ES2754402T3 - Métodos y kits para el diagnóstico del virus de la gripe - Google Patents

Abstract

Un método para detectar un virus de la gripe de tipo A o B y para detectar la actividad de la neuraminidasa en una muestra, en donde el método comprende: (a) poner en contacto una muestra con un tampón de inmunoensayo adaptado para un inmunoensayo para la detección de un virus de la gripe de tipo A o de un virus de la gripe de tipo B, gracias a lo cual se obtiene una muestra problema para el inmunoensayo; (b) poner en contacto una primera porción de la muestra problema para el inmunoensayo con una prueba que comprende un inmunoensayo para la detección de un virus de la gripe de tipo A o de tipo B, gracias a lo cual se detecta la presencia o la ausencia del virus de la gripe de tipo A o de tipo B en la muestra; (c) poner en contacto una segunda porción de la muestra problema para el inmunoensayo con una matriz cambiadora que comprende un tampón para el ensayo de la neuraminidasa, gracias a lo cual se obtiene una muestra problema de la neuraminidasa; y (d) poner en contacto la muestra problema de la neuraminidasa con un ensayo de actividad de la neuraminidasa, gracias a lo cual se detecta la actividad de la neuraminidasa en la muestra.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos y kits para el diagnóstico del virus de la gripe

CAMPO DE LA INVENCIÓN

Algunas realizaciones dadas a conocer en la presente memoria se refieren a métodos, composiciones, dispositivos y sistemas para pruebas del virus de la gripe en los puntos de asistencia. Algunas realizaciones se refieren a ensayos combinados. En algunas realizaciones, un ensayo para identificar el virus de la gripe de tipo A o el virus de la gripe de tipo B se combina con un ensayo para determinar la sensibilidad que una neuraminidasa del virus de la gripe tiene a un antivírico.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El virus de la gripe es una amenaza constante y grave para la salud pública. Cada año, los padecimientos relacionados con la gripe conducen a aproximadamente 200000 hospitalizaciones y 36000 muertes en los Estados Unidos. Desde una perspectiva del impacto nacional, el coste económico total de la gripe en 2010 se estimó en 29 mil millones de dólares. El tratamiento antivírico contra la gripe es eficaz cuando se administra como un tratamiento o se administra para la profilaxis de una manera programada. Varios estudios concluyen que los fármacos contra la neuraminidasa reducen la duración de los síntomas. Tanto Tamiflu como Relenza tienen una eficacia del 80% a la hora de proteger contra la gripe estacional. Cuando se trata a los pacientes que tienen gripe, se recomienda que el paciente comience el tratamiento antes de que pasen 48 h desde la aparición de los síntomas y mejor cuanto más pequeño sea el retraso. El diagnóstico inmediato y el inicio del tratamiento antivírico conducen al mejor desenlace del paciente.

Sobre la base de la resistencia generalizada a los bloqueantes del canal M2, resulta razonable especular que el uso generalizado de los inhibidores de la neuraminidasa puede finalmente conducir a una aparición de resistencias a ellos en los virus de la gripe estacional o pandémica. Durante los estudios clínicos se han identificado una serie de mutantes resistentes al inhibidor de la neuraminidasa. En un periodo de seguimiento de tres años, se aislaron ocho variantes del virus con una disminución de la sensibilidad al oseltamivir de más de 10 veces. Estos hallazgos debieron sugerir una pausa con respecto a la distribución masiva de los fármacos basados en el inhibidor de la neuraminidasa para el tratamiento de la gripe estacional. En 2010, la OMS se ocupó de la primera consulta global sobre la resistencia a los antivirus en Hong Kong, después de la aparición del virus de la gripe con resistencia transmisible al oseltamivir durante el invierno de 2007-2008, y se detectó la resistencia al oseltamivir en la cepa HSN1 y en el virus de la gripe pandémica H1N1 (2009). Un desenlace clave de esta consulta fue el requisito de informar formalmente del estado de la resistencia al antivírico contra la gripe, bien en entornos clínicos o como parte del seguimiento nacional. Además, algunos antivíricos, como el oseltamivir, provocan efectos adversos, lo que es importante para recetarlo solo cuando sea necesario. La cobertura de los diferentes fármacos antivíricos puede variar entre los proveedores y tener un coste diferente para el paciente. El médico tiene la responsabilidad de recetar solo cuando sea necesario. Aunque el coste sea menos importante que la eficacia, si un paciente puede conseguir un fármaco menos caro, el médico tiene la obligación de informarle de dicha opción. En consecuencia, no se ha satisfecho la necesidad de pruebas en el punto de atención que puedan ofrecer un diagnóstico de una cepa específica para evitar los efectos adversos, lo que enlentece la evolución de la resistencia al fármaco y proporciona un ahorro al paciente y al sistema de asistencia sanitaria de los Estados Unidos.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un método para detectar un virus de la gripe de tipo A o B y detectar la actividad de la neuraminidasa en una muestra, en donde el método comprende:

(a) poner en contacto una muestra con un tampón de inmunoensayo adaptado para un inmunoensayo de detección de un virus de la gripe de tipo A o un virus de la gripe de tipo B, gracias a lo cual se obtiene una muestra problema para el inmunoensayo;

(b) poner en contacto una primera porción de la muestra problema para el inmunoensayo con una prueba que comprende un inmunoensayo para la detección de un virus de la gripe de tipo A o de tipo B, gracias a lo cual se detecta la presencia o la ausencia del virus de la gripe de tipo A o de tipo B en la muestra;

(c) poner en contacto una segunda porción de la muestra problema para el inmunoensayo con una matriz de intercambio que comprende un tampón para el ensayo de la neuraminidasa, por lo que se obtiene una muestra problema de la neuraminidasa; y

(d) poner en contacto la muestra problema de la neuraminidasa con un ensayo de actividad de la neuraminidasa, gracias a lo cual se detecta la actividad de la neuraminidasa en la muestra.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un sistema diagnóstico para detectar el virus de la gripe de tipo A o B y para determinar la actividad de la neuraminidasa en una muestra, en donde el sistema diagnóstico comprende:

un cartucho para determinar la actividad de la neuraminidasa en una muestra, en donde el cartucho está configurado para que convierta una muestra que comprende un tampón incompatible para la determinación en una muestra que comprende un tampón compatible para la determinación;

una prueba para detectar el virus de la gripe de tipo A o de tipo B en la muestra, en donde la prueba está configurada para que convierta una muestra que comprende un tampón incompatible para la detección en una muestra que comprende un tampón compatible para la detección;

un primer detector configurado para medir una señal desde la prueba, y

un segundo detector configurado para medir una señal desde el cartucho, en donde el cartucho comprende una cámara para la matriz que comprende una matriz de cartucho que comprende el tampón compatible para la determinación, y una cámara de reactivos que comprende los reactivos para la determinación de la actividad de la neuraminidasa, en donde la matriz del cartucho comprende un polisacárido reticulado y, en donde la cámara para la matriz y la cámara para el cartucho están en comunicación fluídica de tal manera que una muestra aplicada en la cámara para la matriz fluye desde la cámara para la matriz hasta la cámara de reactivos.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un kit para detectar el virus de la gripe de tipo A o de tipo B y determinar la actividad de la neuraminidasa en una muestra, en donde el kit comprende:

un cartucho para determinar la actividad de la neuraminidasa en una muestra, en donde el cartucho está configurado para que convierta una muestra que comprende un tampón incompatible para la determinación en una muestra que comprende un tampón compatible para la determinación, en donde el cartucho comprende una cámara para la matriz que comprende una matriz de cartucho que comprende el tampón compatible para la determinación, y una cámara de reactivos que comprende los reactivos para la determinación de la actividad de la neuraminidasa, en donde la matriz del cartucho comprende un polisacárido reticulado, y en donde la cámara para la matriz y la cámara para el cartucho están en comunicación fluídica de tal forma que una muestra aplicada en la cámara para la matriz fluye desde la cámara para la matriz hasta la cámara de reactivos; y

una prueba para detectar el virus de la gripe de tipo A o tipo B en la muestra, en donde la prueba está configurada para que convierta una muestra que comprende un tampón incompatible para la detección en una muestra que comprende un tampón compatible para la detección.

Aún otro aspecto de la presente invención se refiere a un compuesto inhibidor enmascarado para ser usado en un ensayo enzimático dual de sensibilidad de la neuraminidasa del virus de la gripe que tiene la estructura de la fórmula (I):

R1, R2 y R3 son cada uno independientemente hidrógeno o alquilo(Ci-5);

n es 0, 1, 2 o 3;

R4 es -(CH2)mC(=O)CF3;

m es 0 o 1;

X es -S(O)z- o -CH(R5)-;

R5 es -S(O)zCH3; y

z es 0, 1 o 2.

Algunas realizaciones de los métodos, kits, sistemas y composiciones dados a conocer en la presente memoria incluyen un método para detectar un virus de la gripe que comprende: (a) poner en contacto una muestra con un tampón de inmunoensayo adaptado para un inmunoensayo para la detección de un virus de la gripe del tipo A o un virus de la gripe del tipo B, gracias a lo cual se obtiene una muestra problema para el inmunoensayo; (b) poner en contacto una primera porción de la muestra problema para el inmunoensayo con una prueba que comprende un inmunoensayo para la detección del virus de la gripe de tipo A o B, gracias a lo cual se detecta la presencia o ausencia del virus de la gripe de tipo A o tipo B en la muestra; (c) poner en contacto una segunda porción de la muestra problema para el inmunoensayo con una matriz que comprende un tampón para el ensayo de la neuraminidasa, gracias a lo cual se obtiene una muestra problema de la neuraminidasa; y (d) poner en contacto la muestra problema de la neuraminidasa con un ensayo de la neuraminidasa, gracias a lo cual se detecta la presencia de una neuraminidasa en la muestra. En algunas realizaciones, el tampón del inmunoensayo es incompatible con un ensayo de la actividad de la neuraminidasa. En algunas realizaciones, el tampón del inmunoensayo inhibe la actividad de la neuraminidasa. En algunas realizaciones, las etapas (c) y (d) se realizan en el mismo recipiente.

Algunas realizaciones dadas a conocer en la presente memoria incluyen un método para detectar un virus de la gripe que comprende: (a) poner en contacto una muestra con un tampón para el ensayo de la neuraminidasa adaptado para un ensayo de la neuraminidasa, gracias a lo cual se obtiene una muestra problema de la neuraminidasa; (b) poner en contacto una primera porción de la muestra problema de la neuraminidasa con una prueba que comprende un inmunoensayo para detectar un virus de la gripe de tipo A o tipo B, en donde la muestra problema de la neuraminidasa entra en contacto con una matriz que comprende el tampón del inmunoensayo, gracias a lo cual se obtiene una muestra problema para el inmunoensayo y se detecta la presencia o la ausencia del virus de la gripe de tipo A o de tipo B en la muestra; y (c) poner en contacto una segunda porción de la muestra problema de la neuraminidasa con un ensayo de la neuraminidasa, gracias a lo cual se detecta la presencia de una neuraminidasa en la muestra. En algunas realizaciones, el tampón para el ensayo de la neuraminidasa es incompatible con un inmunoensayo para la detección de la gripe de tipo A o de tipo B. En algunas realizaciones, el tampón para el ensayo de la neuraminidasa inhibe la fijación específica de un anticuerpo a un antígeno seleccionado del grupo que consiste en el virus de la gripe de tipo A o la gripe de tipo B. En algunas realizaciones, la matriz comprende el tampón de inmunoensayo liofilizado o seco. En algunas realizaciones, la etapa (c) se realiza en un recipiente que comprende numerosas cámaras.

En algunas realizaciones de los métodos para detectar un virus de la gripe, el recipiente comprende numerosas cámaras. En algunas realizaciones, el recipiente comprende una cámara que comprende la matriz y una cámara que comprende los reactivos para el ensayo de la neuraminidasa. En algunas realizaciones, la matriz comprende un polisacárido reticulado. En algunas realizaciones, la matriz se selecciona del grupo que consiste en Sephadex y Sepharose.

En algunas realizaciones, la muestra problema para el inmunoensayo y la muestra problema de la neuraminidasa se desplazan por el recipiente mediante una o varias fuerzas seleccionadas de gravedad, acción capilar y difusión. En algunas realizaciones, el recipiente comprende un cartucho. En algunas realizaciones, el recipiente comprende un cartucho con numerosos pocillos adaptado para ser leído con un fotomultiplicador. En algunas realizaciones, el fotomultiplicador se selecciona del grupo que consiste en un tubo fotomultiplicador y un tubo microfotomultiplicador. En algunas realizaciones, el fotomultiplicador es portátil. En algunas realizaciones, el fotomultiplicador es un lector portátil idóneo para la consulta del médico de atención primaria. En algunas realizaciones, la superficie del tubo fotomultiplicador es redonda y tiene un diámetro de aproximadamente 6 mm a 9 mm, o el tubo microfotomultiplicador es rectangular y tiene un tamaño de aproximadamente 1 mm a 3 mm.

En algunas realizaciones, el ensayo de la neuraminidasa comprende la determinación de la sensibilidad de una neuraminidasa a un compuesto problema. En algunas realizaciones, el ensayo de la neuraminidasa comprende: (a) obtener un índice para el valor de la inhibición, en donde el índice comprende el nivel de actividad de la neuraminidasa en presencia de un compuesto problema con respecto al nivel de actividad de la neuraminidasa en ausencia del compuesto problema; y (b) comparar el índice para el valor de la inhibición con un umbral de inhibición, gracias a lo cual se determina la sensibilidad que presenta la actividad de la neuraminidasa al compuesto problema. En algunas realizaciones, el umbral de inhibición se determina mediante la detección de un virus de tipo A o de tipo B. En algunas realizaciones, se utiliza un primer umbral de inhibición si se detecta el virus de tipo A, y se utiliza un segundo umbral de inhibición si se detecta el virus de tipo B. En algunas realizaciones, el primer umbral es más bajo que el segundo umbral. En algunas realizaciones, el umbral de inhibición se establece con el compuesto problema.

Otra descripción más se refiere a la selección del compuesto problema para el tratamiento del virus de la gripe. En algunas realizaciones, el ensayo de la neuraminidasa comprende un ensayo enzimático dual que comprende una enzima delatora. En algunas realizaciones, la actividad de la neuraminidasa produce un sustrato para la enzima delatora. En algunas realizaciones, el ensayo de la neuraminidasa comprende un conjugado de un ácido de W-acetilneuramínico y luciferina o un derivado de los mismos. En algunas realizaciones, la actividad de la neuraminidasa produce un inhibidor de la enzima delatora. En algunas realizaciones, el ensayo de la neuraminidasa comprende un conjugado de un ácido de W-acetilneuramínico y una trifluorometilcetona o un derivado de los mismos. En algunas realizaciones, la enzima delatora comprende la luciferasa. En algunas realizaciones, el tampón del inmunoensayo inhibe la actividad de la luciferasa. En algunas realizaciones, el nivel de actividad de la neuraminidasa se mide con un tubo fotomultiplicador.

En algunas realizaciones, el compuesto problema es un antivírico. En algunas realizaciones, el compuesto problema es un antivírico seleccionado del grupo que consiste en oseltamivir, zanamivir, lanamivir y peramivir.

En algunas realizaciones, el inmunoensayo comprende un ensayo de tipo sándwich.

En algunas realizaciones, la muestra se obtiene de un sujeto. En algunas realizaciones, se sospecha que el sujeto tiene el virus de gripe. En algunas realizaciones, el sujeto es humano.

Otra descripción más dada a conocer en la presente memoria se refiere a un método para seleccionar un tratamiento contra un virus de la gripe que comprende: (a) poner en contacto una muestra con un tampón de inmunoensayo adaptado para un inmunoensayo para detectar un virus de la gripe de tipo A o un virus de la gripe de tipo B, gracias a lo cual se obtiene una muestra problema para el inmunoensayo; (b) poner en contacto una primera porción de la muestra problema para el inmunoensayo con una prueba que comprende un inmunoensayo para detectar la gripe de tipo A o tipo B, gracias a lo cual se detecta la presencia o la ausencia del virus de la gripe de tipo A o de tipo B en la muestra; (c) poner en contacto una segunda porción de la muestra problema para el inmunoensayo con una matriz que comprende un tampón para el ensayo de la neuraminidasa, gracias a lo cual se obtiene una muestra problema de la neuraminidasa; (d) poner en contacto la muestra problema de la neuraminidasa con un ensayo de la neuraminidasa, gracias a lo cual se determina la sensibilidad que presenta una neuraminidasa de la muestra problema de la neuraminidasa a un compuesto problema, en donde la determinación comprende: (i) obtener un índice para el valor de la inhibición, en donde el índice comprende el nivel de actividad de la neuraminidasa en presencia de uno o varios compuestos problema con respecto al nivel de actividad de la neuraminidasa en ausencia de uno o varios compuestos problema, y (ii) comparar el índice para el valor de la inhibición con un umbral de inhibición, gracias a lo cual se determina la sensibilidad que tiene la actividad de la neuraminidasa al compuesto problema; y (e) seleccionar un compuesto problema entre uno o varios compuestos problema que se determinó que inhibían la actividad de la neuraminidasa. En algunas realizaciones, el tampón del inmunoensayo es incompatible con un ensayo para la actividad de la neuraminidasa. En algunas realizaciones, el tampón del inmunoensayo inhibe la actividad de la neuraminidasa. En algunas realizaciones, las etapas (c) y (d) se realizan en el mismo recipiente.

Otra descripción más dada a conocer en la presente memoria se refiere a un método para seleccionar un tratamiento contra un virus de la gripe que comprende: (a) poner en contacto una muestra con un tampón para el ensayo de la neuraminidasa adaptado para un ensayo de la neuraminidasa, gracias a lo cual se obtiene una muestra problema de la neuraminidasa; (b) poner en contacto una primera porción de la muestra problema de la neuraminidasa con una prueba que comprende un inmunoensayo para detectar un virus de la gripe de tipo A o de tipo B, en donde la muestra problema de la neuraminidasa entra en contacto con una matriz que comprende el tampón del inmunoensayo, gracias a lo cual se obtiene una muestra problema para el inmunoensayo y se detecta la presencia o ausencia del virus de la gripe de tipo A o de tipo B en la muestra;

y (c) poner en contacto una segunda porción de la muestra problema de la neuraminidasa con un ensayo de la neuraminidasa, gracias a lo cual se determina la sensibilidad que tiene una neuraminidasa de la muestra problema de la neuraminidasa a un compuesto problema, en donde la determinación comprende: (i) obtener un índice para el valor de la inhibición, en donde el índice comprende el nivel de actividad de la neuraminidasa en presencia de uno o varios compuestos problema con respecto al nivel de actividad de la neuraminidasa en ausencia del uno o varios compuestos problema, y (ii) comparar el índice para el valor de la inhibición con un umbral de inhibición, gracias a lo cual se determina la sensibilidad que tiene la actividad de la neuraminidasa al compuesto problema; y (e) seleccionar un compuesto problema entre el uno o varios compuestos problema que se determinó que inhibían la actividad de la neuraminidasa. En algunas realizaciones, la matriz comprende el tampón de inmunoensayo liofilizado o si no seco. En algunas realizaciones, la etapa (c) se lleva a cabo en el mismo recipiente. En algunas realizaciones, la etapa (c) se lleva a cabo en un recipiente que comprende numerosas cámaras.

En algunas realizaciones de los métodos descritos en la presente memoria para seleccionar un tratamiento contra un virus de la gripe, el umbral de inhibición se determina mediante la detección del virus de tipo A o de tipo B. En algunas realizaciones, se utiliza un primer umbral de inhibición si se detecta el virus de tipo A, y se utiliza un segundo umbral de inhibición si se detecta el virus de tipo B. En algunas realizaciones, el primer umbral es menor que el segundo umbral.

En algunas realizaciones, el recipiente comprende una tira o cartucho con numerosos pocillos adaptado para ser leído con un tubo fotomultiplicador o con un tubo microfotomultiplicador. En algunas realizaciones, el tubo fotomultiplicador o el tubo microfotomultiplicador es portátil. En algunas realizaciones, el tubo fotomultiplicador es un lector portátil idóneo para la consulta de un médico de atención primaria. En algunas realizaciones, la superficie del tubo fotomultiplicador es redonda y tiene un diámetro de aproximadamente 6 mm a 9 mm, o el tubo microfotomultiplicador es rectangular y tiene un tamaño de aproximadamente 1 mm a 3 mm.

Algunos métodos descritos en la presente memoria también incluyen la selección del compuesto problema para el tratamiento contra el virus de la gripe.

En algunas realizaciones, el ensayo de la neuraminidasa comprende un ensayo enzimático dual que comprende una enzima delatora. En algunas realizaciones, la actividad de la neuraminidasa produce un sustrato para la enzima delatora. En algunas realizaciones, el ensayo de la neuraminidasa comprende un conjugado de un ácido N-acetilneuramínico y luciferina o un derivado de los mismos. En algunas realizaciones, la actividad de la neuraminidasa produce un inhibidor de la enzima delatora. En algunas realizaciones, el ensayo de la neuraminidasa comprende un conjugado de un ácido N-acetilneuramínico y una trifluorometilcetona o un derivado de los mismos. En algunas realizaciones, la enzima delatora comprende la luciferasa.

En algunas realizaciones, el nivel de actividad de la neuraminidasa se mide con un tubo fotomultiplicador.

En algunas realizaciones, el compuesto problema es un antivírico. En algunas realizaciones, el compuesto problema es un antivírico seleccionado del grupo que consiste en oseltamivir, zanamivir, lanamivir y peramivir. En algunas realizaciones, el inmunoensayo comprende un ensayo de tipo sándwich.

En algunas realizaciones, la muestra se obtiene de un sujeto. En algunas realizaciones, se sospecha que el sujeto tiene el virus de la gripe. En algunas realizaciones, el sujeto es humano. En algunas realizaciones, la muestra del sujeto se obtuvo de un sujeto y al sujeto se le recomendó tomar el compuesto problema seleccionado para tratar el virus de la gripe. En algunas realizaciones la muestra del sujeto se obtuvo de un sujeto y al sujeto se le proporcionó el compuesto problema seleccionado para tratar el virus de la gripe.

Algunas realizaciones incluyen un sistema diagnóstico para detectar el virus de la gripe que comprende: un cartucho para determinar la actividad de la neuraminidasa en una muestra, en donde el cartucho está configurado para que convierta una muestra que comprende un tampón incompatible para la determinación en una muestra que comprende un tampón compatible para la determinación; una prueba para detectar la gripe de tipo A o de tipo B en la muestra, en donde la prueba está configurada para que convierta una muestra que comprende un tampón incompatible para la detección en una muestra que comprende un tampón compatible para la detección; un primer detector está configurado para medir una señal desde la prueba; y un segundo detector está configurado para medir una señal desde el cartucho.

El cartucho comprende una cámara para la matriz que comprende una matriz de cartucho que comprende el tampón compatible para la determinación, y una cámara de reactivos que comprende los reactivos para la determinación de la actividad de la neuraminidasa. La matriz del cartucho comprende un polisacárido reticulado. En algunas realizaciones, la matriz del cartucho se selecciona del grupo que consiste en Sephadex y Sepharose. La cámara para la matriz y la cámara para el cartucho están en comunicación fluídica, de tal forma que una muestra aplicada a la cámara para la matriz fluye desde la cámara para la matriz hasta la cámara de reactivos. En algunas realizaciones, la muestra fluye en el cartucho gracias a una o varias fuerzas seleccionadas de gravedad, acción capilar y difusión.

En algunas realizaciones, el cartucho comprende un cartucho con numerosos pocillos adaptado para ser leído con un tubo fotomultiplicador o con un tubo microfotomultiplicador.

En algunas realizaciones, la prueba comprende un inmunoensayo. En algunas realizaciones, el inmunoensayo es un ensayo de tipo sándwich. En algunas realizaciones, la prueba comprende una matriz que comprende el tampón compatible para la detección. En algunas realizaciones, la matriz comprende nitrocelulosa. En algunas realizaciones, el tampón compatible para la detección está liofilizado o seco.

En algunas realizaciones, el primer detector comprende un luminómetro. En algunas realizaciones, el primer detector comprende un lector de reflectancia. En algunas realizaciones, el segundo detector comprende un tubo fotomultiplicador o un tubo microfotomultiplicador. En algunas realizaciones, un dispositivo comprende el primer y el segundo detector. En algunas realizaciones, el primer y el segundo detector son el mismo.

En algunas realizaciones, el dispositivo es portátil. En algunas realizaciones, el dispositivo cabe en la mano.

Algunas realizaciones incluyen un kit para detectar el virus de la gripe que comprende: un cartucho para determinar la actividad de la neuraminidasa en una muestra, en donde el cartucho está configurado para que convierta una muestra que comprende un tampón incompatible para la determinación en una muestra que comprende un tampón compatible para la determinación; y una prueba para detectar el virus de la gripe de tipo A o de tipo B en la muestra, en donde la prueba está configurada para que convierta una muestra que comprende un tampón incompatible para la detección en una muestra que comprende un tampón compatible para la detección. Algunas realizaciones incluyen un primer detector configurado para medir una señal desde la prueba; y un segundo detector configurado para medir una señal desde el cartucho. Algunas realizaciones incluyen reactivos para un ensayo de actividad de la neuraminidasa. En algunas realizaciones, los reactivos para el ensayo de actividad de la neuraminidasa se seleccionan del grupo que consiste en luciferasa, un conjugado de un ácido A/-acetilneuramínico y luciferina o un derivado de los mismos, un ácido W-acetilneuramínico y una trifluorometilcetona o un derivado de los mismos, y un antivírico. En algunas realizaciones, el antivírico se selecciona del grupo que consiste en oseltamivir, zanamivir, lanamivir y peramivir. Algunas realizaciones incluyen reactivos para un inmunoensayo. En algunas realizaciones, los reactivos para el inmunoensayo se seleccionan del grupo que consiste en un anticuerpo específico contra un antígeno del virus de la gripe de tipo A y un anticuerpo específico contra un antígeno del virus de la gripe de tipo B.

Algunas realizaciones incluyen un compuesto inhibidor enmascarado para ser usado en un ensayo enzimático dual de sensibilidad de la neuraminidasa que tiene la estructura de fórmula (I):

en donde: R1, R2 y R3 son cada uno independientemente hidrógeno o alquilo(C-i-5); n es 0, 1, 2 o 3; R4 es -(CH2)mC(=O)CFa; m es 0 o 1; X es -S(O)^z- o -CH(R5)-; R5 es -S(O)^zCH3; y z es 0, 1 o 2.

En algunas realizaciones, el compuesto de fórmula (I) se selecciona del grupo que consiste en:

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

En la figura 1 se representa una realización de una tira para la prueba del inmunoensayo y el lector para el sistema Ventor™ (Becton Dickinson).

En la figura 2 se representa una realización de un flujo de trabajo para la combinación de un inmunoensayo de flujo lateral y un ensayo de vulnerabilidad al fármaco.

En la figura 3 se representa una realización para determinar el índice de la señal en un ensayo de vulnerabilidad al fármaco.

En la figura 4 se representa una realización de una síntesis para un inhibidor enmascarado.

En la figura 5 se representa una realización de un cartucho para un ensayo de la neuraminidasa por cinética de flujo.

La figura 6 es un gráfico de las unidades luminosas relativas y la concentración de un control fluorescente medido con un lector portátil.

La figura 7 es un gráfico de las unidades luminosas relativas para los ensayos de la neuraminidasa, y se muestra la capacidad que tiene un ensayo enzimático dual para seleccionar el mejor antivírico contra la NA a usar en el tratamiento. En el ejemplo, Relenza supera a Tamiflu.

La figura 8 es un gráfico de los valores de inhibición para diferentes diluciones de diferentes virus de la gripe de tipo A, y demuestra que se puede utilizar un valor de inhibición distinto para discernir las cepas de la gripe A resistentes a fármacos de las cepas de la gripe A sensibles a fármacos, que es distinto del valor para las cepas de la gripe B, y BD ofrece la capacidad de tomar la decisión en un PDA, cuando la prueba de AST sigue a una convencional prueba de ID de la gripe que da a conocer si es de tipo A o B.

La figura 9 es un gráfico de los valores de inhibición para diferentes diluciones de diferentes virus de la gripe de tipo B, y demuestra que se puede utilizar un valor de inhibición distinto para discernir las cepas de la gripe B resistentes a fármacos de las cepas de la gripe B sensibles a fármacos, que es distinto del valor para las cepas de la gripe A, y BD ofrece la capacidad de tomar la decisión en un PDA, cuando la prueba de AST sigue a una convencional prueba de ID de la gripe que da a conocer si es de tipo A o B.

La figura 10 es un gráfico de los valores de inhibición para diferentes diluciones de mezclas de virus, y demuestra la capacidad que tiene la tecnología descrita en la presente memoria para señalar la presencia de cepas resistentes a los fármacos cuando están presentes en cultivos mixtos. Es incluso más significativa la capacidad demostrada para señalar el virus de la gripe muy resistente a fármacos que poseen la NA sensible al pH.

En la figura 11 se muestra la estructura química de un sustrato de la neuraminidasa de ejemplo, el NANA-CF3 (inhibidor enmascarado) y la trifluorocetona (inhibidor libre), utilizado en una realización de una cascada enzimática dual para la prueba de vulnerabilidad al antivirus.

En la figura 12 se representa una realización de una cascada enzimática dual completa en la que intervienen el inhibidor enmascarado y libre.

La figura 13 es un gráfico de dos ensayos enzimáticos duales diferentes, y muestra el margen de sensibilidad que se puede conseguir con la química de detección enzimática dual.

En la figura 14 se representa una realización de una tira para la prueba de flujo lateral del inmunoensayo, que incluye colocar previamente en la tira los reactivos de extracción de la nucleocápsida para el inmunoensayo.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

Algunas realizaciones de los métodos, composiciones, kits, dispositivos y sistemas dados a conocer en la presente memoria incluyen una combinación diagnóstica para el punto de asistencia (PDA) capaz de identificar el virus de la gripe A o de la B, y de guiar en el tratamiento con antivíricos. En algunas realizaciones, el personal médico con pocas habilidades de laboratorio puede poner en marcha una plataforma portátil. Algunas realizaciones incluyen una tecnología de flujo lateral para la detección del virus de la gripe con un ensayo para detectar cepas con resistencia al antivirus, directamente desde los aislados clínicos sin ninguna amplificación por cultivo celular.

Algunas realizaciones de los métodos y composiciones dados a conocer en la presente memoria incluyen ensayos de combinación en los que una muestra se analiza para (1) identificar el virus de la gripe de tipo A o de tipo B en la muestra; y (2) detectar la sensibilidad de la neuraminidasa del virus de la gripe a uno o varios fármacos antivíricos. Típicamente, una muestra preparada para ser usada en un inmunoensayo para identificar un virus de la gripe de tipo A o de tipo B es incompatible con su uso en un ensayo relacionado con la actividad de la neuraminidasa del virus. Por ejemplo, un tampón de lisis para ser usado en un inmunoensayo puede inhibir un ensayo de la actividad de la neuraminidasa. Las realizaciones de los métodos y composiciones dados a conocer en la presente memoria incluyen métodos para el uso de un inmunoensayo y un ensayo de actividad de la neuraminidasa de una única muestra en un tampón inicial compatible con uno de los ensayos. Algunas de tales realizaciones dan a conocer una prueba rápida para el tipo de virus de la gripe y ofrecen una guía para seleccionar un fármaco antivírico para el tratamiento.

Además, algunas realizaciones dadas a conocer en la presente memoria mejoran enormemente la sensibilidad de tales ensayos. En algunas realizaciones, un ensayo para identificar el tipo de virus de la gripe en una muestra informa ventajosamente del análisis de un ensayo para determinar la sensibilidad o la resistencia de una neuraminidasa del virus de la gripe a un antivírico. En algunas realizaciones, se puede seleccionar un valor de umbral de inhibición para un virus de tipo A o de tipo B para un fármaco antivírico en concreto y se puede utilizar para determinar si una neuraminidasa es sensible o resistente al fármaco antivírico.

Algunas realizaciones dadas a conocer en la presente memoria incluyen la integración de dos ensayos para que resulte más beneficioso para el paciente. Las realizaciones dadas a conocer en la presente memoria mejoran considerablemente la sensibilidad de un ensayo de identificación del virus de la gripe. Además, ambos ensayos se pueden realizar con el mismo volumen de espécimen. En algunas realizaciones, un tampón inicial de inmunoensayo y de extracción útil con tal ensayo puede permanecer intacto, con lo que un ensayo ya comercializado no es necesario someterlo a un nuevo ensayo clínico. En algunas realizaciones, un espécimen en un tampón idóneo para un inmunoensayo de la gripe para determinar el tipo de gripe se puede convertir en un espécimen en un tampón idóneo para un ensayo de sensibilidad farmacológica de la neuraminidasa. En algunas realizaciones, un espécimen en un tampón idóneo para un ensayo de sensibilidad farmacológica de la neuraminidasa se puede convertir en un espécimen en un tampón idóneo para un inmunoensayo del virus de la gripe para determinar el tipo de gripe. En algunas de las realizaciones precedentes, se puede producir la conversión en un periodo de tiempo idóneo para una prueba de diagnóstico en el punto de asistencia. En algunas realizaciones, el periodo de tiempo idóneo para una prueba de diagnóstico en el punto de asistencia puede incluir menos de aproximadamente 1 día, menos de aproximadamente 12 h, menos de aproximadamente 6 h, menos de aproximadamente 3 h, menos de aproximadamente 1 h, menos de aproximadamente 30 min, menos de aproximadamente 10 min, menos de aproximadamente 5 min, menos de aproximadamente 1 min, y un periodo entre cualquiera de los tiempos precedentes.

Algunas realizaciones de los métodos y composiciones dados a conocer en la presente memoria pueden dar a conocer valores de inhibición farmacológica específicos en los ensayos de sensibilidad farmacológica de la neuraminidasa que son notablemente más bajos que los de otros ensayos anteriores. Tales valores de inhibición farmacológica permiten determinar si una variante del virus de la gripe es resistente al fármaco o sensible al fármaco. La mejora de la sensibilidad da lugar a menos resultados erróneos, cuando se identifica que la gripe no es resistente al fármaco cuando en realidad sí lo es.

Algunas realizaciones incluyen un componente de identificación de la gripe que incluye un inmunoensayo de flujo lateral que utiliza una nanopartícula para la detección, se centra en la presencia de la nucleocápsida del virus de la gripe, y tiene un lector capaz de enviar de manera automática el resultado de la tipificación de la gripe (gripe A frente a gripe B) al módulo del lector y, gracias a ello, se aplica el valor de inhibición farmacológica más adecuado a utilizar en una prueba posterior para diferenciar la sensibilidad al fármaco de la resistencia al fármaco. En algunas realizaciones, el componente de identificación de la gripe envía la información con respecto al tipo de gripe al componente de sensibilidad al fármaco sin ninguna otra intervención humana.

Algunas realizaciones incluyen un ensayo enzimático dual o de dos enzimas para la prueba de vulnerabilidad al fármaco que hace uso de la actividad de la neuraminidasa del virus de la gripe y, gracias a esto, la primera enzima (neuraminidasa) actúa sobre un primer sustrato que libera un segundo sustrato que puede actuar sobre una segunda enzima implicada en la generación de la señal delatora.

Varias versiones de un ensayo de dos enzimas o un ensayo enzimático dual son compatibles con las realizaciones descritas en la presente memoria. En algunas realizaciones, el resultado de la primera reacción entre el sustrato y la enzima puede ser un sustrato que influye sobre una segunda enzima, donde la señal se incrementa con más antígeno del virus de la gripe y disminuye cuando está presente un antivírico eficaz contra la gripe. En algunas realizaciones, el resultado de la primera reacción entre el sustrato y la enzima puede ser un compuesto que funciona como un inhibidor de la reacción de la segunda enzima. En algunas realizaciones, el primer sustrato es un inhibidor enmascarado, es decir, un precursor de un inhibidor. En algunas realizaciones, la señal desciende cuando está presente más antígeno del virus de la gripe y la señal aumenta cuando está presente un antivírico eficaz contra la gripe. Algunas realizaciones de los métodos y las composiciones dados a conocer en la presente memoria incluyen ensayos enzimáticos duales que pueden ofrecer una buena sensibilidad para la neuraminidasa del virus de la gripe, y la sensibilidad puede oscilar de 10 pM a 100 fM.

En la actualidad, los antivíricos más eficaces para el tratamiento del virus de la gripe actúan selectivamente sobre la neuraminidasa. Los dos principales fármacos inhibidores de la neuraminidasa son el zanamivir (RELENZA™) y el oseltamivir (TAMIFLU™). Las cepas de la gripe resistentes a estos fármacos pueden permanecer indetectables durante la visita inicial al médico, lo que provoca una tensión adicional al paciente que se podría evitar con una prueba de resistencia al antivírico en el PDA. En EE. UU. y otros países industrializados, la prueba de vulnerabilidad al antivirus la realizan principalmente los laboratorios públicos, lejos del paciente y mucho después de su visita al médico de atención primaria, como un componente del seguimiento. Hasta hace poco, no era concebible que tales pruebas se pudieran realizar en la consulta de un médico. Además, los reactivos para la vulnerabilidad al antivirus carecían de la sensibilidad necesaria para contemplar la prueba directa en un espécimen sin amplificar por cultivo. Se necesitaba una química con una sensibilidad igual o mejor y dirigida contra un antígeno independiente, y se echaba en falta un lector portátil capaz de leer la salida de varias señales diferentes, tales como reflectancia, fluorescencia y luminiscencia. Por consiguiente, existe la necesidad de una prueba sensible y rápida para la resistencia farmacológica del virus de la gripe que invite a un uso más racional de los tratamientos con antivíricos.

Algunas realizaciones dadas a conocer en la presente memoria incluyen una prueba en el PDA para detectar la presencia del virus de la gripe A y B, que actúa selectivamente sobre una serie de epítopos del virus de la gripe mediante un inmunoensayo, y que valora la resistencia farmacológica del virus de la gripe al actuar selectivamente sobre un antígeno distinto del virus de la gripe, la neuraminidasa. La combinación de estos antígenos conduce a una mejor detección global del virus de la gripe, al mismo tiempo que se da a conocer una guía para el tratamiento.

Algunas realizaciones dadas a conocer en la presente memoria incluyen un inmunoensayo sensible para la nucleocápsida y un ensayo cinético para medir la actividad de la neuraminidasa. En algunas realizaciones, el ensayo cinético puede incluir un ensayo cinético con dos enzimas. El ensayo cinético con dos enzimas para detectar la actividad de la neuraminidasa con un inmunoensayo contra la nucleocápsida puede incluir la luciferasa como segunda enzima y un conjugado derivado de la luciferina como sustrato. Los virus de la gripe de tipo A y de tipo B poseen glucoproteínas en su superficie, las neuraminidasas, capaces de hidrolizar los sustratos que contienen ácido W-acetilneurámico unido a-cetosídicamente, a veces denominado Neu5Ac. En algunas realizaciones, los sustratos para ser usados en una prueba de vulnerabilidad al antivirus basada en la neuraminidasa pueden ser moléculas híbridas (conjugados) que comprenden ácido W-acetilneurámico y luciferina. Cuando la luciferina se libera en presencia de la luciferasa, se produce luz en una cantidad directamente proporcional a la actividad residual de la neuraminidasa en el espécimen. En algunas realizaciones, los conjugados de ácido W-acetilneurámico y luciferina de luciérnaga pueden incluir los utilizados en el Combo kit Cellex OFlu™

Algunas realizaciones dadas a conocer en la presente memoria incluyen un lector. En algunas realizaciones, el lector incluye el lector del sistema Veritor™ (Beckton Dickinson) que incluye capacidades para luminometría. El luminómetro se puede utilizar con diferentes pruebas desechables que incluyen un cartucho de flujo lateral que se utiliza en el sistema Veritor™ y tiras de micropocillos. La sensibilidad adicional y flexibilidad de los desechables pueden ser una opción útil para deducir un segundo resultado del espécimen actualmente utilizado para identificar la presencia del virus de la gripe A o de la B.

Hoy día, cuando el virus de la gripe entra en una comunidad, se toma un espécimen y el médico de asistencia primaria lleva a cabo una determinación del virus de la gripe A o B. El espécimen restante se puede enviar a un laboratorio de seguimiento para la prueba de vulnerabilidad farmacológica y los resultados se cuelgan en una página web del gobierno para que los vean otros médicos de la comunidad. Aunque algunos de los métodos y composiciones dados a conocer en la presente memoria pretenden guiar al médico para que dé el mejor antivírico inhibidor de la neuraminidasa (INA), tales realizaciones también pueden proporcionar una oportunidad para realizar más mejoras en la prueba básica de la gripe en el laboratorio de la consulta del médico en términos de sensibilidad, ya que tanto la neuraminidasa como la nucleocápsida se pueden medir en el mismo espécimen. Algunos de los métodos y composiciones dados a conocer en la presente memoria también ofrecen la posibilidad de recoger datos más exactos de la resistencia al antivirus para el seguimiento, ya que muchas autoridades de vanguardia en el tema creen que el fenotipo real de la neuraminidasa puede cambiar cuando el virus se amplifica mediante el cultivo MDCK, una etapa requerida por el ensayo laborioso tradicional de sensibilidad farmacológica por CI50.

Las mediciones de actividad de la neuraminidasa con y sin el fármaco se realizan por norma en los laboratorios de todo el mundo como pieza básica del seguimiento de la gripe. Aunque el ensayo de actividad de la neuraminidasa basado en el cultivo de tejidos podría beneficiarse de la estandarización adicional, el ensayo es un método aceptable y fiable para determinar la resistencia al fármaco que presenta un espécimen clínico después de que se haya generado por cultivo celular una cantidad suficiente del virus. Los sustratos quimioluminiscentes, tales como el NA-Star™ (Applied Biosystems), se utilizan por norma para medir la actividad de la neuraminidasa del virus de la gripe. En cambio, algunos de los métodos y composiciones dados a conocer en la presente memoria incluyen otra enzima en el cóctel de reactivos, que puede actuar sobre un sustrato creado por la reacción de la neuraminidasa. Al hacerlo así, algunos de los métodos y composiciones dados a conocer en la presente memoria amplifican la señal producida por la enzima nativa del virus de la gripe. A su vez, la segunda enzima sirve para remplazar la etapa de amplificación en cultivo utilizada en el procedimiento de seguimiento de laboratorio más tradicional. En algunas realizaciones, una señal de inmunoensayo del sistema Veritor™ puede verificar si hay suficiente antígeno vírico presente para el ensayo de la neuraminidasa, y reemplazar a la laboriosa titulación del virus, una etapa que se realiza a veces cuando se montan los ensayos de CI50. Cuando se alcanza una determinada intensidad de la señal en el inmunoensayo, el índice de la señal luminiscente (actividad enzimática sin fármaco frente a la actividad enzimática en presencia del fármaco) resulta válida.

Algunos de los métodos y composiciones dados a conocer en la presente memoria incluyen una plataforma que puede ser rápida, fácil de utilizar y de bajo coste. Algunas realizaciones pueden resultar válidas en diferentes contextos de ensayo, lo que da a conocer una herramienta para los laboratorios de la consulta del médico en el PDA y para los laboratorios que necesitan mayores rendimientos. Estas mismas cualidades son útiles para los entornos con recursos limitados y el uso durante pandemias.

Algunos de los métodos y composiciones dados a conocer en la presente memoria incluyen el sistema Veritor™, un sistema portátil, que se lleva en la mano si se desea, y con mejor sensibilidad, debido en gran medida a una nueva partícula detectora registrada. Véase la figura 1. El lector instrumentado crea el potencial para que sea cuantitativo, un atributo del sistema necesario para la prueba de vulnerabilidad al antivirus que se propone.

Algunos de los atributos del sistema Veritor™ que son útiles para una amplia distribución incluyen: 1) la facilidad de uso para los cuidadores relativamente inexpertos y la suficiente portabilidad para transportarlo hasta los lugares más remotos para las pruebas (consultas de médicos, farmacias, centros de rehabilitación y posible uso móvil). 2) El abanico de pacientes es el mayor posible, con una especial dedicación para la primera de las pruebas de vulnerabilidad al antivirus contra la gripe en el PDA. 3) Uso en entornos biológicos. 4) Implantación barata. 5) El sistema de combinación se utiliza para determinar si está presente el virus de la gripe A y de la gripe B en torundas nasales, lavados o aspirados nasofaríngeos, y también tiene la capacidad de señalar las cepas de la gripe resistentes a los fármacos. Como resultado, mejoran el diagnóstico, el tratamiento y el seguimiento. 6) Alimentado con pilas. 7) El lector pesa poco y tiene un tamaño reducido: 15 cm (anchura) x 15 cm (altura) x 15 cm (profundidad).

El diseño del flujo lateral y de las membranas que se muestra en la figura 1 es útil para integrar dos o más ensayos en los que intervienen diferentes químicas. Los sustratos para el flujo lateral permiten que las reacciones químicas en las que intervienen dos enzimas diferentes se ubiquen en una secuencia adecuada, en la cual se pueden cambiar los tampones, se pueden colocar previamente otros reactivos, y se pueden leer diferentes tipos de señales en diferentes regiones del sustrato de flujo lateral.

En algunas realizaciones, los soportes sólidos, tales como la nitrocelulosa, utilizados en la almohadilla de reacción y la partícula detectora son componentes comunes con los dispositivos de ensayo de flujo lateral. Véase, p. ej., la patente de los EE. UU. n.° 5998221 y la patente de los EE. UU. n.° 6194220 que se refieren cada una al flujo lateral cuantitativo. En algunas realizaciones, el flujo lateral cuantitativo es una etapa útil para verificar que el antígeno vírico adecuado está disponible para la prueba de resistencia al antivirus. En algunas realizaciones, las tiras para el flujo lateral pueden utilizar membranas distintas para la almohadilla del espécimen y para la almohadilla del conjugado. En alguna realización, una tira para el flujo lateral puede incluir numerosas membranas. En algunas realizaciones, una tira para el flujo lateral puede incluir cuatro membranas. En algunas realizaciones, una tira para el flujo lateral puede incluir cuatro membranas en un casete para flujo lateral. En otras realizaciones, se utiliza una membrana tanto para recibir el espécimen como para mantener el conjugado seco.

Algunos de los métodos y composiciones dados a conocer en la presente memoria incluyen un sistema enzimático dual. En algunas realizaciones, se pueden utilizar los componentes del sistema de reactivos de sustrato-enzima Cellex. Se pueden encontrar más detalles sobre las químicas enzimáticas duales de esterasas en las siguientes publicaciones: Mize et al., «Dual Enzyme Cascade», Analytical Chemistry, 179, (1989), págs. 229-235; la patente de los EE. UU. n.° 4904583 y la patente de los EE. UU. n.° 4835099.

Algunos de los métodos y composiciones dados a conocer en la presente memoria incluyen enzimas de tipo luciferasa modificadas y sustratos para tales enzimas que incluyen conjugados ácido neuramínico y luciferina. En algunas realizaciones, la amplificación se puede llevar a cabo además mediante la introducción de una segunda enzima diferente (esterasa) y un inhibidor bloqueado (enmascarado) con una fluorocetona. En la figura 4 se muestra la síntesis para una realización de un inhibidor enmascarado de la esterasa. En la figura 4 se muestra una realización de un sustrato que incluye un enlace de carbamato o bien de carbonato a modo de sustrato de la neuraminidasa.

Algunos de los métodos y composiciones dados a conocer en la presente memoria incluyen un abanico de posibles configuraciones de formatos. En algunas realizaciones, la ejecución completa del inmunoensayo y el ensayo enzimático dual pueden incluir un formato de flujo lateral. En algunas de tales realizaciones, un espécimen procesado por el mismo reactivo de extracción se puede cargar en la almohadilla para la muestra en el flujo lateral y momentos después el extremo terminal del casete para el flujo lateral se puede leer para determinar la presencia del virus de la gripe y también se puede dar a conocer una recomendación para el tratamiento. En algunas realizaciones, se puede medir un cambio de color gracias a un lector de reflectancia. En algunas realizaciones, se puede tomar directamente una medición, tal como una medición de la reflectancia, a partir de la membrana del flujo lateral para detectar el virus de la gripe, y otro tipo de medición, tal como una medición de la quimioluminiscencia, de la fluorescencia o de cromóforo, se puede tomar para determinar la vulnerabilidad al fármaco. En algunas realizaciones, se puede tomar una medición con lector que hace referencia a un instrumento para detectar y/o cuantificar los datos, tales como en tiras para pruebas. Tales lectores se describen en las patentes de los EE. UU. n.os 6267722, 6394952 y 6867051. En algunas realizaciones, un lector de la reflectancia se refiere a un instrumento adaptado para leer una tira para la prueba mediante el uso de la luz reflejada, que incluye fluorescencia, o radiación electromagnética de cualquier longitud de onda. La reflectancia se puede detectar con un fotodetector u otro detector, tales como dispositivo de acoplamiento de cargas (DAC).

Tanto el inmunoensayo como la señal de vulnerabilidad se pueden observar con el uso de un detector corriente, tal como una cámara con DAC. En algunas realizaciones, el inmunoensayo y los ensayos de vulnerabilidad se pueden leer con diferentes detectores, tales como un DAC y un tubo fotomultiplicador. En algunas realizaciones, se pueden utilizar las cámaras portátiles con DAC enfriadas para las mediciones quimioluminiscentes cuantitativas «de campo». En algunas realizaciones, un ensayo quimioluminiscente de vulnerabilidad al antivirus también puede leerse mediante un diodo PIN con un amplificador con poco ruido.

En algunas realizaciones, cuando una primera reacción enzimática del ensayo enzimático dual no es compatible con los reactivos del inmunoensayo, el ensayo enzimático dual se inicia desconectado y un espécimen parcialmente procesado con el sustrato escindido se carga sobre la almohadilla de la muestra para el flujo lateral, que se puede desplazar por la tira de flujo lateral mediante la acción capilar hasta un soporte sólido que contiene la luciferasa y los otros reactivos necesarios para generar una señal luminiscente. En esta configuración, la señal del inmunoensayo y de vulnerabilidad se pueden leer con un detector común, tal como una cámara con DAC. En algunas realizaciones, el inmunoensayo y los ensayos de vulnerabilidad se podrían leer con diferentes detectores, tales como un DAC y un tubo fotomultiplicador.

En algunas realizaciones, los ensayos enzimáticos duales sobre el flujo lateral se pueden conseguir al sumergir la sección para el casete de flujo lateral procesado que contiene la luciferina escindida en un pocillo con la luciferasa y los otros reactivos necesarios para producir una señal luminiscente. La luz producida por el ensayo enzimático dual se mide a continuación mediante un luminómetro Luminoskan TL Pus o con un tubo equivalente.

En algunas realizaciones, el inmunoensayo se realiza y se lee en un casete para flujo lateral, y se lleva a cabo un ensayo enzimático dual y se lee en una tira de pocillos. Los dos ensayos pueden compartir un espécimen extraído común, pero se ejecutan en formatos diferentes, luego se leen en un instrumento común que puede acomodar para la reflectancia de flujo lateral y la quimioluminiscencia de la tira de pocillos (o la fluorescencia u otra señal óptica). Tanto el inmunoensayo como la señal de vulnerabilidad se pueden observar con un detector común, tal como una cámara con DAC, o el inmunoensayo y los ensayos enzimáticos duales se pueden leer con diferentes detectores, tal como un DAC y un tubo fotomultiplicador.

Estrategia general para determinar una realización:

Tal y como se muestra en la figura 2, los solicitantes exploraron varias opciones para ejecutar la tipificación del virus de la gripe y la prueba de sensibilidad al antivirus en una sola muestra. En una realización, se dividió el espécimen y se trató con dos tampones de extracción diferentes, de manera que cada porción del espécimen se utiliza en solo un ensayo. Una limitación de este abordaje es que en algunas situaciones no hay disponible suficiente espécimen para ejecutar tanto la ID del virus de la gripe como los ensayos de AST. En una realización, se analizaron un reactivo de extracción y un tampón comunes que se podían utilizar en ambos ensayos. Una limitación de este abordaje es que las condiciones para el inmunoensayo y para el ensayo cinético son diferentes, con lo que el uso de un tampón común está por debajo de lo óptimo. En otra realización, se utilizó un único tampón de extracción apropiado para la ID del virus de la gripe o el ensayo de AST, con la conversión del tampón en el ensayo opuesto en tiempo real. Esta realización proporcionó un volumen de muestra y una sensibilidad suficientes para ambos ensayos. En la figura 2 también se muestran varias realizaciones de formatos de ensayo para la ID del virus de la gripe, así como para la prueba de vulnerabilidad que se desarrollaron. Se utilizan lectores adecuados y desechables para la combinación de los inmunoensayos de flujo lateral y los ensayos enzimáticos duales (p. ej., si una tira de pocillos se utiliza para AST, se puede utilizar un lector de tiras de pocillos diferente, mientras que si se utiliza una tira de flujo lateral, se puede utilizar un único lector de flujo lateral para ambas pruebas).

En algunas realizaciones se utiliza un reactivo de extracción común para el inmunoensayo y para las mediciones de resistencia al antivirus.

En algunas realizaciones se utiliza un formato de flujo lateral para el inmunoensayo y para el ensayo enzimático dual, en el cual se mide la resistencia al antivirus de la neuraminidasa que pasa a través de la almohadilla de nitrocelulosa. En algunas realizaciones, el ensayo se puede realizar en el espécimen de aproximadamente 150 pl que a menudo queda después de haber cargado el cartucho de flujo lateral del inmunoensayo. En algunas realizaciones, uno o ambos volúmenes se pueden medir en una tira de pocillos como un ensayo homogéneo. En algunas realizaciones, un sistema incluye un luminómetro, tal como Tropix o Bethold, un luminómetro portátil, tal como el HG-2 de la compañía de instrumentos científicos Shangai Huguo.

En algunas realizaciones, las fuentes de los virus pueden incluir especímenes clínicos congelados, que se sabe que son positivos para la gripe, para verificar una cinética funcional y el inmunoensayo en presencia de secreciones nasales humanas.

Ensayo enzimático dual de vulnerabilidad al antivirus

Tal y como se muestra en la figura 3, algunas realizaciones de un ensayo cinético enzimático dual para la actividad de la neuraminidasa pueden incluir la luciferasa como la segunda enzima y el conjugado con la luciferina como sustrato. Yolken describió sustratos fluorescentes para la neuraminidasa en 1980. Buxton describió sustratos quimioluminiscentes para la neuraminidasa en 2000 y Hamilton realizó una comparación directa de la prueba ZestatFlu-II autorizada por la FDA en 2004, que utiliza un sustrato quimioluminiscente de la neuraminidasa para identificar el virus de la gripe. Ningún sistema de enzima única y sustrato único se ha convertido en una prueba robusta de vulnerabilidad farmacológica para el funcionamiento en el laboratorio de la consulta de un médico. Esto puede ser un problema de sensibilidad, que se puede subsanar con un mejor sistema de amplificación de señales. Algunas realizaciones dadas a conocer en la presente memoria incluyen un sistema enzimático dual, que implica un conjugado de luciferina. Una vez que modificado por la neuraminidasa del virus de la gripe, el conjugado libera la luciferina libre, que a su vez se ve modificada por la luciferasa. En las realizaciones descritas en la presente memoria, tales sistemas quimioluminiscentes enzimáticos duales pueden proporcionar suficiente amplificación para un diagnóstico de la vulnerabilidad al antivirus en el PDA. Un ejemplo de reactivos útiles con los métodos y composiciones dados a conocer en la presente memoria incluyen los reactivos utilizados en la prueba QFlu™ Combo de Cellex.

Demostración de la capacidad para realizar un inmunoensayo para la gripe A y B y la prueba de vulnerabilidad farmacológica en un espécimen extraído común

Algunas realizaciones dadas a conocer en la presente memoria incluyen la demostración de qué etapas o reactivos de la reacción del ensayo son compatibles cuando se realizan sobre el mismo marco de tiempo y en estrecha proximidad, cuando no en el mismo espacio. En algunas realizaciones, el inmunoensayo para la nucleocápsida y el ensayo enzimático dual para la actividad de la neuraminidasa se pueden monitorizar muy de cerca en busca de cualquier pérdida en la sensibilidad, especificidad, margen de ensayos, resolución y tiempo para obtener el resultado. No todas las etapas de los dos ensayos deben ser compatibles para resultar satisfactorias. En algunas realizaciones los reactivos del inmunoensayo Veritor™ y los reactivos enzimáticos duales actuales utilizados en el ensayo QFlu™ de Cellex (actualmente desplegado para los propósitos de seguimiento) se utilizan en los métodos, composiciones, kits, dispositivos y sistemas descritos. Un reactivo evaluado era el reactivo de lisis utilizado en ambos ensayos. En algunas realizaciones, el reactivo de lisis del inmunoensayo Veritor™ se utiliza para preparar una muestra que se utiliza tanto en la prueba del virus de la gripe A y B como en la prueba de sensibilidad farmacológica. En otra realización, el reactivo de lisis del ensayo QFlu™ de Cellex se utiliza para preparar una muestra utilizada tanto en la prueba del virus de la gripe A y B como en la prueba de sensibilidad farmacológica.

Cribado de interferencia para el ensayo de vulnerabilidad/resistencia al antivirus

Los virus de la gripe de los tipos A y B poseen glucoproteínas de superficie, neuraminidasas capaces de hidrolizar los sustratos que contienen ácido Ñ-acetilneurámico unido a-cetosídicamente, que a veces se denomina Neu5Ac. Los sustratos evaluados para ser usados en la prueba de vulnerabilidad al antivirus basada en la neuraminidasa incluían moléculas híbridas (conjugados) que comprendían ácido W-acetilneurámico y luciferina. Cuando la luciferina se libera en presencia de la luciferasa, se produce luz en una cantidad directamente proporcional a la actividad de la neuraminidasa que queda en el espécimen. En una realización, se evaluaron los conjugados de ácido W-acetilneurámico y luciferina de luciérnaga utilizados en el kit OFlu™ Combo de Cellex, que actualmente se distribuye para aplicaciones de seguimiento. En algunas realizaciones se realizan experimentos comparativos de referencia con una solución concentrada de virus cultivado, gracias a lo cual se realizan dos reacciones independientes para cada condición de prueba, una reacción, por ejemplo, que contiene el antivírico (p. ej.: oseltamivir) y el otra medición de actividad de la neuraminidasa se llevó a cabo sin el inhibidor antivírico. Los especímenes de control se pueden ensayar mediante el método rápido en desarrollo y mediante uno de los métodos recomendados por la OMS basados en la CI50. En algunas realizaciones, el cribado de los reactivos de vulnerabilidad al antivirus se puede realizar en un micropocillo, tubo o cubeta o placa, y se les puede leer la quimioluminiscencia o la fluorescencia. El cribado se puede realizar con cepas de la gripe sensibles y resistentes al antivirus. Cuando se realiza con rapidez, la neuraminidasa pura se puede enriquecer en el espécimen y se puede utilizar en el cribado de interferencia. Los especímenes congelados que se sabe que son clínicamente positivos también se pueden analizar con regularidad principalmente para asegurarse de que otros componentes de la secreción nasal no interfieren con el ensayo enzimático dual.

Cribado de interferencias para el inmunoensayo

En algunas realizaciones, el cribado para los reactivos de detección (inmunoensayo) del virus de la gripe se pueden realizar en el formato de flujo lateral y se les puede leer la reflectancia, tal y como se realiza en la actualidad con el producto Veritor™ de CLIA Waived autorizado por la FDA. El inmunoensayo Veritor™ de BD utiliza dos anticuerpos monoclonales dirigidos contra la nucleocápsida del virus de la gripe. Se inmoviliza un anticuerpo en la superficie de una partícula comercial de oro y el otro se inmoviliza en la nitrocelulosa del casete de flujo lateral. La cantidad de señal detectada en la tira de nitrocelulosa para la reacción es proporcional a la cantidad del virus de la gripe en el espécimen. La comprobación de la posible interferencia de los reactivos enzimáticos duales en el inmunoensayo Veritor™ se puede realizar en presencia de las muestras positivas del virus de la gripe A (gripe A/PR/8/34) y de la gripe B (gripe B/Lee/40) preparadas para producir una concentración final que corresponde a un positivo moderado (unas 5 veces el nivel de detección). La interferencia de la prueba se puede observar en forma de un resultado positivo falso con muestras negativas del virus de la gripe A o de la gripe B, o un resultado negativo falso con una muestra positiva del virus de la gripe A o de la gripe B. Solo se seguirá con los reactivos enzimáticos duales que no muestren interferencia. Cuando se hace con rapidez, la nucleocápsida pura se puede enriquecer en un espécimen y se puede utilizar para cribar solo los que funcionen.

Otra química enzimática dual

Otros sistemas de reactivos enzimáticos duales incluyen los sustratos similares al del sistema de Cellex que incluye componentes de un conjugado de ácido A/-acetilneurámico y luciferina, pero que utilizan un conector diferente. En algunas realizaciones se puede utilizar una enzima de tipo luciferasa diferente.

Determinación del formato/desechable para el ensayo de vulnerabilidad farmacológica

Algunas realizaciones de los métodos y composiciones dados a conocer en la presente memoria incluyen la selección de un formato adecuado para los ensayos combinados. En algunas realizaciones, cuando se encuentra que la química es compatible, la ejecución completa del inmunoensayo y el ensayo enzimático dual se pueden entonces manipular mejor en el formato de flujo lateral. Cuando se utiliza el formato de flujo lateral para ambos ensayos, se puede cargar un espécimen procesado por el mismo reactivo de extracción en un almohadilla para la muestra de flujo lateral y, momentos después, se puede leer el extremo terminal del casete para flujo lateral para detectar la presencia del virus de la gripe, que incluye el tipo A/B, y se puede ofrecer también una recomendación para el tratamiento basada en la vulnerabilidad farmacológica. Se puede tomar una medición de reflectancia directamente de la membrana de flujo lateral para la detección del virus de la gripe y puede tomarse una medición de quimioluminiscente para la vulnerabilidad farmacológica. En algunas realizaciones, se pueden utilizar cámaras con DAC enfriadas y portátiles para las mediciones quimioluminiscentes cuantitativas «de campo».

En algunas realizaciones, cuando una primera reacción enzimática en un ensayo enzimático dual no es compatible con otros reactivos del inmunoensayo, el ensayo enzimático dual se inicia desconectado y un espécimen parcialmente procesado con el sustrato escindido se carga en la almohadilla para la muestra de flujo lateral, que puede desplazarse hacia la tira de flujo lateral mediante la acción capilar hacia un soporte sólido que contiene la luciferasa y los otros reactivos necesarios para generar una señal luminiscente.

En algunas realizaciones, los ensayos enzimáticos duales en el flujo lateral se pueden conseguir al sumergir la sección del casete para el flujo lateral procesado que contiene la luciferina escindida en un pocillo con la luciferasa y los otros reactivos necesarios para producir una señal luminiscente. La luz producida por el ensayo enzimático dual se mide a continuación con un luminómetro Limunoskan TL Pus o equivalente.

En algunas realizaciones, se lleva a cabo el inmunoensayo y se lee en un casete para flujo lateral, y se realiza un ensayo QFluTM Combo de Cellex más eficiente y se lee en una tira de pocillos. Los dos ensayos pueden compartir un espécimen extraído común, pero se ejecutan en diferentes formatos, luego se leen en un instrumento común que puede alojar la reflectancia del flujo lateral y la quimioluminiscencia de la tira de pocillos. En algunas realizaciones se utilizan dos instrumentos distintos. En algunas realizaciones, los dispositivos únicos o múltiples son dispositivos portátiles, alimentados con pilas, que ocupan poco, idóneos para colocarlos en la consulta del médico, por ejemplo, dimensionado para que encaje en la parte superior de un mostrador o en un pabellón médico portátil.

Validación del sistema

Se pueden cultivar y enumerar un conjunto de pruebas para 20 cepas de virus de la gripe, lo que permite que a la plataforma de combinación final (lector y reactivos desechables integrados) se le analice la sensibilidad hasta concentraciones de tan solo 103 partículas víricas (definidas en unidades de TCID50/ml o CEID50/ml). El conjunto de pruebas para las 20 cepas puede contener un equilibrio de las cepas de la gripe A y de la gripe B. Las cepas de la gripe A pueden ser una mezcla del virus de la gripe H1N1 y H3N2. El conjunto de pruebas puede contener cepas resistentes y vulnerables al Tamiflu™. El conjunto de pruebas también puede incluir cepas resistentes y vulnerables a un segundo fármaco INA. Para evaluar por comparación el progreso y el sistema integrado final, se pueden utilizar cerca de 100 aislados clínicos congelados que se sabe que son positivos.

Antivíricos para el desarrollo y la validación

En la tabla 1 se dan a conocer los antivíricos INA (inhibidores de la neuraminidasa) de ejemplo que son útiles para los métodos y las composiciones dadas a conocer en la presente memoria. Ya que una población no puede suponer que las nuevas cepas en circulación del virus de la gripe sean siempre sensibles al oseltamivir y al zanamivir, es deseable generar datos en el diagnóstico de la vulnerabilidad al antivirus en el PDA con el fármaco de Biota.

Tabla 1

Colecciones de cepas, aislados y controles del virus de la gripe

La tabla 2 contiene ejemplos de fenotipos y genotipos específicos para ser usados con algunas realizaciones de los métodos y composiciones dados a conocer en la presente memoria. Las cepas del virus de la gripe A y de la gripe B (BSL-2), ambas resistentes y vulnerables a los fármacos contra la neuraminidasa, se pueden obtener para el desarrollo. En algunas realizaciones, los métodos y las composiciones dados a conocer en la presente memoria incluyen las neuraminidasas del subtipo principal de la gripe A, así como las neuraminidasas de la gripe B.

Tabla 2

Pruebas de referencia para comparación

Algunas realizaciones dadas a conocer en la presente memoria incluyen la determinación de la CI50 para el OFluTM Combo en un solo punto y los inmunoensayos. Los sistemas Veritor™ y OFlu™ se pueden utilizar de acuerdo con los prospectos del envase. Hay muchas opciones para los kits preparados de CI50, tales como el kit NA-Star™ de Applied Biosystems/Life Technologies. En la tabla 3 se dan a conocer ejemplos de suministradores y números de catálogo para los fungibles que se pueden utilizar en la prueba del antivirus.

Tabla 3

Métodos de Ckn

Algunas realizaciones de los métodos y composiciones dados a conocer en la presente memoria se pueden comparar con un ensayo quimioluminiscente de INA llevado a cabo con el kit NA-Star® disponible en el mercado (Applied Biosystems, Foster City, CA) que incluye el tampón NA-Star® (MES a 26 mM, CaCl2 a 4 mM, pH 6,0), el sustrato NA-Star®, acelerador NA-Star® y placas blancas opacas de 96 pocillos. Números de catálogo 4374348 y 4374349. Más detalles del método de CI50, la preparación y el análisis se pueden encontrar en Antimicrobial Agents and Chemotherapy, sept. de 2008, págs. 3284-3292, vol. 52, n.° 9.

Selección del espécimen (torunda o bien lavado o bien aspirado) e impacto en la sensibilidad del ensayo Algunas realizaciones incluyen tres opciones de espécimen (prueba directa con torundas frente a prueba con lavado nasofaríngeo o aspirados). Algunas realizaciones incluyen la prueba con especímenes congelados y en cultivo, y la capacidad para realizar el inmunoensayo de la nucleocápsida y el ensayo de actividad de la neuraminidasa a partir de una única recogida.

Prueba directa con torundas

Algunas realizaciones de los métodos y composiciones dados a conocer en la presente memoria incluyen el uso de torundas para recoger los especímenes. El primer inmunoensayo Veritor™ se basa en una recogida con torundas secas gracias a lo cual todo el espécimen se dedica intencionadamente a un «reactivo de procesamiento» (400 pl de volumen) y el prospecto del envase indica que el espécimen se aplique en la tira de flujo lateral en menos de una hora. Típicamente, quedan varios cientos de microlitros después de cargar un volumen de 80 pl en el casete para flujo lateral, lo que deja una gran cantidad de antígeno procesado sin usar que se puede dirigir a la prueba de vulnerabilidad al antivirus. Aunque esta vía de procesamiento del espécimen no divide en porciones una muestra para el cultivo vírico, en algunas realizaciones se pueden realizar tanto ensayos inmunitarios como cinéticos en o cerca del nivel máximo de detección con algún espécimen restante que se puede suplementar con un estabilizante de ácido nucleico para la posterior detección por PCR.

Prueba con lavado/aspirados nasofaríngeos

La plataforma Veritor™ incluye un método en el que se añade un reactivo mucolítico concentrado al espécimen recogido en 3 partes por 1 antes de la cargarlo en un casete de flujo lateral. Se le añaden 300 pl de cada suspensión del organismo al tubo unificado que contiene el reactivo C RV o el reactivo D RV, tal y como se vende en BD (por ejemplo, en el kit para el sistema Veritor™ para el diagnóstico rápido del virus de la gripe A y B (producto n.° 256045). Se han probado con éxito más de 10 medios de conservación-transporte con estos especímenes de lavado o aspirado. Los ejemplos de los medios de conservación-transporte incluyen: M4RT, M4, M5, UTM, medio Ames (líquido), medio Bartel Vira Trans™, solución salina equilibrada de Hank, solución salina normal, solución salina tamponada con fosfato. El medio M4RT tiene pH 7,3 a 25 °C y contiene las sales equilibradas de Hank: CaCl2, MgC^6H2O, MgSO4^7H2O, KCl, KH2PO4, NaCl, Na2HPO4^7H2O, glucosa. Por lo tanto, en algunas realizaciones se puede recoger una muestra para la propagación del virus con un lavado o aspirado nasofaríngeo antes de añadirle el agente mucolítico. Se puede tener en cuenta un posible efecto de la dilución del antígeno cuando se utilizan especímenes de lavado o aspirados nasofaríngeos. El ensayo Veritor™ tiene mayor sensibilidad que otros ensayos rápidos en el mercado.

Métodos de quimioluminiscencia y métricas para valorar la sensibilidad

Los métodos de quimioluminiscencia útiles con los métodos y composiciones dados a conocer en la presente memoria incluyen los que se describen en las patentes de los EE .UU. n.os 8221 976; 8163237; 7947820; 7 642060; 7291488; 5736365; 5639428; 5561 044; 5518884; 5470723; 5457027; 5314801; 5017473; y 4 810631. En algunas realizaciones, la métrica de una prueba enzimática dual es sustancialmente similar a la métrica, tal como el nivel de detección del virión de la gripe, obtenida con el inmunoensayo Veritor™. En algunas realizaciones, la química para detectar la presencia de la neuraminidasa puede producir señal suficiente a una 103 TCID50 para permitir también la observación de un índice robusto de 5:1 entre las reacciones realizadas con el fármaco y sin el fármaco. En algunas realizaciones, se puede valorar tanto la sensibilidad como la longitud del intervalo lineal. En algunas realizaciones, se puede usar Cellex.

Determinadas químicas

En la figura 2 se muestra una química basada en esterasas que se puede utilizar con las composiciones y los métodos dados a conocer en la presente memoria para ensayar la actividad de la neuraminidasa. Los métodos útiles con las realizaciones de los métodos y las composiciones dados a conocer en la presente memoria incluyen los descritos a continuación: Mize et al., «Dual Enzyme Cascade», Analytical Chemistry, 179, (1989), pág. 229-235; patente de los EE. UU. n.° 4904583; patente de los EE. UU. n.° 4835099. Algunas realizaciones incluyen la modificación de enzimas de tipo luciferasa y de sustratos de las mismas, tales como conjugados modificados de ácido neuramínico-luciferina. Otros inhibidores que se pueden utilizar incluyen los siguientes:

R = H Inhibidor de la esterasa

R = NANA Inhibidor enmascarado de la esterasa

Algunos posibles inhibidores variantes con p-tío/inhibidores enmascarados

El compuesto de la figura 12 tiene la trifluorocetona en la posición para. Más inhibidores de la esterasa incluyen 1,1,1-trifluoro-4-(4-hidroxifenil)bután-2-ona (para); 1,1,1-trifluoro-4-(3-hidroxifenil)bután-2-ona (meta); y 1,1,1-trifluoro-4-(2-hidroxifenil)bután-2-ona (orto).

Los sustratos de tipo inhibidores enmascarados alternativos para ser usados en las realizaciones descritas en la presente memoria incluyen los que tiene la trifluorocetona en las posiciones -meta y -orto, tal y como se da a conocer a continuación:

En otra realización, se podría utilizar un ácido W-acetilneuramínico (NANA) 4,7-metilado-trifluorocetona en el ensayo ED con el inhibidor enmascarado, con más especificidad por la neuraminidasa del virus de la gripe.

Algunas realizaciones incluyen un compuesto inhibidor enmascarado para ser usado en un ensayo enzimático dual de sensibilidad de la neuraminidasa del virus de la gripe que tiene la estructura de fórmula (I):

en donde: R1, R2 y R3 son cada uno independientemente hidrógeno o alquilo(C-i-5); n es 0, 1, 2 o 3; R4 es -(CH2)mC(=O)CFa; m es 0 o 1; X es -S(O)z- o -CH(R5)-; R5 es -S(O)zCH3; y z es 0, 1 o 2.

En algunas realizaciones, un compuesto de fórmula (I) se selecciona del grupo que consiste en:

Secuenciación de ADN

En algunas realizaciones, se obtienen datos del genotipo de un virión de la gripe a partir de un espécimen. En algunas realizaciones, un aislado del virus en concreto puede producir un perfil de sensibilidad farmacológica con la prueba comparativa del método de CI50 en cultivo de tejidos a partir de un perfil obtenido de la prueba rápida en el PDA. Los diferentes perfiles se pueden deber a una mutación en los restos que están en el centro activo de la neuraminidasa y se sabe que le confieren resistencia en subtipos específicos de la gripe o a sustituciones en fase en cualquier parte de la NA. Se conocen bien en la técnica los métodos para secuenciar los ácidos nucleicos a partir de especímenes.

Interferencia debida a otros patógenos

En algunas realizaciones, se contempla que algunos especímenes de pacientes en los que se sospecha que tienen una infección con el virus de la gripe pueden contener otros patógenos que producen una neuraminidasa. En la tabla 4 se dan a conocer ejemplos de patógenos que se encuentran con más frecuencia en los especímenes clínicos positivos para la gripe.

Tabla 4

En la tabla 5 se dan a conocer los ejemplos de los patógenos que se pueden analizar en la prueba de interferencia de especímenes. En tales patógenos se puede analizar si tienen algún efecto en los métodos y composiciones dados a conocer en la presente memoria. Las pruebas de interferencia se hacen con el virus completo o la neuraminidasa purificada. Estos patógenos se pueden analizar a las concentraciones a las que se espera que estén presentes en las tomas de muestras clínicas.

Tabla 5

En algunas realizaciones, las muestras pueden incluir lavados, aspirados y torundas nasofaríngeas.

Detección del virus de la gripe de tipo A o del virus de la gripe de tipo B

Algunas de las realizaciones dadas a conocer en la presente memoria incluyen la detección de la presencia de un virus de la gripe de tipo A o un virus de la gripe de tipo B en un espécimen. Algunas realizaciones incluyen el uso de un inmunoensayo para identificar los antígenos víricos que puedan distinguir entre los tipos de virus de la gripe, tales como A/B. En algunas realizaciones, el antígeno es una nucleocápsida. En algunas realizaciones, el inmunoensayo comprende un ensayo de tipo sándwich. En algunas de tales realizaciones, un primer anticuerpo se fija específicamente a un antígeno diana, y al antígeno fijado y al primer anticuerpo se les fija a continuación específicamente un segundo anticuerpo que produce una señal. En algunas realizaciones, la señal es colorimétrica, fluorescente, quimioluminiscente y radioactiva. En algunas realizaciones, un inmunoensayo puede incluir un sistema de flujo lateral. En algunas realizaciones, una tira para la prueba comprende el inmunoensayo. Los sistemas y composiciones útiles con los métodos y composiciones dados a conocer en la presente memoria incluyen el sistema Veritor™ para detectar rápidamente el virus de la gripe de tipo A y B (Beckon Dickinson). En algunos casos, la salida de la tira para la prueba será reflectancia. En algunas realizaciones, la salida de la tira para la prueba será un cambio de color que se puede medir con un lector de reflectancia. Además de los formatos del inmunoensayo de flujo lateral, las realizaciones para determinar los virus de la gripe de tipo A o de tipo B pueden comprender la detección molecular e inmunitaria en la fase de tipo solución, sobre sustratos tales como membranas, superficies y partículas. En algunas realizaciones, los ELISA en micropocillos, los ensayos de separación magnética por nanoetiquetas y la aglutinación de partículas. Un ejemplo de un ensayo de detección molecular incluye el sistema Xpert® Flu (Cephied, Sunnyvale, CA). Las realizaciones que incluyen nanoetiquetas incluyen nanoetiquetas de espectroscopia Raman de superficie mejorada (SERS, por su nombre en inglés). Véase, p. ej., ACS Nano, 2009, 3 (10), págs. 2859-2869. Las realizaciones que incluyen la aglutinación de partículas se conocen bien e incluyen poner en contacto un antígeno en un fluido con elementos de fijación a antígenos, tales como los anticuerpos que revisten las partículas. Véase, p. ej., la patente de los EE. UU. n.° 4590169.

Algunas de las realizaciones dadas a conocer en la presente memoria que incluyen la detección de la presencia de un virus de la gripe de tipo A o un virus de la gripe de tipo B en un espécimen incluyen métodos que no son inmunoensayos. En algunas realizaciones, la presencia de un virus de la gripe de tipo A o de un virus de la gripe de tipo B se puede detectar con el uso de los métodos basados en ácidos nucleicos, tales como la PCR, hibridación de ácidos nucleicos y secuenciación de ácidos nucleicos.

Medición de la actividad de la neuraminidasa

Algunas realizaciones dadas a conocer en la presente memoria incluyen la detección y/o medición de la actividad de la neuraminidasa en una muestra. En algunas realizaciones, la neuraminidasa es una neuraminidasa vírica, tal como la neuraminidasa del virus de la gripe de tipo A o de tipo B. En algunas realizaciones, la enzima que se detecta es una sialidasa. En algunas realizaciones, la actividad de la neuraminidasa se pude medir con un ensayo enzimático dual. Los reactivos útiles con algunas realizaciones de los métodos y composiciones dados a conocer en la presente memoria incluyen los del ensayo OFluTM NI (Cellex, Inc., Maryland) y el ensayo QFluTM Combo.

En algunas realizaciones, un sustrato para la neuraminidasa se convierte en un sustrato para una segunda enzima, tal como una esterasa, tal como la luciferasa. En algunas realizaciones, un sustrato para la neuraminidasa incluye conjugados de derivados del ácido N-acetilneuramínico (ácido siálico) y derivados de la luciferina. En algunas realizaciones, los conjugados entre el ácido N-acetilneuramínico o sus derivados y la luciferina se unen entre sí a través de un enlace glucosídico mediante un grupo -OH del anillo del azúcar del ácido N-acetilneuramínico. En algunas realizaciones, la posición sobre el anillo del azúcar es la posición 2' ya que es el enlace glucosídico que está favorecido por la neuraminidasa de la gripe. Los ejemplos de derivados del ácido siálico incluyen los ácidos 4-alquil- o 7-alquil- o 4,7-alquil-N-acetilneuramínico (p. ej., los descritos en la patente de los EE. UU. n.° 6303764 y las patentes de los EE. UU. n.os 6420552 y 6680054). Un ejemplo es el conjugado de los ácidos N-acetileneuramínicos 4,7-metilados y la luciferina de luciérnaga. Las realizaciones de tales conjugados se dan a conocer en la patente de los EE. UU. n.° 7893272. En algunas realizaciones, los conjugados utilizados como sustrato de la neuraminidasa se pueden representar mediante la fórmula siguiente que muestra la sal de Na:

En algunas realizaciones, Ri, R2, R3 son cada uno, independientemente unos de otros, hidrógeno o alquilo que tiene de 1 a 5 átomos de carbono.

En algunas realizaciones, un sustrato para la neuraminidasa se convierte en un inhibidor de una segunda enzima, tal como una esterasa, tal como la luciferasa. En algunas realizaciones, un sustrato para la neuraminidasa incluye conjugados de derivados del ácido N-acetilneuramínico (ácido siálico) y derivados de una trifluorometilcetona (CF3). Los derivados del ácido N-acetilneuramínico son tal y como está descrito más arriba. En algunas realizaciones, un sustrato para la neuraminidasa es:

En algunas realizaciones, en donde un sustrato para la neuraminidasa se convierte a un inhibidor de una segunda enzima, tal como una esterasa, el sustrato también se sabe que es un inhibidor enmascarado. Los ejemplos de inhibidores enmascarados útiles con algunos métodos dados a conocer en la presente memoria se describen en la presente memoria.

En la figura 4 se muestra una síntesis de ejemplo. En algunas realizaciones, una muestra puede contener una neuraminidasa de una fuente que no sea el virus de la gripe. En algunas realizaciones, una neuraminidasa indeseada se inhibe con anticuerpos e inhibidores específicos. La actividad indeseada de la neuraminidasa se inhibe con anticuerpos policlonales o monoclonales específicos. Por ejemplo, para detectar la neuraminidasa del virus de la gripe, la actividad inespecífica de la neuraminidasa de organismos probablemente contaminantes en la muestra, tales como las especies bacterianas Stretococcus pneumoniae y Actinomyces viscosus, se inhiben con anticuerpos específicos contra las neuraminidasas de estas fuentes. Este abordaje es posible ya que las neuraminidasas de diferentes organismos tienen diferentes secuencias de aminoácidos, lo que permite generar anticuerpos contra la neuraminidasa específicos de especie o específicos de subespecie. Por ejemplo, los anticuerpos específicos que se suelen utilizar con frecuencia para diferenciar los subtipos de neuraminidasas del virus de la gripe en los ensayos de neutralización de la neuraminidasa.

Ensayos de combinación

Algunas realizaciones dadas a conocer en la presente memoria incluyen ensayos de combinación en donde se ensaya una muestra para (1) identificar el virus de la gripe de tipo A o de tipo B en la muestra; y (2) conocer la sensibilidad de la neuraminidasa del virus de la gripe a determinados fármacos antivíricos. En algunas realizaciones, el inmunoensayo para identificar el virus de la gripe de tipo A o de tipo B en la muestra se realiza en un tampón que es diferente del usado en el ensayo para medir la sensibilidad de la neuraminidasa del virus de la gripe a determinados fármacos antivíricos.

En algunas realizaciones se obtiene un espécimen. En algunas realizaciones, los especímenes pueden incluir lavados, aspirados y torundas nasofaríngeas. En algunas realizaciones, puede haber cantidades insuficientes de un espécimen para preparar varias muestras iniciales en diferentes tampones. En algunas realizaciones se coloca un espécimen en un primer tampón para obtener una primera muestra problema para un primer ensayo. En algunas realizaciones, la primera muestra problema comprende un tampón que es incompatible con un segundo ensayo. Por ejemplo, el primer tampón puede inhibir un segundo ensayo. En algunas de tales realizaciones, la primera muestra problema se convierte en una segunda muestra problema que comprende un segundo tampón que es compatible con un segundo ensayo. En algunas realizaciones, el primer o segundo ensayo incluyen un inmunoensayo para identificar el virus de la gripe de tipo A o de tipo B en la muestra. En algunas realizaciones, el primero o segundo ensayo es un ensayo para determinar la sensibilidad de la neuraminidasa del virus de la gripe a determinados fármacos antivíricos.

En algunas realizaciones, se añade un espécimen a un primer tampón compatible con un inmunoensayo para la identificación del virus de la gripe de tipo A o de tipo B para preparar una muestra problema para el inmunoensayo. Una primera porción de la muestra problema para el inmunoensayo se puede aplicar a un inmunoensayo para identificar el virus de la gripe de tipo A o de tipo B. Se puede convertir una segunda porción en una muestra problema para el ensayo de la neuraminidasa al poner en contacto la muestra problema para el inmunoensayo con una matriz de intercambio equilibrada con un segundo tampón compatible con un ensayo de la actividad de la neuraminidasa. Los ejemplos de matrices incluyen polisacáridos reticulados tal como Sephadex o Sepharose. En algunas realizaciones, la neuraminidasa comprende un cartucho que comprende una cámara que comprende la matriz. La variedad de Sephadex puede ser un G25 medio, G25 grueso, G25 fino. La altura del lecho puede ser cualquiera desde 1 cm a 15 cm. En algunas realizaciones, la resina se puede proporcionar prelavada y preequilibrada en un tampón que favorece la liberación de la neuraminidasa del virus de la gripe y una posterior medición de actividad de la neuraminidasa. Tales reactivos son similares a los encontrados en los kits NA-STAR™ y NA-FLUOR™ y el producto ZstatFlu™. Estos tampones contendrán típicamente poca cantidad de cloruro de sodio, tal como menos de 100 mM y a menudo menos de 10 mM. En algunas realizaciones, la cantidad de cloruro de sodio está entre 100 mM y 0,1 mM, 100 mM y 1 mM, 10 mM y 0,1 mM, y 10 mM y 1 mM. Estos tampones contendrán típicamente iones de calcio y/o magnesio en el margen de 0,1 mM a 50 mM, de 1 mM a 20 mM y/o de 4 mM a 10 mM para producir la medición más óptima de actividad de la neuraminidasa. El pH de los tampones utilizados para equilibrar la resina debe estar entre 5 y 8 para asegurarse de que el posterior ensayo de actividad de la neuraminidasa puede funcionar en cepas raras que contienen una neuraminidasa sensible al pH, tal como el virus de la gripe mortal H7N9. El espécimen de la gripe que pasa por el cartucho con resina puede contener una pequeña cantidad de detergente similar al detergente utilizado para liberar la nucleocápsida para el inmunoensayo de identidad de la gripe. Los detergentes pueden incluir NP-40, sales de biliares, Brij-35 y los Tritones. Un ejemplo de un Triton es Triton-X-100. Un ejemplo de una sal biliar es el desoxicolato de sodio. Estos agentes de lisis de tejidos y virus pueden venir en soluciones madre líquidas y en otros casos estar disponibles como sólidos. Los Tritones y el NP-40 pueden estar presentes del 0,01% al 10% v/v, o del 0,5% al 3% v/v en la muestra que pasa por el cartucho con resina. Los detergentes sólidos pueden estar presentes en concentraciones que oscilan del 0,1% al 10% p/v, o del 0,5% al 2% p/v.

En algunas realizaciones, se añade un espécimen a un primer tampón compatible con un ensayo de actividad de la neuraminidasa para preparar una muestra problema para el ensayo de la neuraminidasa. Se puede aplicar una primera porción de la muestra problema para el ensayo de la neuraminidasa a un ensayo de actividad de la neuraminidasa. Una segunda porción se puede convertir en una muestra problema para el inmunoensayo al poner en contacto la muestra problema para el ensayo de la neuraminidasa con una matriz de intercambio equilibrada con un segundo tampón compatible con un inmunoensayo para la identificación del virus de la gripe de tipo A o de tipo B. Los ejemplos de tales matrices incluyen polisacáridos reticulados, tales como Sephadex, Sepharose y nitrocelulosa. En algunas realizaciones, el inmunoensayo comprende una tira para la prueba y la matriz comprende nitrocelulosa. En algunas realizaciones, el segundo tampón está liofilizado o si no, seco en la matriz. El tampón de extracción diseñado para hacer que la nucleocápsida esté disponible para la detección por inmunoensayo se coloca previamente en la almohadilla del espécimen, en la almohadilla del conjugado, o en ambas. Los ejemplos idóneos de estas almohadillas (membranas) incluyen la fibra de vidrio Millipore G041, Millipore GFDX y Millipore C083 celulósica, Millipore C048, Millipore C068, Millipore C083, Millipore C248. Una familia específica de almohadillas de Millipore idóneas es la línea de productos SureWick. Otros ejemplos idóneos son la borra de algodón CF1, CF3, CF4 de GE Healthcare, Whatman Fusion 5, Std 14 y Std 15, y otros ejemplos son las almohadillas de poliéster para conjugar el espécimen. En la figura 14 se ilustra una realización de la colocación previa de los reactivos de extracción de la nucleocápsida para el inmunoensayo en la tira para la prueba de flujo lateral del inmunoensayo.

Medición de la sensibilidad de una neuraminidasa a un compuesto problema

Algunas realizaciones dadas a conocer en la presente memoria incluyen la medición de la sensibilidad de una neuraminidasa a un compuesto problema. Un compuesto problema incluye un fármaco antivírico, tal como un fármaco antivírico contra la gripe. En las realizaciones, la actividad de una neuraminidasa se mide en presencia y ausencia de un compuesto problema. El índice de la actividad se puede utilizar para determinar un valor de inhibición y el valor de inhibición puede compararse con un umbral de inhibición seleccionado para determinar si la neuraminidasa es sensible o resistente al compuesto problema.

En algunas realizaciones, un valor del umbral de inhibición se puede determinar mediante la determinación de los valores de inhibición para un panel de virus diferentes con una sensibilidad o resistencia conocidas a un compuesto problema en concreto. Los valores de inhibición para cada virus se pueden representar en un gráfico y el umbral de inhibición se puede determinar que se sitúa entre los valores de inhibición de los virus que son sensibles al compuesto problema y los valores de inhibición de los virus que son resistentes al compuesto problema. Los solicitantes han descubierto que, inesperadamente, los umbrales de inhibición para el virus de la gripe de tipo A y de tipo B son diferentes. En algunas realizaciones, el virus de tipo A tiene un umbral de inhibición más bajo que el virus de tipo B para determinados compuestos problema. En algunas realizaciones, si se conoce el tipo de virus de la gripe en una muestra (p. ej., tipo A o tipo B), el nivel del umbral de inhibición adecuado se puede aplicar al compuesto probado, lo que puede incrementar significativamente la sensibilidad del ensayo, lo que permite aportar la capacidad para resolver entre las cepas de la gripe con un nivel bajo de resistencia farmacológica y las esas cepas que no muestran ninguna resistencia farmacológica de ninguna clase.

Cartuchos de análisis para la neuraminidasa

Algunas realizaciones de los métodos y composiciones dados a conocer en la presente memoria incluyen cartuchos de análisis para un ensayo de la neuraminidasa. En algunas realizaciones, el ensayo de la neuraminidasa para determinar la sensibilidad a un compuesto problema, tal como un fármaco problema y/o un fármaco antivírico, se puede realizar en un cartucho que comprende una cámara para la matriz y una cámara de reactivos. En algunas realizaciones, el cartucho pude incluir una o más cámaras de análisis. Las cámaras de análisis pueden incluir una o varias cámaras de análisis para: espécimen reactivos de ensayo sin el compuesto problema; reactivos de ensayo sin espécimen o compuesto problema; espécimen reactivos de ensayo compuesto problema; y reactivo de ensayo compuesto problema sin espécimen. En algunas realizaciones, se analizan numerosos compuestos problema y se incluyen cámaras de análisis adicionales para el espécimen reactivos de ensayo compuesto problema, y reactivo de ensayo compuesto problema sin el espécimen para cada compuesto problema adicional (p. ej., primer, segundo, tercero, cuarto, etc., compuesto problema). Las cámaras de análisis de control para el espécimen reactivos de ensayo y/o reactivos de ensayo se pueden utilizar para todos los compuestos problema analizados en el cartucho. En algunas realizaciones, la cámara para la matriz está en comunicación fluídica con una o varias cámaras más, tales como las cámaras que se seleccionan para contener el espécimen. En algunas realizaciones, las cámaras de análisis incluyen: (1) prueba con fármaco, que incluye el espécimen, la mezcla de reacción y el fármaco problema; (2) prueba sin fármaco, que incluye el espécimen y la mezcla de reacción; (3) control para la mezcla de reacción, que incluye la mezcla de reacción; y (4) el control para el fármaco problema, que incluye la mezcla de reacción y el fármaco. En algunas realizaciones, se pueden incluir otros controles.

En algunas realizaciones se añade una muestra de fluido en la cámara para la matriz. La muestra de fluido fluye a través de la cámara para la matriz hasta una cámara seleccionada por contener la muestra mediante una o varias fuerzas seleccionadas de difusión, flujo capilar y gravedad. La señal de una reacción que se produce en una cámara se puede medir con un tubo fotomultiplicador. En la figura 5 se muestra un cartucho de ejemplo.

Métodos para detectar el virus de la gripe

Algunas realizaciones dadas a conocer en la presente memoria incluyen la detección de un virus de la gripe que comprende poner en contacto una muestra con un tampón de inmunoensayo adaptado para un inmunoensayo para detectar un virus de la gripe de tipo A o un virus de la gripe de tipo B, gracias a lo cual se obtiene una muestra problema para el inmunoensayo; poner en contacto una primera porción de la muestra problema para el inmunoensayo con una tira para la prueba que comprende un inmunoensayo para detectar el virus de la gripe de tipo A o de tipo B, gracias a lo cual se detecta la presencia o ausencia del virus de la gripe de tipo A o de tipo B en la muestra; por en contacto una segunda porción de la muestra problema para el inmunoensayo con una matriz que comprende un tampón para el ensayo de la neuraminidasa, por lo que se obtiene una muestra problema de la neuraminidasa; y poner en contacto la muestra problema de la neuraminidasa con un ensayo de la neuraminidasa, gracias a lo cual se detecta la presencia de una neuraminidasa en la muestra. En algunas realizaciones, el tampón del inmunoensayo es incompatible con un ensayo para la actividad de la neuraminidasa. En algunas realizaciones, el tampón del inmunoensayo inhibe la actividad de la neuraminidasa.

Algunas realizaciones de los métodos y las composiciones dadas a conocer en la presente memoria incluyen métodos para la detección de un virus de la gripe que comprenden: poner en contacto una muestra con un tampón para el ensayo de la neuraminidasa adaptado para un ensayo de la neuraminidasa, gracias a lo cual se obtiene una muestra problema de la neuraminidasa; poner en contacto una primera porción de la muestra problema de la neuraminidasa con una tira para la prueba que comprende un inmunoensayo para detectar el virus de la gripe de tipo A o de tipo B, en donde la muestra problema de la neuraminidasa entra en contacto con una matriz que comprende el tampón de inmunoensayo, gracias a lo cual se obtiene una muestra problema para el inmunoensayo y se detecta la presencia o la ausencia del virus de la gripe de tipo A o de tipo B en la muestra; y poner en contacto una segunda porción de la muestra problema de la neuraminidasa con un ensayo de la neuraminidasa, gracias a lo cual se detecta la presencia de la neuraminidasa en la muestra. En algunas realizaciones, el tampón para el ensayo de la neuraminidasa es incompatible con un inmunoensayo para detectar un virus de la gripe de tipo A o de tipo B. En algunas realizaciones, el tampón para el ensayo de la neuraminidasa inhibe la fijación específica de un anticuerpo a un antígeno seleccionado del grupo que consiste en el virus de la gripe de tipo A y de tipo B. En algunas realizaciones, la matriz comprende el tampón del inmunoensayo liofilizado.

En algunas realizaciones, la matriz comprende un tampón para el ensayo de la neuraminidasa y los reactivos para el ensayo de la neuraminidasa se encuentran en el mismo recipiente, tal como un cartucho. En algunas realizaciones, el recipiente comprende numerosas cámaras, tal como una cámara que comprende la matriz y una cámara que comprende reactivos para el ensayo de la neuraminidasa. En algunas realizaciones, la matriz comprende un polisacárido reticulado, tal como Sephadex o Sepharose. En algunas realizaciones, el recipiente comprende un cartucho con numerosos pocillos adaptado para ser leído con un tubo fotomultiplicador, tal como un tubo fotomultiplicador portátil. A continuación, la tira con los muchos pocillos o el cartucho con resina y la tira multipocillo se desplaza por un raíl que coloca cada pocilio directamente debajo del detector. El movimiento por el raíl se realiza mediante un motor de pasos que está programado para detenerse y permitir el recuento de cada pocillo.

En algunas realizaciones, la muestra problema para el inmunoensayo y la muestra problema de la neuraminidasa se desplazan hasta el recipiente mediante una o más fuerzas seleccionadas de gravedad, acción capilar y difusión. Algunas realizaciones de los métodos y composiciones dados a conocer en la presente memoria incluyen la determinación de la sensibilidad de una neuraminidasa a un compuesto problema que comprende: (a) obtener un índice para el valor de la inhibición, en donde el índice comprende el nivel de actividad de la neuraminidasa en presencia de un compuesto problema con respecto al nivel de actividad de la neuraminidasa en ausencia del compuesto problema; y (b) comparar el índice para el valor de la inhibición con un umbral de inhibición, gracias a lo cual se determina la sensibilidad de la actividad de la neuraminidasa al compuesto problema. Un índice para el valor de la inhibición por encima del umbral de inhibición indica que la actividad de la neuraminidasa es sensible al compuesto problema y, gracias a ello, la cepa del virus de la gripe es sensible al compuesto problema, y un índice por debajo del umbral indica que la actividad de la neuraminidasa no es sensible al compuesto problema y, por lo tanto, la cepa de la gripe es resistente al compuesto problema. En algunas realizaciones, el umbral de inhibición se determina mediante la detección de un virus de tipo A o de tipo B. En algunas realizaciones, el umbral de inhibición se determina mediante el compuesto problema. En algunas realizaciones, un compuesto problema se puede seleccionar de acuerdo con la sensibilidad de la neuraminidasa al compuesto problema para tratar el virus de la gripe. En algunas realizaciones, a un paciente que padece la cepa de la gripe ensayada se le puede aconsejar que tome el compuesto problema, o que el compuesto problema se puede administrar a un paciente, cuando la neuraminidasa es sensible al compuesto problema.

En algunas realizaciones, un ensayo de la neuraminidasa comprende un ensayo enzimático dual que comprende una enzima delatora. En algunas realizaciones, la actividad de la neuraminidasa produce un sustrato para la enzima delatora. En algunas realizaciones, el ensayo de la neuraminidasa comprende un conjugado de ácido N-acetilneuramínico y luciferina o un derivado de los mismos. En algunas realizaciones, la actividad de la neuraminidasa produce un inhibidor de la enzima delatora. En algunas realizaciones, el ensayo de la neuraminidasa comprende un conjugado de ácido N-acetilneuramínico y trifluorometilcetona o un derivado del mismo. En algunas realizaciones, la enzima delatora comprende la luciferasa. En algunas realizaciones, el tampón del inmunoensayo inhibe la actividad de la luciferasa. En algunas realizaciones, el nivel de actividad de la neuraminidasa se mide con un tubo fotomultiplicador.

En algunas realizaciones, el compuesto problema es un fármaco antivírico. En algunas realizaciones, el compuesto problema es un fármaco antivírico seleccionado del grupo que consiste en oseltamivir, zanamivir, peramivir y lanamivir.

En algunas realizaciones, el inmunoensayo comprende un ensayo de tipo sándwich.

En algunas realizaciones, la muestra se obtiene de un sujeto, tal como un humano, tal como el sujeto del que se sospecha que tiene la gripe.

En algunas realizaciones, el ensayo de combinación descrito en la presente memoria tiene un límite de detección del virus de la gripe en términos de dosis infecciosa de al menos 2000 TCID50/ml, 1000 TCID50/ml, 500 TCID50/ml, 200 TCID50/ml, 100 TCID50/ml, o un margen definido por dos valores cualquiera de ellos. Sobre una base molar, la prueba de combinación descrita tiene la capacidad de detectar la neuraminidasa en al menos 1000 fM, 500 fM, 100 fM, 10 fM o un margen definido por dos valores cualquiera de ellos.

Métodos para seleccionar un tratamiento

La descripción adicional de los métodos y composiciones dados a conocer en la presente memoria se refiere a los métodos para seleccionar un tratamiento contra un virus de la gripe que comprende (a) poner en contacto una muestra con un tampón del inmunoensayo adaptado para un inmunoensayo para detectar un virus de la gripe de tipo A o un virus de la gripe de tipo B, gracias a lo cual se obtiene una muestra problema para el inmunoensayo; (b) poner en contacto una primera porción de la muestra problema para el inmunoensayo con una tira para la prueba de flujo lateral que comprende un inmunoensayo para detectar un virus de la gripe de tipo A o de tipo B, gracias a lo cual se detecta la presencia o la ausencia del virus de la gripe de tipo A o de tipo B en la muestra; (c) poner en contacto una segunda porción de la muestra problema para el inmunoensayo con una matriz que comprende un tampón para el ensayo de la neuraminidasa, gracias a lo cual se obtiene una muestra problema de la neuraminidasa; (d) poner en contacto la muestra problema de la neuraminidasa con un ensayo de la neuraminidasa, gracias a lo cual se determina la sensibilidad de una neuraminidasa de la muestra problema de la neuraminidasa a un compuesto problema (p. ej., fármaco antivírico contra el virus de la gripe), en donde la determinación comprende: (i) obtener un índice para el valor de la inhibición, en donde el índice comprende el nivel de actividad de la neuraminidasa en presencia de un compuesto problema con respecto al nivel de actividad de la neuraminidasa en ausencia del compuesto problema y (ii) comparar el índice para el valor de la inhibición con un umbral de inhibición, gracias a lo cual se determina la sensibilidad de la actividad de la neuraminidasa al compuesto problema; y (e) seleccionar o identificar el compuesto problema que se ha determinado que inhibe la actividad de la neuraminidasa. En algunas realizaciones, el umbral de inhibición se determina mediante la detección del virus de tipo A o de tipo B. En algunas realizaciones, el tampón del inmunoensayo es incompatible con un ensayo para la actividad de la neuraminidasa. En algunas realizaciones, el tampón del inmunoensayo inhibe la actividad de la neuraminidasa. En algunas realizaciones, las etapas (c) y (d) se realizan en el mismo recipiente. En algunas realizaciones se sospecha que el sujeto tiene el virus de la gripe. En algunas realizaciones, el sujeto es un humano.

La descripción adicional de los métodos y de las composiciones dados a conocer en la presente memoria se refiere a los métodos para seleccionar un tratamiento contra un virus de la gripe que comprende: (a) poner en contacto una muestra con un tampón para el ensayo de la neuraminidasa adaptado para un ensayo de la neuraminidasa, gracias a lo cual se obtiene una muestra problema de la neuraminidasa; (b) poner en contacto una primera porción de la muestra problema de la neuraminidasa con una tira para la prueba que comprende un inmunoensayo para detectar un virus de la gripe de tipo A o de tipo B, en donde la muestra problema de la neuraminidasa entra en contacto con una matriz que comprende el tampón del inmunoensayo, gracias a lo cual se obtiene una muestra problema para el inmunoensayo y se detecta la presencia o la ausencia del virus de la gripe de tipo A o de tipo B en la muestra; y (c) poner en contacto una segunda porción de la muestra problema de la neuraminidasa con un ensayo de la neuraminidasa, gracias a lo cual se determina la sensibilidad de una neuraminidasa de la muestra problema de la neuraminidasa a un compuesto problema, en donde la determinación comprende: (i) obtener un índice para el valor de la inhibición, en donde el índice comprende el nivel de actividad de la neuraminidasa en presencia de un compuesto problema con respecto al nivel de actividad de la neuraminidasa en ausencia del compuesto problema y (ii) comparar el índice para el valor de la inhibición con un umbral de inhibición, gracias a lo cual se determina la sensibilidad de la actividad de la neuraminidasa al compuesto problema; y (e) seleccionar el compuesto problema que se ha determinado que inhibe la actividad de la neuraminidasa. En algunas realizaciones, el umbral de inhibición se determina mediante la detección del virus de tipo A o de tipo B. En algunas realizaciones, la matriz comprende el tampón del inmunoensayo liofilizado. En algunas realizaciones, la etapa (c) se realiza en el mismo recipiente.

En algunas realizaciones, el umbral de inhibición se determina mediante la detección del virus de tipo A o de tipo B, en donde se utiliza un primer umbral de inhibición si se detecta el virus de la gripe de tipo A, y se utiliza un segundo umbral de inhibición si se detecta el virus de la gripe de tipo B. En algunas realizaciones, el umbral de inhibición es más bajo si se detecta el virus de la gripe de tipo A que si se detecta el virus de la gripe de tipo B.

En algunas realizaciones, el recipiente comprende numerosas cámaras, tal como una cámara que comprende la matriz y una cámara que comprende los reactivos para el ensayo de la neuraminidasa. En algunas realizaciones, la matriz comprende un polisacárido reticulado, tal como Sephadex y Sepharose.

En algunas realizaciones, el recipiente comprende un cartucho, tal como un cartucho con numerosos pocillos adaptado para ser leído con un tubo fotomultiplicador. En algunas realizaciones, el tubo fotomultiplicador es portátil. En algunas realizaciones, el ensayo de la neuraminidasa comprende un ensayo enzimático dual que comprende una enzima delatora. En algunas realizaciones, la actividad de la neuraminidasa produce un sustrato para la enzima delatora. En algunas realizaciones, el ensayo de la neuraminidasa comprende un conjugado de ácido N-acetilneuramínico y luciferina o un derivado de los mismos. En algunas realizaciones, la actividad de la neuraminidasa produce un inhibidor de la enzima delatora. En algunas realizaciones, el ensayo de la neuraminidasa comprende un conjugado de ácido N-acetilneuramínico y trifluorometilcetona o un derivado de los mismos. En algunas realizaciones, la enzima delatora comprende la luciferasa. En algunas realizaciones, el nivel de actividad de la neuraminidasa se mide con un tubo fotomultiplicador.

En algunas realizaciones, el compuesto problema es un fármaco antivírico. En algunas realizaciones, el compuesto problema es un fármaco antivírico seleccionado del grupo que consiste en oseltamivir, zanamivir, peramivir y lanamivir.

En algunas realizaciones, el inmunoensayo comprende un ensayo de tipo sándwich.

En algunas realizaciones, la muestra se obtiene de un sujeto.

Sistemas y kits

Algunas realizaciones dadas a conocer en la presente memoria incluyen sistemas diagnósticos para detectar el virus de la gripe. Tales sistemas incluyen un cartucho para la determinación de la actividad de la neuraminidasa en una muestra, en donde el cartucho está configurado para que convierta una muestra que comprende un tampón incompatible para la determinación en una muestra que comprende un tampón compatible para la determinación; y una tira para la prueba para la detección del virus de la gripe de tipo A o de tipo B en la muestra, en donde la tira para la prueba, tal como una tira para flujo lateral, está configurada para que convierta una muestra que comprende un tampón incompatible para la detección en una muestra que comprende un tampón compatible para la detección. Tales sistemas también incluyen un primer detector configurado para medir una señal desde el cartucho; y un segundo detector está configurado para medir una señal desde la tira para la prueba.

El cartucho comprende una cámara para la matriz que comprende una matriz de cartucho que comprende el tampón compatible para la determinación, y una cámara de reactivos que comprende los reactivos para la determinación de la actividad de la neuraminidasa. La matriz del cartucho comprende un polisacárido reticulado. En algunas realizaciones, la matriz para el cartucho se selecciona del grupo que consiste en Sephadex y Sepharose. La cámara para la matriz y la cámara para el cartucho están en comunicación fluídica, de tal forma que una muestra aplicada a la cámara para la matriz fluye desde la cámara para la matriz hasta la cámara de reactivos. En algunas realizaciones, la muestra fluye en el cartucho mediante una o varias fuerzas seleccionadas de gravedad, acción capilar y difusión. En algunas realizaciones, el cartucho comprende un cartucho con numerosos pocillos adaptado para ser leído con un tubo fotomultiplicador.

En algunas realizaciones, la tira para la prueba comprende un inmunoensayo. En algunas realizaciones, el inmunoensayo es un ensayo de tipo sándwich. En algunas realizaciones, la tira para la prueba comprende una matriz que comprende el tampón compatible para la detección. En algunas realizaciones, la matriz comprende nitrocelulosa. En algunas realizaciones, el tampón compatible para la detección está liofilizado.

En algunas realizaciones, el primer detector comprende un luminómetro. En algunas realizaciones, el primer detector comprende un lector de reflectancia. En algunas realizaciones, el segundo detector comprende un tubo fotomultiplicador. En algunas realizaciones, un dispositivo comprende el primer y el segundo detectores. En algunas realizaciones, el primer y el segundo detectores son el mismo. En algunas realizaciones, el dispositivo es portátil. En algunas realizaciones, el dispositivo cabe en la mano. En algunas realizaciones, la tira para el flujo lateral y la tira multipocillos/cartucho para la resina se leen en una plataforma común con dos modalidades de detección independientes, pero que comparten una fuente de energía y una pantalla comunes para revisar los resultados de ID y AST.

Algunas realizaciones dadas a conocer en la presente memoria incluyen kits de diagnóstico para detectar el virus de la gripe. En algunas realizaciones, tales kits incluyen un cartucho para determinar la actividad de la neuraminidasa en una muestra, en donde el cartucho está configurado para que convierta una muestra que comprende un tampón incompatible para la determinación en una muestra que comprende un tampón compatible para la determinación; y una tira para la prueba para detectar el virus de la gripe de tipo A o de tipo B en la muestra, en donde la tira para la prueba está configurada para que convierta una muestra que comprende un tampón incompatible para la detección en una muestra que comprende un tampón compatible para la detección. Algunas realizaciones también incluyen un primer detector configurado para medir una señal desde el cartucho; y un segundo detector configurado para medir una señal desde la tira para la prueba.

Algunas realizaciones también incluyen los reactivos para un ensayo de actividad de la neuraminidasa. En algunas realizaciones, los reactivos del ensayo de actividad de la neuraminidasa se seleccionan del grupo que consiste en luciferasa, un conjugado de ácido N-acetilneuramínico y luciferina o un derivado de los mismos, un ácido N-acetilneuramínico y una trifluorometilcetona o un derivado de los mismos, y un fármaco antivírico. En algunas realizaciones, el fármaco antivírico se selecciona del grupo que consiste en oseltamivir, zanamivir, peramivir y lanamivir.

Algunas realizaciones también incluyen los reactivos para un inmunoensayo. En algunas realizaciones, los reactivos del inmunoensayo se seleccionan del grupo que consiste en un anticuerpo específico contra un antígeno del virus de la gripe de tipo A, y un anticuerpo específico contra un antígeno del virus de la gripe de tipo B.

EJEMPLOS

Ejemplo 1. Ensayo de combinación

Este ejemplo ilustra un flujo de trabajo de ejemplo con una prueba para el virus de la gripe de tipo A o de tipo B, y una prueba de resistencia de la neuraminidasa al fármaco. Un kit que comprende: un tubo con aplicador que contiene un tampón de extracción del inmunoensayo y una tapa con una abertura; un primer dispositivo de la prueba que comprende un inmunoensayo de flujo lateral para identificar el virus de la gripe de tipo A o de tipo B; y un segundo dispositivo de la prueba que comprende un ensayo de flujo cinético para determinar la resistencia farmacológica de la neuraminidasa, se desenvuelve del envase y cada componente se marca con una identificación del paciente. Se recoge un espécimen de la nariz del paciente con una torunda. La torunda se introduce en el tampón de extracción y se arremolina contra la pared interior tres veces. Se retira la torunda del tampón de extracción mientras se aprietan los laterales del tubo y a continuación se descarta. La tapa del tubo con aplicador esta fijada al tubo.

Se invierte el tubo con aplicador, se hacen salir tres gotas (aproximadamente 85 jl) del tampón de extracción por la tapa y se aplican al primer dispositivo de la prueba. El primer dispositivo de la prueba incluye una almohadilla para el espécimen que no se solapa con los reactivos del detector que contiene un primer tampón de la prueba para la primera prueba. El espécimen se deja difundir por el primer tampón de la prueba hacia el sitio de la prueba del primer dispositivo de la prueba. El primer dispositivo de la prueba se incuba durante 10 min y los resultados de la primera prueba se miden con un lector. El lector proporciona una indicación de si en la muestra está presente el virus de la gripe de tipo A o de tipo B.

Se invierte el tubo con aplicador y se aprieta para que el tampón de extracción que queda salga por la tapa y se aplica al segundo dispositivo de la prueba. En esta prueba, un incremento de la neuraminidasa da lugar a un incremento en la señal de la luciferasa. El segundo dispositivo incluye una cámara para el cambio del tampón (también conocido como cámara para la matriz) y las cámaras de reacción. El espécimen se difunde por la cámara para el cambio del tampón hacia las cámaras de la reacción para los ensayos de resistencia farmacológica de la neuraminidasa. Un valor de inhibición es el índice de la señal con el fármaco problema con respecto a la señal sin el fármaco problema, teniendo en cuenta el ruido de fondo de la señal producido por la mezcla de reacción y el fármaco problema. Las cámaras de reacción se muestran en la tabla 5A.

Tabla 5A

Se incuba el segundo dispositivo de la prueba y se mide la señal emitida por cada cámara con un tubo fotomultiplicador. Se determina un valor de inhibición con la siguiente fórmula a partir de la señales de cada cámara de reacción:

Los niveles del umbral de sensibilidad farmacológica para cada fármaco antivírico problema se seleccionan de acuerdo con el tipo de virus de la gripe determinado en la primera prueba, y se utiliza el fármaco antivírico problema. Si el valor de inhibición está por debajo del valor del umbral de inhibición, se determina que la neuraminidasa es sensible al fármaco antivírico problema.

Ejemplo 2: Sensibilidad del instrumental con el tubo fotomultiplicador

Este ejemplo muestra la sensibilidad de un dispositivo con el tubo fotomultiplicador TO-Can de Hamamatsu y la capacidad para realizar la lectura del ruido con poca oscuridad en un sistema portátil que se lleva en la mano. Se midieron las unidades luminosas relativas (ULR) para diferentes concentraciones de una señal quimioluminiscente positiva que produce el reactivo de control (Cell Titer Glo) al utilizarse un dispositivo con el tubo fotomultiplicador TO-Can de Hamamatsu. Los controles incluían un control de ruido y un control de recuento en oscuridad. Los resultados se muestran en la figura 6.

Ejemplo 3: Ensayo enzimático dual

Este ejemplo muestra un ensayo enzimático dual para la cepa problema A/Mississippi/03/2001 A (H1N1) H275Y que comprende una neuraminidasa que es sensible al zanamivir y resistente al oseltamivir. El espécimen que comprende la cepa problema se diluyó 1/3000 o 1/9000, y se aplicó en un dispositivo de análisis por flujo cinético. Las cámaras de la prueba en el ensayo de análisis por flujo cinético incluían las de la tabla 5A, es decir: (1) mezcla de reacción espécimen; (2) mezcla de reacción espécimen fármaco antivírico problema; (3) control: mezcla de reacción; y (4) control: mezcla de reacción fármaco antivírico problema. Se midió la señal emitida por cada cámara de la prueba con un dispositivo con tubo fotomultiplicador. Los resultados se muestran en la figura 7. El ensayo demostró que la cepa problema era más sensible al zanamivir que al oseltamivir.

Ejemplo 4: Sensibilidad de diferentes cepas de la gripe A

Este ejemplo muestra la determinación de un nivel del umbral de inhibición para un panel de virus de la gripe de tipo A que se sabe que son sensibles o resistentes al oseltamivir. Se prepararon los especímenes de diferentes diluciones de diferentes cepas de la gripe A y se aplicaron a un dispositivo de la prueba de flujo cinético con oseltamivir. Las cámaras de la prueba en el ensayo de flujo cinético incluían lo de la tabla 5A, es decir: (1) mezcla de reacción espécimen; (2) mezcla de reacción espécimen fármaco antivírico problema; (3) control: mezcla de reacción; y (4) control: mezcla de reacción fármaco antivírico problema. Se midió la señal de cada cámara de la prueba con un tubo fotomultiplicador. Se determinó un valor de inhibición de cada cepa como en el ejemplo 1. Los valores de inhibición se representaron en un gráfico para diferentes diluciones de cada cepa y se determinó un valor de umbral de inhibición a partir del gráfico. El valor de inhibición de umbral, o valor de corte, para discernir la sensibilidad al fármaco de la resistencia al fármaco fue de aproximadamente 0,6. El corte se determinó que era un valor donde las barras de error de las cepas sensibles al fármaco no se solapaban con las cepas resistentes a la gripe. Véase la figura 8.

Ejemplo 5: Sensibilidad de diferentes cepas de la gripe B

Este ejemplo muestra la determinación de un nivel de umbral de inhibición para un panel de virus de la gripe de tipo A que se sabe que son sensibles o resistentes al oseltamivir. Se prepararon los especímenes y se analizaron como en el ejemplo 4. Se determinó un valor de inhibición para cada cepa. Los valores de inhibición se representaron en un gráfico para diferentes diluciones de cada cepa, y se determinó un valor de inhibición de umbral a partir del gráfico. El valor de inhibición de umbral, o valor de corte, para discernir lo sensible al fármaco de lo resistente al fármaco es de aproximadamente 1,55. Véase la figura 9.

Ejemplo 6: Efecto del cambio de tampón sobre el ensayo de flujo lateral

Este ejemplo demuestra la sensibilidad del inmunoensayo de flujo lateral para determinar el virus de la gripe de tipo A o de tipo B en un espécimen, después del cambio de tampón desde el tampón para el ensayo de la neuraminidasa por flujo cinético. Se analizaron los especímenes de diferentes diluciones de los virus de la gripe (A/PR/8/34, B/Florida/4/2006 y A/Texas/12/2007) utilizando (1) el ensayo Veritor™ de flujo lateral de acuerdo con el prospecto del envase, o (2) el ensayo Veritor™ de flujo lateral con cambio de tampón en el que el tampón de extracción del ensayo de flujo cinético se cambia al tampón de extracción del inmunoensayo presente en la almohadilla del flujo lateral. Se midieron las señales y el lector proporcionó una determinación de la presencia o la ausencia del virus de la gripe de tipo A y/o de tipo B en cada muestra. En la tabla 6 se resumen los resultados. En especial, se identificó el virus de la gripe de tipo A o de tipo B en los especímenes más diluidos en los ensayos con un protocolo con Veritor™ con cambio de tampón, que con el ensayo Veritor™ de acuerdo con el prospecto del envase.

Tabla 6

Ejemplo 7: Sensibilidad del inmunoensayo y del ensayo enzimático dual (ED)

El inmunoensayo Veritor™ y el ensayo enzimático dual por flujo cinético de la neuraminidasa con oseltamivir se realizaron en diferentes diluciones del virus de la gripe: A/Perth/211/2011 WT (tipo silvestre). En la tabla 7 se resumen los resultados de dos experimentos. Estos resultados demuestran que aplicar un espécimen en el tampón de extracción del inmunoensayo a una resina de Sephadex G25M equilibrada previamente con el tampón de actividad de la neuraminidasa no tuvo un efecto negativo sobre la sensibilidad del ensayo ED estándar (est.). El ensayo ED est. fue capaz de proporcionar un resultado de sensibilidad farmacológica a las concentraciones clínicamente relevantes de los especímenes.

Tabla 7

Ejemplo 8: Detección de la resistencia farmacológica en los especímenes con mezclas de virus de la gripe Se analizaron diferentes diluciones de especímenes mediante el uso de un ensayo de flujo cinético con el fármaco antivírico oseltamivir. Los especímenes incluían A/Bethesda (H3N2 R); A/Fukui (H3N2 S); y la mezcla de A/Bethesda (V) A/Fukui (WT). Se midieron las señales con un tubo fotomultiplicador y se determinaron los valores de inhibición. Los resultados se resumen en la figura 10. Estos resultados demuestran que la química de detección de AST enzimática dual estándar, cuando se hace tras un ensayo que distingue el virus de la gripe A y de la gripe B (lo que permite aplicar el valor de inhibición más adecuado), con el uso de un TFM con la detección de un único fotón y la aplicación de la sustracción del fondo puede identificar una cepa resistente al fármaco cuando está presente en un espécimen con una cepa sensible al fármaco.

Ejemplo 9: Comparación de los ensayos enzimáticos duales

En este ejemplo se compara la sensibilidad de dos tipos de ensayos enzimáticos duales. Se ensayaron diferentes diluciones de una neuraminidasa purificada del virus de la gripe H3N2 con un ensayo enzimático dual que incluía (1) un sustrato de la neuraminidasa que es precursor de un inhibidor de la luciferasa (NANA-CF3; véase la figura 11); o bien (2) un sustrato de la neuraminidasa que es precursor de un sustrato de la luciferasa (un conjugado de ácido W-acetilneuramínico y luciferina). La actividad de la neuraminidasa escinde el NANA-CF3 para dar el inhibidor de la esterasa, el CFC. En un ensayo en el que la esterasa comprende la luciferasa, la actividad de la neuraminidasa da lugar a la presencia del inhibidor CFC, que inhibe la actividad de la luciferasa, lo que da lugar a una disminución de la conversión de un sustrato de la luciferasa en un producto luminiscente. Véase la figura 12. El resultado de los ensayos se muestra en la figura 13. El nivel de detección (LOD, por su nombre en inglés) para el ensayo (1, ensayo enzimático dual con inhibidor enmascarado) era de aproximadamente 10 pM. En cambio, el nivel de detección para el ensayo (2, ensayo enzimático dual estándar) era de menos de 0,1 pM.

Ejemplo 10: Efecto del control sobre las señales de fondo

Este ejemplo muestra el efecto de sustraer el ruido de fondo tal y como se describe en la fórmula del ejemplo 1 a la hora de calcular los valores de inhibición de la actividad de la neuraminidasa en presencia del fármaco antivírico. Los valores de inhibición se determinaron para diferentes concentraciones de una cepa concreta de virus con un fármaco antivírico concreto, como en el ejemplo 1. El valor de inhibición sin las sustracciones del fondo se determinó con la fórmula que viene a continuación para la señal de una cámara que contiene la mezcla de reacción espécimen fármaco antivírico problema (prueba con fármaco), y mezcla de reacción espécimen (prueba sin fármaco):

. . . .... .. (p ru e b a c o n fá rm a c o ) .

V a lo r d e in h ib ic ió n = - ij- ------ ¡------ ;— ----------- 7— x a m p lif ic a d o r

(p ru e b a s in fá rm a c o )

Los resultados se muestran en la tabla 8. En la tabla 8, las columnas de izquierda a derecha son los resultados de concentraciones decrecientes del virus. La sustracción del ruido de fondo, tal y como se muestra en el ejemplo 1 en el cálculo de los valores de inhibición, incrementa la sensibilidad del ensayo.

Tabla 8

El término «que comprende», tal y como se utiliza en la presente memoria, es sinónimo de «que incluye», «que contiene» o «caracterizado por», y es inclusivo o ilimitado y no descarta otros elementos o etapas de métodos más que no se mencionan.

La descripción de más arriba describe varios métodos y materiales de la presente invención. Esta invención está sujeta a modificaciones en los métodos y materiales, así como alteraciones en los métodos de fabricación y en el equipamiento. Tales modificaciones pueden ser evidentes para los expertos en la técnica a partir de una consideración de esta descripción o de la práctica de la invención descrita en la presente memoria.

Claims (26)

REIVINDICACIONES

1. Un método para detectar un virus de la gripe de tipo A o B y para detectar la actividad de la neuraminidasa en una muestra, en donde el método comprende:

(a) poner en contacto una muestra con un tampón de inmunoensayo adaptado para un inmunoensayo para la detección de un virus de la gripe de tipo A o de un virus de la gripe de tipo B, gracias a lo cual se obtiene una muestra problema para el inmunoensayo;

(b) poner en contacto una primera porción de la muestra problema para el inmunoensayo con una prueba que comprende un inmunoensayo para la detección de un virus de la gripe de tipo A o de tipo B, gracias a lo cual se detecta la presencia o la ausencia del virus de la gripe de tipo A o de tipo B en la muestra;

(c) poner en contacto una segunda porción de la muestra problema para el inmunoensayo con una matriz cambiadora que comprende un tampón para el ensayo de la neuraminidasa, gracias a lo cual se obtiene una muestra problema de la neuraminidasa; y

(d) poner en contacto la muestra problema de la neuraminidasa con un ensayo de actividad de la neuraminidasa, gracias a lo cual se detecta la actividad de la neuraminidasa en la muestra.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el tampón de inmunoensayo es incompatible con un ensayo para la actividad de la neuraminidasa.

3. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde el tampón del inmunoensayo inhibe la actividad de la neuraminidasa.

4. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde las etapas (c) y (d) se realizan en el mismo recipiente, en donde el recipiente comprende numerosas cámaras, y en donde el recipiente comprende una cámara que comprende la matriz y una cámara que comprende los reactivos para el ensayo de la neuraminidasa.

5. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la matriz comprende un polisacárido reticulado.

6. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 5, en donde el recipiente comprende un cartucho con numerosos pocillos adaptado para ser leído con un fotomultiplicador, en donde el nivel de actividad de la neuraminidasa se mide con un tubo fotomultiplicador.

7. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el ensayo de la neuraminidasa comprende la determinación de la sensibilidad que tiene una neuraminidasa a un compuesto problema, y en donde el ensayo de la neuraminidasa comprende:

(a) obtener un índice para el valor de la inhibición, en donde el índice comprende el nivel de actividad de la neuraminidasa en presencia de un compuesto problema con respecto al nivel de actividad de la neuraminidasa en ausencia del compuesto problema; y

(b) comparar el índice para el valor de la inhibición con un umbral de inhibición, gracias a lo cual se determina la sensibilidad que tiene la actividad de la neuraminidasa al compuesto problema.

8. El método de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el umbral de inhibición se determina mediante la detección de un virus de tipo A o de tipo B, en donde se utiliza un primer umbral de inhibición si se detecta el virus de tipo A y se utiliza un segundo umbral de inhibición si se detecta el virus de tipo B.

9. El método de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el primer umbral es menor que el segundo umbral.

10. El método de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el umbral de inhibición se determina mediante el compuesto problema, en donde el compuesto problema es un fármaco antivírico.

11. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde el ensayo de la neuraminidasa comprende un ensayo enzimático dual que comprende una enzima delatora, en donde la actividad de la neuraminidasa produce un sustrato para la enzima delatora, o la actividad de la neuraminidasa produce un inhibidor de la enzima delatora.

12. El método de acuerdo con la reivindicación 11, en donde la enzima delatora comprende la luciferasa, y en donde el tampón de inmunoensayo inhibe la actividad de la luciferasa.

13. Un sistema diagnóstico para la detección del virus de la gripe de tipo A o B y para la determinación de la actividad de la neuraminidasa en una muestra, en donde el sistema diagnóstico comprende:

un cartucho para determinar la actividad de la neuraminidasa en una muestra, en donde el cartucho está configurado para que convierta una muestra que comprende un tampón incompatible para la determinación en una muestra que comprende un tampón compatible para la determinación;

una prueba para detectar el virus de la gripe de tipo A o de tipo B en la muestra, en donde la prueba está configurada para que convierta una muestra que comprende un tampón incompatible para la detección en una muestra que comprende un tampón compatible para la detección,

un primer detector configurado para medir una señal procedente de la prueba; y

un segundo detector configurado para medir una señal procedente del cartucho, en donde el cartucho comprende una cámara para la matriz que comprende una matriz de cartucho que comprende el tampón compatible para la determinación, y una cámara de reactivos que comprende los reactivos para la determinación de la actividad de la neuraminidasa, en donde la matriz del cartucho comprende un polisacárido reticulado, y en donde la cámara para la matriz y la cámara para el cartucho están en comunicación fluídica, de tal manera que una muestra aplicada a la cámara para la matriz fluye desde la cámara para la matriz hasta la cámara de reactivos.

14. El sistema de acuerdo con la reivindicación 13, en donde el cartucho comprende un cartucho con numerosos pocillos adaptado para ser leído con un tubo fotomultiplicador o con un tubo microfotomultiplicador.

15. El sistema de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 14, en donde la prueba comprende un inmunoensayo.

16. Un kit para detectar el virus de la gripe de tipo A o de tipo B y determinar la actividad de la neuraminidasa en una muestra, en donde el kit comprende:

un cartucho para determinar la actividad de la neuraminidasa en una muestra, en donde el cartucho está configurado para que convierta una muestra que comprende un tampón incompatible para la determinación en una muestra que comprende un tampón compatible para la determinación, en donde el cartucho comprende una cámara para la matriz que comprende una matriz de cartucho que comprende el tampón compatible para la determinación, y una cámara de reactivos que comprende los reactivos para la determinación de la actividad de la neuraminidasa, en donde la matriz del cartucho comprende un polisacárido reticulado, y en donde la cámara para la matriz y la cámara para el cartucho están en comunicación fluídica de tal manera que una muestra aplicada a la cámara para la matriz fluye desde la cámara para la matriz hasta la cámara de reactivos; y

una prueba para detectar el virus de la gripe de tipo A o de tipo B en la muestra, en donde la prueba está configurada para que convierta una muestra que comprende un tampón incompatible para la detección en una muestra que comprende un tampón compatible para la detección.

17. El kit de acuerdo con la reivindicación 16, que además comprende los reactivos para un ensayo de actividad de la neuraminidasa, en donde los reactivos del ensayo de actividad de la neuraminidasa se seleccionan del grupo que consiste en luciferasa, un conjugado de ácido A/-acetilneuramínico y luciferina o un derivado de los mismos, un ácido W-acetilneuramínico y una trifluorometilcetona o un derivado de los mismos, y un fármaco antivírico.

18. El kit de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 17, que además comprende los reactivos para un inmunoensayo, en donde los reactivos del inmunoensayo se seleccionan del grupo que consiste en un anticuerpo específico contra un antígeno del virus de la gripe de tipo A y un anticuerpo específico contra un antígeno del virus de la gripe de tipo B.

19. Un compuesto inhibidor enmascarado para ser usado en el ensayo enzimático dual de sensibilidad de la neuraminidasa del virus de la gripe que tiene la estructura de la fórmula (I):

en donde:

R1, R2 y R3 son cada uno independientemente hidrógeno o alquilo(Ci-5);

n es 0, 1, 2 o 3;

R4 es -(CH2)mC(=O)CF3;

m es 0 o 1;

X es -S(O)z o -CH(R5)-;

R5 es -S(O)zCH3; y

z es 0, 1 o 2.

20. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 19, en donde el compuesto de la fórmula (I) se selecciona del grupo que consiste en:

21. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 12, en donde el ensayo de la neuraminidasa comprende un compuesto inhibidor enmascarado que tiene la estructura de fórmula (I):

R1, R2 y R3 son cada uno independientemente hidrógeno o alquilo(C1-5);

n es 0, 1, 2, o 3;

R4 es -(CH2)mC(=O)CF3;

m es 0 o 1;

X es -S(O)z- o -CH(R5)-;

R5 es -S(O)zCH3; y

z es 0, 1 o 2.

22. El método de acuerdo con la reivindicación 21, en donde el compuesto de fórmula (I) se selecciona del grupo que consiste en:

23. El sistema de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en donde los reactivos para la determinación de la actividad de la neuraminidasa comprenden un compuesto inhibidor enmascarado que tiene la estructura de fórmula (I):

R1, R2 y R3 son cada uno independientemente hidrógeno o alquilo(C1-5);

n es 0, 1, 2 o 3;

R4 es -(CH2)mC(=O)CF3;

m es 0 o 1;

X es -S(O)z- o -CH(R5)-;

R5 es -S(O)zCH3; y

z es 0, 1 o 2.

24. El sistema de acuerdo con la reivindicación 23, en donde el compuesto de fórmula (I) se selecciona del grupo que consiste en:

25. El kit de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, en donde los reactivos para la determinación de actividad de la neuraminidasa comprenden un compuesto inhibidor enmascarado que tiene la estructura de fórmula (I):

R1, R2 y R3 son cada uno independientemente hidrógeno o alquilo(Ci-5);

n es 0, 1, 2 o 3;

R4 es -(CH2)mC(=O)CF3;

m es 0 o 1;

X es -S(O)z- o -CH(R5)-;

R5 es -S(O)zCH3; y

z es 0, 1 o 2.

26. El kit de acuerdo con la reivindicación 25, en donde el compuesto de fórmula (I) se selecciona del grupo que consiste en:

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