CN113881581B

CN113881581B - 一株高核糖核酸酿酒酵母菌株及其应用

Info

Publication number: CN113881581B
Application number: CN202111251540.3A
Authority: CN
Inventors: 李崎; 陈皓; 刘希晨; 王金晶; 刘春凤; 郑飞云; 钮成拓; 许鑫
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2021-10-21
Filing date: 2021-10-21
Publication date: 2023-08-08
Anticipated expiration: 2041-10-21
Also published as: CN113881581A

Abstract

本发明公开了一株高核糖核酸酿酒酵母菌株及其应用，属于生物工程技术领域。本发明利用常压室温等离子诱变技术(ARTP)诱变出发菌株(9.20％)，KS培养基初筛诱变菌株，筛选效率大大提高。在得到的若干高产核糖核酸酵母中复筛得到性状优良的JNB‑G03H8。此菌株RNA含量高，在正常的YPD培养基摇瓶培养后，菌体RNA含量(g/DCW)可达12.89％，通过响应面优化实验在优化培养基条件下菌体RNA含量最高可达15.80％，相较于出发菌株G03 9.20％的含量，提高了70.76％，且为非转基因菌，无毒无害，遗传稳定，应用于食品领域安全可靠。

Description

一株高核糖核酸酿酒酵母菌株及其应用

技术领域

本发明涉及一株高核糖核酸酿酒酵母菌株及其应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

RNA是生命的重要组成部分之一，普遍存在于所有生命体中，与生物合成蛋白质有着紧密的联系。核酸及其衍生物(鸟苷酸(IMP)和肌苷酸(GMP))可以开发二代味精、酱油等新型食品调味品；用作水稻、瓜果等农作物的生长促进物质；用作制造治疗冠心病、肿瘤、心肌梗塞等疾病的药物等，其工业化生产就显得意义非凡，如图1所示。随着科学技术的快速发展，科研工作者已经阐明其在生物体内的一些作用机理，它在食品、医药、保健、农业等行业具有十分广泛的应用前景，未来利用酵母RNA时也将更加具有针对性和开阔性。

目前生产RNA应用最多的是酵母菌，其RNA含量高，易于培养，且酿酒酵母是一种公认的安全(GRAS)微生物，是RNA的首选工业来源。目前，RNA的各项功能与应用扩展已经引起重视，RNA的高效分离提取对酵母选育工作效率的提升也有着促进作用，富含核糖核酸的酵母选育研究在酵母生产RNA领域中具有十分重要的意义，也逐渐成为研究的主要方向之一。

中国专利申请CN1498264A公开了一种“富核糖核酸啤酒酵母菌种及其制造方法”，该方法制备的酵母菌体中含有相当于菌体重量的10％以上的核糖核酸，但是不超过12％；中国申请专利CN102559522A公开了“一种高核酸面包酵母及其制备方法”，该方法制备的酵母菌体中含有相当于菌体重量的20％以上的核酸，其中的RNA大于12％；中国专利申请CN106635851A公开了“一种高核酸酿酒酵母菌的选育方法”，该方法通过培养基和发酵优化后，酵母菌RNA含量可达14.6％-15.2％；中国专利申请CN101928674A公开了“选育高核酸酵母、用高核酸酵母制备核糖核酸的方法”，该方法筛选出的酿酒酵母菌株在最佳的培养条件下菌体RNA含量可达12％-14％。因此，获得更高RNA含量的酵母菌菌株，提高优良性状目的菌株的筛选效率，一直是领域内的研究热点。

RNA及其降解产物核苷酸在医药、保健品和食品加工业方面有非常广泛的应用前景，但由于目前RNA产品的质量安全和价格因素限制了它的使用。因此本申请对开辟选育高核糖核酸酵母菌株的新方法，实现更高效率及更好性状的目的菌株的筛选，得到更高的RNA产量降低实现菌株高产核糖核酸的成本，提高酵母RNA产品安全性，具有很重要的意义。

发明内容

针对目前存在的问题，本发明通过诱变等方法筛选到一株能够提升核糖核酸产量的酿酒酵母菌株。

本发明的第一个目的是提供一株高产核糖核酸酵母，巴斯德酵母菌属(Saccharomyces pastorianus)JNB-G03H8，已于2021年6月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22785，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明的第二个目的是提供含有所述巴斯德酵母菌的微生物菌剂。

本发明的第三个目的是提供一种生产RNA的方法，所述方法是将所述巴斯德酵母菌加入培养基中，发酵生产RNA。

在一种实施方式中，所述培养基包括YPD培养基。

在一种实施方式中，所述培养基以葡萄糖、麦芽糖和/或糖蜜为碳源；所述葡萄糖、麦芽糖和/或糖蜜为培养基质量的2～5％。

在一种实施方式中，所述葡萄糖为培养基质量的2％，所述麦芽糖为培养基质量的2％，所述糖蜜为培养基质量的4～5％。

优选的，所述糖蜜为培养基质量的4.84％。

在一种实施方式中，所述培养基中还含有质量比为0.5～1％的(NH₄)₂SO₄、0.4～0.8％的KH₂PO₄、0.1～0.3％的MgSO₄·7H₂O、0.02～0.1g/L FeSO₄·7H₂O、0.02～0.1g/LZnSO₄·7H₂O。

优选的，所述培养基中还含有质量比为0.62％的(NH₄)₂SO₄、0.72％的KH₂PO₄、0.2％的MgSO₄·7H₂O、0.06g/L FeSO₄·7H₂O、0.06g/L ZnSO₄·7H₂O。

在一种实施方式中，在26～28℃，pH5～6.5的条件下培养16～18h。

优选的，在26～28℃，pH6.0～6.5的条件下培养16～18h。

本发明的第四个目的是提供所述巴斯德酵母菌或是所述微生物菌剂在食品、医药、保健、农业领域中的应用。

在一种实施方式中，利用所述巴斯德酵母菌发酵得到的核糖核酸制备鸟苷酸和肌苷酸。

在一种实施方式中，所述巴斯德酵母菌可以用于肉类加工、鱼类加工、罐头生产、调味料、酱油、调味汁、卤料的制备。

有益效果：

本发明的巴斯德酵母菌(Saccharomyces pastorianus)CGMCC No.22785与其他酵母相比能够实现在正常YPD培养基中培养即可达到高产核糖核酸的水平，RNA含量(g/DCW)可达12.89％，优化培养基条件下菌体RNA含量为15.80％，相较于出发菌株G03 9.20％的含量，提高了70.76％，同时，经过遗传稳定性实验分析，JNB-G03H8在八次传代之后仍然具有良好的性状，且为非转基因菌，无毒无害，遗传稳定，应用于食品领域安全可靠。

生物材料保藏

本申请提供的JNB-G03H8，分类学命名为Saccharomyces pastorianus；已于2021年6月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.22785，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

附图说明

图1为酵母RNA的功能及应用；

图2为不同酵母菌株的生物量积累能力和RNA合成能力对比图；

图3为出发菌株G03的RNA含量随生长曲线的变化；

图4为出发菌株G03的ARTP诱变致死曲线；

图5为高产核糖核酸酵母影印平板法筛选对比图，KS平板(左)和YPD固体平板(右)；

图6为复筛出的高产核糖核酸诱变菌的生物积累量与RNA含量图；

图7为不同高产核糖核酸突变菌株的产乙醇能力的对比；

图8为不同高产核糖核酸突变菌株的遗传稳定性分析图；

图9为JNB-G03H8菌株RNA随培养时间的变化图；

图10为JNB-G03H8菌株在不同碳源培养条件下的RNA含量对比图；

图11为JNB-G03H8菌株在不同培养温度条件下的RNA含量对比图；

图12为JNB-G03H8菌株在不同培养基pH条件下的RNA含量对比图；

图13为响应面优化实验实际测定值与模型预测值对比图；

图14为响应面3D图；当KH₂PO₄浓度保持在0.4％，糖蜜和(NH₄)₂SO₄浓度的作为变量时，JNB-G03H8的RNA含量的响应面曲线。

图15为响应面3D图；当(NH₄)₂SO₄浓度保持在1％，糖蜜和KH₂PO₄浓度的作为变量时，JNB-G03H8的RNA含量的响应面曲线。

图16为响应面3D图；当糖蜜浓度保持在4％，(NH₄)₂SO₄和KH₂PO₄浓度的作为变量时，JNB-G03H8的RNA含量的响应面曲线。

具体实施方式

YPD液体培养基(质量比)：葡萄糖2％，蛋白胨2％，酵母粉1％。

YPD培养基平板(质量比)：葡萄糖2％，蛋白胨2％，酵母粉1％，琼脂粉2％。

KS筛选培养基(质量比)：葡萄糖2％，蛋白胨2％，酵母粉1％，琼脂粉2％，KCI 1％。

优化培养基(质量比)：糖蜜4.84％，(NH₄)₂SO₄ 0.62％，KH₂PO₄ 0.72％，MgSO₄·7H₂O 2％，FeSO₄·7H₂O 0.06g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.06g/L，酵母浸粉1％。

酒精度测定：具体操作步骤见安东帕密度仪操作手册，安东帕密度仪能够精确可靠地测定多种酒精饮料(如：所有类型的啤酒和啤酒混合物、葡萄酒、苹果酒、烈酒、白酒以及发酵葡萄汁、麦芽汁、糖浆和待发酵糖浆等)中的酒精含量。利用BEER模式测定发酵液的酒精度。

实施例1：诱变出发菌株的选择

(1)对比不同菌株的不同碳氮源利用能力

制备无碳固体培养基的基本配方：酵母提取物1％，蛋白胨2％，琼脂粉2％，分别加入2％的葡萄糖、海藻糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉；制备无氮固体培养基的基本配方：酵母提取物1％，葡萄糖2％，琼脂粉2％，分别加入2％的氯化铵、草酸铵、谷氨酸、尿素、大豆蛋白胨、蛋白胨。接种待测酵母于培养基平板上，28℃培养48h，菌落长势：+++表示长势浓密、++表示长势一般、+表示长势差稀疏、--表示萎缩、-表示不生长，对比不同碳源的利用能力。

由表1和表2可知，相较于510、M14两株啤酒酵母和一株BC毕赤酵母，G03啤酒酵母菌株具有更高的不同碳、氮源利用效率，并且在草酸铵作为氮源时具有独一的利用能力。

表1不同酵母的不同碳源利用能力对比

表2不同酵母的不同氮源利用能力对比

(2)不同酵母菌株的生物量积累能力和RNA合成能力对比

菌株生物量的测定：取待测的菌体发酵液10mL于提前干燥且恒重的离心管中，通过12000r/min进行离心处理20s，去除上清，将离心到底部的酵母菌体收集起来。取收集的酵母乳进行充分洗涤3次以上，然后在100±5℃条件下进行干燥处理，当处于恒重时，计算此时的细胞干重(g/L)。

菌株RNA含量的测定：取对数中期(与菌株生物量测定为同一个时期)的酵母菌液1mL于A、B两个试管中，12000r/min离心20s，A管置于100±5℃烘箱中烘干称质量，B管去除上清，加1mL 0.5M高氯酸重悬，置于70℃的水浴锅中加热20min，期间每隔6-7min上下颠倒试管混匀，然后置于冰上冷却，以12000r/min离心2min。取2μL上清液于Nannotrop仪器测定A260 nm值。核酸含量及核酸产量计算公式如下：

式中：X为核酸含量，％；A为波长260nm处样品的吸光度值；m为1mL菌液所得菌体质量，mg；0.0368为单位吸光度值。

由图2可知，G03具有优良的性状，RNA含量对比之下为最高，因此选为出发菌株。

实施例2：ARTP诱变选育高产核糖核酸酵母

(1)诱变致死曲线测定

取一环G03的菌泥接入10mL YPD液体培养基中，28℃，180r/min的摇床培养24h后，取菌液1mL至100mL新鲜的YPD液体培养基中，28℃，180r/min的摇床培养11h至对数中期。取适量上述菌液用4％甘油稀释100倍，取10μL稀释后的菌液点于ARTP诱变载片上进行诱变处理，处理时间分别为10s、20s、30s、40s、50s、60s、70s和80s。诱变处理完成后，将处理后的载片置于加有1mL YPD液体培养基的1.5mL离心管中，于28℃，180r/min的摇床活化1h，取活化后的菌液涂布于YPD固体平板，置于28℃恒温培养箱中进行培养48h。

根据绘制出来的致死曲线如图3选取死亡率≥80％的时间段，按照上述步骤对出发菌株进行ARTP诱变。

(2)ARTP诱变处理出发菌株

根据(1)得到的结果，选取80s、90s的处理时间进行诱变处理，得到诱变处理后的突变菌株。

实施例3：高产核糖核酸酵母的筛选

(1)初筛

采用KCl敏感性筛选高核酸突变菌株。将实施例2中得到的突变菌经过YPD固体平板培养后，分别影印到含1-2％KCl的YPD培养基平板和普通YPD固体平板上，置于28℃恒温培养箱中进行培养24h，取出对应的平板，由于高核糖核酸诱变菌会在含1-2％KCl的YPD培养基平板呈现生长抑制状态，即菌落大小会比在正常YPD固体平板上小，如图5所示。再而从正常YPD固体平板挑取相应菌体进行后续筛选。

(2)复筛

在对应KS固体平板的普通YPD固体平板上挑取的生长抑制菌，于100ml YPD液体培养基28℃，180r/min的摇床培养24h，测定菌株RNA含量。选取RNA含量较高的突变菌，进行其他复筛指标的研究。

突变菌株生物量积累与RNA含量合成能力测定：同实施例1中对应方法。

突变菌株产乙醇能力分析：将经过诱变复筛得到的高产核酸的突变株取一环菌泥接入100mL YPD液体培养基，28℃，180r/min的摇床培养24h后，取菌液于50ml离心管，8000r/min，3min离心，收集上清液，啤酒分析仪(同具体实施方法酒精度的测定)测定发酵液的酒精含量(w/w％)。

突变菌株遗传稳定性分析：将经过诱变复筛得到的高产核酸的突变株取一环菌泥接入10mL YPD液体培养基中，28℃，180r/min的摇床培养24h后，取菌液1mL至50mL的YPD液体培养基中，28℃，180r/min的摇床培养12h，连续转接8代，测定第八代高核糖核酸突变株的RNA含量，对比菌体初代的RNA含量，得到该突变菌株遗传稳定性结果。

对比发现，JNB-G03H8菌株具有最高的RNA含量，菌株产乙醇能力提高，结果如图7所示，并具备良好的遗传能力，经过八次传代实验仍然具有良好的性状，如图8所示。故将JNB-G03H8作为优选菌株，用于摇瓶培养基的优化，并将其送至保藏中心保藏。

实施例4：高产核糖核酸酵母JNB-G03H8的培养基优化

(1)单因素优化培养条件与碳源选择

从JNB-G03H8斜面上挑取一环菌泥于10ml YPD培养基中活化24h，吸取1ml菌液至100ml YPD培养基摇瓶下培养，从10h开始每2h测定菌体RNA含量与干重，结果如图9。结果显示，在培养时间为16h时菌株RNA含量达到最高水平，18h时RNA含量已经降低，故在相同培养条件下，在培养时间达16-18h之间时为最佳RNA含量测定时间，故选择16h为最佳培养时间。

从JNB-G03H8斜面上挑取一环菌泥于10ml YPD培养基中活化24h，吸取1ml菌液至100ml YPD培养基于不同培养温度(26℃、28℃、30℃、32℃、34℃)、培养基pH(4.5、5、5.5、6、6.5)条件下摇瓶培养16h测定菌株RNA含量，结果如图11和12。可见在培养温度为28℃、pH为6时，JNB-G03H8的RNA含量相较于其他水平为较高状态，故选择为最佳培养条件。

结合上述条件，进行最优碳源种类选择，从JNB-G03H8斜面上挑取一环菌泥于10mlYPD培养基中活化24h，吸取1ml菌液至100ml不同碳源成分培养基(培养基中分别含有质量比2％的葡萄糖、2％的海藻糖、2％的麦芽糖、2％的蔗糖、2％的乳糖、2％的果糖、2％的蜜糖)于不同28℃、培养基pH为6的条件下摇瓶培养16h测定菌株RNA含量，如图10所示，即选择糖蜜为培养基优化碳源成分。

(2)Plackett-Burman试验

按照Plackett-Burman试验设计，把每个因素设计成高(+1)、低(-1)2个水平，RNA含量为响应值，利用Minitab11.0软件进行Plackett-Burman设计，见表3，从JNB-G03H8斜面上挑取一环菌泥于10ml YPD培养基中活化24h，吸取1ml菌液至100ml Plackett-Burman试验设计培养基中，调整pH为6，于温度为28℃、摇床转速180r/min培养16h测定菌株RNA含量，实验结果见表4，各因素效应分析见表5，故选取影响菌体RNA含量的显著水平最高(P＜0.05)的三个因素：糖蜜、(NH₄)₂SO₄、KH₂PO₃，进行最陡爬坡设计实验。

表3Plackett-Burman试验设计因素水平表

表4 12组Plackett-Burman试验设计结果表

表5以RNA为响应值的Plackett-Burman试验结果分析表

(3)最陡爬坡实验

根据表5得到的回归结果和各因素系数，糖蜜、(NH₄)₂SO₄和KH₂PO₄这三因素被认为是重要的变量。糖蜜、KH₂PO₄的系数为正，而(NH₄)₂SO₄的系数为负，即意味着增加糖蜜、KH₂PO₄的浓度并降低(NH₄)₂SO₄的浓度对RNA产生有积极影响。确定最陡爬坡实验的路径以识别变化变量的正确方向。实验设计和相应的结果显示在表6，其他因素的浓度水平固定为0如表6所示。菌株最高的RNA含量水平是在第7组，这意味着该点靠近最大值区域RNA。因此，选择该点作为Central Composite Design(CCD)的中心点以进一步优化。

表6最陡爬坡的实验设计和结果

(4)响应面分析试验设计及结果

根据最陡爬坡试验确定了重要因素添加量的取值区间，利用Design-Expert软件进行CCD中心组合的试验设计，以发酵培养16h后菌体中RNA含量为响应值，中心组合试验设计结果见表7，模型显著水平分析见表8。回归系数和相应的P值用于检查每个系数的显著性。这表明P值越小，相应系数的显著性越大。表8显示，(NH₄)₂SO₄对RNA产生有显著影响，而糖蜜和KH₂PO₄没有显著影响，而三个因素的二次项是有显著效果的。图13所示的预测值与实验值的关系图表明，RSM模型的所有预测值都接近实验值。

表7 CCD中心复合设计的实验设计和结果

表8 CCD中心复合设计的回归结果

三维响应面曲线用来反映两个因素之间的相互作用，从而获得最大的RNA产量(图14～16)。三维图和等高线图的形状显示了两个变量之间的相互作用。当试验变量的非编码值为：糖蜜4.84％，(NH₄)₂SO₄ 0.62％，KH₂PO₄ 0.72％，其他因素水平为：MgSO₄·7H₂O0.2％，FeSO₄·7H₂O 0.06g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.06g/L，酵母浸粉1％时，可获得最大核糖核酸产量，为15.84％。最终通过验证实验来验证模型的准确性：将菌株JNB-G03H8在YPD培养基中培养16h，将培养后得到的菌液按照1％比例接种至100mL的优化培养基中，在28℃，摇床180r/min条件下培养16h，测定菌株中的RNA含量。

结果显示，JNB-G03H8菌株RNA含量在生长过程中最高可达15.80％。

实施例5：含有菌株JNB-G03H8的微生物菌剂的制备

取400μL的菌株JNB-G03H8接种于20mL YPD液体培养基中，28℃下活化2至3代，待菌株JNB-G03H8达到10⁸cfu/mL以上活菌数时，5000～10000rpm下离心10～20min，去除上清液后，在无菌环境下依次加入缓冲液和，待细胞浓度不低于10⁶cfu/mL时，真空冷冻干燥处理得到固体菌剂。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims

1. 一株巴斯德酵母菌（Saccharomyces pastorianus），已于2021年6月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO. 22785。

2.含有权利要求1所述巴斯德酵母菌的微生物菌剂。

3.一种生产RNA的方法，其特征在于，将权利要求1所述巴斯德酵母菌加入培养基中，发酵生产RNA。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述培养基包括YPD培养基。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述培养基以葡萄糖、麦芽糖和/或糖蜜为碳源；所述葡萄糖、麦芽糖和/或糖蜜为培养基质量的2~5%。

6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述培养基中还含有质量比为0.5~1%的（NH₄）₂SO₄、0.4~0.8%的KH₂PO₄、0.1~0.3%的MgSO₄•7H₂O、0.02~0.1 g/L FeSO₄•7H₂O、0.02~0.1g/L ZnSO₄•7H₂O。

7. 根据权利要求3~6任一所述的方法，其特征在于，在26~28℃，pH5~6.5的条件下培养16-18 h。

8.权利要求1所述巴斯德酵母菌或是权利要求2所述微生物菌剂在制备食品、医药品、保健品、农业产品中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，利用所述巴斯德酵母菌发酵得到的核糖核酸制备鸟苷酸和肌苷酸。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述巴斯德酵母菌用于肉类加工或调味料的制备。

11.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述巴斯德酵母菌用于鱼类加工或调味汁的制备。

12.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述巴斯德酵母菌用于罐头生产。

13.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述巴斯德酵母菌用于酱油、味精或卤料的制备。