CN109207386B - 酿酒酵母菌株、及生产高核酸酵母的方法和应用 - Google Patents

酿酒酵母菌株、及生产高核酸酵母的方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株酿酒酵母菌株、及生产高核酸酵母的方法和应用。本发明提供了一株酿酒酵母属菌株d8.8(Saccharomyces cerevisiae d8.8)菌种，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2017148。同时还提供了利用该菌株发酵得到的微生物菌剂以及生产酵母菌的方法。所述方法包括将菌株d8.8分别进行摇瓶培养、种子培养、初级发酵、一级发酵、二级发酵和商品发酵，使得最终酵母浓度为180‑240g/L。本发明利用酵母菌株进行工业化发酵生产，得到酵母菌体内核酸含量达菌体干重的20％以上，提高了酵母菌内核酸的含量，从而降低了工业化生产成本。

Description

酿酒酵母菌株、及生产高核酸酵母的方法和应用
技术领域
本发明涉及微生物应用技术领域，具体涉及一株酿酒酵母菌株、及生产高核酸酵母的方法和应用。
背景技术
酵母核酸是从天然酵母中提取的核糖核酸，目前主要应用于医药、保健食品以及婴幼儿食品中，目前国家法律法规规定，只能从酿酒酵母中或克鲁维酵母中提取核糖核酸，但这两种酵母菌体内的核酸含量都很低。申请公布号为CN1019286A的里面提到一种高核酸酿酒酵母菌种的核酸含量在12-14％左右。
申请公布号为CN102559522A的里面提一种高核酸面包酵母及其制备方法，该菌种核酸含量在20％。
申请公布号为CN103820337A里面提到一种高核酸酿酒酵母菌种，酵母菌体内的RNA含量经过诱变后在摇瓶阶段含量达17.5％，但没有进入工业化生产。
发明内容
本发明解决的现有技术的问题是：利用现有的酵母菌株进行大规模工业化生产，其获得的酵母菌的核酸含量不高，不能满足大规模工业化生产的需求，这些工业化生产获得的酵母菌，由于核酸含量不高，在应用于医药、保健食品或者婴幼儿食品中时，增加了相应的生产成本。
本发明通过选育获得了一株高产核酸的酿酒酵母菌种，并通过特殊生产工艺使酵母的菌体量更高、酵母内的核酸含量也得到大幅提高，菌体内核酸含量达24％，提高了酵母内核酸含量，从而降低了工业化生产成本。
本发明是安琪酵母股份有限公司选育一株高核酸酿酒酵母菌种，并借助工艺发酵获得高核酸的酵母菌体，提高了菌体内的核酸含量，优点是可以以低成本的工业化生产来获取高核酸酵母菌体。
具体来说，本发明提出了如下技术方案。
第一方面，本发明提供了一种酿酒酵母属菌株d8.8(Saccharomycescerevisiaed8.8)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M 2017148。
第二方面，本发明提供了以上所述的酿酒酵母属菌株d8.8在生产高核酸酵母方面的应用，所述高核酸酵母是指核酸含量为酵母菌干重的20％以上，优选为24％以上。
第三方面，本发明提供了一种微生物菌剂，所述微生物菌剂利用权利要求1所述的酿酒酵母属菌株d8.8发酵得到，其活性成分为权利要求1所述的酿酒酵母属菌株d8.8。
优选的，根据以上所述的微生物菌剂，所述微生物菌剂含有以上所述的酿酒酵母属菌株d8.8为10亿个/g以上。
第四方面，本发明提供了一种利用酿酒酵母属菌株d8.8(Saccharomycescerevisiaed8.8)菌株发酵生产酵母菌的方法，包括如下步骤：
(1)摇瓶培养：将酵母菌株接种在含糖量为5-20重量％的培养液中培养，得到摇瓶种子培养液，所述酵母菌株为酿酒酵母属菌株d8.8(Saccharomyces cerevisiaed8.8)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M 2017148；
(2)种子培养：将步骤(1)得到的摇瓶种子培养液接入含糖量为5-20重量％的培养液中培养，得到种子培养液；
(3)初级发酵：将步骤(2)得到的种子培养液接种到含糖量为15-30重量％的初级发酵罐中培养，得到初级发酵培养液；
(4)一级发酵：将步骤(3)得到的初级发酵培养液接到一级发酵罐中培养，得到一级发酵液；
(5)二级发酵：将步骤(4)得到的一级种子发酵液接种入到二级发酵罐中培养，得到二级发酵液，然后分离得到的酵母乳；
(6)商品发酵：将步骤(5)得到的酵母乳接于商品发酵罐中进行发酵培养，至最终酵母浓度为180-240g/L，得到酵母菌。
优选的，根据以上所述的方法，步骤(3)中初级发酵罐的体积为15-30m3。
优选的，根据以上所述的方法，步骤(4)一级发酵罐体积为50-100m3。
优选的，根据以上所述的方法，步骤(5)中二级发酵罐的体积为200m3-500m3。
优选的，根据以上所述的方法，步骤(6)中品发酵罐的体积为200m3-500m3。
优选的，根据以上所述的方法，步骤(1)-步骤(6)中培养温度为28-35℃，pH值为4.3-6.2。
优选的，根据以上所述的方法，步骤(1)-步骤(6)中培养温度为30-33℃，pH值为4.8-5.8。
优选的，根据以上所述的方法，
步骤(3)中培养过程中通入无菌空气，无菌空气的流速为每1m3培养液对应12-30m3空气/小时；
步骤(4)中培养过程中通入无菌空气，无菌空气的流速为每1m3培养液对应14-35m3空气/小时；
步骤(5)培养过程中通入无菌空气，无菌空气的流速为每1m3培养液对应70-150m3空气/小时；
步骤(6)中培养过程中通入无菌空气，无菌空气的流速为每1m3培养液对应70-150m3空气/小时。
优选的，根据以上所述的方法，步骤(6)培养过程中控制发酵液中乙醇的含量在0.28重量％以下。
优选的，根据以上所述的方法，步骤(4)(5)(6)发酵过程中，分别通过补料流加的方式加入氮源、磷源和含糖量为20-50％的碳源；优选地，所述氮源折合N元素含量为15-17％；所述磷源折合P2O5浓度为10-13％；所述碳源为糖蜜。
优选的，根据以上所述的方法，所述氮源选自硫酸铵、磷酸氢铵、氨水、磷酸铵、磷酸氢铵或磷酸氢二铵中的一种或两种以上；所述磷源选自磷酸、磷酸铵、磷酸二氢钾、磷酸氢铵或磷酸氢二铵中的一种或两种以上。
第五方面，本发明提供了以上任一项所述的方法生产得到的酵母菌，所述酵母菌中核酸含量为酵母菌干重的20％以上，优选为24％以上。
第六方面，本发明提供了以上所述的微生物菌剂以及以上所述的酵母菌在医药、保健食品或婴幼儿食品领域中的应用。
本发明所取得的有益效果是：本发明利用酵母菌株进行发酵生产，得到菌体内核酸含量达20％以上，甚至是24％以上的酵母菌，提高了酵母菌内的核酸含量，降低了工业化生产成本。
菌株保藏信息
本发明所用的菌种酿酒酵母属菌株d8.8(Saccharomyces cerevisiae d8.8)于2017年03月29日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M2017148，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，邮政编码：430072；电话：027-68754052。
具体实施方式
如上所述，本发明是安琪酵母股份有限公司选育一株酿酒酵母菌种，该菌株从老面团(老面团是发面用的面种子，即发面蒸馒头时剩下的一小面团，由于里面含有酵母菌，可以在下次发面时发面用)中得到，而且通过光学显微镜观察，该酿酒酵母菌株，呈现椭球形，以出芽方式无性繁殖；在固体培养基平板上28℃培养24h后，为乳白色，不透明，圆形菌落。通过常规形态观察、生理生化试验，然后借助PCR技术通过鉴定26S rDNAD1/D2区基因序列，确定本发明菌株为酿酒酵母属菌株。
该菌种酿酒酵母属菌株d8.8(Saccharomyces cerevisiae d8.8)于2017年03月29日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M 2017148。
利用该酵母菌株通过小罐培养、一级发酵罐培养、二级发酵罐培养、以及商品发酵罐培养，生产得到高核酸酵母。
在一种优选实施方式中，利用以上所述的酿酒酵母属菌株d8.8(Saccharomyclescerevisiaed8.8)菌株发酵生产酵母菌的方法，包括如下步骤：
(1)摇瓶培养：将酵母菌株接种在含糖量为5-20重量％的培养液中培养，得到摇瓶种子培养液；
(2)种子培养：将步骤(1)得到的摇瓶种子培养液接入含糖量为5-20重量％的培养液中培养，得到种子培养液；
(3)初级发酵：将步骤(2)得到的种子培养液接种到体积为15-30m3的初级发酵罐中培养，得到初级发酵培养液，其中初级发酵罐中含有糖含量为15-30重量％的初级发酵液；
(4)一级发酵：将步骤(3)得到的初级发酵培养液接到体积为50-100m3的一级发酵罐培养，得到一级种子发酵液；
(5)二级发酵：将步骤(4)得到的一级种子发酵液接种到体积为200m3-500m3的二级发酵罐培养，分离得到的酵母乳；
(6)商品发酵：将步骤(5)得到的酵母乳接于体积为200m3-500m3的商品发酵罐进行发酵培养，使得最终酵母浓度为180-240g/L。
其中，在一种优选实施方式中，步骤(1)中培养液中含有糖、酵母浸粉、钾盐和镁盐。更优选，以重量份计，所述糖为5-20份、酵母浸粉为1-3份、钾盐为0.5-2份和镁盐为0.5-2份。
在一种优选实施方式中，步骤(2)中培养液中含有糖、酵母浸粉、钾盐和镁盐。更优选，以重量份计，所述糖为375-1500份、酵母浸粉为150-300份、钾盐为5-10份和镁盐为5-10份。
在一种优选实施方式中，步骤(3)中初级发酵液中含有糖、铵盐、镁盐、锌盐，所述铵盐、镁盐和锌盐优选为硫酸铵、硫酸镁和硫酸锌；以重量份计，所述糖为400-1500份、铵盐为25-100份、镁盐为2-20份和锌盐2-10份。
在一种优选实施方式中，步骤(4)、步骤(5)和步骤(6)中通过补料的方式流加含有氮源、碳源和磷源的培养基，所述碳源优选为20％-50％的糖蜜。
在一种优选实施方式中，步骤(4)中一级发酵罐中的培养液中包括糖蜜、硫酸铵和磷酸二氢铵。
在一种优选实施方式中，步骤(5)中二级发酵罐中的培养液中包括有糖蜜、硫酸铵、磷酸二氢铵、硫酸镁和硫酸锌。
在一种优选实施方式中，步骤(6)中商品发酵罐中的培养液中包括有糖蜜、硫酸铵、硫酸镁、硫酸锌、硫酸亚铁、酵母浸粉、磷酸二氢铵、磷酸氢二钾和甲酸钠。
下面对本实施例所用的原料及设备的生产厂家，以及产品分析使用的设备和分析方法进行说明如下，其中所述的化学物质没有标明的均为常规试剂的化学纯级别。其中，实施例和对比例中所用到的原料的信息如下表所示。
表1 本发明所用到的原料和仪器的信息
Figure BDA0001337273340000061
Figure BDA0001337273340000071
实施例一
(一)高核酸酵母菌的发酵生产
本发明提供了一种利用酿酒酵母属酵母菌株d8.8生产酵母菌的方法，包括如下步骤：
采用酿酒酵母菌种酿酒酵母d8.8(Saccharomyces cerevisiae d8.8)保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC M2017148。通过光学显微镜观察，该酿酒酵母菌株细胞直径约4-6μm，呈现椭球形，以出芽方式无性繁殖；在固体培养基平板上28℃培养24h后，为乳白色，不透明，圆形菌落。
利用所述菌株培养活化后，依次经过250mL摇瓶培养、10L小罐培养、15m3发酵罐培养、60m3一级种子发酵罐培养、300m3二级种子发酵罐培养以及300m3商品发酵培养(商品发酵是指初始发酵阶段湿重达到50-60g/L)，工业化生产得到的酵母菌。
实验过程中将保藏的甘油菌接种到PDA琼脂培养基斜面上，在30℃培养48h，按照如下步骤进行工业化生产。其中mL代表毫升、℃代表摄氏度、h代表小时、L代表升、g代表克、kg代表千克、m3代表立方米。
(1)250mL摇瓶培养步骤如下：斜面菌种接种到250mL摇瓶，在30℃中静置培养24h。
其中，250mL培养基配方如下：蔗糖10g、磷酸二氢钾0.5g、硫酸镁0.5g、酵母浸粉2g以及无菌水100mL，调节pH值为4.8。
(2)10L小罐培养如下：将步骤(1)得到的摇瓶培养液转接于10L小罐中，在30℃温度下，10r/min搅拌培养24h，得到种子培养液。
其中，10升小罐培养基配方如下：蔗糖750g、酵母浸粉150g、磷酸二氢钾7.5g、硫酸镁7.5g和无菌水7.5L，调节pH值为4.7。
(3)15m3发酵罐培养：将步骤(2)得到的种子培养液转接于15m3种子发酵罐中，在30℃温度下，50r/min搅拌条件下培养18h，得到初级发酵培养液。培养过程通入无菌空气，无菌空气的流速为每1m3培养液对应10m3/h。
其中，15m3种子发酵罐中培养基的配方如下：含糖浓度为28％的糖蜜1.8m3(糖蜜加水稀释，参照中华人民共和国轻工行业标准QBT2684-2005测定总糖的浓度为30％，以下均采用相同的方法制备得到不同糖浓度的糖蜜)、无菌水6m3、硫酸铵25kg、硫酸镁5kg、硫酸锌2kg，调节pH值为4.5。
(4)60m3一级种子发酵罐培养：将步骤(4)得到的初级发酵培养液转于60m3一级种子发酵罐中进行补料种子发酵，在30℃温度，100r/min搅拌条件下发酵16小时，得到一级发酵培养液。发酵过程中通过无菌空气，无菌空气的流速为每1m3培养液对应30m3/h。
其中，60m3一级种子发酵罐中已装有的培养基的配方如下：无菌热水17m3、50L含糖浓度为28％糖蜜、折合N元素含量为16％的硫酸铵50L、折合P2O5浓度为12％的磷酸二氢铵30L，调节pH值为4.5；
同时，在培养过程中通过流加的方式，加入以下物质来进行补料：8.5m3含糖浓度为28％糖蜜、400L氮元素含量为16％的硫铵水溶液和500L折合P2O5浓度为12％的磷酸二氢铵水溶液。
(5)300m3二级种子发酵罐培养：将步骤(4)制备得到的一级发酵培养液转接于300m3二级种子发酵罐中进行流加补料发酵。在温度30℃，150r/min转速下发酵15小时后，得到二级发酵培养液。发酵过程中通过无菌空气，无菌空气的流速为每1m3培养液对应70m3/h。
然后进行洗涤分离得到重相酵母乳，得到45m3酵母乳，测定湿重在600-700g/L之间。将该酵母乳做为一代种子进行商品发酵培养。
其中，300m3二级种子发酵罐中已装有的培养基的配方为：无菌热水50m3、含糖浓度为28％糖蜜400L、N元素含量为16％的硫酸铵水溶液400L、折合P2O5浓度12％磷酸二氢铵水溶液200L、硫酸镁150kg、硫酸锌50kg，调节pH值为4.3；
同时，在培养过程中通过流加的方式，加入以下物质来进行补料：含糖浓度为28％糖蜜80m3、N元素含量为16％的硫酸铵水溶液3.4m3和P2O5浓度12％磷酸二氢铵水溶液3m3。
(6)300m3商品发酵培养：将上步分离洗涤得到的酵母乳接种于300m3的发酵罐，做商品发酵(商品发酵是指初始发酵阶段湿重达到50-60g/L发酵开始)进行连续流加补料，在通风为70-150m3/h、温度30℃，搅拌速度200r/min条件下，发酵培养13h，测得酵母湿重浓度为200g/L(酵母湿重计算方法：取一定量的发酵液，5000rpm离心3min后，去上清，称量沉淀重量(g/L))。发酵过程中通入无菌空气，无菌空气的流速为每1m3培养液对应70m3/h。
其中，300m3商品发酵罐中已装有的培养基的配方为：无菌热水82m3、含糖浓度为28％糖蜜600L、N元素含量为16％的硫铵水溶液200L、P2O5浓度12％磷酸二氢铵水溶液300L、硫酸镁150kg、硫酸锌50kg、酵母浸粉1.6kg、硫酸亚铁400g、甲酸钠900g、磷酸氢二钾900g，调节pH值为4.8；
同时，在商品发酵过程中通过流加的方式，加入以下物质进行补料：含糖浓度为28％的糖蜜84m3、N元素含量为16％的硫铵水溶液3.5m3和P2O5浓度12％磷酸二氢铵水溶液2.3m3。
(二)干物质和核酸含量的测定
按照如下方法对制备得到的酵母菌测定干物质以及核酸的含量。
1.磷的测定方法
其中，磷的测定方法使用中华人民共和国国家标准GB5009.87-2016食品安全国家标准食品中磷的测定中的第一法：钼蓝分光光度法进行测定，具体的测定方法如下：
(1)试剂
磷标准储备液(100.0mg/L)：准确称取在105℃下干燥至恒重的磷酸二氢钾0.4394g(精确0.0001g)置于烧杯中，加入适量水溶解并转移至1000ml容量瓶中，加水定容至刻度，混匀。
磷标准使用液(10.0mg/L):准确吸取10mL磷标准储备液(100.0mg/l)，置于100ml容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀。
(2)仪器和设备
分光光度计、可调式电热板或可调试电热炉、马弗炉、分析天平：感量0.1mg和1mg。
(3)分析步骤
湿法消解：称取试样0.2g-3g(精确至0.001g)或准确吸取液体试样0.500ml-5.00ml于带刻度消化管中，加入10ml硝酸，1ml高氯酸，2ml硫酸，在可调节式电炉上消解(参考条件：120℃/0.5h-1h、升至180℃/2h-4h、升至200℃-220℃)。若消化液呈棕色，再加硝酸，消解至冒白烟，消化液呈无色透明或略带黄色。消化液放冷，加20ml水，赶酸。放冷后转移至100ml容量瓶中，用水多次洗消化管，合并洗液于容量瓶中，加水至刻度，混匀。作为试样测定溶液。同时做试剂空白试验。亦可采用锥形瓶，于可调式电热板上，按上述方法进行湿法消解。
干法灰化：称取试样0.5g-5g(精确至0.001g)或准确吸取液体试样0.500ml-10.0ml，在火上灼烧成灰分，再于550℃下成灰分，直至灰分成白色为止，加入10ml盐酸溶液，在水浴蒸干，再加2ml盐酸溶液，用水分数次将残渣完全洗入100ml容量瓶中，并用水稀释至刻度摇匀，同时做试剂空白试验。
(4)测定：对苯二酚、亚硫酸钠还原法
标准曲线的制作：准确吸取磷标准使用液0ml、0.500ml、1.00ml、2.00ml、3.00ml、4.00ml、5.00ml，相当于含磷量0μg、5.00μg、10.0μg、20.0μg、30.0μg、40.0μg、50.0μg，分别置于25ml具塞试管中，依次加入2ml钼酸铵溶液(50g/L)摇匀，静置。加入1ml亚硫酸钠溶液(200g/l)、1ml对苯二酚溶液(5g/L)，摇匀。加水至刻度，混匀。静置0.5h后，用1cm比色杯，在660nm波长处，以零管作参比，测定吸光度，以测出的吸光度对磷含量绘制标准曲线。
试样溶液的测定：准确吸取试样溶液2.00ml及等量的空白溶液，分别置于25ml具塞试管中，加入2ml钼酸铵溶液(50g/l)摇匀，静置。加入1ml对苯二酚溶液(200g/l)、1ml对苯二酚溶液(5g/l)，摇匀。加水至刻度，混匀。静置0.5h后，用1cm比色杯，在660nm波长处，测定吸光度，与标准系列比较定量。
(5)分析结果的表述
试样中磷的含量按式
Figure BDA0001337273340000111
式中：
X─试样中磷含量，单位为毫克每百克或毫克每百毫升(mg/100g或mg/100ml)
m1─测定用试样溶液中磷的质量，单位为微克(μg)
m2─测定用空白溶液中磷的质量，单位为微克(μg)
V1─试样消化液定容体积，单位为毫升(ml)
m─试样称样量或移取体积，单位为克(g/或ml)
V2─测定用试样消化液的体积，单位为毫升(ml)
100─换算系数
1000─换算系数
2.干物质的检测
干物质检测方法使用企业标准酵母乳分析方法测定，将样品置于103±2℃烘箱内直接干燥，失去水分后，所得质量的百分数即为干物质百分含量。
用到的主要仪器为：电热干燥锅、分析天平，感量0.1mg；称量瓶40×25mm；干燥器，用变色硅胶做干燥剂。
具体的测定方法如下：
称取1.5g(称准至0.0002g)捣碎的鲜酵母，于已烘至恒重的称量瓶中，放入电热干燥箱烘3小时，移入干燥器中冷却至室温，称重。再放入电热干燥箱内，继续烘干1小时，称重，直至恒重。
按照如下公式进行结果计算：
Figure BDA0001337273340000121
式中：X------干物质的百分含量％
m------称量瓶的恒重质量g
m1------烘干前称量瓶加样品的恒重质量g
m2------烘干后称量瓶加样品的恒重质量g
3.核酸含量的测定
根据所测定的磷的含量，干物质的含量，按照如下公式计算核酸含量计算公式：
绝干酵母内核酸含量＝(磷含量×340/31)÷样品干物质％(公式3)
公式3中的绝干酵母指的是利用干物质的检测方法制备得到的酵母(即绝干酵母)，不同于干酵母。
例如在鲜酵母中，称取样品质量为0.5g，消化处理后作标准曲线，求得出样溶液中磷的质量(m1)为5.6μg，带入上述(公式,)计算出该样品磷含量为0.0056mg/100g。同时再次称取该样品1.5g烘干至恒重通过(公式2)计算得出样品的干物质为25.22％，那么该样品的核酸含量通过(公式3)计算得出24.35％。
实施例二
(一)高核酸酵母的制备
采用如下方法进行工业化生产，得到高核酸酵母。
(1)250mL摇瓶培养步骤如下：斜面菌种接种到250mL摇瓶，在35℃中静置培养20h。
其中，250mL培养基配方如下：蔗糖20g、磷酸二氢钾2g、硫酸镁2g、酵母浸粉1g以及无菌水100mL，调节pH值为6。
(2)10L小罐培养如下：将步骤(1)得到的摇瓶培养液转接于10L小罐中，在35℃温度下，20r/min搅拌培养20h，得到种子培养液。
其中，10升小罐培养基配方如下：蔗糖1.5Kg、酵母浸粉300g、磷酸二氢钾5g、硫酸镁5g和无菌水7.5L，调节pH值为6。
(3)15m3发酵罐培养：将步骤(2)得到的种子培养液转接于15m3种子发酵罐中，在35℃温度下，100r/min搅拌条件下培养15h，得到初级发酵培养液。培养过程通入无菌空气，无菌空气的流速为每1m3培养液对应20m3/h。
其中，15m3种子发酵罐中培养基的配方如下：含糖浓度为40％的糖蜜2m3、无菌水6m3、硫酸铵100kg、硫酸镁10kg、硫酸锌10kg，调节pH值为6。
(4)60m3一级种子发酵罐培养：将步骤(4)得到的初级发酵培养液转于60m3一级种子发酵罐中进行补料种子发酵，在35℃温度，150r/min搅拌条件下发酵10小时，得到一级发酵培养液。发酵过程中通过无菌空气，无菌空气的流速为每1m3培养液对应35m3/h。
其中，60m3一级种子发酵罐中已装有的培养基的配方如下：无菌热水17m3、50L含糖浓度为28％糖蜜、折合N元素含量为16％的硫酸铵50L、折合P2O5浓度为12％的磷酸二氢铵30L，调节pH值为6.0；
同时，在培养过程中通过流加的方式，加入以下物质来进行补料：8.5m3含糖浓度为40％糖蜜、400L氮元素含量为16％的硫铵水溶液和500L折合P2O5浓度为12％的磷酸二氢铵水溶液。
(5)300m3二级种子发酵罐培养:将步骤(4)制备得到的一级发酵培养液转接于300m3二级种子发酵罐中进行流加补料发酵。在温度35℃，200r/min转速下发酵10小时后，得到二级发酵培养液。发酵过程中通过无菌空气，无菌空气的流速为每1m3培养液对应150m3/h。
然后进行洗涤分离得到重相酵母乳，得到酵母乳，测定湿重在600-700g/L之间。将该酵母乳做为一代种子进行商品发酵培养。
其中，300m3二级种子发酵罐中已装有的培养基的配方为：无菌热水50m3、含糖浓度为28％糖蜜400L、N元素含量为16％的硫酸铵水溶液400L、折合P2O5浓度12％磷酸二氢铵水溶液200L、硫酸镁150kg、硫酸锌50kg，调节pH值为6；
同时，在培养过程中通过流加的方式，加入以下物质来进行补料：含糖浓度为40％糖蜜80m3、N元素含量为16％的硫酸铵水溶液3.4m3和P2O5浓度12％磷酸二氢铵水溶液3m3。
(6)300m3商品发酵培养：将上步分离洗涤得到的酵母乳接种于300m3的发酵罐，做商品发酵(商品发酵是指初始发酵阶段湿重达到50-60g/L)进行连续流加补料，在35℃温度，200r/min转速条件下，培养10h，测得酵母湿重浓度为180g/L。发酵过程中通入无菌空气，无菌空气的流加量为每1m3发酵液对应150m3/h。
其中，300m3商品发酵罐中已装有的培养基的配方为：无菌热水82m3、含糖浓度为28％糖蜜600L、N元素含量为16％的硫铵水溶液200L、P2O5浓度12％磷酸二氢铵水溶液300L、硫酸镁150kg、硫酸锌50kg、酵母浸粉1.6kg、硫酸亚铁400g、甲酸钠900g、磷酸氢二钾900g，调节pH值为6.0；
同时，在商品发酵过程中通过流加的方式，加入以下物质进行补料：含糖浓度为40％的糖蜜84m3、N元素含量为16％的硫酸铵水溶液3.5m3和P2O5浓度12％磷酸二氢铵水溶液2.3m3。
(二)干物质和核酸含量的测定
按照与实施例一相同的方法，对制备得到的酵母测定干物质和核酸的含量，测定结果见表2。
实施例三
(一)高核酸酵母的制备
采用如下方法进行工业化生产，得到高核酸酵母。
(1)250mL摇瓶培养步骤如下：斜面菌种接种到250mL摇瓶，在28℃中静置培养30h。
其中，250mL培养基配方如下：蔗糖5g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁1g、酵母浸粉3g以及无菌水100mL，调节pH值为5.5。
(2)10L小罐培养如下：将步骤(1)得到的摇瓶培养液转接于10L小罐中，在28℃温度下，15r/min搅拌培养30h，得到种子培养液。
其中，10升小罐培养基配方如下：蔗糖375Kg、酵母浸粉200g、磷酸二氢钾10g、硫酸镁10g和无菌水7.5L，调节pH值为5.5。
(3)15m3发酵罐培养：将步骤(2)得到的种子培养液转接于15m3种子发酵罐中，在28℃温度下，75r/min搅拌条件下培养25h，得到初级发酵培养液。培养过程通入无菌空气，无菌空气的流速为每1m3培养液对应30m3/h。
其中，15m3种子发酵罐中培养基的配方如下：含糖浓度为60％的糖蜜2m3、无菌水6m3、硫酸铵25kg、硫酸镁20kg、硫酸锌5kg，调节pH值为5.5。
(4)60m3一级种子发酵罐培养：将步骤(4)得到的初级发酵培养液转于60m3一级种子发酵罐中进行补料种子发酵，在28℃温度，200r/min搅拌条件下发酵10小时，得到一级发酵培养液。发酵过程中通过无菌空气，无菌空气的流速为每1m3培养液对应14m3/h。
其中，60m3一级种子发酵罐中已装有的培养基的配方如下：无菌热水17m3、50L含糖浓度为28％糖蜜、折合N元素含量为16％的硫酸铵50L、折合P2O5浓度为12％的磷酸二氢铵30L，调节pH值为5.5；
同时，在培养过程中通过流加的方式，加入以下物质来进行补料：2.3m3含糖浓度为40％糖蜜、1000L氮元素含量为16％的硫铵水溶液和1000L折合P2O5浓度为12％的磷酸二氢铵水溶液。
(5)300m3二级种子发酵罐培养:将步骤(4)制备得到的一级发酵培养液转接于300m3二级种子发酵罐中进行流加补料发酵。在温度28℃，100r/min转速下发酵20小时后，得到二级发酵培养液。发酵过程中通过无菌空气，无菌空气的流速为每1m3培养液对应100m3/h。
然后进行洗涤分离得到重相酵母乳，得到酵母乳，测定湿重在600-700g/L之间。将该酵母乳做为一代种子进行商品发酵培养。
其中，300m3二级种子发酵罐中已装有的培养基的配方为：无菌热水50m3、含糖浓度为28％糖蜜400L、N元素含量为16％的硫酸铵水溶液400L、折合P2O5浓度12％磷酸二氢铵水溶液200L、硫酸镁150kg、硫酸锌50kg，调节pH值为5.5；
同时，在培养过程中通过流加的方式，加入以下物质来进行补料：含糖浓度为28％糖蜜7m3、N元素含量为16％的硫酸铵水溶液2.8m3和P2O5浓度12％磷酸二氢铵水溶液2.5m3。
(6)300m3商品发酵培养：将上步分离洗涤得到的酵母乳接种于300m3的发酵罐，做商品发酵，同时进行连续流加补料，在28℃温度，100r/min条件下，培养20h，测得酵母湿重浓度为240g/L。发酵过程中通入无菌空气，无菌空气的流加量为每1m3发酵液对应100m3/h。
其中，300m3商品发酵罐中已装有的培养基的配方为：无菌热水82m3、含糖浓度为28％糖蜜600L、N元素含量为16％的硫铵水溶液200L、P2O5浓度12％磷酸二氢铵水溶液300L、硫酸镁150kg、硫酸锌50kg、酵母浸粉1.6kg、硫酸亚铁400g、甲酸钠900g、磷酸氢二钾900g，调节pH值为5.5；
同时，在商品发酵过程中通过流加的方式，加入以下物质进行补料：含糖浓度为40％的糖蜜8m3、N元素含量为16％的硫酸铵水溶液2.5m3和P2O5浓度12％磷酸二氢铵水溶液4.5m3。
(二)干物质和核酸含量的测定
按照与实施例一相同的方法，对制备得到的酵母测定干物质和核酸的含量，测定结果见表2。
实施例四
(一)高核酸酵母的制备
采用如下方法进行工业化生产，得到高核酸酵母。
(1)250mL摇瓶培养步骤：同实施例一。
(2)10L小罐培养：同实施例一。
(3)15m3发酵罐培养：同实施例一。
(4)60m3一级种子发酵罐培养：同实施例一。
(5)300m3二级种子发酵罐培养：同实施例一。
(6)300m3商品发酵培养：将步骤(5)分离洗涤得到的酵母乳接种于300m3的发酵罐中，做商品发酵，进行连续流加补料，在30℃温度，150r/min条件下，培养15h，测得酵母湿重浓度为200g/L。发酵过程中通入无菌空气，无菌空气的流加量为每1m3发酵液对应100m3/h。
其中，300m3商品发酵罐中已装有的培养基的配方为：(商品发酵是指初始发酵阶段湿重达到50-60g/L)：无菌热水90m3、含糖浓度为28％糖蜜1000L、N元素含量为16％的硫铵水溶液400L、P2O5浓度12％磷酸二氢铵水溶液200L、硫酸镁100kg、硫酸锌100kg、酵母浸粉1kg、硫酸亚铁1kg、甲酸钠1kg、磷酸氢二钾1kg，调节pH值为5；
同时，在商品发酵过程中通过流加的方式，加入以下物质进行补料：含糖浓度为28％的糖蜜8m3、N元素含量为16％的硫酸铵水溶液5m3和P2O5浓度12％磷酸二氢铵水溶液2m3。
(二)干物质和核酸含量的测定
按照与实施例一相同的方法，对制备得到的酵母测定干物质和核酸的含量，测定结果见表2。
对比例一
(一)高核酸酵母的制备
采用如下方法进行工业化生产，得到高核酸酵母。
(1)250mL摇瓶培养步骤：同实施例一。
(2)10L小罐培养：同实施例一。
(3)15m3发酵罐培养：同实施例一。
(4)60m3一级种子发酵罐培养：同实施例一。
(5)300m3二级种子发酵罐培养：同实施例一。
(6)300m3商品发酵培养：将步骤(5)分离洗涤得到的酵母乳接种于300m3的发酵罐中，在30℃温度，250r/min条件下做商品发酵，培养10h，发酵过程中通入无菌空气，无菌空气的流加量为每1m3发酵液对应200m3/h。
其中，300m3商品发酵罐中已装有的培养基的配方为：(商品发酵是指初始发酵阶段湿重达到50-60g/L)：无菌热水90m3、含糖浓度为28％糖蜜8m3、N元素含量为16％的硫铵水溶液5m3、P2O5浓度12％磷酸二氢铵水溶液2m3、硫酸镁100kg、硫酸锌100kg、酵母浸粉1kg、硫酸亚铁1kg、甲酸钠1kg、磷酸氢二钾1kg，调节pH值为5。
(二)干物质和核酸含量的测定
按照与实施例一相同的方法，对制备得到的酵母测定干物质和核酸的含量，测定结果见表2。
对比例二
(一)高核酸酵母的制备
采用如下方法进行工业化生产，得到高核酸酵母。
(1)250mL摇瓶培养步骤：同实施例一。
(2)10L小罐培养：同实施例一。
(3)15m3发酵罐培养：同实施例一。
(4)60m3一级种子发酵罐培养：将步骤(3)得到的初级发酵培养液转于60m3一级种子发酵罐中进行一级发酵，在28℃温度，200r/min搅拌条件下发酵10小时，得到一级发酵培养液。发酵过程中通过无菌空气，无菌空气的流速为每1m3培养液对应50m3/h。
其中，60m3一级种子发酵罐中已装有的培养基的配方如下：无菌热水17m3、2m3含糖浓度为28％糖蜜、折合N元素含量为16％的硫酸铵1000L、折合P2O5浓度为12％的磷酸二氢铵1000L，调节pH值为5.5。
(5)300m3二级种子发酵罐培养:将步骤(4)制备得到的一级发酵培养液转接于300m3二级种子发酵罐中进行二级种子发酵培养。在温度28℃，300r/min转速下发酵10小时后，得到二级发酵培养液。发酵过程中通过无菌空气，无菌空气的流速为每1m3培养液对应250m3/h。
然后进行洗涤分离得到重相酵母乳，得到酵母乳，测定湿重在600-700g/L之间。将该酵母乳做为一代种子进行商品发酵培养。
其中，300m3二级种子发酵罐中已装有的培养基的配方为：无菌热水50m3、含糖浓度为28％糖蜜7m3、N元素含量为16％的硫酸铵水溶液2.8m3、折合P2O5浓度12％磷酸二氢铵水溶液2.5m3、硫酸镁150kg、硫酸锌50kg，调节pH值为5.5。
(6)300m3商品发酵培养：将步骤(5)分离洗涤得到的酵母乳接种于300m3的发酵罐中，做商品发酵，在30℃温度，250r/min条件下，做商品发酵。发酵培养共计10h，发酵过程中通入无菌空气，无菌空气的流加量为每1m3发酵液对应200m3/h。
其中，300m3商品发酵罐中已装有的培养基的配方为：(商品发酵是指初始发酵阶段湿重达到50-60g/L)：无菌热水90m3、含糖浓度为28％糖蜜8m3、N元素含量为16％的硫铵水溶液5m3、P2O5浓度12％磷酸二氢铵水溶液2m3、硫酸镁100kg、硫酸锌100kg、酵母浸粉1kg、硫酸亚铁1kg、甲酸钠1kg、磷酸氢二钾1kg，调节pH值为5。
(二)干物质和核酸含量的测定
按照与实施例一相同的方法，对制备得到的酵母测定干物质和核酸的含量，测定结果见表2。
对比例三
对比例三与实施例一不同的是，对比例三未进行300m3商品发酵培养，其它均与实施例一相同。然后按照实施例一相同的方法，对制备得到的酵母测定干物质和核酸的含量，测定结果见表2。
表2不同实施例和对比例的酵母的测定结果
指标 干物质 核酸含量
实施例一 25.22％ 24.35％
实施例二 24.6％ 24.12％
实施例三 23.87％ 24.07％
实施例四 22.25％ 23.01％
对比例一 18.75％ 16.23％
对比例二 16.24％ 17.12％
对比例三 15.38％ 16.47％
从表2可以看出，通过实施例一到实施例四的工艺，发酵得到的酵母核酸含量和干物质的含量均在20％以上，核酸含量甚至得到了24.35％。而对比例一中，在商品发酵过程中，采用非流加培养的方式，制备得到的酵母核酸的含量仅为16.23％。对比例二中在一级种子发酵罐培养、二级种子发酵罐培养以及商品发酵过程中采用非流加培养的方式，制备得到的酵母核酸的含量仅为17％左右。对比例三中在经过了一级种子发酵培养和二级种子发酵培养后，并未进行商品发酵培养，制备得到的酵母核酸的含量仅为16％左右。
综上所述，利用本发明提供的菌株生产得到的酵母菌的核酸含量得到20％以上，甚至是24％以上。提高了酵母内核酸的含量，而且大大降低了工业化生产成本，可以满足大规模工业化生产的需求。而且通过本发明的菌株工业化生产获得的酵母菌，由于核酸含量高，在应用于医药、保健食品或者婴幼儿食品中时，能够大幅降低相应的生产成本，有着更广阔的应用市场和价值。
以上所述，仅是本发明实施的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡在本发明的精神和原则之内所做的修改、等同替换和改进等，均需要包含在本发明的保护范围之内。

Claims (17)

1.一种酿酒酵母属菌株d8.8（Saccharomyces cerevisiae），保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2017148。
2.权利要求1所述的酿酒酵母属菌株d8.8在生产高核酸酵母方面的应用，所述高核酸酵母是指核酸含量为酵母菌干重的20%以上。
3.根据权利要求2所述的酿酒酵母属菌株d8.8在生产高核酸酵母方面的应用，所述高核酸酵母是指核酸含量为酵母菌干重的24%以上。
4.一种微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂利用权利要求1所述的酿酒酵母属菌株d8.8发酵得到，其活性成分为权利要求1所述的酿酒酵母属菌株d8.8。
5.根据权利要求4 所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂含有权利要求1所述的酿酒酵母属菌株d8.8为10亿个/g以上。
6.一种利用权利要求1所述的酿酒酵母属菌株d8.8发酵生产酵母菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）摇瓶培养：将酵母菌株接种在含糖量为5-20重量%的培养液中培养，得到摇瓶种子培养液；
（2）种子培养：将步骤（1）得到的摇瓶种子培养液接入含糖量为5-20重量%的培养液中培养，得到种子培养液；
（3）初级发酵：将步骤（2）得到的种子培养液接种到含糖量为15-30重量%的初级发酵罐中培养，得到初级发酵培养液，初级发酵罐体积为15-30m3；
（4）一级发酵：将步骤（3）得到的初级发酵培养液接到一级发酵罐中培养，得到一级发酵液，一级发酵罐体积为50-100m3；
（5）二级发酵：将步骤（4）得到的一级种子发酵液接种入到二级发酵罐中培养，得到二级发酵液，然后分离得到的酵母乳，二级发酵罐的体积为200m3-500m3；
（6）商品发酵：将步骤（5）得到的酵母乳接于商品发酵罐中进行发酵培养，至最终酵母浓度为180-240g/L，得到酵母菌，商品发酵罐的体积为200m3-500m3；
其中，步骤（1）-步骤（6）中培养温度为28-35℃，pH值为4.3-6.2；
步骤（3）中培养过程中通入无菌空气，无菌空气的流速为每1 m3培养液对应12-30m3空气/小时；
步骤（4）中培养过程中通入无菌空气，无菌空气的流速为每1m3培养液对应14-35m3空气/小时；
步骤（5）培养过程中通入无菌空气，无菌空气的流速为每1 m3培养液对应70-150m3空气/小时；
步骤（6）中培养过程中通入无菌空气，无菌空气的流速为每1 m3培养液对应70-150m3空气/小时；步骤（6）培养过程中控制发酵液中乙醇的含量在0.28重量%以下;
并且，步骤（4）、（5）、（6）发酵过程中，分别通过补料流加的方式加入氮源、磷源和含糖量为20-50%的碳源。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（1）-步骤（6）中培养温度为30-33℃，pH值为4.8-5.8。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，步骤（6）培养过程中控制发酵液中乙醇的含量在0.28重量%以下。
9.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述氮源折合N元素含量为15-17%；所述磷源折合P2O5浓度为10-13%；所述碳源为糖蜜。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述氮源折合N元素含量为15-17%；所述磷源折合P2O5浓度为10-13%；所述碳源为糖蜜。
11.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述氮源选自硫酸铵、磷酸氢铵、氨水、磷酸铵、磷酸氢铵或磷酸氢二铵中的一种或两种以上；所述磷源选自磷酸、磷酸铵、磷酸二氢钾、磷酸氢铵或磷酸氢二铵中的一种或两种以上。
12.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述氮源选自硫酸铵、磷酸氢铵、氨水、磷酸铵、磷酸氢铵或磷酸氢二铵中的一种或两种以上；所述磷源选自磷酸、磷酸铵、磷酸二氢钾、磷酸氢铵或磷酸氢二铵中的一种或两种以上。
13.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述氮源选自硫酸铵、磷酸氢铵、氨水、磷酸铵、磷酸氢铵或磷酸氢二铵中的一种或两种以上；所述磷源选自磷酸、磷酸铵、磷酸二氢钾、磷酸氢铵或磷酸氢二铵中的一种或两种以上。
14.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述氮源选自硫酸铵、磷酸氢铵、氨水、磷酸铵、磷酸氢铵或磷酸氢二铵中的一种或两种以上；所述磷源选自磷酸、磷酸铵、磷酸二氢钾、磷酸氢铵或磷酸氢二铵中的一种或两种以上。
15.权利要求6-14中任一项所述的方法生产得到的酵母菌，其特征在于，所述酵母菌中核酸含量为酵母菌干重的20%以上。
16.权利要求15所述的方法生产得到的酵母菌，其特征在于，所述酵母菌中核酸含量为酵母菌干重的24%以上。
17.权利要求4或5所述的微生物菌剂以及权利要求15或16所述的酵母菌在制备医药、保健食品或婴幼儿食品领域中的应用。
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