核酸的含量≥10％，所述核苷酸的含量为1.8‑2.5％。本发明还提供了上述酵母水解物的制备方法，本发明所得到的酵母水解物，含有粗蛋白、氨基酸、小肽、核酸和核苷酸等营养成分，在饲料中使用可改善蛋白质原料的营养品质，同时不需要添加外源性核苷酸，能够满足养殖动物对蛋白原料营养价值的需求。
Description
技术领域
本发明涉及微生物应用技术领域，具体涉及一种饲用核苷酸型酵母水解物及其制备方法和应用。
背景技术
我国一直是蛋白饲料资源严重短缺的国家，每年需花费大量外汇进口，一方面带来了巨大的经济压力，另一方面也给生物安全性带来了严峻挑战。面对蛋白资源对外高度依赖，原料价格无序波动，开放优质的饲用蛋白原料成为行业内研究的热点。
集约化养殖以追求动物高生产性能为目标，保持养殖动物健康是提高生产效益的基础。肠道是动物获取各种营养物质的主要途径，因此维持动物肠道健康及其功能的完整性对提高生产效益意义重大。日粮营养不当或外界环境应激是改变动物肠道形态的原因之一，并可能会影响动物胃肠道的健康。
研究发现，核苷酸作为细胞合成的必需物质，动物尤其是幼龄动物日粮中补充外源核苷酸能加速肠道细胞的分化、生长与修复，促进小肠成熟，对于维持、改善和修复胃肠道功能、缓解应激具有重要意义。
但目前，市场上的饲用酵母水解物中，核酸物质抽提用于其他生产，作为饲用的产品不含或含很少核酸，部分富含丰富的核酸物质，但未经核酸降解剂处理，酵母水解物中各种核苷酸含量较低。
有研究表明，核苷酸对单胃动物的胃肠道形态和功能，免疫系统和肠道菌群均产生积极的影响，添加酵母水解物能够提高动物对应激的抵抗力，增加采食量，提高生长速度。目前，市场上大部分饲用酵母水解物中，除外源添加核苷酸物质外，酵母水解物中含有的各种核苷酸含量较低(<0.3％)。
发明内容
为此，本发明所解决的技术的问题是现有技术中饲用的酵母水解物中核苷酸含量低或需要外源添加的缺陷，提供了一种饲用核苷酸型酵母水解物。
本发明提供了一种饲用核苷酸型酵母水解物，所述酵母水解物通过酵母乳自溶，复合酶酶解得到，所述酵母水解物包含蛋白质、核酸和核苷酸，所述核苷酸为非外源性的，以酵母水解物干物质质量计，所述蛋白质的含量≥48％，所述的核酸的含量≥10％，所述核苷酸的含量为1.8-2.5％。
本发明还提供了一种饲用核苷酸型酵母水解物的制备方法，其包含下述步骤：
(1)发酵培养：将酿酒酵母菌株进行发酵培养，得到酵母乳；
(2)自溶：将步骤(1)所得到的酵母乳进行热击处理，以进行自溶；
(3)酶解：将步骤(2)所得到的酵母乳加入复合酶进行酶解得到酵母水解物，优选的，所述复合酶包含木瓜蛋白酶和核酸酶。
本发明还提供了一种饲料，其包含饲用核苷酸型酵母水解物和基础日粮，所述饲用核苷酸型酵母水解物的添加量为1-10％，优选添加量为1-5％。
具体来说，本发明提出了如下技术方案。
本发明提供了一种饲用核苷酸型酵母水解物，其中，所述酵母水解物通过酵母乳自溶，复合酶酶解得到，所述酵母水解物包含蛋白质、核酸和核苷酸，所述核苷酸为非外源性的，以酵母水解物干物质质量计，所述蛋白质的含量≥48％，所述的核酸的含量≥10％，所述核苷酸的含量为1.8-2.5％。
优选的，对于所述的酵母水解物，其中，所述核苷酸包含胞苷酸、腺苷酸、鸟苷酸、尿苷酸和肌苷酸，优选的，胞苷酸的质量含量为0.2-0.5％，所述腺苷酸的质量含量为0.5-0.9％，所述鸟苷酸的质量含量为0.4-0.9％，所述尿苷酸的质量含量为0.2-0.6％，所述肌苷酸的质量含量为0.03-0.2％，较优选的，所述胞苷酸的质量含量为0.21-0.44％，所述腺苷酸的质量含量为0.7-0.86％，所述鸟苷酸的质量含量为0.57-0.71％，所述尿苷酸的质量含量为0.22-0.52％，所述肌苷酸的质量含量为0.03-0.097％，更优选的，所述胞苷酸的质量含量为0.33-0.44％，所述腺苷酸的质量含量为0.7-0.86％，所述鸟苷酸的质量含量为0.65-0.71％，所述尿苷酸的质量含量为0.41-0.52％，所述肌苷酸的质量含量为0.03-0.097％。
优选的，对于所述的酵母水解物，其中，所述酵母乳采用酿酒菌株d8.8(Saccharomyces cerevisiaed8.8)进行发酵培养得到，其保藏编号为CCTCC NO:M2017148。
本发明提供了上述所述的酵母水解物的制备方法，其包含下述步骤：
(1)发酵培养：将酿酒酵母菌株进行发酵培养，得到酵母乳；
(2)自溶：将步骤(1)所得到的酵母乳进行热击处理，以进行自溶；
(3)酶解：将步骤(2)所得到的酵母乳加入复合酶进行酶解得到酵母水解物，优选的，所述复合酶包含木瓜蛋白酶和核酸酶。
优选的，对于所述的制备方法，其中，在步骤(2)中，所述热击处理的温度为80-95℃。
优选的，对于所述的制备方法，其中，在步骤(2)中，所述热击处理的时间为40-50s。
优选的，对于所述的制备方法，其中，在步骤(2)中，在所述热击处理后加入柠檬酸进行保温处理，较优选的，以酵母乳干物质的质量计，所述柠檬酸的添加量为1-5‰。
优选的，对于所述的制备方法，其中，所述保温处理的保温温度为40-60℃，优选为45-60℃，保温时间为8-12h。
优选的，对于所述的制备方法，其中，在步骤(3)中，以酵母乳干物质的质量计，所述木瓜蛋白酶的添加量为1-5‰，所述核酸酶的添加量为1-5‰；优选的，所述木瓜蛋白酶的添加量为2.5-5‰，所述核酸酶的添加量为1.5-5‰，更优选的，所述木瓜蛋白酶的添加量为3-4‰，所述核酸酶的添加量为2-4‰。
优选的，对于所述的制备方法，其中，
所述木瓜蛋白酶的酶解温度为55-65℃，pH为5-6.5，优选pH为5.8-6，酶解时间为5-10小时，优选为6-10小时；
所述核酸酶的酶解温度为55-65℃，优选为58-65℃，pH为5-6.5，酶解时间为10-15小时。
优选的，对于所述的制备方法，其中，在步骤(1)中，所述发酵培养采用流加方式流加碳源、氮源和磷源；
所述碳源为6000-8000g，所述氮源为400-700g，所述磷源为300-600g；
所述碳源为糖蜜，优选为30％的糖蜜；
所述氮源选自于氨水、硫酸铵中的一种，优选为硫酸铵；
所述磷源选自于磷酸或磷酸二氢钾中的一种，优选为磷酸二氢钾。
优选的，对于所述的制备方法，其中，在步骤(1)中，所述发酵培养的发酵温度为29-33℃，发酵时间为12-18小时，发酵的pH为4.5-6.4。
本发明提供了所述的酵母水解物在饲料中的应用。
本发明提供了一种饲料，其包含酵母水解物和基础日粮，所述酵母水解物的添加量为1-10％，优选添加量为1-5％。
本发明所取得的有益效果是：
本发明所获得的核苷酸型酵母水解物，含有粗蛋白、氨基酸、小肽、核酸和核苷酸等营养成分，尤其核苷酸可以提高酵母水解物的营养价值，在饲料中使用可改善蛋白质原料的营养品质，缓解饲料蛋白质资源紧缺的矛盾，同时能够满足养殖动物对蛋白原料营养价值的需求，对于动物的现代科学化养殖生产具有重要意义。
菌株保藏信息
本发明所用的菌种酿酒酵母d8.8(Saccharomyces cerevisiae d8.8)于2017年3月29日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M2017148，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，邮政编码：430072；电话：(027)-68754052。
本发明所用的菌种为酿酒酵母d8.8(Saccharomyces cerevisiae d8.8)。该菌株从老面团(老面团是发面用的面种子，即发面蒸馒头时剩下的一小面团，由于里面含有酵母菌，可以在下次发面时发面用)中得到，而且通过光学显微镜观察，该酿酒酵母菌株，呈现椭球形，以出芽方式无性繁殖；在固体培养基平板上28℃培养24h后，为乳白色，不透明，圆形菌落。通过常规形态观察、生理生化试验，然后借助PCR技术通过鉴定26S rDNA D1/D2区基因序列，确定本发明菌株为酿酒酵母属菌株。
附图说明
图1是利用电子舌测定酵母水解物味觉的流程图。
具体实施方式
如上所述，本发明提供了一种饲用核苷酸型酵母水解物，所述酵母水解物通过酵母乳自溶，复合酶酶解得到，所述酵母水解物包含蛋白质、核酸和核苷酸，所述核苷酸为非外源性的，以酵母水解物干物质质量计，所述蛋白质的含量≥48％，所述的核酸的含量≥10％，所述核苷酸的含量为1.8-2.5％。
在本发明较优选的一种具体实施方式中，所述核苷酸的含量为1.83-2.48％，优选的，所述核苷酸的含量为1.93-2.48％，更优选为2.26-2.48％。
在本发明优选的一种具体实施方式中，所述核苷酸包含胞苷酸、腺苷酸、鸟苷酸、尿苷酸和肌苷酸，优选的，所述胞苷酸的质量含量为0.2-0.5％，所述腺苷酸的质量含量为0.5-0.9％，所述鸟苷酸的质量含量为0.4-0.9％，所述尿苷酸的质量含量为0.2-0.6％，所述肌苷酸的质量含量为0.03-0.2％，较优选的，所述胞苷酸的质量含量为0.21-0.44％，所述腺苷酸的质量含量为0.7-0.86％，所述鸟苷酸的质量含量为0.57-0.71％，所述尿苷酸的质量含量为0.22-0.52％，所述肌苷酸的质量含量为0.03-0.097％，更优选的，所述胞苷酸的质量含量为0.33-0.44％，所述腺苷酸的质量含量为0.7-0.86％，所述鸟苷酸的质量含量为0.65-0.71％，所述尿苷酸的质量含量为0.41-0.52％，所述肌苷酸的质量含量为0.03-0.097％。
在本发明优选的一种具体实施方式中，所述酵母乳采用酿酒菌株d8.8(Saccharomyces cerevisiae d8.8)进行发酵培养得到，保藏编号为CCTCC NO:M2017148。
本发明提供了一种上述酵母水解物的制备方法，其包含下述步骤：
(1)发酵培养：将酿酒酵母菌株进行发酵培养，得到酵母乳；
(2)自溶：将步骤(1)所得到的酵母乳进行热击处理，以进行自溶；
(3)酶解：将步骤(2)所得到的酵母乳加入复合酶进行酶解得到酵母水解物，优选的，所述复合酶包含木瓜蛋白酶和核酸酶。
在本发明优选的一种具体实施方式中，在步骤(1)中，所述发酵培养采用流加方式培养，流加碳源、氮源和磷源，所述碳源为6000-8000g，所述氮源为400-700g，所述磷源为300-600g，所述碳源为糖蜜，优选为30％的糖蜜；所述氮源选自于氨水、硫酸铵中的一种，优选为硫酸铵；所述磷源选自于磷酸或磷酸二氢钾中的一种，优选为磷酸二氢钾。
在本发明优选的一种具体实施方式中，在步骤(1)中，发酵温度为29-33℃，发酵时间为12-18小时，发酵pH为4.5-6.4。
在本发明优选的一种具体实施方式中，在步骤(2)中，所述热击处理的温度为80-95℃，在进行热击处理后加入柠檬酸，然后进行保温处理，优选的，以酵母乳干物质的质量计，加入含量为1-5‰；较优选的，保温温度为40-60℃，保温时间为8-12小时。所述热击处理的目的是促使酵母细胞发生裂解，使酵母细胞内的蛋白酶对酵母细胞发挥作用，促进酵母细胞自溶。
在本发明优选的一种具体实施方式中，在步骤(3)中，以酵母乳干物质的质量计，所述木瓜蛋白酶的添加量为1-5‰，所述核酸酶的添加量为1-5‰；优选的，所述木瓜蛋白酶的添加量为2.5-5‰，所述核酸酶的添加量为1.5-5‰，更优选的，所述木瓜蛋白酶的添加量为3-4‰，所述核酸酶的添加量为2-4‰。
优选的，在步骤(3)中，酶解为先进行木瓜蛋白酶进行酶解，然后加入核酸酶进行酶解。
在本发明优选的一种具体实施方式中，在步骤(3)中，所述所述木瓜蛋白酶的酶解温度为55-65℃，pH为5-6.5，优选pH为5.8-6，酶解时间为5-10小时，优选为6-10小时；
所述核酸酶的酶解温度为55-65℃，优选为58-65℃，pH为5-6.5，酶解时间为10-15小时。
在本发明优选的一种具体实施方式中，所述饲用核苷酸型酵母水解物的制备方法还包含将步骤(3)所得的水解物进行浓缩干燥的步骤，其具体操作方法为：升温至80-90℃保温1-5小时灭酶并浓缩干燥，得到酵母水解物产品。
本发明所述的酵母水解物及上述制备方法所得到的酵母水解物在饲料中的应用。
本发明还提供了一种饲料，其包含上述所述的酵母水解物和基础日粮，所述酵母水解物的添加量为1-10％，优选添加量为1-5％。
下面对本实施例所用的原料的生产厂家，以及产品分析使用的设备和分析方法进行说明如下，其中所述的化学物质没有标明的均为常规试剂的化学纯级别。实施例所用到的原料的信息如表1所示
表1实施例中所用到的原料的信息
| 原料信息 | 纯度 | 生产厂家 |
| 木瓜蛋白酶 | 10万u/g食品级 | 南宁庞博生物工程有限公司 |
| 核酸酶 | 10万u/g食品级 | 安琪酵母股份有限公司 |
| 柠檬酸 | 99％食品级 | 潍坊英轩实业有限公司 |
| 糖蜜 | 一级糖蜜 | 南宁糖业股份有限公司 |
| 硫酸铵 | 食品级99％ | 江苏科伦多食品配料有限公司 |
| 氨水 | 食品级 | 湖北兴银河化工有限公司 |
| 磷酸 | 食品级 | 湖北兴银河化工有限公司 |
| 磷酸二氢钾 | 食品级99％ | 湖北兴银河化工有限公司 |
实施例一饲用核苷酸型酵母水解物的制备
(1)酵母发酵培养
培养液含有碳源、氮源、磷源，其中碳源为30％的糖蜜6000g，氮源为硫酸铵400g，磷源为磷酸二氢钾300g。将培养液在121℃灭菌10min，上罐流加，接种酵母菌进行发酵培养，发酵温度30℃，发酵时间15小时，发酵pH 4.5，获得酵母乳。
(2)酵母自溶酶解
将酵母乳在温度90℃进行热击45s后，控制温度50℃，添加占酵母乳干物质加入重量的2‰的柠檬酸，进行10h的自溶。
控制温度58℃，调节pH至6，加入木瓜蛋白酶3‰，酶解8小时；再升温至60℃，调节pH至5.8，加入核酸酶2‰，酶解15小时。
(3)浓缩干燥
酶解反应结束后，升温到80℃保温5小时灭酶活并浓缩干燥，获得核苷酸型酵母水解物产品。
实施例二饲用核苷酸型酵母水解物的制备
(1)酵母发酵培养
培养液含有碳源、氮源、磷源，其中碳源为30％的糖蜜7000g，氮源为硫酸铵550g，磷源为磷酸二氢钾500g。将培养液在121℃灭菌10min，上罐流加，接种酵母菌进行发酵培养，发酵温度32℃，发酵时间12小时，发酵pH 5，获得酵母乳。
(2)酵母自溶酶解
将酵母乳在温度95℃进行热击40s后，控制温度45℃、添加占酵母乳干物质加入重量的5‰的柠檬酸，进行12h的自溶。
控制温度55℃、调节pH至5.8，加入木瓜蛋白酶2.5‰，酶解10小时；再升温至58℃，调节pH至5，加入核酸酶1.5‰，酶解12小时。
(3)浓缩干燥
酶解反应结束后，升温到90℃保温1小时灭酶活并浓缩干燥，获得核苷酸型酵母水解物产品。
实施例三饲用核苷酸型酵母水解物的制备
(1)酵母发酵培养
培养液含有碳源、氮源、磷源，其中碳源为30％的糖蜜8000g，氮源为硫酸铵700g，磷源为磷酸600g。将培养液在121℃灭菌10min，上罐流加，接种酵母菌进行发酵培养，发酵温度29℃，发酵时间18小时，发酵pH 6，获得酵母乳。
(2)酵母自溶酶解
将酵母乳在温度80℃进行热击50s后，控制温度60℃、添加占酵母乳干物质加入重量的1‰的柠檬酸，进行8小时的自溶。
控制温度65℃、调节pH至6，加入木瓜蛋白酶4‰，酶解6小时；维持温度65℃，调节pH至6.5，加入核酸酶4‰，酶解10小时。
(3)浓缩干燥
酶解反应结束后，升温到85℃保温3小时灭酶活并浓缩干燥，获得核苷酸型酵母水解物产品。
实施例四饲用核苷酸型酵母水解物的制备
(1)酵母发酵培养
培养液含有碳源、氮源、磷源，其中碳源为30％的糖蜜6000g，氮源为氨水400g，磷源为磷酸二氢钾300g。将培养液在121℃灭菌10min，上罐流加，接种酵母菌进行发酵培养，发酵温度33℃，发酵时间15小时，发酵pH 6.4，获得酵母乳。
(2)酵母自溶酶解
将酵母乳在温度85℃进行热击45s后，控制温度40℃、添加占酵母乳干物质加入重量的2.5‰的柠檬酸，进行9小时的自溶。
控制温度60℃、调节pH至5，加入木瓜蛋白酶5‰，酶解5小时；维持温度55℃，调节pH至6，加入核酸酶5‰，酶解10小时。
(3)浓缩干燥
酶解反应结束后，升温到85℃保温2小时灭酶活并浓缩干燥，获得核苷酸型酵母水解物产品。
实施例五饲用核苷酸型酵母水解物的制备
(1)酵母发酵培养
培养液含有碳源、氮源、磷源，其中碳源为30％的糖蜜7500g，氮源为氨水600g，磷源为磷酸400g。将培养液在121℃灭菌10min，上罐流加，接种酵母菌进行发酵培养，发酵温度32℃，发酵时间16小时，发酵pH 5，获得酵母乳。
(2)酵母自溶酶解
将酵母乳在温度88℃进行热击50s后，控制温度50℃、添加占酵母乳干物质加入重量的4‰的柠檬酸，进行10.5小时的自溶。
控制温度58℃、调节pH至6.5，加入木瓜蛋白酶1‰，酶解8小时；维持温度60℃，调节pH至5.8，加入核酸酶1‰，酶解15小时。
(3)浓缩干燥
酶解反应结束后，升温到80℃保温4小时灭酶活并浓缩干燥，获得核苷酸型酵母水解物产品。
实施例六饲用核苷酸型酵母水解物的制备
(1)酵母发酵培养
培养液含有碳源、氮源、磷源，其中碳源为30％的糖蜜8000g，氮源为硫酸铵700g，磷源为磷酸二氢钾600g。将培养液在121℃灭菌10min，上罐流加，接种酵母菌进行发酵培养，发酵温度30℃，发酵时间15小时，发酵pH 4.5，获得酵母乳。
(2)酵母自溶酶解
将酵母乳在温度85℃进行热击40s后，控制温度50℃、添加占酵母乳干物质加入重量的2‰的柠檬酸，进行10小时的自溶。
控制温度58℃、调节pH至6，加入木瓜蛋白酶3‰，酶解8小时；维持温度60℃，调节pH至5.8，加入核酸酶4‰，酶解15小时。
(3)浓缩干燥
酶解反应结束后，升温到80℃保温5小时灭酶活并浓缩干燥，获得核苷酸型酵母水解物产品。
实施例七饲用核苷酸型酵母水解物的制备
(1)酵母发酵培养
培养液含有碳源、氮源、磷源，其中碳源为30％的糖蜜7000g，氮源为硫酸铵550g，磷源为磷酸500g。将培养液在121℃灭菌10min，上罐流加，接种酵母菌进行发酵培养，发酵温度32℃，发酵时间18小时，发酵pH 5，获得酵母乳。
(2)酵母自溶酶解
将酵母乳在温度88℃进行热击50s后，控制温度45℃、添加占酵母乳干物质加入重量的5‰的柠檬酸，进行12小时的自溶。
控制温度55℃、调节pH至5.8，加入木瓜蛋白酶1‰，酶解10小时；维持温度58℃，调节pH至5，加入核酸酶5‰，酶解12小时。
(3)浓缩干燥
酶解反应结束后，升温到90℃保温1小时灭酶活并浓缩干燥，获得核苷酸型酵母水解物产品。
实施例八饲用核苷酸型酵母水解物的制备
(1)酵母发酵培养
培养液含有碳源、氮源、磷源，其中碳源为30％的糖蜜6000g，氮源为硫酸铵400g，磷源为磷酸二氢钾300g。将培养液在121℃灭菌10min，上罐流加，接种酵母菌进行发酵培养，发酵温度29℃，发酵时间12小时，发酵pH 6，获得酵母乳。
(2)酵母自溶酶解
将酵母乳在温度95℃进行热击45s后，控制温度60℃、添加占酵母乳干物质加入重量的1‰的柠檬酸，进行8小时的自溶。
控制温度65℃、调节pH至6，加入木瓜蛋白酶5‰，酶解6小时；维持温度65℃，调节pH至6.5，加入核酸酶1‰，酶解10小时。
(3)浓缩干燥
酶解反应结束后，升温到85℃保温3小时灭酶活并浓缩干燥，获得核苷酸型酵母水解物产品。
对比例一普通酵母水解物制备
(1)酵母发酵培养
培养液含有碳源、氮源、磷源，其中碳源为30％的糖蜜6000g，氮源为硫酸铵400g，磷源为磷酸二氢钾300g。将培养液在121℃灭菌10min，上罐流加，接种酵母菌进行发酵培养，发酵温度30℃，发酵时间15小时，发酵pH 4.5-6.4，获得纯培养液体发酵酵母乳。
(2)酵母自溶酶解
将酵母乳在温度90℃进行热击45s后，控制温度50℃，添加占酵母乳干物质加入重量的2‰的柠檬酸，进行10h的自溶。
控制温度58℃，调节pH至6，加入木瓜蛋白酶3‰，酶解8小时。
(3)浓缩干燥
酶解反应结束后，升温到80℃保温5小时灭酶活并浓缩干燥，获得酵母水解物产品。
对比例二普通酵母水解物制备
(1)酵母发酵培养
培养液含有碳源、氮源、磷源，其中碳源为30％的糖蜜7000g，氮源为硫酸铵550g，磷源为磷酸二氢钾500g。将培养液在121℃灭菌10min，上罐流加，接种酵母菌进行发酵培养，发酵温度32℃，发酵时间12小时，发酵pH 4.5-6.4，获得纯培养液体发酵酵母乳。
(2)酵母自溶酶解
将酵母乳在温度95℃进行热击40s后，控制温度45℃、添加占酵母乳干物质加入重量的5‰的柠檬酸，进行12h的自溶。
控制温度55℃、调节pH至5.8，加入木瓜蛋白酶2.5‰，酶解10小时。
(3)浓缩干燥
酶解反应结束后，升温到90℃保温1小时灭酶活并浓缩干燥，获得酵母水解物产品。
对比例三普通酵母水解物制备
(1)酵母发酵培养
培养液含有碳源、氮源、磷源，其中碳源为30％的糖蜜8000g，氮源为硫酸铵700g，磷源为磷酸二氢钾600g。将培养液在121℃灭菌10min，上罐流加，接种酵母菌进行发酵培养，发酵温度29℃，发酵时间18小时，发酵pH 4.5-6.4，获得纯培养液体发酵酵母乳。
(2)酵母自溶酶解
将酵母乳在温度80℃进行热击50s后，控制温度60℃、添加占酵母乳干物质加入重量的1‰的柠檬酸，进行8小时的自溶。
控制温度65℃、调节pH至6，加入木瓜蛋白酶4‰，酶解6小时。
(3)浓缩干燥
酶解反应结束后，升温到85℃保温3小时灭酶活并浓缩干燥，获得酵母水解物产品。
对比例四普通酵母水解物制备
(1)酵母发酵培养
培养液含有碳源、氮源、磷源，其中碳源为30％的糖蜜6000g，氮源为硫酸铵400g，磷源为磷酸二氢钾300g。将培养液在121℃灭菌10min，上罐流加，接种酵母菌进行发酵培养，发酵温度30℃，发酵时间15小时，发酵pH 4.5，获得酵母乳。
(2)酵母自溶酶解
将酵母乳在温度90℃进行热击45s后，控制温度50℃，添加占酵母乳干物质加入重量的2‰的柠檬酸，进行10h的自溶。
控制温度60℃，调节pH至5.8，加入核酸酶2‰，酶解15小时。
(3)浓缩干燥
酶解反应结束后，升温到80℃保温5小时灭酶活并浓缩干燥，获得核苷酸型酵母水解物产品。
对比例五普通酵母水解物制备
(1)酵母发酵培养
培养液含有碳源、氮源、磷源，其中碳源为30％的糖蜜7000g，氮源为硫酸铵550g，磷源为磷酸二氢钾500g。将培养液在121℃灭菌10min，上罐流加，接种酵母菌进行发酵培养，发酵温度32℃，发酵时间12小时，发酵pH 5，获得酵母乳。
(2)酵母自溶酶解
将酵母乳在温度95℃进行热击40s后，控制温度45℃、添加占酵母乳干物质加入重量的5‰的柠檬酸，进行12h的自溶。
控制温度58℃，调节pH至5，加入核酸酶1.5‰，酶解12小时。
(3)浓缩干燥
酶解反应结束后，升温到90℃保温1小时灭酶活并浓缩干燥，获得核苷酸型酵母水解物产品。
对比例六普通酵母水解物制备
(1)酵母发酵培养
培养液含有碳源、氮源、磷源，其中碳源为30％的糖蜜6000g，氮源为硫酸铵400g，磷源为磷酸二氢钾300g。将培养液在121℃灭菌10min，上罐流加，接种酵母菌进行发酵培养，发酵温度30℃，发酵时间15小时，发酵pH 4.5，获得酵母乳。
(2)酵母自溶酶解
将酵母乳在温度90℃进行热击45s后，控制温度50℃，添加占酵母乳干物质加入重量的2‰的柠檬酸，进行10h的自溶。
控制温度58℃，调节pH至6，加入木瓜蛋白酶0.8‰，酶解8小时；再升温至60℃，调节pH至5.8，加入核酸酶0.8‰，酶解15小时。
(3)浓缩干燥
酶解反应结束后，升温到80℃保温5小时灭酶活并浓缩干燥，获得核苷酸型酵母水解物产品。
对比例七普通酵母水解物制备
(1)酵母发酵培养
培养液含有碳源、氮源、磷源，其中碳源为30％的糖蜜6000g，氮源为硫酸铵400g，磷源为磷酸二氢钾300g。将培养液在121℃灭菌10min，上罐流加，接种酵母菌进行发酵培养，发酵温度30℃，发酵时间15小时，发酵pH 4.5，获得酵母乳。
(2)酵母自溶酶解
将酵母乳在温度90℃进行热击45s后，控制温度50℃，添加占酵母乳干物质加入重量的2‰的柠檬酸，进行10h的自溶。
控制温度58℃，调节pH至6，加入木瓜蛋白酶5.2‰，酶解8小时；再升温至60℃，调节pH至5.8，加入核酸酶5.2‰，酶解15小时。
(3)浓缩干燥
酶解反应结束后，升温到80℃保温5小时灭酶活并浓缩干燥，获得核苷酸型酵母水解物产品。
实施例和对比例应用效果
(1)成分分析
其中，粗蛋白的测定参照GB/T6432-94饲料中粗蛋白的测定方法进行测定，其具体操作为：取1g试样，在混合催化剂(0.4g五水硫酸铜+6g硫酸钾)作用下，加入12ml浓硫酸进行消煮；再进行蒸馏，用硼酸吸收产物氨；再用0.1mol/l的盐酸滴定，读取数据，计算氮含量，蛋白质系数选用N(氮含量)×6.25，计算得到粗蛋白的含量。
核酸测定参照GB/T6437-2002饲料中总磷的测定方法进行测定，其包含下述步骤：
1.工作曲线的绘制
准确移取磷标准液0.0、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0ml于50ml的容量瓶中，各加钒钼酸铵显色剂10ml，用水稀释到刻度，摇匀，常温下放置10min以上，以0.0ml溶液为参比，用1cm比色皿，在400nm波长下用分光光度计(上海智城分析仪器制造有限公司，UV2000)测各溶液的吸光度。以磷含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制工作曲线。
其中，所述磷标准液的配制：将磷酸二氢钾在105℃干燥1h，在干燥器中冷却后称取0.2195g溶解于水，定量转入1000ml容量瓶中，加硝酸3ml，用水稀释至刻度，摇匀，即为50μg/ml的磷标准液；
钒钼酸铵显色剂的制备：称取偏钒酸铵1.25g，加水200ml加热溶解，冷却后再加入250ml硝酸，另称取钼酸铵25g，加水400ml加热溶解，在冷却的条件下，将两种溶液混合，用水定容至1000ml，避光保存，若生产沉淀，则不能继续使用。
2.试样的测定
准确移取试样分解液1.0ml于50ml容量瓶中，加入钒钼酸铵10ml，用水稀释至刻度，摇匀，常温下放置10min以上，用1cm比色皿在400nm波长下测定试样分解液的吸光度，在工作曲线上查得试样分解液的磷含量。
其中，试样分解液的制备方法为：称取试样1g于凯氏烧瓶中，加入硝酸30ml，小心加热煮沸至黄烟逸尽，稍冷，加入高氯酸10ml，继续加热至高氯酸冒白烟(不得蒸干)，溶液基本无色，冷却，加水30ml，加热煮沸，冷却后，用水转移入100ml容量瓶中并稀释至刻度，摇匀，为试样分解液。
核苷酸测定参照GB/T23530-2009酵母抽提物中核苷酸的测定方法进行测定，其包含以下步骤：
1、仪器、试剂
高效液相色谱仪(配有低压四元泵、紫外检测器和柱温箱系统)(Waters，E2695)。
色谱柱：C18柱(如：如intersil C18 250mm×4.6mm，也可采用其它等同性能的分析柱。)
过滤装置：1000mL真空抽滤器，0.2um或0.45um滤膜。
真空抽滤脱气装置。
容量瓶：100mL。
分析天平：感量0.1mg。
磷酸二氢铵溶液：0.02mmol/L，pH＝5.4。准确称取2.30g磷酸二氢氨，用高纯水溶解，加水至900mL，用0.1mol/L氢氧化钠调节pH为5.40±0.10，定容到1L。
5’-胞苷酸二钠(CMP)：分子式C9H12N3Na2O8P，纯度≥98％。Sigma货号:C1131
5'-尿苷酸二钠(UMP)：分子式C9H11N2Na2O9P，纯度≥98％。Sigma货号:U6375
5'-鸟苷酸二钠(GMP)：分子式为C10H12N5Na2O8P，纯度≥98％。Sigma货号:G8377
5'-肌苷酸二钠(IMP)：分子式为C10H11N4Na2O8P，纯度≥98％。Sigma货号:I4625
核苷酸标准储备溶液：分别准确称取在(105±2)℃干燥4h的IMP、GMP、UMP、CMP各0.0500g，用高纯水溶解，定容到100mL，分别制成浓度为500ug/mL的标准储备溶液。
2.分析步骤
(1)色谱条件
色谱柱：intersil C18250mm×4.6mm；
流动相：0.02mol/L磷酸二氢铵溶液,pH＝5.40；
流速：1.0ml/min；
检测波长：254nm；
柱温箱温度：30℃
(2)样品制备
称取样品1g～2g(精确至0.0001g)，加水溶解，移入100mL容量瓶中并用水定容至刻度。根据样品中核苷酸的对溶液进行适当的稀释(稀释倍数为F，最后一次稀释使用流动相定容)。用0.45μm水相微孔膜过滤，滤液备用。
(3)标准溶液制备
表2：标准系列溶液的准备
| 序号 | 标准储备溶液的用量 | 定容体积(ml) | 每种核苷酸的浓度(μg/mL) |
| 1 | 吸取IMP、GMP、UMP、CMP各0mL | 50 | 0 |
| 2 | 吸取IMP、GMP、UMP、CMP各1mL | 50 | 10 |
| 3 | 吸取IMP、GMP、UMP、CMP各2mL | 50 | 20 |
| 4 | 吸取IMP、GMP、UMP、CMP各3mL | 50 | 30 |
| 5 | 吸取IMP、GMP、UMP、CMP各5mL | 50 | 50 |
| 6 | 吸取IMP、GMP、UMP、CMP各10mL | 50 | 100 |
标准系列溶液定容用溶液：流动相
(4)测定
将标准系列和样品溶液分别进样，进样量为20μL，根据标准品的保留时间定性样品中IMP、GMP、UMP、AMP的色谱峰。根据样品的峰面积，以外标法计算各组分的百分含量。
(5)结果计算
IMP/GMP/UMP/CMP含量计算：
其中：
X—样品中IMP/GMP/UMP/CMP的含量，％；
C—查标准曲线获得进样溶液中IMP/GMP/UMP/CMP的含量，μg/ml；
V—定容体积，ml；
F—稀释倍数；
M—称样质量，g；
X1—样品水分含量，％；
结果保留至小数点后两位。
比值计算说明：按照GB/T23530-2007标准，计算比值时IMP、GMP、CMP、UMP结果都需要折干；
精密度：在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10％。
经检测，本实施例1-8、对比例1-7中制得的酵母水解产物成分如下表3、表4所示。
表3实施例酵母水解产物成分
| 成分含量，％ | 实施例一 | 实施例二 | 实施例三 | 实施例四 | 实施例五 | 实施例六 | 实施例七 | 实施例八 |
| 蛋白质 | 51.63 | 48.38 | 52.97 | 48.25 | 49.55 | 51.76 | 48.55 | 48.94 |
| 核酸 | 10.43 | 10.59 | 10.8 | 11.04 | 12.25 | 11.62 | 12.44 | 11.55 |
| 核苷酸总和 | 2.26 | 2.15 | 2.39 | 1.93 | 1.83 | 2.48 | 2.20 | 1.89 |
| CMP | 0.44 | 0.29 | 0.33 | 0.25 | 0.25 | 0.38 | 0.33 | 0.21 |
| UMP | 0.43 | 0.42 | 0.41 | 0.48 | 0.29 | 0.52 | 0.45 | 0.22 |
| GMP | 0.65 | 0.63 | 0.69 | 0.57 | 0.48 | 0.71 | 0.61 | 0.65 |
| IMP | 0.04 | 0.085 | 0.097 | 0.035 | 0.062 | 0.032 | 0.085 | 0.053 |
| AMP | 0.7 | 0.72 | 0.86 | 0.59 | 0.75 | 0.84 | 0.72 | 0.76 |
表4对比例酵母水解产物成分
| 成分含量，％ | 对比例一 | 对比例二 | 对比例三 | 对比例四 | 对比例五 | 对比例六 | 对比例七 |
| 蛋白质 | 50.45 | 49.67 | 47.94 | 48.75 | 49.65 | 49.23 | 48.96 |
| 核酸 | 14.54 | 12.60 | 13.81 | 10.45 | 11.59 | 10.55 | 9.22 |
| 核苷酸总和 | 0.14 | 0.13 | 0.16 | 1.35 | 1.23 | 1.46 | 1.84 |
| CMP | 0.011 | 0.019 | 0.016 | 0.18 | 0.12 | 0.21 | 0.22 |
| UMP | 0.022 | 0.021 | 0.025 | 0.27 | 0.21 | 0.27 | 0.37 |
| GMP | 0.041 | 0.035 | 0.044 | 0.36 | 0.37 | 0.43 | 0.51 |
| IMP | ＜0.002 | 0.01 | ＜0.002 | 0.06 | 0.08 | 0.042 | 0.06 |
| AMP | 0.07 | 0.046 | 0.07 | 0.48 | 0.45 | 0.51 | 0.68 |
从表3和表4可以看出，对于实施例一至实施例八，通过木瓜蛋白酶和核酸酶的酶解作用，酵母水解物中的蛋白质含量和核苷酸含量均较高，可以作为饲料使用，而不需要添加外源的核苷酸即可满足动物对营养物质的需要。
而对于对比例一至对比例三，只加入木瓜蛋白酶，无法将酵母细胞中的核酸降解为核苷酸；对于对比例四至对比例五，只加入核酸酶，核酸酶不能充分进入酵母细胞发挥降解核酸，而降低了其作用效果；对于对比例六，所添加的木瓜蛋白酶和核酸酶含量较少，只能够将部分核酸降解为核苷酸，但是导致酵母水解物中核苷酸含量低于1.8％；对于对比例七，所添加的木瓜蛋白酶和核酸酶含量过多，出现了酶解作用发生酶饱和的现象，对于开发核苷酸型酵母水解物的工艺而言，不能达到既经济又高效的目的。因此，在单一酶作用或两种酶过低的条件下，在酵母水解物中，虽然蛋白质含量较高，但核苷酸含量较低，需要添加外源核苷酸才可以满足动物对营养物质的需求。
因此，通过木瓜蛋白酶和核酸酶的共同酶解作用，所得到的酵母水解物的蛋白质含量和核苷酸均较高，在作为饲料使用时，能够满足动物对营养物质的需要，而不需要添加额外的外源核苷酸。
(2)电子舌评估
将本发明实施例1、对比例1制得的酵母水解物、采用电子舌智能味觉分析系统进行味觉检测。其具体操作步骤为：
1、器具
烧杯：规格为100ml平底烧杯
玻璃棒：用于搅拌溶液使其均匀
称样小勺：称取样品
纯净水：溶解样品
电子舌智能味觉分析系统(日本insent公司TS-5000z)：武汉轻工大学提供
准备相关参比液、清洗液、味觉标准溶液，备用。
2、前处理
用称样小勺，精确称取3g样品于洁净100ml玻璃杯中，用量筒量取100ml(±1ml)超纯水，倒入烧杯中，用玻璃棒搅拌均匀，备测。
3、上机检测
移取80ml到专用检测杯中，按照事先设定的程序，如图1所示进行电子舌检测。五个味觉传感器获取4组数据，取后3次的平均值。
其具体操作步骤为：用传感器测定参比溶液的电势Vr作为基准电势，然后测定样品电势Vs(鲜味测定)，然后用参比溶液进行简单清洗，再次测试参比溶液电势Vr’(回味测定)，然后用专用洗净溶液彻底清洗传感器，即可得到。
不同电极检测了酸、苦、鲜、咸、厚味，这五种味道的强弱用电压数值表示，数值越大，表明其味值越大。
表5电子舌检测味觉结果
| 样品 | 酸味 | 苦味 | 涩味 | 苦味后味 | 涩味后味 | 鲜味 | 鲜味后味 | 咸味 |
| 实施例一 | -29.89 | 2.86 | -12.66 | -0.72 | -5.94 | 11.66 | 1.34 | 8.00 |
| 对比例一 | -29.99 | 3.06 | -9.32 | -0.96 | -0.90 | 10.93 | 1.53 | 7.46 |
不同原料的味觉存在很大差异。对于酸味，实施例一和对比例一的差别不大，但实施例一的苦味、涩味和涩味后味均低于对比例一，鲜味和咸味高于对比例一，说明本发明所得到的酵母水解物味道较好。
(3)动物实验验证
将本发明实施例一及对比例一所制得的酵母水解物进行动物试验。
选取21日龄左右体重尽量一致、体况良好的断奶仔猪16头。过渡3天，按体重相近，公母各半的原则分为2个处理组，即实施例1组、对比例1组，每个处理4个重复，每个重复1栏猪，每栏2头猪(一阉公一母)，试验日粮见表6。日常管理按常规饲养管理进行，保证料槽饲料充足以供仔猪自由采食，自动饮水器供水，室内温度维持常温。试验为期14天，试验期间每日早上8点结料，统计平均日采食量，试验开始和结束时仔猪称重。不同酵母水解物对仔猪生长性能的影响见表7。
其中，平均日采食量ADFI：记录每日每圈试验猪教槽料的供给量及剩余量，两者之差即为每日实际采食量。
平均日增重ADG：在试验期内增加的体重除以正试期总天数。
料重比F/G：在试验期内消耗的全部饲料量与增重之比。
表6试验日粮及营养水平(％)
| 原料 | 实施例1组 | 对比例1组 |
| 玉米(一级) | 50.23 | 50.23 |
| 豆粕(CP46) | 23.3 | 23.3 |
| 乳清粉 | 7 | 7 |
| 大豆油 | 3.44 | 3.44 |
| 蔗糖(食用) | 3 | 3 |
| 葡萄糖(食用) | 3 | 3 |
| 秘鲁鱼粉 | 3.34 | 3.34 |
| 实施例1所制备的酵母水解物 | 3 | 0 |
| 对比例1所制备的酵母水解物 | 0 | 3 |
| 甲酸钙 | 1.04 | 1.04 |
| 磷酸二氢钙 | 0.8 | 0.8 |
| L-赖氨酸盐酸盐(98.5) | 0.56 | 0.56 |
| DL-蛋氨酸 | 0.12 | 0.12 |
| 苏氨酸 | 0.17 | 0.17 |
| 氧化锌 | 0.3 | 0.3 |
| 食盐 | 0.2 | 0.2 |
| 小料 | 0.5 | 0.5 |
| 合计 | 100 | 100 |
表7不同工艺酵母水解物对仔猪生长性能的影响
| 处理 | 初重(kg) | 末重(kg) | ADG(g/d) | ADFI(g/d) | F/G |
| 实施例1组 | 6.49±0.09 | 9.99±1.43 | 251.87±83.60 | 397.94±96.70 | 1.56±0.48 |
| 对比例1组 | 6.46±0.04 | 9.85±1.01 | 247.23±69.35 | 369.74±77.54 | 1.62±0.16 |
实施例1组仔猪的末重、采食量ADFI和平均日增重ADG均高于对比例1组，料重比低于对比例1组；与对比例1组相比，实施例1组仔猪的日均采食量提高7.6％(369.74VS397.94)。试验结果表明，核苷酸型酵母水解物诱食和促生长作用优于普通酵母水解物。
实施例二至实施例八均具有相同的技术效果，即实施例二至实施例八所得到的酵母水解物味道较好，且能够促进动物的生长。
综上所述，本发明所得到的酵母水解物含有丰富的蛋白质、核苷酸，作为饲料使用时，不需要加入外源核苷酸，就能够满足动物对营养物质的需求，味道较好且能够促进动物的生长。
以上所述，仅是本发明实施的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡在本发明的精神和原则之内所做的修改、等同替换和改进等，均需要包含在本发明的保护范围之内。
Claims (14)
1.一种饲用核苷酸型酵母水解物，其特征在于，所述酵母水解物通过酵母乳自溶，复合酶酶解得到，所述酵母水解物包含蛋白质、核酸和核苷酸，所述核苷酸为非外源性的，以酵母水解物干物质质量计，所述蛋白质的含量≥48％，所述核酸的含量≥10％，所述核苷酸的含量为1.8-2.5％。
2.根据权利要求1所述的酵母水解物，其中，所述核苷酸包含胞苷酸、腺苷酸、鸟苷酸、尿苷酸和肌苷酸，所述胞苷酸的质量含量为0.2-0.5％，所述腺苷酸的质量含量为0.5-0.9％，所述鸟苷酸的质量含量为0.4-0.9％，所述尿苷酸的质量含量为0.2-0.6％，所述肌苷酸的质量含量为0.03-0.2％，较优选的，所述胞苷酸的质量含量为0.21-0.44％，所述腺苷酸的质量含量为0.7-0.86％，所述鸟苷酸的质量含量为0.57-0.71％，所述尿苷酸的质量含量为0.22-0.52％，所述肌苷酸的质量含量为0.03-0.097％，更优选的，所述胞苷酸的质量含量为0.33-0.44％，所述腺苷酸的质量含量为0.7-0.86％，所述鸟苷酸的质量含量为0.65-0.71％，所述尿苷酸的质量含量为0.41-0.52％，所述肌苷酸的质量含量为0.03-0.097％。
3.根据权利要求1或2所述的酵母水解物，其中，所述酵母乳采用酿酒菌株d8.8(Saccharomyces cerevisiaed8.8)进行发酵培养得到，其保藏编号为CCTCC NO:M2017148。
4.权利要求1-3任一项所述的酵母水解物的制备方法，其包含下述步骤：
(1)发酵培养：将酿酒酵母菌株进行发酵培养，得到酵母乳；
(2)自溶：将步骤(1)所得到的酵母乳进行热击处理，以进行自溶；
(3)酶解：将步骤(2)所得到的酵母乳加入复合酶进行酶解得到酵母水解物，优选的，所述复合酶包含木瓜蛋白酶和核酸酶。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其中，在步骤(2)中，所述热击处理的温度为80-95℃。
6.根据权利要求4或5所述的制备方法，其中，在步骤(2)中，所述热击处理的时间为40-50s。
7.根据权利要求4-6任一项所述的制备方法，其中，在步骤(2)中，在所述热击处理后加入柠檬酸进行保温处理，较优选的，以酵母乳干物质的质量计，所述柠檬酸的添加量为1-5‰。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其中，所述保温处理的保温温度为40-60℃，优选为45-60℃，保温时间为8-12h。
9.根据权利要求4-8任一项所述的制备方法，其中，在步骤(3)中，以酵母乳干物质的质量计，所述木瓜蛋白酶的添加量为1-5‰，所述核酸酶的添加量为1-5‰；优选的，所述木瓜蛋白酶的添加量为2.5-5‰，所述核酸酶的添加量为1.5-5‰；更优选的，所述木瓜蛋白酶的添加量为3-4‰，所述核酸酶的添加量为2-4‰。
10.根据权利要求4-9任一项所述的制备方法，其中，
所述木瓜蛋白酶的酶解温度为55-65℃，pH为5-6.5，优选pH为5.8-6，酶解时间为5-10小时，优选为6-10小时；
所述核酸酶的酶解温度为55-65℃，优选为58-65℃，pH为5-6.5，酶解时间为10-15小时。
11.根据权利要求4-10任一项所述的方法，其中，在步骤(1)中，所述发酵培养采用流加方式流加碳源、氮源和磷源；
所述碳源为6000-8000g，所述氮源为400-700g，所述磷源为300-600g；
所述碳源为糖蜜，优选为30％的糖蜜；
所述氮源选自于氨水、硫酸铵中的一种，优选为硫酸铵；
所述磷源选自于磷酸或磷酸二氢钾中的一种，优选为磷酸二氢钾。
12.根据权利要求11所述的制备方法，其中，在步骤(1)中，所述发酵培养的发酵温度为29-33℃，发酵时间为12-18小时，发酵的pH为4.5-6.4。
13.权利要求1-3任一项所述的酵母水解物或权利要求4-12任一项所述的方法制备得到的酵母水解物在饲料中的应用。
14.一种饲料，其包含权利要求1-3任一项所述的酵母水解物或权利要求4-12任一项所述的方法制备得到的酵母水解物和基础日粮，所述酵母水解物的添加量为1-10％，优选添加量为1-5％。
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