CN112646904B - 唐菖蒲伯克霍尔德氏菌及米酵菌酸产毒株的检测方法、检测用荧光pcr引物和探针 - Google Patents
唐菖蒲伯克霍尔德氏菌及米酵菌酸产毒株的检测方法、检测用荧光pcr引物和探针 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种唐菖蒲伯克霍尔德氏菌及米酵菌酸产毒株的检测方法、检测用荧光PCR引物和探针，所述唐菖蒲伯克霍尔德氏菌检测用荧光PCR引物和探针包括PBA‑F引物，序列如SEQ ID NO:1所示；PBA‑R引物，序列如SEQ ID NO:2所示；PBA荧光探针，序列如SEQ ID NO:3所示。本发明的技术方案采用两步法对样本进行唐菖蒲伯克霍尔德氏菌及米酵菌酸产毒株实时荧光PCR检测，填补了分子检测的空白，可用于食品中唐菖蒲伯克霍尔德氏菌及米酵菌酸产毒株的快速筛查，此方法特异性好、重复性强、灵敏度高，能及时排查隐患，具有较强的实用价值。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种唐菖蒲伯克霍尔德氏菌及米酵菌酸产毒株的检测方法、检测用荧光PCR引物和探针。
背景技术
唐菖蒲伯克霍尔德氏菌是一类革兰氏阴性短杆菌，无芽孢，最适生长温度37℃，最适pH 5~6，在自然界中分布较为广泛。许多唐菖蒲伯克霍尔德氏菌无毒，但是某些致病变种会对动物或植物致病。目前研究发现该菌有4个致病变种，分别是B. gladioli pv.agaricicola、B.gladioli pv. alliicola、B. gladioli pv.gladioli和B.gladiolipv.cocovenenans，其中致病变种B. gladioli pv.cocovenenans产米酵菌酸毒素，该致病变种存在于谷物类发酵制品、变质银耳和木耳等食品中，另外三个变种对植物有致病性。
米酵菌酸是一种高度不饱和脂肪酸，强耐热毒素，120℃高温处理1h毒性仍然不会被破坏，唐菖蒲伯克霍尔德氏菌致病变种B. gladioli pv.cocovenenans最适合产该毒素的温度为26℃~28℃,在该温度下3~5天是其产毒素的高峰期。米酵菌酸在人体内主要通过消化道粘膜吸收，经过血液循环进入到身体，主要的靶器官是肝、脑、肾等器官，发病急，潜伏期多数为2~24h，至今没有文献报道相关有效解毒药。该菌种中毒有显著的地域特色，广西、云贵山区以及东北相关报道较多，这跟当地制作如吊浆粑、酵米面等食品有一定关系。2020年10月黑龙江鸡西市居民因食用被唐菖蒲伯克霍尔德氏菌（椰毒假单胞菌酵米面亚种）污染的当地特色食物酸汤子导致9人中毒并死亡，引起社会高度关注。
现有技术中，唐菖蒲伯克霍尔德氏菌常用的检测方法是GB 4789.29-2020《食品安全国家标准 食品微生物学检验 唐菖蒲伯克霍尔德氏菌（椰毒假单胞菌酵米面亚种）检验》，该标准未涉及分子领域，鉴定菌株是否产毒需要做产毒试验，检测周期较长。
发明内容
针对以上技术问题，本发明公开了一种唐菖蒲伯克霍尔德氏菌及米酵菌酸产毒株的检测方法、检测用荧光PCR引物和探针，能满足食品中唐菖蒲伯克霍尔德氏菌及米酵菌酸产毒株的快速检测要求。
对此，本发明采用的技术方案为：
一种唐菖蒲伯克霍尔德氏菌检测用荧光PCR引物和探针，其包括PBA-F引物，序列如SEQ ID NO:1所示；PBA-R引物，序列如SEQ ID NO:2所示；PBA荧光探针，序列如SEQ IDNO:3所示。
作为本发明的进一步改进，所述PBA荧光探针的3'端标记有BHQ、TAMRA、Eclipse、Dabcy或Lowa Black TM RQ中的一种荧光猝灭基团，5'端标记有FAM、JOE、TET、HEX、VIC、CY5或CY3中的一种荧光报告基团。
本发明公开了一种唐菖蒲伯克霍尔德氏菌米酵菌酸产毒株检测用荧光PCR引物和探针，其包括PBA-F引物，BA-F引物，序列如SEQ ID NO:4所示；BA-R引物，序列如SEQ ID NO:5所示；BA荧光探针，序列如SEQ ID NO:6所示。
作为本发明的进一步改进，所述BA荧光探针的3'端标记有BHQ、TAMRA、Eclipse、Dabcy或Lowa Black TM RQ中的一种荧光猝灭基团，5'端标记有FAM、JOE、TET、HEX、VIC、CY5或CY3中的一种荧光报告基团。
本发明公开了一种唐菖蒲伯克霍尔德氏菌及米酵菌酸产毒株检测用荧光PCR引物和探针，其包括如上所述的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌检测用荧光PCR引物和探针、如上所述的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌米酵菌酸产毒株检测用荧光PCR引物和探针。
作为本发明的进一步改进，所述菖蒲伯克霍尔德氏菌检测用荧光PCR引物和探针的使用浓度比为：PBA-F: PBA-R: PBA＝1: 1: 1。
作为本发明的进一步改进，所述唐菖蒲伯克霍尔德氏菌米酵菌酸产毒株检测用荧光PCR引物和探针的使用浓度比为：BA-F: BA-R: BA＝1: 1: 1。
本发明还公开了一种唐菖蒲伯克霍尔德氏菌及米酵菌酸产毒株的检测方法，其包括如下步骤：
步骤S1，提取样本中的DNA；
步骤S2，利用PBA-F引物和 PBA-R引物、以及探针PBA对步骤S1中提取的DNA进行荧光PCR扩增，根据PCR结果确定是否含有唐菖蒲伯克霍尔德氏菌；
步骤S3，利用BA-F引物和 BA-R引物、以及探针BA对步骤S1中提取的DNA进行荧光PCR扩增，根据PCR结果确定是否含有唐菖蒲伯克霍尔德氏菌产米酵菌酸毒株。
作为本发明的进一步改进，步骤S2中的荧光PCR反应体系为：PCR Mix（2×）10μL，20 μmol/L PBA-F引物和 PBA-R引物各0.5μL，20 μmol/L 探针PBA 0.5μL，模板2μL，添加无菌水至反应体系为20μL；
作为本发明的进一步改进，步骤S2中，荧光PCR扩增的条件为：95℃ 1min；95℃5s；60℃ 34s，40个循环。
作为本发明的进一步改进，步骤S3中的荧光PCR反应体系为：PCR Mix（2×）12.5μL，10 μmol/LBA-F引物和 BA-R引物各1.0μL，10 μmol/L 探针BA 1.0μL，模板5μL，添加无菌水至反应体系为25μL。
作为本发明的进一步改进，步骤S3中，荧光PCR扩增的条件为：95℃ 3min；95℃5s；60℃ 40s，40个循环。
作为本发明的进一步改进，步骤S2中，当Ct值≥40.0，判定样品结果为阴性；Ct值≤35.0，判定样品结果为阳性；当35.0<Ct值<40.0，样本重做，重做结果Ct值≥40.0者为阴性，否则为阳性。对于阳性结果，应参见GB 4789.29-2020做进一步的毒性试验。
作为本发明的进一步改进，步骤S3中，当Ct值≥40.0，判定样品结果为阴性；Ct值≤35.0，判定样品结果为阳性；当35.0<Ct值<40.0，样本重做，重做结果Ct值≥40.0者为阴性，否则为阳性。对于阳性结果，应参见GB 4789.29-2020做进一步的生化鉴定和报告。
当步骤S2得到的样品结果为阳性，且步骤S3得出的样品结果为阳性，则判断含有唐菖蒲伯克霍尔德氏菌米酵菌酸产毒株。
作为本发明的进一步改进，步骤S1中，采用煮沸裂解法提取样本中的DNA。具体而言，取增菌液1 mL，加到1.5 mL离心管中，12000 g离心2 min，吸弃上清；加入500 μL无菌水，混匀后12000 g离心2 min，吸弃上清；加入100 μL无菌水，沸水浴10 min，12000 g离心2min，取上清保存于-20℃备用以待检测。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明的技术方案采用两步法对样本进行唐菖蒲伯克霍尔德氏菌及米酵菌酸产毒株实时荧光PCR检测，填补了分子检测的空白，可用于食品中唐菖蒲伯克霍尔德氏菌及米酵菌酸产毒株的快速筛查，此方法特异性好、重复性强、灵敏度高，能及时排查隐患，具有较强的实用价值。
附图说明
图1是本发明实施例的荧光定量PCR特异性检测分析图。
图2是本发明实施例的荧光定量PCR灵敏度检测分析图。
图3是本发明实施例的荧光定量PCR的扩增曲线图。
具体实施方式
下面对本发明的较优的实施例作进一步的详细说明。
采用实时荧光PCR检测食品中唐菖蒲伯克霍尔德氏菌及米酵菌酸产毒株方法，其包括：
第一步，设计唐菖蒲伯克霍尔德氏菌检测用PCR引物和探针，对样本进行荧光PCR扩增，初步判断食品是否含有唐菖蒲伯克霍尔德氏菌；
第二步，设计唐菖蒲伯克霍尔德氏菌米酵菌酸检测用PCR引物和探针，对样本进行荧光PCR扩增，在第一步的基础上判断是否为产米酵菌酸毒株。
下面结合具体的实施例对上述方法及其效果进行具体的说明。
实施例1
食品中唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的检测。
（1）引物的设计与合成
设计和筛选唐菖蒲伯克霍尔德氏菌检测用特异性引物和 TaqMan探针，其序列为：
PBA-F引物：5'-GCTTCCGCTATCCAAATTACTACTTC-3'（如SEQ ID NO：1所示），
PBA-R引物：5'-ATGACAAATGTTCGAGTCAGTTGAC-3'（如SEQ ID NO：2所示），
探针PBA：5'-FAM-ATGACAAATGTTCGAGTCAGTTGAC-BHQ-3'（如SEQ ID NO：3所示）。
（2）样本DNA提取
采用煮沸裂解法提取DNA，取增菌液1 mL，加到1.5 mL离心管中，12000 g离心2min，吸弃上清；加入500 μL无菌水，混匀后12000 g离心2 min，吸弃上清；加入100 μL无菌水，沸水浴10 min，12000 g离心2 min，取上清保存于-20℃备用以待检测；也可使用商业化的DNA提取试剂盒并按其说明书操作。
（3）PCR条件的优化
利用PBA-F/R引物，PBA探针，以唐菖蒲伯克霍尔德氏菌CICC10574 DNA为模板，对荧光PCR反应的各条件进行优化，获得PCR扩增体系为：PCR Mix（2×）10 μL，20 μmol/L上游引物和下游引物各0.5μL，20μmol/L 探针0.5μL，模板2μL，添加无菌水至反应体系为20μL；扩增程序为95℃ 预变性1min；95℃变性 5s；60℃ 34s，40个循环。
（4）特异性分析
采用煮沸裂解法提取唐菖蒲伯克霍尔德氏菌（CICC10574）、2株实验室分离唐菖蒲伯克霍尔德氏菌株、3株洋葱伯克霍尔德菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、单核细胞增生李斯特菌、荧光假单胞菌和大肠埃希氏菌DNA，采用上述优化的PCR条件进行荧光PCR特异性检测，得到的结果如图1所示。
图1中，唐菖蒲伯克霍尔德氏菌有明显的扩增曲线生成，洋葱伯克霍尔德菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、单核细胞增生李斯特菌、荧光假单胞菌、大肠埃希氏菌均无扩增，说明具有很高的特异性，可以用于样品中唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的检测。
（5）灵敏度分析
以唐菖蒲伯克霍尔德氏菌（CICC10574）DNA模板为原液，采用ddH2O进行10倍梯度稀释，最终稀释为1.12*102 ng/μL~1.12*10-8 ng/μL，按照上述体系进行检测，得到的结果如图2所示。可见，建立的实时荧光PCR体系DNA检测下限为1.12*10-2 ng/μL。
当本实施例分析样品的结果为含有唐菖蒲伯克霍尔德氏菌，则进行实施例2，以判断是否含有唐菖蒲伯克霍尔德氏菌产米酵菌酸毒株。
实施例2
唐菖蒲伯克霍尔德氏菌产米酵菌酸毒株检测
（1）引物的设计与合成
设计唐菖蒲伯克霍尔德氏菌米酵菌酸毒株检测用引物和探针，建立区分产米酵菌酸/不产米酵菌酸的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的荧光PCR体系，其序列为：
BA-F引物：5'-CGATGATATAGCCGAGGTT-3'（如SEQ ID NO：4所示），
BA-R引物：5'-CAGGTTCCAGTGCCATTA-3'（如SEQ ID NO：5所示），
探针BA：5'-FAM-CGATGGTCCGTATCTCCTGCTTGTGC-BHQ-3'（如SEQ ID NO：6所示）。
（2）DNA提取
采用煮沸裂解法提取DNA，取增菌液1 mL，加到1.5 mL离心管中，12000 g离心2min，吸弃上清；加入500 μL无菌水，混匀后12000 g离心2 min，吸弃上清；加入100 μL无菌水，沸水浴10 min，12000 g离心2 min，取上清保存于-20℃备用以待检测；也可使用商业化的DNA提取试剂盒并按其说明书操作。
（3）PCR条件的优化
利用BA-F/R引物，BA探针，以唐菖蒲伯克霍尔德氏菌94806（该菌由实验室分离，经过GB4789.29鉴定产米酵菌酸） DNA为模板，对荧光PCR反应的各条件进行优化，获得PCR扩增体系为：PCR Mix（2×）12.5μL，10 μmol/L上游引物和下游引物各1.0μL，10μmol/L 探针1.0μL，模板5μL，添加无菌水至反应体系为25μL；扩增程序为95℃预变性 3min；95℃变性5s；60℃ 40s，40个循环。
（4）特异性分析
采用煮沸裂解法提取实验室分离的37株唐菖蒲伯克霍尔德氏菌DNA，采用上述优化的PCR条件进行荧光PCR特异性检测，结果如图3所示，图3中编号为94806、00746、83756、79123和86297共5株唐菖蒲伯克霍尔德氏菌有明显的扩增曲线生成，其余32株均无扩增。该结果与采用标准GB5009.189检测的米酵菌酸结果一致，这说明建立的荧光PCR体系具有很好的特异性，能够有效地用于唐菖蒲伯克霍尔德氏菌米酵菌酸产毒株的检测。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 深圳市计量质量检测研究院
<120> 一种唐菖蒲伯克霍尔德氏菌及米酵菌酸产毒株的检测方法、检测用荧光PCR引物和探针
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcttccgcta tccaaattac tacttc 26
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgacaaatg ttcgagtcag ttgac 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgacaaatg ttcgagtcag ttgac 25
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgatgatata gccgaggtt 19
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
caggttccag tgccatta 18
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cgatggtccg tatctcctgc ttgtgc 26
Claims (1)
1.一种食品中唐菖蒲伯克霍尔德氏菌及米酵菌酸产毒株的检测方法，其特征在于：其包括如下步骤：
步骤S1，提取食品样本中的DNA；
步骤S2，利用PBA-F引物和PBA-R引物、以及探针PBA对步骤S1中提取的DNA进行荧光PCR扩增，根据PCR结果确定是否含有唐菖蒲伯克霍尔德氏菌；
步骤S3，利用BA-F引物和BA-R引物、以及探针BA对步骤S1中提取的DNA进行荧光PCR扩增，根据PCR结果确定是否含有唐菖蒲伯克霍尔德氏菌产米酵菌酸毒株；
所述PBA-F引物的序列如SEQ ID NO:1所示；所述PBA-R引物的序列如SEQ ID NO:2所示；所述探针PBA的序列如SEQ ID NO:3所示；PBA-F引物、PBA-R引物和探针PBA的使用浓度比为：PBA-F:PBA-R:PBA＝1: 1: 1；
所述BA-F引物的序列如SEQ ID NO:4所示；所述BA-R引物的序列如SEQ ID NO:5所示；所述探针BA的序列如SEQ ID NO:6所示；BA-F引物、BA-R引物和探针BA的使用浓度比为：BA-F:BA-R:BA＝1: 1: 1；
所述探针PBA、探针BA的3 '端标记有BHQ、TAMRA、Eclipse、Dabcy或Lowa Black TM RQ中的一种荧光猝灭基团，5 '端标记有FAM、JOE、TET、HEX、VIC、CY5或CY3中的一种荧光报告基团；
所述步骤S2中的荧光PCR反应体系为：2×4 PCR Mix 10μL，20 μmol/L PBA-F引物和PBA-R引物各0.5μL，20 μmol/L探针PBA 0.5μL，模板2μL，添加无菌水至反应体系为20μL；荧光PCR扩增的条件为：95℃ 1min；95℃ 5s；60℃ 34s，40个循环；
所述步骤S3中的荧光PCR反应体系为：2× PCR Mix 12.5μL，10 μmol/LBA-F引物和BA-R引物各1.0μL，10 μmol/L探针BA 1.0μL，模板5μL，添加无菌水至反应体系为25μL；荧光PCR扩增的条件为：95℃ 3min；95℃ 5s；60℃ 40s，40个循环；
所述步骤S2中，当Ct值≥40 .0，判定样品结果为阴性；Ct值≤35 .0，判定样品结果为阳性；当35.0<Ct值<40 .0，样本重做，重做结果Ct值≥40.0者为阴性，否则为阳性；步骤S3中，当Ct值≥40.0，判定样品结果为阴性；Ct值≤35 .0，判定样品结果为阳性；当35 .0<Ct值<40.0，样本重做，重做结果Ct值≥40 .0者为阴性，否则为阳性；
当步骤S2得到的样品结果为阳性，且步骤S3得出的样品结果为阳性，则判断含有唐菖蒲伯克霍尔德氏菌米酵菌酸产毒株；
所述步骤S1中，采用煮沸裂解法提取样本中的DNA。
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