CN101928674A - 选育高核酸酵母、用高核酸酵母制备核糖核酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及从酿酒酵母中选育高核酸酵母，采用大量酿酒酵母保藏菌种，在一个合适的酵母生长培养基中培养，选育原始菌株，原始菌株再经复筛和培养基的选择获得工业生产用高核酸酵母菌株，经毒力试验，菌体和代谢产物无致毒反应。本发明所采用的酿酒酵母是中国卫生部在可用于保健食品的真菌菌株群中第一推荐的，从酿酒酵母中选育高核酸酵母用于核酸的工业生产，选育的高核酸酵母菌株再次经微生物学鉴定是酿酒酵母，是传统用于生产啤酒的同一类菌株，在最佳培养条件下达到菌体内核酸含量12-14％(W/W)。可广泛用于大规模工业化生产，制备的核酸可以放心地用于保健食品、药品、婴儿食品等领域。
Description
一、技术领域：
本发明涉及筛选、培养高核酸酿酒酵母制取核糖核酸(RNA)的技术工艺，以用于大规模工业化生产核酸的方法。
二、背景技术：
核糖核酸不只是基因工程研究中常用的材料，在保健食品、抗病毒抗肿瘤药物的生产、食品添加剂——如肌苷酸、鸟苷酸的大规模生产、婴儿奶粉中的添加都有广泛需求，在工业上能大量生产核糖核酸的工艺是生物技术领域的重要课题之一。
核糖核酸是生物存在的物质基础，几乎所有生物体都含有核糖核酸，但并不是大部分生物资源都可以用来大规模提取核糖核酸，其原因是含量低、资源获得困难或工业上无法制备。
从微生物中提取核糖核酸是工业上最实际和有效的方法，人们已经发现一些最常见的微生物含有丰富的核酸，如啤酒酵母、纸浆酵母、石油酵母、面包酵母、白地霉、青霉菌菌丝体、制霉菌素菌丝体等。在各种微生物类群中核糖核酸的含量范围幅度很大，通常在细菌中RNA占0.3-51％，在酵母中占2.7-11％，在霉菌中占0.7-28％。在菌体内RNA含量的变化受培 养基组成影响甚大，其中铵离子和磷酸盐浓度影响显著，酵母的RNA不仅含量高并且易于提取，可用于工业化生产5′核苷酸。曾有学者选用500株不同的酵母菌在最好的培养条件下测定RNA含量，发现发酵培养18小时，RNA含量在3.5-9.2％，除了野生型酵母菌株外，通过诱变育种的方法例如使用亚硝基胍(NTG)为诱变剂寻找对氯化钾敏感的变异株可以提高菌体的核酸含量。
选用核酸含量高的菌株，并不是用于工业上大规模生产核酸的唯一要求，更重要的是选育的菌株，在发酵培养过程中生成的菌体、核酸及其代谢产物对人体的安全性，在啤酒的生产中培养啤酒酵母通常用麦芽汁为碳源及营养源，且啤酒酵母是世界上公认的具有食用安全性的菌株。
三、发明内容：
本发明的目的之一是从酿酒酵母中选育高核酸酵母，核心技术是选育到一株安全无毒的、卫生部许可在保健食品中使用的含高核糖核酸的酵母菌株，并配合工业上使用糖蜜为碳源，经深层发酵培养获得含高核酸的酵母菌体；目的之二是用高核酸酵母制备核糖核酸的方法，用于核酸的提取，从而完成食品、医药、农业等领域需求的核酸生产。
本发明为实现上述目的所采用的技术方案是：从酿酒酵母中选育高核酸酵母，采用大量的酿酒酵母保藏菌种，经初筛和复筛获得一株核酸含量较高的原始菌株Y37，原始菌株Y37再经最佳培养基的筛选获得工业生产用高核酸酵母菌株，经毒力试验，菌体和代谢产物都无致毒反应。
所述初筛和复筛菌种采用的培养基(g/100ml)配方如下：葡萄糖3、酵母膏0.1、磷酸氢二铵1、硫酸镁0.05、氯化钾0.15、硫酸锌0.001、氯化钠0.01、硫酸亚铁0.001，PH5.0。
所述筛选工业生产用高核酸酵母所用的最佳培养基(g/100ml)配方如 下：糖蜜(含糖44.6％)8.0、硫酸镁0.067、硫酸铵0.044、尿素0.044、蛋白胨0.011、硫酸亚铁0.033、硫酸锌0.033、磷酸(85％)0.273、PH3.9。
本发明所述高核酸酵母制备核糖核酸的方法，对高核酸酵母菌体抽提核糖核酸，获得的核糖核酸经核酸酶P1降解制得核苷酸。
所述对菌体抽提核糖核酸采用高温食盐法抽提。
所述高温食盐法抽提核糖核酸是指采用10％食盐在90℃高温破碎酵母细胞，抽提核酸，其核酸收率达12-14％(W/W)，核酸含量大于90％。
所述采用核酸酶P1将核糖核酸降解成5′核苷酸，其降解率大于80％，其四种5′核苷酸比例符合常规核糖核酸组份。
本发明所采用的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，是中国卫生部在可用于保健食品的真菌菌株群中第一推荐的，从酿酒酵母中选育高核酸酵母用于核酸的工业生产，选育的高核酸酵母菌株经微生物学鉴定是酿酒酵母，是传统用于生产啤酒的同一类菌株，在最佳培养条件下达到菌体内核酸含量12-14％(W/W)，以后又经菌株毒力试验证实菌体(包含核酸)及其代谢产物(全培养液)是无毒的。具有食品、保健品行业广泛应用性，为了廉价和大量地获得菌体以供核酸的提取，本发明选用糖蜜为碳源，硫酸铵、尿素、蛋白胨的适当组合为氮源，磷酸是促进高核酸合成的优选因素。核酸的抽提其关键技术是细胞破损，让包含在胞内的核酸释放出来，可以用机械磨损，酸、碱、食盐处理以改变细胞内外渗透压等方法提取核酸，取得的核酸对酵母而言收率高，核酸的纯度高(没有被降解)，副产品脱核酵母的收率高，工艺生产的污染物少；虽然碱法、混合盐法、表面活性剂法、酶法都可以从酿酒酵母中提取核酸，但本发明采用高温食盐抽提法是对该酿酒酵母最佳的破细胞和核酸抽提法，其核酸收率达12-14％(W/W)，提取的核酸含量大于90％。提取的核酸经核酸酶P1降解，降解率 达80％以上，5′核苷酸各组份的比例符合生物体常规核酸的组份，可广泛用于大规模工业化生产，制备的核酸可以放心地用于保健食品、药品、婴儿食品(奶粉添加剂)等领域。
四、具体实施方式：
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，但本发明不限于具体实施例。
实施例1
从酿酒酵母中选育高核酸酵母：
1、从保藏的自然型酿酒酵母中初筛高核酸酵母菌株：
采用的培养基(g/100ml)配方如下：葡萄糖3、酵母膏0.1、磷酸氢二铵1、硫酸镁0.05、氯化钾0.15、硫酸锌0.001、氯化钠0.01、硫酸亚铁0.001，PH5.0。
将筛选菌种分别置于上述无菌培养基中，在30℃下通风培养48小时，进行初筛，初筛之后再进行复筛。
表一：各菌株核酸的含量(培养48hr，每30毫升培养物中RNA mg)
| NO | 菌株 | RNA mg | NO | 菌株 | RNA mg | NO | 菌株 | RNA mg |
| 1 | Y14 | 44.8 | 17 | Y42 | 38.8 | 33 | 2.128 | 45.6 |
| 2 | Y15 | 37.6 | 18 | Y49 | 33.8 | 34 | 2.156 | 36.08 |
| 3 | Y20 | 13.2 | 19 | Y50 | 42.0 | 35 | 2.163 | 43.2 |
| 4 | Y23 | 30.4 | 20 | Y54 | 27.9 | 36 | 2.182 | 41.6 |
| 5 | Y28 | 25.2 | 21 | Y55 | 40.9 | 37 | 2.452 | 41.1 |
| 6 | Y29 | 43.2 | 22 | Y59 | 32.8 | 38 | 2.453 | 42.96 |
| 7 | Y30 | 16.8 | 23 | Y84 | 40.8 | 39 | 2.457 | 40.5 |
[0023]
| 8 | Y33 | 44.8 | 24 | Y109 | 40.0 | 40 | 2.597 | 18.4 |
| 9 | Y34 | 38.24 | 25 | Y110 | 45.7 | 41 | 2.742 | 42.8 |
| 10 | Y35 | 36.0 | 26 | Y119 | 39.2 | 42 | 2.870 | 38.4 |
| 11 | Y36 | 41.12 | 27 | 2.11 | 45.6 | 43 | 2.1392 | 38.4 |
| 12 | Y37 | 50.9 | 28 | 2.2 | 29.2 | 44 | 2.1406 | 40.5 |
| 13 | Y38 | 35.6 | 29 | 2.97 | 40.4 | 45 | 2.1407 | 47.04 |
| 14 | Y39 | 35.2 | 30 | 2.98 | 41.44 | 46 | 2.1430 | 46.0 |
| 15 | Y40 | 25.2 | 31 | 2.110 | 43.2 | |||
| 16 | Y41 | 36.0 | 32 | 2.126 | 39.76 |
表二：优选高核酸酵母的复筛(培养48hr，每30毫升培养物中RNA mg)
| NO | 菌株 | RNA mg | NO | 菌株 | RNA mg |
| 1 | Y14 | 45.96 | 7 | 2.98 | 39.76 |
| 2 | Y29 | 44.84 | 8 | 2.128 | 45.76 |
| 3 | Y33 | 42.44 | 9 | 2.453 | 43.28 |
| 4 | Y37 | 49.44 | 10 | 2.1407 | 46.48 |
| 5 | Y50 | 48.58 | 11 | 2.1430 | 39.52 |
| 6 | Y110 | 47.0 |
2、筛选原始菌株Y37高核酸酵母最佳工业生产培养基：
将上述经过初筛和复筛选育到的原始菌株高核酸酵母Y37用不同的碳源、氮源及无机盐做正交试验，选择适合工业化生产的最佳培养基，最佳培养基组份(g/100ml)配比如下：糖蜜〔含糖44.6％(W/V)〕8.0、硫酸镁0.067、硫酸铵0.044、尿素0.044、蛋白胨0.011、硫酸亚铁0.033、 硫酸锌0.033、磷酸〔85％(W/V)〕0.273、PH3.9。
将复筛菌种分别置于上述无菌培养基中，在30℃下通风培养48小时进行选育。
结果：酿酒酵母Y37菌体内的RNA含量由8-10％上升到12-14％。
3、为了再次确认选育菌株的微生物分类类群，经中科院微生物研究所检测鉴定：
本研究获得的一株酵母菌(菌株号Y37)进行了详细的菌落和细胞生态学观察，并测定了其26SrRNA基因D1/D2区的碱基序列，分析比较结果表明，Y37菌株的形态特征与酿酒酵母(Saccharomyces cerevisae)的标准描述完全一致，其D1/D2区碱基序列与酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)模式菌株的相应DNA碱基序列100％相同(比较结果如下)： 送检酵母菌株Y37的26SrRNA D1/D2区碱基序列：
1 AGTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTT
61 GGAGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAG
121 GGTGAGAATCCCGTGTGGCGAGGAGTGCGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAG
181 TTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGA
241 GAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTG
301 AAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCC
361 CTCTGCTCCTTGTGGGTAGGGGAATCTCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGTGG
421 CAGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTATTATAGCCTGTGGGAATACT
481 GCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCATAATGGTTATATGCC
541 GCCCGTCTTGAAA
送检菌株Y37与酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae模式菌株NRRLY-12632的26SrDNA D1/D2区序列(GenBank accession number： AY048154)的比较(Query＝Y37，Sbjct＝NRRL Y-12632)：
Query：1 agtgaagcggcaaaagctcaaatttgaaatctggtaccttcggtgcccgagttgtaattt 60
Sbjct：31 agtgaagcggcaaaagctcaaatttgaaatctggtaccttcggtgcccgagttgtaattt 90
Query：61 ggagagggcaactttggggccgttccttgtctatgttccttggaacaggacgtcatagag 120
Sbjct：91 ggagagggcaactttggggccgttccttgtctatgttccttggaacaggacgtcatagag 150
Query：121 ggtgagaatcccgtgtggcgaggagtgcggttctttgtaaagtgccttcgaagagtcgag 180
Sbjct：151 ggtgagaatcccgtgtggcgaggagtgcggttctttgtaaagtgccttcgaagagtcgag 210
Query：181 ttgtttgggaatgcagctctaagtgggtggtaaattccatctaaagctaaatattggcga 240
Sbjct：211 ttgtttgggaatgcagctctaagtgggtggtaaattccatctaaagctaaatattggcga 270
Query：241 gagaccgatagcgaacaagtacagtgatggaaagatgaaaagaactttgaaaagagagtg 300
Sbjct：271 gagaccgatagcgaacaagtacagtgatggaaagatgaaaagaactttgaaaagagagtg 330
Query：301 aaaaagtacgtgaaattgttgaaagggaagggcatttgatcagacatggtgttttgtgcc 360
Sbjct：331 aaaaagtacgtgaaattgttgaaagggaagggcatttgatcagacatggtgttttgtgcc 390
Query：361 ctctgctccttgtgggtaggggaatctcgcatttcactgggccagcatcagttttggtgg 420
Sbjct：391 ctctgctccttgtgggtaggggaatctcgcatttcactgggccagcatcagttttggtgg 450
Query：421 caggataaatccataggaatgtagcttgcctcggtaagtattatagcctgtgggaatact 480
Sbjct：451 caggataaatccataggaatgtagcttgcctcggtaagtattatagcctgtgggaatact 510
Query：481 gccagctgggactgaggactgcgacgtaagtcaaggatgctggcataatggttatatgcc 540
Sbjct：511 gccagctgggactgaggactgcgacgtaagtcaaggatgctggcataatggttatatgcc 570
Query：541 gcccgtcttgaaa 553
Sbjct：571 gcccgtcttgaaa 583
据此，送检菌株Y37鉴定为：
酿酒醇母 Saccharomyces cerevisiae Mayen ex E.C.Hansen。
4、酵母菌株的毒力试验：
为了证实选育的酿酒酵母Y37是安全性菌株，经中国疾病预防控制中心营养与食品安全所进行酵母菌株的毒力试验。
1)、培养物制备：将送检菌株转种于马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基，确证为纯培养后，分别接种于麦芽汁-酵母膏、麦芽汁-蛋白胨及马铃薯-酵母膏-蔗糖培养基中，置28±1℃培养14d。将培养物经流动蒸汽1h后，过滤，所得滤液部分于80℃恒温下浓缩2.5倍备用，余者直接供实验用。
2)、实验动物：选用北京维通利华实验动物技术有限公司繁殖的ICR(动物批准号SCXK11-00-0008)健康小鼠240只，雌雄各半，雌性小鼠体重范围18.2-22.6g，雄性小鼠体重范围18.1-22.6g。
3)、小鼠毒力实验：每种产毒液体培养基需ICR小鼠80只，雌雄各半，分别随机分为4组，每组10只。剂量组设置为：培养基空白对照组、培养基2.5倍浓缩空白对照组、培养物原液组、培养物2.5倍浓缩组。将受试动物以20.0ml/kgBW的剂量给小鼠一次性灌胃后观察14d，记录实验过程中小鼠的中毒表现及死亡情况。
4)、检验结果：将酵母菌株接种于马铃薯-酵母膏-蔗糖、麦芽汁-蛋白胨、麦芽汁-酵母膏3种产毒液体培养基中，28±1℃培养14d。培养物的原液和2.5倍浓缩液，经口以20.0ml/kg BW给小鼠一次性灌胃后观察14d。与对照组相比，未观察到受试小鼠有毒性反应或死亡。
5、酿酒酵母Y37最适培养基的研究：
使用糖蜜与各种氮源组合，对酿酒酵母Y37进行发酵培养研究，并提取核酸，本发明提供的培养基组份为(g/100ml)：
糖蜜〔含糖44.6％(W/V)〕8.0、硫酸镁0.067、硫酸铵0.044、尿素0.044、蛋白胨0.011、硫酸亚铁0.033、硫酸锌0.033、磷酸〔85％(W/V)〕0.273、PH3.9。
实施例2
用高核酸酵母制备核糖核酸：
本发明所提供的核酸提取方法：用Y37酿酒酵母菌制得的高核酸酵母，折干称取7.5％(W/V)，加入食盐10％(W/V)，升温至90℃，保温3-4小时，核酸的提取率达12-14％(W/W)。
核酸的纯度及降解效果检测：发明制备的核酸，经光谱法测定其核酸纯度为90-94％。取15g纯RNA经核酸酶P1降解，结果如下(HPLC数据)：
| 5′核苷酸 | 5′核苷酸/RNA％ |
| CMP | 16.40 |
| UMP | 22.73 |
| GMP | 24.60 |
| AMP | 20.73 |
| 总5′核苷酸 | 84.46 |
本发明完成了选育安全性无毒的高核酸酿酒酵母，经发酵培养用于提取核酸的工艺将可用于工业上大规模生产核酸。
Claims (8)
1.用酿酒酵母选育高核酸酵母，其特征是：采用酿酒酵母保藏菌种，在适合的培养基中，经初筛、复筛获得一株核酸含量较高的原始菌株，再经最佳培养基的筛选获得可用于工业化生产提取核酸的酿酒酵母Y37，经毒力试验菌体和代谢产物无致毒反应。
2.根据权利要求1，用酿酒酵母选育高核酸酵母，其特征是：选育的高核酸酵母菌经微生物学鉴定其是酿酒酵母。
3.根据权利要求1所述的用酿酒酵母选育高核酸酵母，其特征是：初筛和复筛菌种采用的培养基(g/100ml)配方如下：葡萄糖3、酵母膏0.1、磷酸氢二铵1、硫酸镁0.05、氯化钾0.15、硫酸锌0.001、氯化钠0.01、硫酸亚铁0.001，PH5.0。
4.根据权利要求1所述的用酿酒酵母选育高核酸酵母，其特征是：筛选工业生产用高核酸酵母所用的最佳培养基(g/100ml)配方如下：糖蜜〔含糖44.6％(W/V)〕8.0、硫酸镁0.067、硫酸铵0.044、尿素0.044、蛋白胨0.011、硫酸亚铁0.033、硫酸锌0.033、磷酸〔85％(W/V)〕0.273、PH3.9。
5.根据权利要求1-4任一制得的高核酸酵母制备核糖核酸的方法，其特征是：对高核酸酵母菌体抽提核糖核酸，获得的核糖核酸经核酸酶P1降解制得5′核苷酸。
6.根据权利要求5所述的高核酸酵母制备核糖核酸的方法，其特征是：对菌体抽提核糖核酸采用高温食盐法抽提。
7.根据权利要求6所述的高核酸酵母制备核糖核酸的方法，其特征是：高温食盐法抽提核糖核酸是指采用10％食盐在90℃高温处理已制取的酿酒酵母，经高温食盐法提取获得的核酸含量大于90％。
8.根据权利要求6所述的高核酸酵母制备核糖核酸的方法，其特征是：采用核酸酶P1将制取的核糖核酸降解成5′核苷酸，其降解率大于80％，四种5′核苷酸比例符合常规核糖核酸组份。
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