FI91193C - Menetelmä nesteessä olevan ligandin detektoimiseksi ja menetelmässä käyttökelpoinen välineistö - Google Patents

Menetelmä nesteessä olevan ligandin detektoimiseksi ja menetelmässä käyttökelpoinen välineistö Download PDF

Info

Publication number
FI91193C
FI91193C FI875070A FI875070A FI91193C FI 91193 C FI91193 C FI 91193C FI 875070 A FI875070 A FI 875070A FI 875070 A FI875070 A FI 875070A FI 91193 C FI91193 C FI 91193C
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
enzyme
ligand
inhibitor
liquid
modulator
Prior art date
Application number
FI875070A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI875070A (fi
FI875070A0 (fi
FI91193B (fi
Inventor
James P O'connell
Patrick D Mize
Original Assignee
Becton Dickinson Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Becton Dickinson Co filed Critical Becton Dickinson Co
Publication of FI875070A0 publication Critical patent/FI875070A0/fi
Publication of FI875070A publication Critical patent/FI875070A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI91193B publication Critical patent/FI91193B/fi
Publication of FI91193C publication Critical patent/FI91193C/fi

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/581—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with enzyme label (including co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or substrates)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C225/00—Compounds containing amino groups and doubly—bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton, at least one of the doubly—bound oxygen atoms not being part of a —CHO group, e.g. amino ketones
    • C07C225/02—Compounds containing amino groups and doubly—bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton, at least one of the doubly—bound oxygen atoms not being part of a —CHO group, e.g. amino ketones having amino groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton
    • C07C225/04—Compounds containing amino groups and doubly—bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton, at least one of the doubly—bound oxygen atoms not being part of a —CHO group, e.g. amino ketones having amino groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton the carbon skeleton being saturated
    • C07C225/06—Compounds containing amino groups and doubly—bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton, at least one of the doubly—bound oxygen atoms not being part of a —CHO group, e.g. amino ketones having amino groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton the carbon skeleton being saturated and acyclic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C45/00—Preparation of compounds having >C = O groups bound only to carbon or hydrogen atoms; Preparation of chelates of such compounds
    • C07C45/51—Preparation of compounds having >C = O groups bound only to carbon or hydrogen atoms; Preparation of chelates of such compounds by pyrolysis, rearrangement or decomposition
    • C07C45/511—Preparation of compounds having >C = O groups bound only to carbon or hydrogen atoms; Preparation of chelates of such compounds by pyrolysis, rearrangement or decomposition involving transformation of singly bound oxygen functional groups to >C = O groups
    • C07C45/512—Preparation of compounds having >C = O groups bound only to carbon or hydrogen atoms; Preparation of chelates of such compounds by pyrolysis, rearrangement or decomposition involving transformation of singly bound oxygen functional groups to >C = O groups the singly bound functional group being a free hydroxyl group
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C45/00—Preparation of compounds having >C = O groups bound only to carbon or hydrogen atoms; Preparation of chelates of such compounds
    • C07C45/51—Preparation of compounds having >C = O groups bound only to carbon or hydrogen atoms; Preparation of chelates of such compounds by pyrolysis, rearrangement or decomposition
    • C07C45/52—Preparation of compounds having >C = O groups bound only to carbon or hydrogen atoms; Preparation of chelates of such compounds by pyrolysis, rearrangement or decomposition by dehydration and rearrangement involving two hydroxy groups in the same molecule
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C45/00—Preparation of compounds having >C = O groups bound only to carbon or hydrogen atoms; Preparation of chelates of such compounds
    • C07C45/61—Preparation of compounds having >C = O groups bound only to carbon or hydrogen atoms; Preparation of chelates of such compounds by reactions not involving the formation of >C = O groups
    • C07C45/63—Preparation of compounds having >C = O groups bound only to carbon or hydrogen atoms; Preparation of chelates of such compounds by reactions not involving the formation of >C = O groups by introduction of halogen; by substitution of halogen atoms by other halogen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C45/00—Preparation of compounds having >C = O groups bound only to carbon or hydrogen atoms; Preparation of chelates of such compounds
    • C07C45/61—Preparation of compounds having >C = O groups bound only to carbon or hydrogen atoms; Preparation of chelates of such compounds by reactions not involving the formation of >C = O groups
    • C07C45/67—Preparation of compounds having >C = O groups bound only to carbon or hydrogen atoms; Preparation of chelates of such compounds by reactions not involving the formation of >C = O groups by isomerisation; by change of size of the carbon skeleton
    • C07C45/673—Preparation of compounds having >C = O groups bound only to carbon or hydrogen atoms; Preparation of chelates of such compounds by reactions not involving the formation of >C = O groups by isomerisation; by change of size of the carbon skeleton by change of size of the carbon skeleton
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C49/00—Ketones; Ketenes; Dimeric ketenes; Ketonic chelates
    • C07C49/04—Saturated compounds containing keto groups bound to acyclic carbon atoms
    • C07C49/16—Saturated compounds containing keto groups bound to acyclic carbon atoms containing halogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C49/00—Ketones; Ketenes; Dimeric ketenes; Ketonic chelates
    • C07C49/04—Saturated compounds containing keto groups bound to acyclic carbon atoms
    • C07C49/17—Saturated compounds containing keto groups bound to acyclic carbon atoms containing hydroxy groups
    • C07C49/173—Saturated compounds containing keto groups bound to acyclic carbon atoms containing hydroxy groups containing halogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C49/00—Ketones; Ketenes; Dimeric ketenes; Ketonic chelates
    • C07C49/20—Unsaturated compounds containing keto groups bound to acyclic carbon atoms
    • C07C49/24—Unsaturated compounds containing keto groups bound to acyclic carbon atoms containing hydroxy groups
    • C07C49/245—Unsaturated compounds containing keto groups bound to acyclic carbon atoms containing hydroxy groups containing six-membered aromatic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/06—Phosphorus compounds without P—C bonds
    • C07F9/08—Esters of oxyacids of phosphorus
    • C07F9/09—Esters of phosphoric acids
    • C07F9/091—Esters of phosphoric acids with hydroxyalkyl compounds with further substituents on alkyl
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/06—Phosphorus compounds without P—C bonds
    • C07F9/08—Esters of oxyacids of phosphorus
    • C07F9/09—Esters of phosphoric acids
    • C07F9/12—Esters of phosphoric acids with hydroxyaryl compounds
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
    • G01N33/542—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with steric inhibition or signal modification, e.g. fluorescent quenching
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/81—Packaged device or kit
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/807—Apparatus included in process claim, e.g. physical support structures
    • Y10S436/808—Automated or kit

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)
  • Investigating Or Analyzing Non-Biological Materials By The Use Of Chemical Means (AREA)

Description

91193 i
MenetelmM nesteesså olevan ligandin detektoimiseksi ja me-netelmåsså kSyttokelpoinen vålineist6 TSmå keksinto koskee menetelmåå nesteessM olevan 5 ligandin detektoimiseksi ja menetelmSsså kSytettSvSS våli-neistoå. Erityisesti keksinto koskee menetelmåå ja våli-neistoå immuunimååritystå vårten, jossa detektoitavissa oleva signaali saadaan aikaan moduloimalla indikaattori-reaktion entsymaattista katalyysiå.
10 On kehitetty sekå nopeita ettå herkkiå mååritysjår- jestelmiå juoksevassa nåytteesså olevan aineen pitoisuuden måårittåmiseksi. Immuunimååritykset perustuvat antigeenin tai hapteenin sitoutumiseen spesifiseen vasta-aineeseen, ja ne ovat olleet erityisen kåyttokelpoisia, koska ne ovat 15 hyvin spesifisiå ja herkkiå. Nåisså måårityksisså kåytetåån yleenså jotakin edellå mainituista reagensseista leimatussa muodossa, jolloin leimattua reagenssia kutsutaan usein merkkiaineeksi. Immuunimååritysmenettelyt voidaan toteut-taa liuoksessa tai kiinteållå alustalla ja ne voivat olla 20 joko heterogeenisia, jolloin ne vaativat sidotun merkkiai-neen erottamista vapaasta (sitoutumattomasta) merkkiainees-ta, tai homogeenisia, jolloin erotusvaihetta ei tarvita.
Radioimmuunimåårityksisså (RIA-menetelmisså) kåytetåån leimausaineina radioisotooppeja, niillå saadaan aikaan 25 hyvå herkkyys ja toistettavuus ja ne voidaan automatisoida suurten nåytemåårien kåsittelemiseksi nopeasti. Isotoopit ovat kuitenkin kalliita, niiden såilyvyys on suhteellisen heikko, ne vaativat kalliita ja monimutkaisia vålineitå, ja niiden kåsittelysså ja håvittåmisesså tåytyy noudattaa 30 pitkalle meneviå turvallisuustoimenpiteita.
Fluoroimmuunimåårityksesså (FIA) kåytetåån fluoro-kromeja leimausaineina, ja sillå saadaan aikaan leimaus-aineen suora detektointi. Tunnetuilla homogeenisilla FIA-menetelmillå, joissa kåytetåån orgaanisia fluorokromeja, 35 kuten fluoreseiini- tai rodamiinijohdannaisia, ei kuiten-kaan ole saavutettu RIA:n suurta herkkyyttå, mikå johtuu suurelta osin valon siroamisesta mååritysvåliaineeseen suspendoituneista epåpuhtauksista ja mååritysvåliaineen 2 sisåltåmien muiden fluoresoivien aineiden emittoimasta taustafluoresenssista.
Myos entsyymejå on kåytetty merkkiaineina immuuni-måårityksisså. Tavanomaisessa entsyymi-immuunimaårityk-5 sesså (EIA) entsyymi kytketåån kovalenttisesti spesifises-ti sitoutuvan antigeeni-vasta-aine -parin toiseen komponentt iin, ja tuloksena olevan entsyymikonjugaatin annetaan reagoida substraatin kanssa, jolloin muodostuu signaali, joka detektoidaan ja mitataan. Kun signaali on vårinmuutos, 10 on paljain silmin tehtåvå detektointi rajoittunutta, koska yksilo keskimåårin pystyy detektoimaan kromoforien låsnå-olon vain suunnilleen pitoisuuteen 10'1 - 10*6 mol/1 asti.
ΕΙΆ:η herkkyyttå voidaan usein parantaa spektrofo-tometrisin menetelmin; nåmå menettelyt vaativat kuitenkin 15 kalliita laitteita. Eråån toisen låhestymistavan mukaisesti herkkyyttå voidaan parantaa erilaisin vahvistusmenetel-min. On julkistettu yhden entsyymin yhteydesså kåytettåviå vahvistusmenetelmiå, joissa on detektoitu ligandeja, joita esiintyy pitoisuuksina 10‘6 - 10'10 mol/1. Nåmå menetel-20 måt ovat kuitenkin olleet yleenså epåtyydyttåviå ligandi-pitoisuuden ollessa alle 10*11 mol/1. Kaskadivahvistusme-nettelyisså suurennetaan detektoitavissa olevien (yleenså vårillisten) molekyylien lukumååråå kayttåmållå kahta tai useampaa entsyymiå tai entsyymijohdannaista. US-patentti-25 julkaisussa 4 463 090 (Harris) kuvataan kaskadivahvistus-immuunimååritystå, jossa suurimolekyylinen aktivaattori, kuten ligandiin kytketty entsyymi tai proentsyymi, aktivoi toisen entsyymin, joka reagoi substraatin kanssa, jolloin muodostuu detektoitavissa oleva signaali, tai joka puoles-30 taan aktivoi kolmannen entsyymin.
US-patenttijulkaisussa 4 446 231 (Self) kuvataan immuunimååritystå, jossa kåytetåån syklistå amplifikaatiota ja joka sisåltåå ensimmåisen ja toisen entsyymijårjestelmån ja toisen entsyymijårjestelmån modulaattorin. Ensimmåinen 35 jårjestelmå sisåltåå ensimmåisen ligandiin kytketyn entsyymin. Selfin keksinnon ensimmåisesså suoritusmuodossa ensimmåinen entsyymijårjestelmå vaikuttaa modulaattorin esias-teeseen, jolloin modulaattori vapautuu. Modulaattori on li 3 91193 toisen entsyymin kofaktori, joka aktivoi toisen entsyymi-jårjestelmån katalysoimaan substraatin reaktiota detek-toitavissa olevaksi tuotteeksi. Reaktion aikana modulaat-tori muuttuu epMaktiiviseen muotoon, ja syklin tSydentSM 5 kolmas entsyymi, joka aktivoi uudelleen modulaattorin. Toi-sessa suoritusmuodossa modulaattori on toisen jSrjestelmSn inhibiittori, ja sen poistaa ensimmåinen entsyymijSrjestel-na, jolloin toinen jårjestelma aktivoituu vaikuttamaan sub-straattiin, jolloin muodostuu detektoitavissa oleva tuote.
10 Boguslaski et al. (US-patenttijulkaisu 4 492 751) kuvaavat syklistå jSrjestelmåå, jossa entsyymin substraatti tai koentsyymi kytketSSn spesifisesti sitoutuvan parin toi-seen jåseneen.
Erilaisten molekyylien on osoitettu aiheuttavan 15 kohde-entsyymin spesifisen inaktivoitumisen. Eras inhibiit-torien alaryhmå, joita kutsutaan mekanismiin perustuviksi inhibiittoreiksi, ovat entsyymien substraatteja, jotka rea-goivat entsyymin kanssa sillå tavalla, ettå muodostuu kova-lenttinen sidos. Walsh [Tetrahedron 38 (1982) 871] on esit-20 tSnyt katsauksen mekanismiin perustuvista inhibiittoreista.
ErSSseen toiseen inhibiittorien alaryhmSSn kuuluvat mole-kyylit, jotka toimivat stabiileina siirtymStilavastineina. Gelb et al. [Biochemistry 24 (1985) 1813] ovat kuvanneet joidenkin fluoriketonien toimintaa hydrolyyttisten entsyy-25 mien siirtymatilainhibiittoreina.
Tama keksintd koskee menetelmåå nesteessS olevan ligandin detektoimiseksi, jolle menetelmSlle on tunnus-omaista, etta (a) yhdistetSan ensimmMinen neste, jonka epMillåån 30 sisåltavan ligandia, kiinteaan kantajaan immobilisoituun antiligandiin ja merkkiaineeseen, joka sisåltSa ensiitanSis-tS entsyymiS, jolloin antiligandi sitoutuu ligandiin ja merkkiaine sitoutuu joko antiligandiin tai ligandiin, jolloin muodostuu kantajalle sitoutunut faasi; 35 (b) erotetaan kantaja mainitusta ensimmSisestå nes- teesta; (c) saatetaan kantaja kosketukseen toisen nesteen kanssa, joka sisaltåS toista entsyymiM ja suojattu fluori- 4 ketoni-inhibiittoria, jolloin xnainittu ensimmSinen entsyymi muuttaa suojatun fluoriketoni-inhibiittorin fluoriketoni-inhibiittoriksi ja vapauttaa mainitun inhibiittorin mainit-tuun toiseen nesteeseen; 5 (d) lisStSSn mainittuun toiseen nesteeseen mainitun toisen entsyymin substraattia, jolloin mainittu inhibiitto-ri estSS mainitun substraatin muuttumisen tuotteeksi mainitun toisen entsyymin vaikutuksesta; ja (e) detektoidaan mainittu ligandi mainittuun muu-10 tokseen liittyvån signaalin avulla.
Keksinnon eråanM puolena on siis menetelmS neste-nåytteesså, josta tåstedes kåytetåSn ilmausta "tuntematon nåyte", olevan ligandin detektoimiseksi. Tuntematon nSyte, jonka epåillåan sisaltavan ligandia, yhdistetMMn spesifi-15 seen antiligandiin ja ligandin merkkiaineeseen. Merkkiaine sisåltaa ensimmåista entsyymia, joka on kytketty joko li-gandiin tai toiseen antiligandiin, joka on myds spesifinen ligandille. Olosuhteet tehdaan sellaisiksi, ettM tapahtuu ligandin, antiligandin ja merkkiaineen sitoutuminen, jol-20 loin muodostuu sitoutunut faasi. Kun sitoutunut faasi on erotettu nesteesta, se saatetaan kosketukseen nesteesså suojatun modulaattorin ja toisen entsyymin kanssa. Ensim-mainen entsyymi poistaa suojausryhman, jolloin toisen entsyymin modulaattori vapautuu. Sitten lisåtSån toisen 25 entsyymin substraattia. Toinen entsyymi muuttaa substraatin tuotteeksi, joka muodostaa detektoitavissa olevan signaalin, jolloin substraatin muuttumista tuotteeksi toisen entsyymin vaikutuksesta saatelee modulaattori.
Ligandi voi olla antigeeni, hapteeni tai vasta-30 aine. Edullinen ligandi on antigeeni, edullisimmin virus-antigeeni. Menetelmå voidaan toteuttaa kompetitiivisella immuunimåMritysmenetelmMllM, jolloin merkkiaine on ensim-mSiseen entsyymiin kytketty ligandi. Edullisesti voidaan kSyttåS kerrosimmuunimåSritysmenetelmas (sandwich-mene-35 telmaM), jolloin merkkiaine on ensimmMiseen entsyymiin kytketty toinen antiligandi.
KeksinnossM kSytetty suojattu modulaattori on siis suojattu inhibiittori, jonka merkkiaineen ensimmåinen ent-
II
5 91193 syymikomponentti muuttaa inhibiittoriksi. Edullinen sub-straatti on kromogeeni, jonka toinen entsyymi pystyy muut-tamaan eri vMriseksi tuotteeksi. Kromogeeni on edullisim-min variton ja muuttuu varilliseksi tuotteeksi toisen ent-5 syymin vaikutuksesta, jolloin kromogeenin muuttumista tuotteeksi estMS inhibiittori.
Maårityksen edullisimmassa muodossa voidaan immo-bilisoida vasta-aine kiinteåan kantajaan ja saattaa se si-toutumisolosuhteissa kosketukseen virusantigeenin ja toi-10 sen, antigeenille spesifisen, alkalisella fosfataasilla (ensimmåinen entsyymi) leimatun vasta-aineen kanssa. Si-toutumisen ja erottamisen jålkeen kiinteS kantaja, jolle on kiinnittynyt vasta-aine - antigeeni - alkalisella fosfataasilla leimattu vasta-aine-kerrosrakenne, saatetaan 15 kosketukseen suojatun inhibiittorin ja toisen entsyymin kanssa nesteessM. Jos nåyte sisaitaa antigeenia, kiinteSSn kantajaan sidottu alkalinen fosfataasi poistaa suojaus-ryhmMn, jolloin inhibiittori vapautuu. Seokseen lisStåSn våritonta kromogeenia. NesteessS muodostunut inhibiittori 20 estaM toisen entsyymin muuttamasta kromogeenia varilliseksi tuotteeksi. siten varin kehittyminen osoittaa antigee-nin poissaolon naytteesta, ja varin kehittymisen puuttu-minen osoittaa antigeenin lasnaolon naytteessa.
Keksinto koskee myos valineistoa, joka sisaitaa 25 materiaalit keksinnon mukaisen menetelman toteuttamiseksi paaasiassa edelia kuvatulla tavalla.
Keksinnon mukaiselle valineistolle on tunnusomais-ta, etta se sisaitaa ligandin antiligandia, ensimmaista entsyymiå ja toisen entsyymin suojattua fluoriketoni-inhi-30 biittoria.
Missa tahansa EIA-jårjestelmassa, johon sisaityy suojauksen poistaminen entsyymin inhibiittorista, asete-taan seka inhibiittorille etta suojatuille inhibiittoreil-le vakavia vaatimuksia, jos maarityksen tulee saavuttaa pa-35 ras mahdollinen herkkyys. TamSh keksinnon mukaisesti suo- jattu inhibiittori on erinomainen substraatti ensimmaiselle (suojauksen poistavalle) entsyymiIle mutta kaytannollisesti katsoen reagoimaton toisen (varin muodostavan) entsyymin 6 suhteen. Inhibiittori, josta on poistettu suojaus, on vas-taavasti voimakas inhibiittori toiselle entsyymille, mutta ei vaikuta kSytånnollisesti katsoen ollenkaan ensimmMiseen entsyymiin. Koska suojatun inhibiittorin ja inhibiittorin 5 reaktiot ensimmaisen ja vastaavasti toisen entsyymin kanssa ovat hyvin selektiivisiS, ristireaktiivisuuksien aiheutta-mat, tahånastisille syklisille EIA-jSrjestelmille ominaiset "lyhyet kierrokset" tulevat eliminoiduiksi suurin piirtein kokonaan.
10 Siten tåmå keksinto tarjoaa kåytettSvåksi monikåyt- toisen menetelmån nåytteisså hyvin pieninS pitoisuuksina esiintyvien ligandien maarittamiseksi. TamS menetelma mah-dollistaa paljain silmin tehtavan detektoinnin ja maåri-tyssignaalin mittaamisen ligandin ollessa lasnM niinkin 15 pieninå pitoisuuksina kuin 10'12 mol/1 ja laajentaa suures-ti detektoitavissa tai maåritettavisså olevien ligandien joukkoa vaatimatta kalliita tai noninutkaisia laitteita. Lisåksi måarityksen herkkyys on parempi, ts aika, joka tarvitaan ligandin låsnS- tai poissaolon detektoimiseen, 20 voidaan lyhentaa jopa sadasosaan tavanomaiseen EIA:han ver-rattuna. Siten saavutetaan merkittavia kustannus- ja tilan-såastojå, mika mahdollistaa taman keksinnon mukaisten måa-ritysten tekenisen pienissa kliinisissa laboratorioissa tai jopa lååkårin vastaanottotiloissa.
25 Kuva esittMa tåmån keksinnon mukaisella menetelroal- la ja sen mukaisella vålineistollå tehdyn tyypillisen mSS-rityksen tulosta.
Vaikka monissa erilaisissa muodoissa olevat suori-tusmuodot sopivat tahan keksintoon, tassa kuvataan yksi-30 tyiskohtaisesti taman keksinnon edullisia suoritusmuotoja; tåmS selostus tulee kuitenkin ymmårtåS keksinnon periaat-teita esimerkinomaisesti kuvaavaksi, eikM sen tarkoitukse-na ole rajoittaa keksintoå kuvattuihin suoritusmuotoihin. Keksinnon suojapiirin maSraavat liitteenM olevat patentti-35 vaatimukset ja niiden vastineet.
II
91193 7 Tåmån keksinnon mukaista menetelmåå noudattamalla aine, jota tåstedes kutsutaan ligandiksi ja jota on låsnå tuntemattomassa nåytteesså, voidaan detektoida visuaali- sesti, ts paljain silmin tarkastelemalla, vaikka sitå 5 olisi lSsnå hyvin pienlna pitoisuuksina. Menetelmåån si- såltyy vahintåån kaksl vahvistusvaihetta. Ensimmåinen vah- vistusvaihe on suojauksen poistaminen modulaattorista entsymaattisesti. Tolnen vahvistusvaihe on indikaattori- reaktlon entsymaattinen katalysointi. Nåmå vahvistusvai- 20 heet tapahtuvat peråkkåin, jolloin saadaan alkaan signaa- lin vahvistuminen 106-kertaiseksi tai enemmån, jolloin -12 ligandi, jota esiintyy nåytteesså pitoisuutena 10 mol/1 tai pienempåna pitoisuutena, voidaan detektoida paljain silmin. Jos halutaan lisåvahvistusta, voidaan kåyttåå en-25 simmåistå entsyymia, joka aloittaa peråkkåisten reaktioi-den sarjan (kaskadin), johon osallistuu lukuisia entsyyme-jå, jolloin mikå tahansa reaktioista tai ne kaikki voi-vat saada aikaan signaalin vahvistumisen edelleen.
TSmån keksinnSn mukaisessa menetelmåsså kåytetåån 20 immunologista reaktiota tuntemattomassa nåytteesså ole- van ligandin detektointiin. Termillå "immuno1oginen reak-tio" tarkoitetaan tåsså yhteydesså antigeenin ja vasta-ai-neen, hapteenin ja vasta-aineen tai minka tahansa sopi-van, spesifisesti sitoutuvan antigeeni-, vasta-aine- tai 25 hapteenianalogin spesifistå sitoutvimisreaktiota.
Immunologinen reaktio voidaan toteuttaa misså tahansa sopivassa nesteesså. Neste voi olla esimerkiksi eli-mistoneste, jonka epåillåån sisåltåvån ligandia, kuten see-rumi, virtsa, selkåydinneste, keuhkopussineste tms. Neste 30 voi vaihtoehtoisesti olla vesi, fysiologinen suolaliuos tai mikå tahansa sopiva puskuriliuos tai elimistdnestei-den ja muiden nesteiden seos, johon on lisåtty nåytettå, jonka epåillåån sisåltåvån ligandia.
Tåmån keksinnon mukaista edullista menetelmåå ker-35 rosmåårityksen tekemiseksi kuvataan ensin alla olevaan 8 måSrityskaavioon viitaten mååritykseen liittyvien kompo-nenttien ja niiden vålisen vuorovaikutuksen selvittSmi-seksi yleisesti, minkS jålkeen kutakin komponenttia kS-sitellSån yksityiskohtaisesti.
5
B-M
1) sitaninen 10 AL + L + T-E^-----y AL: L:T-E^ 2) erotus 15 3) pesu M + B % E2 20
Sub---—> p 25 Edellå olevassa kaaviossa, jossa kaksoispiste merkitsee immunologista sitoutumista, vSliviiva kemiallis- ta sidosta tai fysikaalista liittymista, kuten absorptio- ta, kiinteå nuoli kemiallista muuttumista ja katkoviiva- nuoli reaktion tai måarityskomponentin modulaatiota, on 30 lyhenteiden merkitys seuraava: AL = antiligandi L = ligandi T = merkkiaine E^ = ensimmainen entsyjmi E2 = toinen B-M = suojattu entsyymi modulaattori M = entsyymin modulaat- B = modulaat- Sub = substraatti tori torin suojaus- 35 ryhmå P = tuote.
I! 91193 9
Kaaviosta havaitaan, ettå muodostetaan olosuhteet, joissa ligandi sitoutuu antiligandiin ja merkkiaineeseen, minkS jSlkeen seuraavat erotusvaihe ja asianmukaiset pesu-vaiheet. Lisataan toista entsyymiå ja suojattua modulaat-5 toria, joka koostuu modulaattorista (aktivaattorista tai inhibiittorista) ja suojausryhmSstå, ja suojausryhma pois-tuu merkkiaineen ensimmainen entsyymikomponentin vaikutuk-sesta. Lisåtåån toisen entsyymin substraattia, jolloin subs-traatin muuttumista detektoitavissa olevaksi tuotteeksi 10 sSStelee modulaattori, jota ensimmSinen entsyymi vapauttaa suojatusta modulaattorista. Tuotteen maSrS on joko suo-raan tai kaSnteisesti verrannollinen modulaattorin ja si-ten ligandin pitoisuuteen sen mukaan, onko modulaattori aktivaattori vai vastaavasti inhibiittori. Varsinainen 15 mitattava signaali voi olla indikaattorireaktioon liitty-va vari, kuten esimerkiksi tuotteen vari tai sen muodostu-misnopeus tai substraatin våri tai sen haviamisnopeus.
Keksinnon erSåssa edullisessa suoritusmuodossa voi yksi tai useampia mSSrityskomponentteja olla immobilisoi-20 tuina kiintean kantajan pintaan. Kuten on alalia tunnettua, kiinteS kantaja voi olla mika tahansa kantaja, joka ei oleellisesti håiritse maSritysta. Esimerkkeja kayttokel-poisista kantajista ovat Iasi ja polymeerimateriaalit, kuten polyeteeni, polyvinylideenifluoridi, polystyreeni 25 tms. TSllaiset kantajat voidaan saattaa mihin tahansa sopivaan muotoon, kuten levyiksi, putkiksi, syvennyksiksi tai, edullisesti, maljoiksi, kuten mikromaljoiksi. MSari-tyskomponentti voidaan esimerkiksi kiinnittSS putken, edullisesti toisesta paastaan umpinaisen muoviputken 30 sisåseiniin ja pohjaan tai edullisimmin mikromaljan sy- vennyksiin. Kun haluttu mSara antiligandia on kiinnitetty kiinteSan kantajaan, voidaan kantajalla mahdollisesti jal-jella olevat sitoutumiskohdat edullisesti tayttåa inertil-la proteiinilla. Inertti proteiini voi olla mikS tahansa 35 proteiini, kuten esimerkiksi ovalbumiini, joka voidaan 10 kiinnittaå kantajaan ja joka ei millaan tavalla håiritse edellå kuvattuja ligandin, antiligandin ja merkkiaineen Vcilisia speisfisiå sitoutumisreaktioita.
Kiinteåån kantajaan immobilisoitua antiligandia in-5 kuboidaan edullisesti ligandin ja merkkiaineen kanssa nii-den sitomiseksi kiinteåån kantajaan. Kun on tehty pesu håi-ritsevien materiaalien poistamiseksi, voidaan lisatå loput måarityskomponentit ja saattaa mååritys loppuun jåljempanå kuvattavalla tavalla.
10 Kuvataksemme nyt yksityiskohtaisesti måårityskompo- nentteja, ligandi voi olla peraisin mistå tahansa låhtees-tå, ja se voi olla antigeeni, vasta-aine tai hapteeni. Ligandi voi olla esimerkiksi elimistonesteesså esiintyvå antigeeni tai se voidaan eriståa elimistdnesteestå ja 15 siirtåå sitten eri nesteeseen, kuten puskuriliuokseen.
Ligandi voi olla myos peråisin muusta lShteesta kuin eli-mistbnesteesta, kuten esimerkiksi mikro-organismiviljel-masta tai siitå saadusta solu-uutteesta. Ligandit ovat edullisesti antigeeneja, edullisimmin elimistonesteesså 20 esiintyviS virusantigeeneja, kuten Herpes simplex-virus (HSV), adenovirus, influenssa A -virus, paraninfluenssa 3- virus ja RSV-virus.
Antiligandi saatetaan kosketukseen nesteesså ole-van ligartdin kanssa immunologisen reaktion indusoimisek-25 si. Antiligandi voi olla antigeeni tai joko monoklonaali-nen tai polyklonaalinen vasta-aine tai niiden mikS tahansa sopiva analogi, joka reagoi spesifisesti ligandin kanssa. Antiligandi voi lisåksi olla vasta-ainekompleksi, joka koostuu useista sitoutuneista vasta-aineista, kuten 30 esimerkiksi ensimmåiseen vasta-aineeseen spesifisesti sitoutunut toinen vasta-aine. Ligandi voi vaihtoehtoises-ti sitoutua muutamaan eri antillgandiin, esimerkiksi jouk-koon polyklonaalisia vasta-aineita tai muutaman monoklonaa-lisen vasta-ainemolekyylin, jotka sitoutuvat samanaikai-35 sesti ligandin pinnan eri alueisiin, seokseen. YleensM toi- li 91193 11 nen vasta-aine reagoi eri lajissa muodostettua ensimmaistå vasta-ainetta vastaan. Kompleksissa oleva sitoutuneiden vasta-aineiden joukko voi sisåltåå suunnilleen kahdesta kymmeneen tai useampia vasta-aineita.
5 Keksinndn mukaisessa kerrosmåårityksesså on edul- lista kayttåa ylimåårin antiligandia, jossa on riittavas-ti sitoutumiskohtia ligandin sitomiseksi suurin piirtein kokonaan.
Merkkiaine sisåltåå kaksi komponenttia, ensimmåi-10 sen entsyymin konjugoituna ligandiin (jåljempånå kuvattava kompetitiivinen maaritys) tai, edullisessa kerrosmåårityksesså, toiseen antiligandiin. Entsyymi voidaan kytkea ligandiin tai antiligandiin millå tahansa sopivalla ta-valla, edullisesti kovalenttisella sidoksella, ennen im-15 munologista reaktiota. Entsyymien kovalenttinen kytkemi-nen ligandeihin tai antiligandeihin on tavanomainen ja alan ammattimiesten hyvin tuntema menettely.
Ensimmaisenå entsyymina voidaan kayttåa mitå tahansa entsyymiå, joka pystyy poistamaan suojausryhunan suoja-20 tusta roodulaattorista. Soveltuvia ensimmåisiå entsyymejå ovat yleenså hydrolaasit, kuten fosfataasit, peptidaasit, esteraasit, glykosidaasit tms. Esimerkkejå sopivista ent-syymeistå. ovat trypsiini, trombiini, nisakkåån maksan esteraasi, asetyylikoliiniesteraasi, -galaktosidaasi 25 ja edullisinunin alkalinen fosfataasi nåihin kuitenkaan rajoittumatta.
Ligandia, antiligandia ja merkkiainetta sisåltåvåå nestetta voidaan tarvittaessa inkuboida sitoutumisen indu-soimiseksi. Inkubointi voidaan tehdå misså tahansa låmpb-30 tilassa ja sen kesto voi olla mikå tahansa sitoutumisen aikaansaamiseksi sopiva, edullisesti noin 1 min - 4 tuntia suunnilleen låmpotilassa 20 - 40°C. Antiligandia, ligandia ja merkkiainetta, jotka ovat sitoutuneet, kutsutaan tåst-edes sitoutuneeksi fraktioksi ja sitoutumattomia antili-35 gandia, ligandia ja ligandia vapaaksi fraktioksi. Mååri- 12 tys voidaan, mutta sita ei ole vålttamStontS tehda silla tavalla, etta sitoutuneen ja vapaan fraktion vSlille muo-dostuu tasapaino.
Sitoutunut fraktio voidaan erottaa maSritysseoksen nestefaasissa olevasta vapaasta fraktiosta millå tahansa 5 tavanoroaisella menetelmållå, kuten suodattamalla, dekan-toimalla, sentrifugoimalla, imemållå tins. Kun immunologi-nen reaktio on tehty kiintealla kantajalla, on katevaa dekantoida nestefaasi, pestå kiinteå kantaja vapaan fraktion ja mahdollisten muiden mååritystå hairitsevien ainei-10 den poistumisen takaamiseksi ja suspendoida se takaisin sopivaan nesteeseen, kuten veteen, fysiologiseen suolaliuok-seen tai puskuriliuokseen. Sitten lisåtåSn suojattua modu-laattoria, ja sSadetSån pH mihin tahansa arvoon, edulli-sesti alueelle 6-8, joka ei aiheuta suojausryhmån ei-ent-15 symaattista poistumista, kuten kuvataan jMljempånS.
Suojattu modulaattori voi olla mikS tahansa mate-riaali, jonka ensiirmSinen entsyymi pystyy muuttamaan toi-se;n entsyymin modulaattoriksi. Edullisessa suojatussa modulahttorissa on kaksi komponenttia, modulaattori ja 20 suojausryhma. Edullisin suojattu modulaattori on suojattu inhlbiittori, joka on epåreaktiivinen toisen entsyymin suhteen siihen asti, kun ensimmåinen entsyymi poistaa sen suojausryhmSn ja inhibiittori vapautuu mMaritysvaliainee-seen, NiinpS suojatun inhibiittorin komponenttien valinta 25 riippuu kHytettSvistå ensimmåisesta ja toisesta entsyymis-ta. SuojausryhmSn tulisi olla ryhma, joka voidaan kovalent-tisesti kytkea inhibiittoriin sidoksella, jonka ensimmai-nen entsyymi pystyy katkaisemaan suurin piirtein selektii-visesti, ja inhibiittorikomponentin tulisi inhiboida toi-30 sen entsyymin aktiivisuus vaikuttamatta oleellisesti en-simmaiseen entsyymiin. Niinpa toisen entsyymin ja sen substraatin luonnetta kSsitellSSn ennen suojatun inhibiittorin ja inhibiittorin tarkempaa kuvaamista.
Keksinndn mukaisessa maSrityksessS toinen entsyymi 35 on yleenså hydrolaasi, joka muuttaa substraatin tuotteeksi.
II
91193 13
Soveltuvia hydrolaaseja ovat esimerkiksi fosfataasit, pep-tidaasit, kuten trypsiini, kymotrypsiini ja pepsiini, ja edullisesti esteraasit, kuten asetyylikoliiniesteraasi (AChE) ja butyylikolinesteraasi. Edullisin toinen ent-5 syymi on karboksiesteraasi kuten kaniinin maksan este-raasi (RLE).
Substraatti voi olla mikS tahansa aine, joka sisal-taa ryhman, jonka toinen entsyymi pystyy lohkaisemaan irti, niin etta saadaan tuote, joka on detektoitavissa vSriin 10 liittyvan signaalin avulla. Niinpa keksinnon eraassa suo-ritusmuodossa detektoitava signaali on vSrin kehittyminen tai haviSminen tai vMrin muuttuminen toiseksi vMriksi. Kek-sinnOn eraassM toisessa suoritusmuodossa signaali voi olla muutos nopeudessa, jolla substraatti muuttuu tuotteeksi; 15 voidaan esimerkiksi havaita, etta substraatin vari pysyy muuttiimattoman tietyn pituisen ajan. Niinpa signaali voidaan mitata joko kineettisissa tai termodynaamisissa olo-suhteissa. Kineettisissa mittauksissa maaritetaan muutos-nopeus tiettyna aikana, ja ne tehdaan yleensa suorittamalla 20 sarja mittauksia eri aikoina maaritysreagenssien yhdista-misen jaikeen. Termodynaamisissa mittauksissa maaritetaan tapahtuneen muutoksen suuruus, kun on saavutettu tasapaino substraatin ja indikaattorireaktion tuotteen vaiilia. Mittaukset voidaan tehda joko instrxamentaalisesti tai 25 edullisesti paljain silmin.
On edullista, etta substraatti on varitdn, kunnes toinen entsyymi lohkaisee sen, jolloin muodostuu varilli-nen tuote. Soveltuvia substraatteja ovat indoksyylieste-rit ja edullisesti nitrofenoliesterit, kuten orto- ja 30 paranitrofenyyliasetaatit ja -butyraatit. Nama substraa- tit ovat varittQmia, kunnes tapahtuu asetyyli- tai buty-ryyliryhmien lohkaisu karboksiesteraasin vaikutuksesta, jolloin muodostuu varillisia nitrofenoleja. Niinpa modu-laattorin ollessa inhibiittori ja sxibstraatin ollessa 35 nitrofenoliesteri on mitattava signaali varin muodostumi- sen estyminen.
14
On ilmeista, etta keksinnon mukaista menetelmaå voidaan kåyttaa myos fluoresenssi-iiranuunimåMrityksessM. Keksinnon tassa suoritusmuodossa toinen entsyymi voi muut-taa ei-fluorogeenisen substraatin fluorogeeniseksi tuot-5 teeksi, jolloin mitattava signaali on fluoresenssin modu-laatio. Keksinnon tåmån suoritusmuodon yhteydessS on edul-lista, etta modulaattori on inhibiittori ja toinen entsyy-mi esteraasi.
Kuten edella mainittiin, merkkiaineen ensimmainen 10 entsyymikomponenttti lohkaisee suojausryhmSn pois suoja- tusta inhibiittorista, jolloin saadaan toisen entsyymin inhibiittori · Keksinnftssa voidaan kayttSa uutta ryhmHM entsyymi-inhibiittoreita ja suojattuja entsyymi-inhibiit-toreita, joilla on alia esitetyt yleiskaavat I-IV, jolloin 15 ryhmån B luonne, kuten jåljempånå kuvataan, mSaraa sen, onko yhdiste inhibiittori vain suojattu inhibiittori.
y z o b2 II 1 .1 20 n, - iCHji n - c - c - c - ich2) n X - e acf2 - c - [c»2)n - n - \t»2)m - x - b
III
Y 0 Z n2 .
I " « ί ' w"3 i i ACFj - c · kb2'" ——X ° cc,y„-«-e
F
111 lv 30 Kaavoissa I-IV R^ voi olla H, haaroittunut tai suoraketjuinen alempi alkyyli, jossa on 1-6 hiiliatomia, tai ryhma A /R2 - ®N-R-, 35 \.R2 li 91193 15 jossa 1*2 voi olla alempi alkyyli, jossa on 1-6 hiiliatomia; Rg voi olla H, nitroryhmå, alkoksyyliryhma, halo-geeniatomi tms; voi olla alkyyliryhmS, jossa on 1-10 hiiliatomia tai alkenyyli- tai alkynyyliryhma, jossa on 5 2-10 hiiliatomia, jotka ryhmSt voivat mahdollisesti olla substituoituja aryyliryhmålia, tai nitro-, hydroksyyli-, merkapto-, alkyylioksi-, halogeenialkyyli-, hydroksialkyyli-tai merkaptoalkyylisubstituoidulla aryyliryhmalla; Y ja Z voivat olla riippumattomasti H tai F, jolloin vShintSan 10 toinen ryhmistå Y ja Z on F; X voi olla 0, S tai NR^, jossa R^ voi olla H tai R2; n voi olla 1-6; m voi olla 2-6; A voi olla F tai CF^; ja B voi olla H, fosforihappo tai -suola, glykosyyliryhmS, aminohapporyhmå, kuten lysii-ni- tai arginiiniryhma, joka on sitoutunut kovalenttises-15 ti ryhmaan X aminohapon karboksyyliryhmån kautta, 2-4 hiiliatomia sisHltava asyyliryhma, kuten asetyyli- tai butyryyliryhma, tai peptidi, jolla on kaava: - C - CH - NH - c - CH - NH * C - CM - NH LC - R„
20 II I II I II I I
0 n6 o r7 o n0 o
NM
/ jossa Rg on (ch2J4nh2) ich2i3nh - c 25 \ NHj tai bentsyyliryhmå.
Rj voi olla H tai haaroittunut tai suoraketjuinen alempi alkyyliryhma, jossa on 1-6 hiiliatomia; Rg voi olla H, haaroittunut tai suoraketjuinen alempi alkyyli- tai hydrok-20 si(alempi alkyyli)ryhmS, jossa on 1-4 hiiliatomia; CH2COOH tai (CHj^COOH; Rg voi olla haaroittunut tai suoraket juinen alempi alkyyli- tai alempi alkoksyyliryhmS, jossa on 1-4 hiiliatomia, tai fenyyli- tai bentsyylioksi-ryhmå; ja q voi olla 0-10.
25 Kun B' on H, kaavat X-IV edustavat entsyymi-inhibiit- 16 toreita. Kun B on mikå tahansa muu ryhmå kuin H, kaavat I-IV edustavat suojattuja entsyymi-inhibiittoreita. Kun B on fosforihappo tal sen suola, on tarkoitus, ettå B:llå on kaava: 0° jossa P on sitoutunut ryhmSMn X ja n voi olla edella ku-vattu.
Kaavojen I-IV mukaiset inhibiittorit ja suojatut inhibiittorit voidaan syntetisoida mills tahansa tavan-omaisten kemiallisten reaktioiden sarjalla, kuten alan 15 ammattimies havainnee. Soveltuvia ja kåteviå menetelmia esitetSSn jaljempSna olevissa esimerkeisså. Seuraava luettelo tehokkaista entsyymi-inhibiittoreista on tarkoi-tettu vain esimerkinomaiseksi.
20 Nimi NMR-tiedot Ki (Μ)Λ (esteraasi) 91193 17 7. 1,1,1-trifluori-6- (4- (cocu, - i «(·<">· 2 0kio-h.hu ,__, ,.- ~ v. 1 2.70(q.2H>. 5.55(b.,lH), 6.77(d.2K> hydroksifenyyli) -2-heksan- 7 02(i 2H) ani fCDC13) - I.35<·»4Η), I-65(e,4H)· 8. l-fenYYli-3,3-difluori- 2.το(*,2κκ z.nu.m· 10-hydroksi-4-dekanoni 3.ts<«»a.uo. 3.s5(t,2i>. 7.25(.,511 5 9. 1,1,1-trifluori-5-hydrok- (cocu) - 2.is<..4i). 4.03<b«.iB). a.o«io-<. m si-2-pentanoni 4.20(.,211
J _. - (CDC13) - 1.15(-.41). 2.10(b.,ll). «.0 κ 10-7. PtE
10. 1,1, l-trifluori-6-hydr-oksi-2-heksanoni „ i 30 1.Θ0(·.8Η), 2.40 11. 1,1,1-trifluori-8- (Saw. 2.75(1.211. 3.65(..211 hydroksi-2-oktanoni 10 -i -i * i ί j λ 3j π (CDCI3) - 0-15(..611. l.H5(t,211. 1.2 . 10-6, Pl£ 10 12· l“«Mietyyli-4-difluc>- 1*52 β, i.wt-.u). 4.15(..211 ri-8,8-dimetyyli-4-nDna-noni 13. 1,1,1,2,2-pentafluo- (coci3i - 2.94(..21).3.04(..21). e.o « 10-7. rle ri-5-(4-hydrcksifenyyli)- 5·»^.*».
3-pentanoni 14. 1,1,1-trifluori-4-(3- (cocui - 5.»(»>·.m. e.90(d.ui 1.6 « 10-7. rle 15 hydroksiferiyyli) -3-trans- \)·««*. 7.25(-.411. 7.9510.1*1 j-i«·.
buten-2-oni 15. NfN-dimetyyli-n-/2- 1020) - 1.90(..411, 3.ΐ3(»,βιι. s.o . 10-9. ack (hydroksi) etyy 1^/-5,5,5- 3.30(..211. 3.41(..211. 4.01(6..211.
trifluori-4-oksopentaani-arniinin hydroksidisuola 20 16* N,N-dimetyyli-N-^- (B20) . 1.95(.,41), 2.54(., 4« 6 5 „ I0.8 , (hydroksi) butyy 117—5,5,5— 3.10(.,611, 3.35(.,211, 3.55(.,211, trif luori-4 -oksopentaani- 1s-25(b*-lH> amiinin hydroksidisuola PIE: sian maksan esteraasi (E.C. 3.1.1.1) 25 RLE: kaniinin maksan esteraasi (E.C. 3.1.1.1) AChE: asetyylikoliiniesteraasi (E.C. 3.1.1.7)
Keksinnon edullisimmassa suoritusmuodossa merkki-aine on toinen antiligandi, johon on kytketty kovalentti-30 sesti alkalinen fosfataasi. Kun kiinteå kantaja on ero-tettu ja pesty ja suspendoitu uudelleen sopivaan mSSri-tysnesteeseen, lisåtSSn RLE:ta tai AChE:tS (toista entsyy-miS) ja kaavan V mukaista suojattua inhibiittoria. Jos tuntematon nSyte sisåltåS antigeenia, tSmå ja merkkiaine 35 kiinnittyvSt kantajalle, ja alkalinen fosfataasi aiheuttaa 18 yhdisteen V fosfaattiesterisidoksen katkeamisen, jolloin muodostuu kaavan VI inukainen inhibiittori. Mååritys saa-tetaan loppuun lisaamalla o-nitrofenyylibutyraattia tai o-nitrofenyyliasetaattia (VII).
r 0 CH-n
5 0 C«3 II I
fosfataasi · ch, ch3 j vi 10 v o
II
- .0 - C - CH3 λ . OH
CC CC
1:3 N02 NO 2
VII VIII
Jos muodostuu inhibiittoria VI sen ansiosta, ettå tuntematon nayte sisaltaa antigeenia, inhiboituu este-20 raasiaktiivisuus, eika varitdn substraatti VII muutu va-rilliseksi tuotteeksi VIII. Ellei tuntematon nayte sisal-la antigeenia, ei kiinteålle kantajalle kiinnity alkalis-ta fosfataasia, eika muodostu inhibiittoria VI, ja siksi muodostuu vårillista tuotetta VIII esteraasin ollessa 25 inhiboimaton.
Keksinnon tassS edullisimmassa suoritusmuodossa voidaan kayttamSlla alkalista fosfataasia pitoisuutena -12 -9 1 x 10 mol/1 ja RLE:ta pitoisuutena 3 x 10 mol/1 ensimmaisena ja vastaavasti toisena entsyymina detektoida 30 antigeenin lasna- tai poissaolo tuntemattomasta nayttees- -12 ta pitoisuustasolle 1 x 10 mol/1 asti noin 7 minrssa. Jos tuntematon nayte sisaitaM antigeenia, ei tMssM ajas-sa kehity paljain silmin havaittavissa olevaa varia (noin 1 x ΙΟ-1"* mol/1 tuotetta VIII) . Ellei antigeenia ole las-35 na, vari kehittyy. Tavanomaisessa immuunimaarityksessa, 11 91193 19 jossa JcMytetaSn pelkkSS ensinunSistå entsyymiS (alkalista fosfataasia), kestSa sitfi vastoin noin 104 min, ennen kuin entsyymi on lohkaissut riittSvSsti fosforyloitua nitrofenolia detektoitavissa olevan vårin muodostumisek-5 si. Siten tamM keksintQ nostaa mSSritysherkkyyden 15-ker-taiseksi, kun kMytetSSn mainittuja reagensseja mainittuina pitoisuuksina.
Kuten edella mainittiin, keksinnSn eras toinen suo-ritusmuoto on kompetitiivinen mSSritys, jossa merkkiaineena 10 on ennalta mSMratty mSSrS ensimmSiseen entsyymiin kytket-tyS ligandia. Kompetitiivisessa mSSrityksessS kSytettSva antiligandimååra on riittSmStfin kaiken mSSritysnesteessa olevan ligandin ja merkkiaineen sitomiseksi, niin ettS ligandi ja merkkiaine kilpailevat rajoitetusta maarasta 15 antiligandisitoutumiskohtia. NiinpM kompetitiivisessa maarityksessS antiligandiin sitoutuvien ligandin ja merkkiaineen (sitoutunut fraktio] maarat ovat kaantaen ver-rannollisia niiden pitoisuuksiin maaritysnesteessa.
Jos halutaan signaalin vahvistamista edelleen, 20 voidaan tehda monivaiheinen kaskadivahvistusmaaritys, jos sa joukko maaritysvaiiaineessa olevia reagensseja reagoi perakkain, mika johtaa lopulta modulaattorin suojauksen poistoon. Kuvattaessa keksinndn tata suoritusmuotoa on katevaa pitaa edella kuvattua ensimmaista entsyymia pri-25 maarisena entsyymina, joka entsymaattisesti muuttaa maaritysvaiiaineessa olevan reagenssin sekundaariseksi entsyy-miksi, joka poistaa suojauksen edella kuvatun toisen ent-syymin modulaattorista. Sekundaarinen entsyymi tai mahdol-linen mydhempi entsyymi voi lisaksi reagoida muiden rea-30 genssien kanssa, jolloin muodostuu muita entsyymeja, jot-ka voivat jatkaa entsymaattisten reaktioiden sarjaa, kun-nes suojaus poistuu modulaattorista. Valitsemalla asian-mukaisesti maaritysvaiiaineeseen lisattavat reagenssit, voidaan toteuttaa haluttu maara vahvistusvaiheita.
35 Vahvistus tapahtuu kaikissa edella kuvatuissa kek- 20 sinnon suoritusmuodoissa siita syysta, ettS ensimmainen entsyymi, tai mahdollisesti myGhemmin muodostuva entsyymi, ja toinen entsyymi toimivat todellisina katalysaattoreina, jolloin yksi entsyymimolekyyli voi vaikuttaa kSytanndlli-5 sesti katsoen rajoittamattomaan maaråån suojattuja modu- laattori- tai vastaavasti substraattimolekyylejM kulumatta itse. Niinpa yksi molekyyli kutakin entsyymia olisi teo-riassa riittåvå toteuttamaan keksinnon mukaisen menetel-man. KSytfinnossM lisattavien entsyymien maarfit ja kSytet-10 tavS vahvistuskertojan lukumaara maarataan halutun vah-vistustason mukaan, ja tSllaiset mSaritykset ovat alan ammattimiesten hyvin hallitsemia.
On ilmeista, etta voidaan ajatella lahes rajoitta-matonta maaraa kompetitiivisia ja kerrosmaaritysmuotoja, 15 jotka kuuluvat keksinnGn piiriin. Lisaksi keksinto tarjoaa kaytettavaksi maaritysmuotoja, jotka soveltuvat joko ligandin detektointiin tai ligandin pitoisuuden maaritta-miseen. Ligandipitoisuus voidaan maarittaa vertaamalla tuntemattoman naytteen muodostaman signaalin suuruutta 20 signaaleihin, joita saadaan maarittamaiia sarja tunnettuja ligandimaaria oleellisilta osiltaan samanlaisissa olosuh-teissa. Kun keksinnon mukaista menetelmaa on maara kayt-taa ligandin pitoisuuden maarittamiseen, on edullista lukea signaalin intensiteetti sopivalla laitteella, kuten 25 spektrofotometrilia, esimerkiksi Beckman DU7 Spectrophoto-meter-laitteella (Beckman Instruments, Inc., Irvine, KaliforniaJ.
Keksinnon eraassa suoritusmuodossa toinen entsyymi voidaan immobilisoida kiinteaan faasiin antiligandin va-30 littGmaan laheisyyteen. Immunologisen reaktion, jossa ligand! ja merkkiaine tarttuvat kiinteaan kantajaan, ta-pahduttua kantaja erotetaan nestefaasista, pestaan, ja lisataan suojattua modulaattoria. Merkkiaineen ensimmainen entsyymiosa reagoi kantajalla olevan toisen entsyymin 35 modulaattorin kanssa ja vapauttaa sen. Sitten voidaan
II
91193 21 lisatéi toisen entsyymin substraattia ja saattaa måMritys loppuun edellå kuvatulla tavalla.
Taman keksinnon kohteena on myc5s reagenssivali-neisto tai materiaalipakkaus ligandimåMrityksen tekemi-5 seksi tåmMn keksinnon mukaisella menetelmållS. Pakkaus voi sisaltaa yhden tai useampia antiligandeja, ensimmåisen ent-syymin, joka voi olla kytkettynå johonkin antiligandeista tai ligandiin, toisen entsyymin ja toisen entsyymin suoja-tun modulaattorin, jolloin jokin antiligandeista voi mah-10 dollisesti olla kiinnitettynS kiinteSån kantajaan. Pakkaus voi sisåltåS myos ligandistandardit, kuten esimerkiksi yhden tai useampia ligandinåytteitå, joiden pitoisuus on tunnettu, tai se voi sisåltaå muita reagensseja, entsyy-mien substraatteja tai muita leimattuja tai leimaamattomia 15 spesifisiS ligandeja, antiligandeja tai niiden komplekse-ja, jotka ovat kåyttdkelpoisia mSSrityksen tekemisesså. Pakkauksen komponentit voidaan toimittaa erillisissa såi-lioissa, esimerkiksi pulloissa, tai kaksi tai useampia komponentteja voidaan yhdiståS yhteen sailioon.
20 Rutiinianalyysimenetelmåt:
Flash-silikageelikromatografia tehtiin 32-63 meshin ICN-silikageelilla 21-48 kPa:n paineella. Analyyttinen TLC tehtiin alumiinitaustaisilla silikageelilevyillS, joiden mitat olivat 0,25 mm x 5 cm x 20 cm (EM Scientific).
25 Preparatiivinen TLC tehtiin lasipohjaisilla silikageeli-levyilla, joiden mitat olivat 2,0 mm x 20 cm x 20 cm (EM Scientific). Sulamispisteet mitattiin Thomas Hoover-kapillaarilaitteella, ja ne ovat korjaamattomia. NMR-spektrit rekisterSitiin IBM WP-200SY -spektrofotometrillM, 30 ja kemialliset siirtymat ilmoitetaan ppm:inå suhteessa trimetyylisilaaniin. HPLC tehtiin UV-detektoinnilla va-rustetulla Waters 510 -kaksipumppujarjestelmålla kåyttS-mallå yhta tai kahta liuotinta ja Brownlee AX-300 -kolonnia (7 x 250 mm); jarjestelma A): aluksi 5 min 30 mmol/1 35 NH^OAc:a (pH’’6,5), sen jålkeen lineaarinen gradientti 22 NH^OAc-pitoisuuteen 2,0 mol/1 30 min:n aikana ja sen jal-keen 1,0 mol/1 NH^OAcra 5 min. Jårjestelmåsså B) kåytet-tiin isokraattista puskurijårjestelmåå, joka sisålsi 10 mmol/1 NH^OAcia (pH 6,5), 40 min. Virtausnopeus oli 1,0 5 ml/min. Kaasukromatografia tehtiin HP 5849A Gas Chromatograph -laitteella, joka oli varustettu liekki-ionisaatio-detektorilla ja automaattisella injektorilla, kåyttåmållå 30 M DB-1 Megabore -kolonnia (J & W Scientific, Inc.). Olosuhteet olivat GC-.ssa seuraavat: 3 min lampotilassa 10 100°C, sen jålkeen gradientti låmpbtilaan 250°C nopeudella 10°C/min ja sitten 3,0 min låmpotilassa 250°C virtausnopeu-den ollessa 16,0 ml/min,
Inhibitiovakiot mitattiin 50 mM Tris-puskurissa (pH 8,0). Entsyymiå ja inhibiittoria inkuboitiin huoneen 15 lampotilassa 20 min. Sitten lisåttiin entsyymin substraat-tia, ja seurattiin hydrolyysinopeutta spektrofotometri-sesti. PLE:n ja RLE:n substraattina oli o-nitrofenyyli-butyraatti ja AChE:n substraattina asetyylitiokoliini ja Ellmanin reagenssi.
20 Esimerkkl 1
Diammonium-/'4-(3-okso-4,4,4-trifluoributyyli)-fenyyli/fosfaatti A. Etyyli-3-(4-metoksifenyyli)-2-(l-okso-2,2,2-trifluorietyyli)propionaatti 25 1 litran pyoreapohjaiseen nelikaulapulloon, joka oli varustettu palautusjåahdyttimella, tiputussuppilolla, argoninsyottoputkella ja magneettisekoittimella, laitet-tiin 7,17 g (0,149 mol) natriumhydridin 50 %:sta oljy-dispersiota ja 300 ml kuivaa etyylieetteria. Liuokseen 30 lisattiin hitaasti ja sekoittaen 9 ml absoluuttista eta-nolia. Kun vedyn kehittyminen oli loppunut, lisSttiin tunnin aikana seos, joka sisålsi 25 g (0,136 mol) etyyli-4,4,4-trifluorimetyyliasetoasetaattia ja 21,3 g (0,136 mol) 4-metoksibentsyylikloridia. Sitten seosta refluksoi-35 tiin yon yli'. Sen jålkeen reaktioseos jååhdytettiin, 91193 23 uutettiin vedellS ja IN HCl:lla, kuivattiin (vedeton MgS04), ja poistettiin liuotin alipaineessa. EpSpuhdas reaktioseos, jota oli 33,5 g, kSsiteltiin kromatografisesti silikageelipylvåassS (60 x 300 mm) eluenttina etyy-5 liasetaatin ja heksaanin seos suhteessa 1:3. KeskenSSn samanlaiset fraktiot yhdistettiin, jolloin saatiin 9,0 g (27 %) haluttua tuotetta dljynå.
NMR (CDC13): £ 2,12 (m, 3H), 2,67 (m, 2H), 3,85 (m, 3H), 3,90 (s, 3H) 7,24 (q, 4H).
10 B. l,l,l-trifluori-4-(4-hydroksifenyyli)-2-butanoni 100 ml:n pySre3pohjaiseen pulloon, joka oli varus-tettu palautusjaahdyttimelia, magneettisekoittimella ja argoninsy5tt6putkella, laitettiin 2,05 g (6,7 mmol) etyy-li-3-(4-metoksifenyyliJ-2-(l-okso-2,2,2-trifluorietyyli)-15 propionaattia, 20 ml liuosta, joka sisSlsi 31 % HBr:a
AcOH:ssa, ja 10 ml vettS. TStå seosta pidettiin låmpoti-lassa 120°C ydn yli, vSkevSitiin alipaineessa ja jaettiin dikloorimetaanin ja veden kesken. Orgaaninen kerros uutettiin bisulfiittivesiliuoksella, kyllåisellå natriumvety-20 karbonaattiliuoksella, kuivattiin (vedet6n MgSO^), ja poistettiin liuotin alipaineessa. Epåpuhdas reaktioseos kåsiteltiin kromatografisesti silikageelipylvåållå (50 x 3Q0 mm) eluenttina etyyliasetaatin ja heksaanin seos suhteessa 1:1. Keskenå&n samanlaiset fraktiot yhdistettiin, 25 ja poistettiin liuotin alipaineessa, jolloin saatiin 600 mg (41 %) tuotetta kirkkaana bljynS.
NMR (CDC13): S 2,95 (m, 4H), 4,90 (leveS s, IH), 6,93 (dd, 4H), J = 4,60 Hz.
C. Dietyyli-^- (3-okso-4,4,4-trif luoributyyli) -30 fenyyli7fosfaatti 10 ml:n yksikaulainen pyQreåpohjainen pullo, joka oli varustettu argoninsySttQputkella ja magneettisekoittimella, laitettiin jåShauteeseen, ja siihen panostettiin 400 mg (1,8 mmoll l,l,l-trifluori-4-(4-hydroksifenyyli)-35 2-butanonia, 400 mg (2,4 mmol) dietyylikloorifosfaattia, 24 0,15 ml kuivaa pyridiiniS ja 5 ml dikloorimetaania lSm-potilassa 5°C. Seosta sekoitettiin huoneen låmpdtilassa yc5n yli, suodatettiin pyridiinihydrokloridin poistamisek-si, uutettiin 0,1N HClrlla ja sitten vedellå ja kuivat-5 tiin (vedetdn MgS04J. Poistamalla liuotin alipaineessa saatiin 600 mg raakatuotetta ruskeana SljynS. Prepara-tiivisessa TLC:ssS, jossa kSytettiin etyyliasetaatin ja heksaanin seosta suhteessa 1:1, saatiin 600 mg (92 %) kirkasta dljyS.
10 NMR (CDC13J: ^1,50 (m, 6H) , 3,0 (m, 4H) , 4,20 (m, 4H) , 7,15 (s, 4H).
D. Diammonium-/4-(3-okso-4,4,4-trifluoributyyli)-fenyyli/fosfaatti 25 ml:n pyoreapohjaiseen yksikaulapulloon, joka 15 oli varustettu argoninsydttoputkella ja magneettisekoitti-mella, laitettiin 5,0 ml dikloorimetaania, 140 mg (0,4 mmol) dietyyli-^4-(3-okso-4,4,4-trifluoributyyli)fenyyliJ-fosfaattia ja 2,0 ml bromitrimetyylisilaania. Kun tåtS seosta oli sekoitettu 3 tuntia ymparistbn lSmpotilassa, 20 UsSttiin 10 ml metanolia, ja haihtuvat materiaalit pois-tettiin alipaineessa. JSannos liuotettiin veteen, ja pH såSdettiin arvoon 7,3 1,0N NaOHilla. Vesiliuos uutettiin etyylieetterilia ja kylmakuivattiin, jolloin saatiin 190 mg valkeaa kiinteSta ainetta. TMmå materiaali liuotettiin 25 10 ml:aan 30 mM NH4OAc-puskuria ja puhdistettiin HPLCrlla jarjestelmSn (A) mukaisesti. Tuotesaanto oli kylmakui-vauksen jMlkeen 50 mg (37 %), sp 235-240°C.
NMR (D20) : 1,90 (m, 2H) , 2,56 (m, 2H) , 4,65 (s, DOH) , 6,88 (dd, 4H), J = 6,82 Hz.
30 Esimerkki XI
l-hydroksi-5,5-difluori-8,8-dimetyyli-4-nonanoni A. Etyyli-212-difluori-5,5-dimetyyliheksanoaatti 100 ml;n pyQreSpohjaiseen kolmikaulapulloon, joka oli varustettu tiputussuppilolla, argoninsydttdputkella, 35 jaahauteella ja magneettisekoittimella, laitettiin 8,0 ml 91193 25 dikloorimetaania ja 2,21 g (20 mmol) etyyli-2-okso-5,5-dimetyyliheksanoaattia. Reaktioseokseen lisSttiin 2,11 g (13 mmol) dietyyliaminorikkitrifluoridia 5 ml:ssa dikloorimetaania 15 min:n aikana, ja seosta sekoitettiin yon 5 yli ympSristbn ISmpdtilassa. Reaktioseos jaettiin veden ja dikloorimetaanin vSlillS, orgaaninen kerros kuivattiin (vedeton MgS04), ja liuotin poistettiin alipaineessa. OljymSinen jSSnnos tislattiin ISmpdtilassa 83-88°C 20 mmHgrn paineessa, jolloin saatiin 1,0 g (25 %) tuotetta.
10 NMR (CDCl3)i i 0,95 (s, 9HJ, 1,40 (m, 4H), 2,10 (m, 2H), 4,35 (q, 2H) .
B. 2,3,4,5-tetrahydro-2-okso-3-/’(5,5-dimetyyli- 2,2-difluori-l-okso)heksyyli/furaani 25 ml:n pybreSpohjaiseen kolmikaulapulloon, joka 15 oli varustettu kuivausputkella, tiputussuppilolla, kuumen-nusvaipalla ja magneettisekoittimella, laitettiin 0,24 g (5,0 mmol) natriumhydridiS 50 %:sena Sljydispersiona. Nat-riumhydridi pestiin kuivalla heksaanilla (2 x 10 ml) , ja lisSttiin pulloon 5,0 ml etyylieetteriS. Natriumhydridi-20 suspensioon lisMttiin hitaasti seos, joka sisSlsi 5 pisaraa absoluuttista etanolia ja 5 ml eetteria. Kun vedyn ke-hittyminen oli loppunut; lisSttiin 20 min:n aikana seos, joka sisSlsi 1,0 g (5,0 mmol) etyyli-2,2-difluori-5,5-di-metyyliheksanoaattia ja 0,43 g (5,0 mmol) ^-butyrolakto-25 nia 5,0 mltssa etyylieetteriS. Liuosta refluksoitiin 3 tun-tia ja sekoitettiin sitten ympSristSn lSmpotilassa y5n yli. Reaktioseos jaettiin IN HClsn kanssa, orgaaninen kerros pestiin vedelIS (2 x 50 ml), kuivattiin (vedetbn MgSO^), ja liuotin poistettiin alipaineessa. OljymSinen jSSnnos, 30 jota oli 0,88 g, kiteytettiin heksaanin ja etyyliasetaatin seoksesta, jolloin saatiin 0,66 g (63 %) tuotetta.
NMR (CDC13): S 0,95 (s, 9H), 1,35 (m, 2H), 2,00 (m, 3H), 2,50 (m, 2H), 3,00 (m, IH), 4,35 (m, IH), 4,5 (m, IH).
C. l-hydroksi-5,5-difluori-8,8-dimetyyli-4-nonanoni 35 10 ml:n pyoreSpohjaiseen yksikaulapulloon, joka 26 oli varustettu argoninsyott6putkella, magneettisekoitti-mella ja palautusjååhdyttimellå, laitettiin 1,0 ml jåå-etikkaa, 4 pisaraa våkevåå HCl:a ja 200 mg (0,81 mmol) 2,3,4,5-tetrahydro-2-okso-3-(5,5-dimetyyli-2,2-difluori-5 1-oksiheksyyli)furaania. Reaktioseosta pidettiin låmp6- tilassa 110°C yon yli argonin alla. Reaktioseos uutettiin etyylieetterillS, pestiin eetteriliuos vedellå, kuivat-tiin (vedeton MgS04), ja poistettiin liuotin alipaineessa. Jåånnds kåsiteltiin kromatografisesti silikageelikolon-10 nissa eluenttina heksaanin ja etyyliasetaatin seos suh-teessa 9:1, jolloin saatiin kirkas 61jy.
NMR (CDC13): £ 0,95 (s, 9H), 1,45 (t, 2H), 2,00 (m, 6H), 3,12 (leveå s, IH), 4,15 (m, IH).
Esimerkki III
!5 N,N-dimetyyli-N-/2-(hydroksi)etyyli7~5,5,5-tri- fluori-4-oksopentaaniamiinin hydroksidisuola A. 2,3,4,5-tetrahydro-2-okso-3-,£(2,2,2-trifluori-1,l-dihydroksi)-etyyli/furaani 3 litran pydreSpohjaiseen kolmikaulapulloon, joka 20 oli varustettu palautusjaahdyttimellå, tiputussuppilolla, argoninsy6tt6putkella, magneettisekoittimella ja kuvimen-nusvaipalla, laitettiin 36 g (0,75 mol) natriumhydridin 50 %;sta 61jydispersiota, Natriumhydridi pestiin (2 x 200 ml) kuivalla heksaanilla ja suspendoitiin sitten seokseen, 25 jossa oli 800 ml etyylieetteriS ja 2 ml absoluuttista etanolia. Seos, joka sisålsi 60,2 g (0,7 mol) V'-butyro-laktonia ja 99,4 g (0,7 mol) etyylitrifluoriasetaattia eetterisså (750 ml), lisåttiin suspensioon sellaisella nopeudella, ettå seos kiehui kevyesti. Seosta refluksoi-30 tiin vielå kaksi tuntia ja sekoitettiin sitten ympåriston låmp6tilassa yon yli. Reaktioseos jååhdytettiin jååhau-teessa, ja lisåttiin 250 ml IN HClta. Orgaaninen kerros erotettiin, pestiin vedellå (2 x 200 ml), kuivattiin (vedet6n MgS04I, ja poistettiin liuotin alipaineessa.
35 Jåånnos kiteytettiin heksaanin ja etyyliasetaatin seokses-
II
91193 27 ta, jolloin saatiin 64,0 g (45,4 %) tuotetta, sp 87-90°C.
NMR (DMS0-d6): ^2,33 (m, 2H), 3,09 (t, IH), J = 7 Hz, 4,20 (m, 2H), 7,00 s, IH), 7,52 (s, IH).
B. 1,1,1-trifluori-5-hydroksi-2-pentanonin 5 valmistus 500 ml:n pydreåpohjaiseen kolmikaulapulloon, joka oli varustettu palautusjååhdyttimellå, kuumennusvaipalla ja magneettisekoittimella laitettiin 61,5 g (0,31 mol) 2,3,4,5-tetrahydro-2-okso-3-(2,2,2-trifluori-1,1-dihydr-10 oksietyyli)furaania, 6,4 ml våkevåå HCl:a, 10 ml vettfi ja 80 ml etikkahappoa, Reaktioseosta pidettiin låmpStilassa 125°C ydn yli. Lisåttiin vielå 3,0 ml våkevåå HCl:a ja 5,0 ml vettå, ja reaktioseosta kuumennettiin vielå 10 tuntia. Reaktioseos jaettiin veden ja etyylieetterin kes-15 ken neutraloiden vesikerros kiinteållå natriumvetykarbo-naatilla (10Q g). Eetteriliuos pestiin vedellå (2 x 20 ml), kuivattiin (vedetdn MgS04), ja poistettiin liuotin alipaineessa, jolloin saatiin 60 g (45 %) vaaleankeltais-ta Qljyå.
20 NMR (CDC13I: å 2,15 (m, 4H), 4,03 (m, IH), 4,20 (m, IH).
C. 1,1,1-trifluori-5-bromi-3-pentanoni 500 ml:n pydreåpohjaiseen kolmikaulapulloon, joka oli varustettu tiputussuppilolla, magneettisekoittimella, jåå-suolahauteella ja argoninsydttdputkella, lai-25 tettiin 125 ml kuivaa dimetyyliformamidia, 29 g (35,7 mmol) tributyylifosfiinia ja 11,2 g (54,9 mmol) 1,1,1-tri-fluori-5-hydroksi-2-pentanonia. Tåma seos jååhdytettiin lfimpotilaan -5°C, ja lisåttiin 11,5 g (71,6 mmol) bromia pisaroittain 2 tunnin aikana. Kun seosta oli sekoitettu 30 yGn yli ympåriston låmpotilassa, se tislattiin 30 cm:n
Vigreaux-kolonnin låpi 2,0 mxnHgsn paineessa. Otettiin tal-teen kaksi fraktiota; ensimmåinen låmpStila-alueella 27-35°C ja toinen alueella 35-70°C. Toinen fraktio jaettiin veden ja etyylieetterin kesken, pestiin orgaaninen faasi vedel-35 lå (3 X 100 ml), kuivattiin (vedetCn MgSO^) ja haihdutet- 28 tiin alipaineessa ympårist6n låmp8tilassa, jolloin saatiin 30 g våritontå oljymaistå dimetyyliformamidin, eetterin ja halutun tuotteen seosta, joka kSytettiin seuraavaan reaktioon ilman jatkopuhdistusta.
5 D. N,N-dimetyyli-5,5,5-trifluori-4-oksopentaani- amiini 500 ml:n pyoreapohjaiseen kolmikaulapulloon, joka oli varustettu tiputussuppilolla, argoninsyottoputkella, magneettisekoittimella ja jaå-suolahauteella, laitettiin lø 21,5 g (0,45 mol) vedetontå dimetyyliamiinia lampotilas- sa -8°C. Tåhcin seokseen lisattiin 19,4 g (8,5 mmol) 1,1,1-trifluori-5-bromi-2-pentanonia dimetyyliformamidissa ja etyylieetterisså pisaroittain IMmpotilassa -10°C. Suspen-siota sekoitettiin 2,5 tuntia IMmpotilassa -10°C. Sitten 15 liuos erotettiin dekantoimalla sakasta. Sakka pestiin etyylieetterilla (3 x 200 ml), yhdistettiin orgaaniset faa.sit, pestiin ne vedella (2 x 30 ml) , kuivattiin (vedeton MgSO^), ja haihdutettiin alipaineessa, jolloin saatiin 15,0 g (92 %) vaaleankeltaista oljya. HCl-suolan 20 NMR (CDC131: S 1,89 (s, 4H), 2,90 (s, 6H), 3,21 (t. 2H).
E. N »N-dimetyyli-N-^- (metoksi) etyyli/-5,5,5-tri-fluori-4-oksopentaaniamiinin hydroksidisuola 25 ml:n pyoreapohjaiseen yksikaulapulloon laitettiin 2,95 g (21,2 mmol) 2-bromietyylimetyylieettericl, 25 0,33 g (1,77 mmol) N,N-dimetyyli-(5,5,5-trifluori-4-okso- pentaaniamiinia) ja 2,5 ml dimetyyliformamidia, ja seosta sekoitettiin ympariston låmpStilassa 3 vrk. Liuotin pois-tettiin alipaineessa, ja kellanruskea oljy kåsiteltiin hydroksidimuodossa olevalla Dowex-l-kolonnilla (15 x 200 3ø mm). kMyttSen eluenttina vettM (200 ml) . Kolonnissa saatu effluentti kylmåkuivattiin, jolloin saatiin 0,28 g (60 %) kellanruskeaa bljya, joka oli tuote hydroksidisuolana.
NMR (D20) : -S 1,94 (m, 3H) , 3,13 (s, 6H) , 3,39 (s, 3H) , 3,41 (m, 2H), 3,60 (m, 2H), 3,88 (levea s, 2H).
35 Materiaali kaytettiin seuraavaan reaktioon ilman lisa-puhdistusta.
li 91193 29 F. N,N-dimetyyli-N-/2-(hydroksi)etyyli/-5,5,5-trifluori-4-oksopentaaniamiinin hydroksidi-suola 10 ml:n pySreåpohjaiseen pulloon, joka oli varus-5 tettu argoninsyottoputkella ja palautusjåahdyttimellå, laitettiin 0,275 g (1,1 mmol) N,N-dimetyyli-N-/2-(met-oksi)etyyli7~5,5,5-trifluori-4-oksopentaaniamiinin hyd-roksidisuolaa, 4,0 ral vettå ja 8,0 ml liuosta, joka sisal-si 30 % HBr:a etikkahapossa. Tata seosta pidettiin låmpo-10 tilassa 120°C 5 tuntia, jSåhdytettiin, ja poistettiin liuotin alipaineessa. JMSnnSs haihdutettiin yhdessS ve-den kanssa (3 x 20 ml), ja saatu oljy kSsiteltiin kromatografisesti hydroksidimuodossa olevalla Dowex-l-kolonnilla (15 x 200 mm). Haihduttamalla effluentti alipaineessa 15 saatiin 0,17 g (63 %) tuotetta hydroksidisuolana.
NMR (D20): b 1,90 (m, 4H), 3,13 (s, 6H), 3,30 (m, 2H), 3,48 (m, 2H)i 4,01 leveå s, 2H).
Esimerkki IV
N,N-dimetyyli-N-/2-(fosfonoksi)etyyli7-5,5,5-20 trifluori-4-oksopentaaniamiinin ammoniumsuola 10 ml:n pyoreSpohjaiseen kolmikaulapulloon, joka oli varustettu tiputussuppilolla, argoninsy5tt6putkella, magneettisekoittimella ja jåS-suolahauteella, laitettiin Qf093 ml (1,0 mmol) fosforioksikloridia ja 0,5 ml tri-25 metyylifosfaattia. TShan seokseen lisåttiin 70,0 mg (0,2 mmol) N,N-dimetyyli-N-/2-(hydroksi)etyyli/-5,5,5-trifluori-4-oksopentaaniamiinin hydroksidisuolaa pisa-roittain låmpotilassa -10°C, Seosta sekoitettiin 30 min ja laitettiin se sitten pakastimeen y6ksi. Seos tritu-30 roitiin etyylieetterillå ja sen jalkeen petrolieetterillå (4 x 50 ml), jolloin saatiin hartsimainen sakka. Sakka peitettiin jåillS, sSadettiin pH arvoon 6,0 IN NaOH:lla, ja haihdutettiin kuiviin alipaineessa. Saatu kiinteS aine, 1Q7 mg, liuotettiin 30 mM NH^OAc-puskuriin (pH 7,0) ja 35 puhdistettii'n HPLC:lla kåyttåen jårjestelmåS B) . Tuote, 30 joka eluoitui 12 minrssa, eristettiin kylmakuivaamalla puskuri, jolloin saatiin 9,0 mg (11 %) vSritonta hartsia. NMR (D20): é 1,90 (m, 4H), 3,14 (s, 6H), 3,42 (m, 2H), 3,60 (m, 2H), 4,19 (levea s, 2H).
5 Esimerkki V
Puolikerrosmaaritys adenoviruksen heksonianti-geenin osoittamiseksi
Puhdistetusta adenovirus-heksoniproteiinista teh-dylla laimennussarjalla (laimennus aina kaksinkertaiseen 10 tilavuuteen) paallystettiin polyvinyylimikromalja 10 mM karbonaattipuskurissa (pH 9,5) 1-18 tunnin ajan. Malja huuhdottiin useita kertoja liuoksella, joka sisalsi 0,05 % polyoksietyleenisorbltaanimonolauraattia fosfaattipusku-roidussa fysiologisessa suolaliuoksessa. Immunologinen 15 reaktio tehtiin kayttamallS alkaliseen fosfataasiin kyt-kettyS vasta-ainetta (hiiren antiheksoni-IgG) laimennet-tuna sopivaan pitoisuuteen 10-%:isella kasvualustalla (si-såltaå naudan sikidseerumia). Kun oli inkuboitu 1 tunti ja tehty tavanomainen huuhtelu, lisattiin suojatun modu-20 laattorin (10 ^-10 ^ mol/1) ja RLE:n (10 ®-10-^ mol/1) seosta, ja maljaa esi-inkuboitiin 10-60 min. Seokseen lisattiin kromogeenista substraattia (ts indoksyylibuty-raattia, tai o-nitrofenyylibutyraattia) . Vårin kehittymi-nen tapåhtui tyypillisesti 15 minrssa, ja vSri voitiin 25 stabiloida pidemmaksi aikaa lisåamallå ylimSårin vapaata modulaattoria. Syvennykset, jotka oli påallystetty lai-mennoksilla, jotka sisSlsivåt 1 ng/ml heksoniproteiinia, antoivat positiivisen reaktion tasså jarjestelmassa. Esimerkki VI
30 Kerrosmaaritys adenoviruksen osoittamiseksi
Polyvinyylikloridimikromalja påallystettiin anti-adenovirus-vasta-aineella inkuboimalla maljaa 1 tunti 1am-potilassa 37°C suhteessa 1:900 laimennetussa varastoliuok-sessa, joka sisSlsi 4,5 mg/ml vasta-ainetta puskurissa, 35 joka sisalsi 10 mmol/1 karbonaattia ja 20 mmol/1 etylee-
II
91193 31 nidiamiinitetraetikkahappoa (EDTAa). Malja pestiin kol-mesti pesupuskuriliuoksella, joka sisalsi 0,1 % kaseii-nia, 10 mmol/1 Trisiå ja 154 mmol/1 NaCl:a (pH 7,6) . Adenoviruksella infektoidut HeLa-solut, jotka oli lai-5 mennettu suunnilleen tiheyteen 1 x 10^ pesåkkeenmuodos- tusyksikkoå (PFU)/ml fosfaattipuskuroidulla fysiologisella suolaliuoksella (pH 7,4), joka sisalsi 0,05 % polyoksi-etyleenisorbitaanimonolauraattia, 0,1 mg/ml gentamisiiniå, 0,5 % fenolipunaista, 0,1 % naudan seerumialbumiinia, 10 10 mmol/1 EDTA:a ja 100 mol/1 etyleeni-bis-(oksietyleeni- nitrilo)tetraetikkahappoa, laimennettiin edelleen sarjaksi (laimennus aina kaksinkertaiseen tilavuuteen) levylle.
Levya inkuboitiin edella kuvatulla tavalla solujen sito-miseksi vasta-aineeseen, pestiin pesupuskurilla, inkuboi-15 tiin merkkiaineliuoksen kanssa, joka sisalsi 0,005 mg/ml alkaliseen fosfataasiin kytkettya anti-adenovirusta pesu-puskurissa, joka sisMlsi 0,5 % gelatiinia ja 10 % inak-tivoitua naudan sikioseerumia. Ylimååråinen merkkiaine- liuos dekantoitiin, ja levy pestiin kolmesti Tris-pusku- -4 20 rilla (ei kaseiinia). Seos, joka sisalsi 1 x 10 mol/1 -9 suojattua inhibiittoria (esimerkki I) ja 5 x 10 mol/1 RLE:tå 50 mM Tris-puskurissa (pH 8,5), lisattiin, ja mal-jaa inkuboitiin huoneen låmpotilassa 10 min. Sitten mal-jan kuhunkin syvennykseen lisattiin o-nitrofenyylibuty-25 raattia (1 mmol/1).
Vertailusyvennyksisså, joissa ei ollut antigeenia, tapahtui paljain silmin havaittavissa olevan vårin kehit-tyminen tyypillisesti noin 15 min:ssa, ja vapaan inhi-biittorin (esimerkin I tuote B) lisaaminen vertailusy-30 vennyksiin esti vårin muodostumisen pitkåhkQksi ajaksi. Testisyvennykset, joissa oli antigeenilaimennoksia, pysy ivåt vårittominå yli 15 min.
Kuva esittåå vårin muodostumisen riippuvuutta an-tigeenipitoisuudesta mååritettyna Beckman DU7 -spektro-35 fotometrill'å 20 min:n kuluttua kromogeenin lisååmisestå.
32
Havaitaan, etta vertailusyvennyksisså olevan liuoksen optinen tiheys (OD) on suurin piirtein vakio, 0,24, ja etta testisyvennyksissa olevien liuosten OD on kååntaen verrannollinen antigeenipitoisuuteen ja låhestyy vertai-5 lunaytteen arvoa hyvin pienillå antigeenipitoisuuksilla.
Yhteenvetona todettakoon, etta, keksinto tarjoaa kay-tettavaksi menetelman nestenSytteessa hyvin pienina pi-toisuuksina esiintyvdn ligandin detektoimiseksi tai maa-rittåmiseksi. Kun ligandi, antiligandi ja merkkiaine on 10 kytketty, sitoutunut faasi erotetaan ja saatetaan koske-tukseen toisen entsyymin ja suojatun modulaattorin kans-sa, jolloin merkkiaineen ensimmåinen entsyymi-komponentti poistaa suojausryhman, jolloin toisen entsyymin modulaat-tori vapautuu. Tuloksena oleva modulaattori vaikuttaa subs-15 traatin muuttumiseen tuotteeksi toisen entsyymin vaiku-tuksesta, joka saa aikaan detektoitavissa olevan signaa-lin. Signaalin detektointi osoittaa ligandin lasna- tai poissaolon naytteessM. Mittaamalla signaalin suuruus voi-daan maSrittaa ligandin pitoisuus. Modulaattori ja toinen 20 entsyymi toteuttavat kaksi vahvistusvaihetta, jolloin signaali voimistuu 10°-kertaiseksi tai enemman, mikS mahdollistaa signaalin havaitsemisen paljain silmin jopa sadasosassa siita ajasta, jonka tavanomainen EIA vaatii.
II

Claims (9)

91193 33
1. Menetelma nesteesså olevan ligandin detektoimi-seksi, tunnettu siita, etta 5 (a) yhdistetåån enslmmainen neste, jonka epSiliaSn sisåltMvMn ligandia, kiinteSMn kantajaan immobilisoituun antiligandiin ja merkkiaineeseen, joka sisaitaa ensim-maista entsyymia, jolloin antiligandi sltoutuu ligandiin ja merkkiaine sitoutuu joko antiligandiin tai ligandiin, 10 jolloin muodostuu kantajalle sitoutunut faasi; (b) erotetaan kantaja mainitusta ensimmaisestM nesteesta; (c) saatetaan kantaja kosketukseen toisen nesteen kanssa, joka sisaitaa toista entsyymia ja suojattua fluo- 15 riketoni-inhibiittoria, jolloin mainittu ensimmSinen ent-syymi muuttaa suojatun fluoriketoni-inhibiittorin fluori-ketoni-inhibiittoriksi ja vapauttaa mainitun inhibiitto-rin mainittuun toiseen nesteeseen; (d) lisåtåån mainittuun toiseen nesteeseen maini- 20 tun toisen entsyymin substraattia, jolloin mainittu in- hibiittori estaå mainitun substraatin muuttumisen tuot-teeksi mainitun toisen entsyymin vaikutuksesta; ja (e) detektoidaan mainittu ligandi mainittuun muu-tokseen liittyvSn signaalin avulla.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelméi, tunnettu siita, etta ensimmainen entsyymi on hyd-rolaasi.
3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelma, tunnettu siita, etta hydrolaasi on alkalinen fos- 30 fataasi.
4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelma, tunnettu siita, etta toinen entsyymi on hydrolaasi.
5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelma, 35 tunnettu siita, etta hydrolaasi on asetyylikolii- niesteraasi, butyylikoliiniesteraasi, karboksiesteraasi, 34 trypsiini, kymotrypsiini tai pepsiini.
6. Patenttivaatimuksen 1 mukaisessa menetelmåsså kåyttokelpoinen vålineisto, joka sisåltåå materiaalit li-gandimåårityksen tekemiseksi, tunnettu siitå, 5 ettS se sisaltaa ligandin antiligandia, ensimmMistS ent-syymia ja toisen entsyymin suojattua fluoriketoni-inhi-biittoria.
7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen vSlineisto, tunnettu siitå, etta mainittu antiligandi on im- 10 mobilisoitu kiinteåån kantajaan.
8. Patenttivaatimuksen 6 mukainen vålineisto, tunnettu siitå, ettå se sisåltåå lisaksi mainit-tua toista entsyymiå.
9. Patenttivaatimuksen 6 mukainen vålineisto, 15 tunnettu siitå, ettå se sisåltåå lisåksi våhin-tåån yhtå muuta reagenssia, joita ovat entsyymin subs-traatti, antigeeni, vasta-aine ja vasta-ainekompleksi, puskuriliuos ja fysiologinen suolaliuos. 91193 35
FI875070A 1986-11-20 1987-11-17 Menetelmä nesteessä olevan ligandin detektoimiseksi ja menetelmässä käyttökelpoinen välineistö FI91193C (fi)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US93295186 1986-11-20
US06/932,951 US4835099A (en) 1986-11-20 1986-11-20 Signal enhancement in immunoassay by modulation of enzymatic catalysis

Publications (4)

Publication Number Publication Date
FI875070A0 FI875070A0 (fi) 1987-11-17
FI875070A FI875070A (fi) 1988-05-21
FI91193B FI91193B (fi) 1994-02-15
FI91193C true FI91193C (fi) 1994-05-25

Family

ID=25463199

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI875070A FI91193C (fi) 1986-11-20 1987-11-17 Menetelmä nesteessä olevan ligandin detektoimiseksi ja menetelmässä käyttökelpoinen välineistö

Country Status (11)

Country Link
US (2) US4835099A (fi)
EP (2) EP0501526B1 (fi)
JP (1) JPH0641950B2 (fi)
AT (2) ATE96911T1 (fi)
AU (1) AU603144B2 (fi)
CA (1) CA1287575C (fi)
DE (2) DE3788048T2 (fi)
DK (1) DK612587A (fi)
FI (1) FI91193C (fi)
NZ (1) NZ222266A (fi)
ZA (1) ZA877719B (fi)

Families Citing this family (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4835099A (en) * 1986-11-20 1989-05-30 Becton, Dickinson And Company Signal enhancement in immunoassay by modulation of enzymatic catalysis
US4962024A (en) * 1988-08-11 1990-10-09 Becton, Dickinson And Company Signal enhancement in assay for an enzyme
US5081274A (en) * 1988-09-19 1992-01-14 Nitto Boseki Co., Ltd. 4-acyl-2,6-dihalophenyl-phosphoric acid derivatives useful in the determination of acid phosphatase activity
US5227291A (en) * 1988-09-19 1993-07-13 Nitto Boseki Co., Ltd. Method for determination of acid phosphatase activity using 4-acyl-2, 6-dihalophenyl phosphoric acid derivatives
MY104234A (en) * 1988-11-17 1994-02-28 Becton Dickinson Co Immunoassay on a preblocked solid surface
US5208143A (en) * 1988-11-17 1993-05-04 Becton, Dickinson And Company Immunoassay on a preblocked solid surface
CA2000678A1 (en) * 1988-11-17 1990-05-17 John E. Reardon Chromogenic substrate for esterase and immunoassay using same
IE900688A1 (en) * 1989-03-08 1991-02-13 Becton Dickinson Co Signal enhancement in magnetic immunoassay by inhibition of¹enzymatic catalysis
US5196306A (en) * 1989-03-29 1993-03-23 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method for the detection or quantitation of an analyte using an analyte dependent enzyme activation system
US5188937A (en) * 1989-04-06 1993-02-23 Becton, Dickinson And Company Layered sandwich assay method for chlamydia and materials therefor
EP0403713A1 (en) * 1989-06-22 1990-12-27 Merrell Dow Pharmaceuticals Inc. Novel acetylcholinesterase inhibitors
US5693668A (en) * 1989-06-22 1997-12-02 Merrell Pharmaceuticals Inc. Acetylcholinesterase inhibitors
WO1991003544A1 (en) * 1989-08-29 1991-03-21 The Regents Of The University Of California Novel hydrolytic enzyme inhibitors and substrates and assays, methods and kits embodying same
US5352673A (en) * 1989-08-29 1994-10-04 Dennis Edward A Prodrugs
US5308766A (en) * 1989-08-29 1994-05-03 The Regents Of The University Of California Hydrolytic enzyme inhibitors/inactivators and methods for using same
US5972630A (en) * 1991-08-19 1999-10-26 Dade Behring Marburg Gmbh Homogeneous immunoassays using enzyme inhibitors
US5279937A (en) * 1992-04-30 1994-01-18 Detechnology Canada Use of macroglobulins to improve the signal-to-background ratio in affinity binding assays
US5523442A (en) * 1993-02-16 1996-06-04 Merrell Pharmaceuticals Inc. Silylated acetylcholinesterase inhibitors
EP0627400A1 (en) * 1993-06-04 1994-12-07 Merrell Dow Pharmaceuticals Inc. Aromatic acetylcholinesterase inhibitors
US5589328A (en) * 1994-08-04 1996-12-31 Mahant; Vijay K. Chemiluminescence assays based on indoxyl substrates, thioindoxyl substrates and other substrates
US5843666A (en) * 1994-09-02 1998-12-01 Lumigen, Inc. Chemiluminescent detection methods using dual enzyer-labeled binding partners
JP3334558B2 (ja) * 1997-04-23 2002-10-15 富士レビオ株式会社 酵素免疫測定方法及び試験片
US6140046A (en) * 1997-07-31 2000-10-31 University Of Florida Detection and differentiation of specific strains of citrus tristeza virus
US6682903B2 (en) 2000-10-14 2004-01-27 Alex M. Saunders Ligand based solution assay for low concentration analytes
US20020142361A1 (en) * 2001-03-27 2002-10-03 Emmert-Buck Michael R. Biodetection method
US20030119203A1 (en) * 2001-12-24 2003-06-26 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Lateral flow assay devices and methods for conducting assays
DE10220935B3 (de) * 2002-05-10 2004-02-05 Siemens Ag Verfahren für die biochemische Analytik von DNA und zugehörige Anordnung
US7432105B2 (en) * 2002-08-27 2008-10-07 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Self-calibration system for a magnetic binding assay
US7285424B2 (en) * 2002-08-27 2007-10-23 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Membrane-based assay devices
US7781172B2 (en) 2003-11-21 2010-08-24 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Method for extending the dynamic detection range of assay devices
US20040121334A1 (en) * 2002-12-19 2004-06-24 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Self-calibrated flow-through assay devices
AU2004224317B2 (en) * 2003-03-21 2009-11-12 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, Centers For Disease Control And Prevention Finding usable portion of sigmoid curve
US7713748B2 (en) 2003-11-21 2010-05-11 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Method of reducing the sensitivity of assay devices
US7943395B2 (en) 2003-11-21 2011-05-17 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Extension of the dynamic detection range of assay devices
US20050191704A1 (en) * 2004-03-01 2005-09-01 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Assay devices utilizing chemichromic dyes
US7939342B2 (en) 2005-03-30 2011-05-10 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Diagnostic test kits employing an internal calibration system
US7858384B2 (en) * 2005-04-29 2010-12-28 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Flow control technique for assay devices
US7803319B2 (en) * 2005-04-29 2010-09-28 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Metering technique for lateral flow assay devices
US7439079B2 (en) 2005-04-29 2008-10-21 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Assay devices having detection capabilities within the hook effect region
US8003399B2 (en) * 2005-08-31 2011-08-23 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Nitrite detection technique
US7829347B2 (en) * 2005-08-31 2010-11-09 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Diagnostic test kits with improved detection accuracy
US7504235B2 (en) * 2005-08-31 2009-03-17 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Enzyme detection technique
US7279136B2 (en) * 2005-12-13 2007-10-09 Takeuchi James M Metering technique for lateral flow assay devices
US7618810B2 (en) * 2005-12-14 2009-11-17 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Metering strip and method for lateral flow assay devices
WO2008013963A2 (en) * 2006-07-28 2008-01-31 University Of Connecticut Fatty acid amide hydrolase inhibitors
US20080057528A1 (en) * 2006-08-30 2008-03-06 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Detection of hydrogen peroxide released by enzyme-catalyzed oxidation of an analyte
US8012761B2 (en) * 2006-12-14 2011-09-06 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Detection of formaldehyde in urine samples
US8377379B2 (en) * 2006-12-15 2013-02-19 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Lateral flow assay device
US7846383B2 (en) * 2006-12-15 2010-12-07 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Lateral flow assay device and absorbent article containing same
US7935538B2 (en) * 2006-12-15 2011-05-03 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Indicator immobilization on assay devices
US20100290948A1 (en) * 2009-05-15 2010-11-18 Xuedong Song Absorbent articles capable of indicating the presence of urinary tract infections
ES2754402T3 (es) 2013-04-01 2020-04-17 Becton Dickinson Co Métodos y kits para el diagnóstico del virus de la gripe

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IT1105734B (it) * 1977-07-14 1985-11-04 Syva Co Prova di legame di competizione di antienzima omogeneo
US4233402A (en) * 1978-04-05 1980-11-11 Syva Company Reagents and method employing channeling
US4492751A (en) * 1978-04-10 1985-01-08 Miles Laboratories, Inc. Heterogenous specific binding assay employing an enzyme substrate as label
US4446231A (en) * 1979-10-03 1984-05-01 Self Colin H Immunoassay using an amplified cyclic detection system
GB2059421A (en) * 1979-10-03 1981-04-23 Self C H Assay method and reagents therefor
EP0060123B1 (en) * 1981-03-07 1986-10-29 Colin Henry Self Assay and use
US4463090A (en) * 1981-09-30 1984-07-31 Harris Curtis C Cascade amplification enzyme immunoassay
AU574646B2 (en) * 1982-07-19 1988-07-14 Cooperbiomedical Inc. Enzyme assay method
DE3303871A1 (de) * 1983-02-05 1984-08-09 Bayer Ag, 5090 Leverkusen Fluorogene phosphorsaeureester, verfahren zu deren herstellung sowie verfahren und mittel zum nachweis und zur fluorimetrischen bestimmung von phosphatasen
GB8407736D0 (en) * 1984-03-26 1984-05-02 Univ London Detecting specific polynucleotide sequences
US4837395A (en) * 1985-05-10 1989-06-06 Syntex (U.S.A.) Inc. Single step heterogeneous assay
US4693970A (en) * 1985-06-21 1987-09-15 Becton, Dickinson And Company Immunoassay using complement
US4835099A (en) * 1986-11-20 1989-05-30 Becton, Dickinson And Company Signal enhancement in immunoassay by modulation of enzymatic catalysis

Also Published As

Publication number Publication date
AU603144B2 (en) 1990-11-08
US5344952A (en) 1994-09-06
DK612587A (da) 1988-05-21
DE3788048T2 (de) 1994-05-19
FI875070A (fi) 1988-05-21
EP0271731A2 (en) 1988-06-22
FI875070A0 (fi) 1987-11-17
ATE96911T1 (de) 1993-11-15
DE3751723D1 (de) 1996-04-04
JPS63212866A (ja) 1988-09-05
NZ222266A (en) 1989-07-27
EP0501526A2 (en) 1992-09-02
ATE134606T1 (de) 1996-03-15
EP0271731B1 (en) 1993-11-03
EP0501526B1 (en) 1996-02-28
FI91193B (fi) 1994-02-15
DE3788048D1 (de) 1993-12-09
JPH0641950B2 (ja) 1994-06-01
EP0501526A3 (en) 1992-09-09
ZA877719B (en) 1988-04-20
US4835099A (en) 1989-05-30
DE3751723T2 (de) 1996-07-11
DK612587D0 (da) 1987-11-20
CA1287575C (en) 1991-08-13
EP0271731A3 (en) 1990-10-24
AU7974987A (en) 1988-05-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI91193C (fi) Menetelmä nesteessä olevan ligandin detektoimiseksi ja menetelmässä käyttökelpoinen välineistö
US5582980A (en) Chemiluminescent 1,2-dioxetanes
US6001659A (en) Assays using chemiluminescent electron-rich aryl-substituted 1,2-dioxetanes
US6514717B2 (en) Kit for conducting an assay to detect a substance using enzymatically-induced decomposition of dioxetanes
US6235464B1 (en) Immunoassay on a preblocked solid surface
US4962024A (en) Signal enhancement in assay for an enzyme
US5188937A (en) Layered sandwich assay method for chlamydia and materials therefor
US5605795A (en) Assays using chemiluminescent, enzymatically cleavable substituted 1,2-dioxetanes and kits therefor
EP0516948A1 (en) Chemiluminescent method and compositions
EP0369657A2 (en) Chromogenic substrate for esterase and immunoassay using same
JPH07184691A (ja) 化学発光によるホスファターゼの酵素活性測定法

Legal Events

Date Code Title Description
BB Publication of examined application
MM Patent lapsed
MM Patent lapsed

Owner name: BECTON, DICKINSON AND COMPANY