JPS63212866A - リガンドの検出方法および検出用キット - Google Patents

リガンドの検出方法および検出用キット

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JPS63212866A JP62293038A JP29303887A JPS63212866A JP S63212866 A JPS63212866 A JP S63212866A JP 62293038 A JP62293038 A JP 62293038A JP 29303887 A JP29303887 A JP 29303887A JP S63212866 A JPS63212866 A JP S63212866A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は被分析体のイムノアッセイならびＫそのアッセ
イで使用する物質に関し、より詳細には、指示反応の酵
素触媒作用の調節により検出可能な信号が増強されるイ
ムノアッセイ法およびそのための物質に関する。
（従来の技術） 迅速でしかも感度の高いアッセイ系は液体中のある種の
物質の濃度を測定するために開発された。
イムノアッセイは特異的抗体への抗原またはハプテンの
結合に基づいてシシ、それらは高レベルの特異性および
感度を与えるので特に有用であった。
これらのアッセイは一般に上記試薬のうちの一方の標識
体を使用し、その標識試薬はしばしばトレーサーと呼ば
れている。イムノアッセイ法は溶液中または担体上で実
施され、そして遊離（非結合）トレーナ−からの結合ト
レーサーの分Ｍｔ−必要とするヘテロジーニアス・イム
ノアッセイ（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ　ｉｍｍｕｎ
ｏａｓａａｙ）、または分離工程を必要としないホモジ
ーニアス・イムノアッセイ（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ　
ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　）のいずれかであシうる。
ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法は標識として放射性
同位元素を使用し、高レベルの感度と再現性を与え、し
かも多数の試料を迅速に悪理するために自動化しやすい
。しかしながら、放射性同位体は高価であり、比較的短
い半減期を有し、高価で複雑な設備を要し、そして取扱
いおよび廃棄処分に対して十分な安全対策が講じられね
ばならない。
螢光イムノアッセイ（ＦＩＡ）は標識として螢光色素を
使用し、そして標Ｒｋ直接検出するものである。しかし
ながら、有機螢光色素（例えばフルオレセインまたはロ
ーダミン誘導体）を使用する既知のホモジーニアスＦｌ
法は、主に検定媒体中に懸濁する不純物による光散乱お
よび検定媒体中に存在する他の螢光物質からのバックグ
ラウンド螢光放出のために、ＲＩＡに匹敵する高感度を
達成しなかった。
酵素もまたイムノアッセイにおいて標識とじて使用され
た。通常のエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）では、
酵素が抗原−抗体の特異的結合対の一方の成分と共有結
合し、その結果生じた酵素複合体が基質と反応して検出
・測定可能な信号を発する。その信号が色の変化である
場合、平均的なヒトは約１０−Ｂまたは１０−’Ｍまで
しか発色体の存在を検出できないので、肉眼での観察に
は限シがある。
ＥＩＡの感度はしばしばスイクトル光度測定技術により
増大しうるが、これらの技法は高価な設備を必要とする
。別の方法では、穏々の増幅法によ）感度が高められる
。単一〇素増幅法が開示され、この場合にはｌＯ〜１０
　　　Ｍの濃度で存在するリガンドが検出された。しか
しながら、これらの方法は一般に１０−１１　Ｍ以上の
りガンｒ濃度において満足のゆくものでなかった。カス
ケード的増幅法では、検出可能な（一般には着色された
）分子の数が２種以上の酵素または酵素誘導体の使用に
よ）増加される。ハリス（Ｈａｒｒｉｓ）の米国特許第
４４６３０９０号明細書は、大きい分子活性化物質（例
えばリガンドに結合した酵素またはプロ薄紫）が第２酵
素を活性化し、その第２薄素が基質と反応して検出可能
な信号を発するか、又は順に第３酵素を活性化すること
から成るカスケード的増幅イムノアッセイｔ−開示して
いる。
セルフ（Ｓｅｌｆ）の米国特許第４４４６２３１号明細
書は、第１および第２酵素系および第２酵素系のための
モジ為レータ−を含む循環増幅エンザイムイムノアッセ
イを開示している。第［酵素系はりガントに結合した第
１５％素を含む。セルフの発明の第１の態様では、第１
酵素系がそジ為レーター前駆体に作用してモジ為レータ
−を遊離させる。
そのモジニレ−ターは第２溝素のコファクターであって
、第２酵素系を活性化して検出可能な生成物への基質の
反応を触媒する。その反応の間Ｋ。
モジ、レータ−は不活性形体に変換され、そしてモジ為
レータ−を再活性化する第３酵素によって循環が達成さ
れる。第２の態様では、モジニレ−ターが第２酵素系の
阻害剤であ）、それが第１酵素系により除去され、それ
によって第２酵素系が活性化されて基質に作用し、そし
て検出可能な生成物を生ずる。
ボグスラスキー（Ｂｏｇｕｓｌａｓｋｉ）らの米国特許
第４４９２７５１号明細書は、酵素基質または補酵素が
特異的結合対の一方の成分に結合された循環系を教示し
ている。
標的酵素を特異的に不活性化する多種多様の分子が明ら
かになった。反応機構阻害剤（ｍｅｃｈａｎｉｓｍ−ｂ
ａａｅｄｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）と呼ばれる１つのサブセ
ットの阻害剤は、酵素と反応して共有結合を形成する酵
素基質である０反応機構阻害剤はクオルシ。
（Ｗａｌｇｈ）　、　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　３８　
、８７１　（１９８２）により論議されている。別のサ
ブセットの阻害剤には安定した遷移状態類似体として作
用する分子が含まれる。ゲルプ（Ｇａｒｂ）らはＢｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２４．１８１３（１９８５）におい
て加水分解酵素の遷移状態阻害剤として若干のフルオロ
ケトン＊ｆ、開示している。
（発明が解決しようとする問題点） 本発明の１つの面は、液体試料（以後未知試料と呼ぶ）
中のリガンドの検出方法に関する。リガンドを含む疑い
のある未知試料は、特異的抗リガンドおよびそのリガン
ドのためのトレーサーと混合される。トレーナ−はリガ
ンドまたはそのリガンげに特異的な第２抗リガンドに結
合された第１酵素を含む。リガンド、抗リガンドおよび
トレーナ−間の結合へ導く条件を与えて結合相を形成さ
せる。
結合相を液体から分離した後、結合相は液体中で遮断モ
Ｊ）＝−レータ−および第２酵素と接触させる。第１醪
素がその遮断基を取り除いて第２酵素のためのモジ為レ
ータ−を生成させる。その後第２簿素の基質を添加する
。基質は第２酵素により検出可能な信号を発する生成物
に変わシ、その第２ＦＪ素による基質の生成物への転化
反応がモジニレ−ターによって調節される。
リガンドは抗原、ハプテンまたは抗体であシうる。好適
なりガンｒは抗原であシ、最も好ｉしくはウィルス抗原
である。この方法は競合的イムノアッセイ法により実施
することができ、その場合トレーサーは第１酵素に結合
したりガンｒである。
好ましくはサント９イツチイムノアクセイ法が使用され
、その場合にはトレーサーは第１５９１素に結合した第
２抗リガンドである。
本発明の好適な遮断モジ島レータ−は、トレーナ−の第
１酵素成分によって阻害剤に転化される遮断阻害剤であ
る。好適な基質は第２酵素により異なる色の生成物へ転
化される色原体である。最も好ましくは、その色原体は
無色であって、第２酵素により着色生成物に変わるもの
であシ、色原体の生成物への転化反応が阻害剤により阻
害される。
最適なアッセイ系では、抗体が担体に固定され、そして
結合条件下でウィルス抗原とアルカリ性ホスファターゼ
（第１酵素）で標識された第２抗体（ウィルス抗原に特
異的）とに接触される。結合および分離の後、抗体：抗
原：アルカリ性ホスファターゼ標識抗体すンビイッチを
有する担体は、液体中で遮断阻害剤および第２酵素と接
触させる。
抗原が液体中に存在する場合は、担体上に捕捉されたア
ルカリ性ホスファターゼが遮断基を取シ除いて阻害剤を
生成させる。無色の色原体が添加される。液体中に生成
された阻害剤は、第２簿素が色原体を着色生成物へ転化
するのを妨げる。従って、発色は試料中に抗原が存在し
ないことを示し、発色の欠如は試料中に抗原が存在する
ことを示している。
本発明の別の面では、新しい種類の酵素モジニレ−ター
および遮断そジェレーターが提供される。
好適なそジ為レータ−は酵素阻害剤であシ、最も好まし
くは第１酵素により除去しうる遮断基を化学的に結合さ
せた官能基をもつフルオロケトンである。
本発明の別の面は、先に述べたような本発明方法を実施
するための物質から成るキク）ｆ包含する。
酵素阻害剤の遮断基除去を伴うＥＩＡ系では、検定を最
高感度で実施しようとする場合、阻害剤と遮断阻害剤の
両方に厳しい制限がかけられる。本発明によれば、遮断
阻害剤は（遮断基除去用）第１酵素のためのすぐれた基
質であるが、（発色用）第２酵素とは本質的に反応しな
い。同様に、遮断基を除去された阻害剤は第２溝素の強
力な阻害剤であるが、第１酵素には本質的に影響を及ぼ
さない。遮断阻害剤および阻害剤と第１および第２酵素
との反応はそれぞれ高度に選択的であるので、交差反応
性による従来技術の循環ＥＩＡ系に特徴的な“短い循環
路”が実質的に排除される。
従って、本発明は液体中に極めて低い濃度で存在するり
ガントの多目的検定法を提供する。本発明方法は、１０
−１．”　Ｍ程度に低い濃度でリガンドが存在するとし
ても、検定信号の肉眼での検出・測定を可能にし、そし
て高価な又は複雑な装置なしで検出または測定しうるリ
ガンドの範囲を大いに広げるものである。さらに、検定
感度すなわちリガンドの有無を検出するのに要する時間
が、通常のＥＩＡと比較して１００倍まで短縮される。
それＫよって、コストやスペースの面での有意な節約が
達成され、本発明アッセイを小さな臨床実験室で又は医
師の診療室でさえ行うことが可能となる。
（問題点を解決するための手段） 本発明は多くの異なる形の実施態様を包含するものであ
るが、ここでは本発明の好適な実施態様を詳細に説明す
る。以下の記載は本発明の原理の例示として解釈される
べきでｌ、ここに記載の実施態様に本発明を制限するも
のでないことを理解すべきである。本発明の範囲は特許
請求の範囲およびそれらの均等物により決定されるであ
ろう。
本発明方法によれば、未知試料中に存在する物質（以後
リガンドと呼ぶ）は、非常に低濃度で存在するときでさ
えも、視覚的にすなわち肉眼での観察により検出される
。この方法は少なくとも２つの増幅段階を含む。第１の
増幅段階はモジニレ−ターの遮断基の酵素的除去である
。第２の増幅段階は指示反応の酵素触媒作用である。こ
れらの増幅段階が頴次行われて１０倍またはそれ以上の
信号増幅を与え、それによｐ　ｌｏ　−１２Ｍまたはそ
れ以下の濃度で試料中に存在するリガンドが肉眼で検出
されうる。それ以上の増幅を望む場合には、複数の酵素
を必要とする段階的反応（これらの反応のいずれか１）
ｔたは全部が更なる信号増幅を与える）を開始される第
１１１［素が用意される。
未知試料中に存在するリガンドを検出するための本発明
方法においては、免疫反応が使用される。
本明細書で用いる”免疫反応”なる用語は抗原と抗体、
ハプテンと抗体、または特異的に結合する抗原、抗体も
しくはハプテンの適当な類似体の特異的結合反応を意味
する。
免疫反応は適当な液体中で実施される。例えば、その液
体は血清、尿、脳を髄液、脳水のようなリガンドを含む
疑いのある体液であシ得る。ｔた、その液体はりガント
を含む疑いのある試料が添加された水、食塩水または適
当な緩衝液、もしくは体液と他の液体との混合物であっ
てもよい。
本発明の好適なサンドイッチアッセイ法は、初めにアッ
セイ成分およびそれらの相互作用の理解を与えるために
、以下のアッセイ７０−シートに関して説明され、その
後各成分が詳しく説明されるであろう。
−Ｍ 八 Ｓｕｂ−一→Ｐ 上記フローシートにおいて、以下の定義が使用され、そ
の際コロンは免疫結合を示し、ハイフンは化学的結合ま
たは物理的付着（例えば吸着）を示し、！！ｉの矢印は
化学的転化を示し、そして点線の矢印は反応またはアッ
セイ成分の調節を示す。
厄　−抗リガンド Ｌ　−リガンド Ｔ−）レーサー Ｅｌ　−第１＃素 Ｅ２　−　第２酵素 Ｂ−Ｍ−遮断モジ為レータ− Ｍ　　−酵素のモジニレ−ター Ｂ　　−モジュレータ−の遮断基 Ｓｕｂ　　−基質 Ｐ　　−生成物 抗すガンｒおよびトレーサーへのりガンｒの結合へ導く
条件が与えられ、その後分離工程および適当な洗浄工程
が行われることは上記フローシートから明らかである。
第２酵素およびモジ為レータ−（活性化剤または阻害剤
）と遮断基から成る遮断モジ為レータ−が添加され、そ
の遮断基はトレーサーの第［酵素成分により除去される
。第２酊素の基質が添加され、第２酵素による基質の検
出可能な生成物への転化反応は、第１酵素により遮断モ
ジェレーターから遊離されたモジニレ−ターによりて調
節される。生成物のレベルは、モジニレ−ターが活性化
剤でちるか又は阻害剤であるかに応じて、モジニレ−タ
ーのレベルに正比例または反比例し、それゆえにリガン
ドのレベルに正比例または反比例する。測定される実際
の信号は指示反応に関連した色、例えば生成物の色また
はその発色速度、もしくは基質の色またはその消失速度
でるシうる。
本発明の好適な災施態様では、１種またはそれ以上のア
ッセイ成分が担体表面に結合される。当分野で知られて
いるように、担体はアッセイを実質的に妨害しなｈなら
ばどんな担体でもよい。使用しりる担体の例はガラスお
よびポリマー材料（例えばポリエチレン、ポリ弗化ビニ
リデン、ポリスチレンなど）である。この種の担体はシ
ート。
チェープ、ウェルのような適当な形状に作られ、好まし
くはマイクロタイタープレートのようなプレートであシ
うる。例えば、アッセイ成分はチューブ（好ましくは一
端が閉じたプラスチック製チ為−プ）の内壁または底部
に結合され、最も好ましくはマイクロタイタープレート
のウェルに結合される。好適には、所望負の抗リガンド
を担体く結合させた後、担体上の残シの結合部位を不活
性タンパク質で飽和させる。不活性タンパク質は、担体
に結合することができ且つ以下で述べるようなリガンド
、抗リガンドおよびトレーサー間の特異的結合反応をい
かなる場合にも妨害しないどんなタンパク質（例えば卯
アルプ建ン）でありてもよい。
好ましくは、担体に結合した抗リガンドをリガンドおよ
びトレーサーと一緒にインキ１ベーションして、両者を
担体に結合させる。妨害物質を除くための洗浄工程の後
に、残シのアッセイ成分を加え、以下で述べるようにし
てアッセイを完結させる。
今や、アッセイ成分について詳細に説明すると、リガン
ドはいかなる供給源からのものであってもよく、抗原、
抗体またはハプテンであシうる。例えば、リガンｒは体
液中に存在する抗原であシ得、またそれは体液から分離
されてその後緩衝液のような異なる液体中に導入されて
もよい、他の場合には、リガンドは体液以外の供給源か
らのものであってもよく、例えば微生物の培養物または
細胞抽出物であシ得る。好適なリガンドは抗原で１）、
最も好ましくは単純性庖疹ウィルス（Ｈ８Ｖ）、アデノ
ウィルス、インフルエンザＡｇウィルス、パラインフル
エンザ３型ウイルスおよびＲＳウィルス（Ｒｅｓｐｉｒ
ａｔｏｒｙ　５７ｎｃｙｔｉａｌ　ｖｉｒｕｓ）のよう
な体液中に存在するウィルス抗原である。
抗リガンドは液体中のリガンドと接触して免疫反応を誘
発する。抗リガンドは抗原または抗体（モノクローナル
抗体またはポリクローナル抗体）であシ得、またそれは
リガンドと特異的に反応する適当なその類似体でありて
もよい。さらに抗リガンドは複数の結合抗体から成る抗
体複合体、例えば第１抗体に特異的に結合し次第２抗体
であり得る。さらにまた、リガンＰは数橋の異なる抗リ
ガンドと結合させてもよく、例えばポリクローナル抗体
の集合体またはりガンどの異なる表面域に同時に結合す
る数種のモノクローナル抗体分子の混合物と結合させて
もよい。一般に、第２抗体は異なる動物種において第１
抗体に対して産生される。複合体中の複数の結合抗体は
約２〜ｌＯ橿またはそれ以上の抗体を含みうる。
本発明のサンドイッチアッセイにおいては、本質的にす
べてのりガントを結合するのに十分な結合部位を有する
過剰の抗リガンドを使用することが好適である。
トレーナ−は２つの成分、すなわちリガンドに結合した
第１酵素（以下で述べる競合的アッセイ）または第２抗
リガンドに結合した第１簿素（好適なサント３イツチア
ツセイ）から成る。酵素は免疫反応に先立ってリガンド
または抗リガンドに適当な方法で（好ましくは共有結合
で）結合される。
酵素とりガントまたは抗リガンドとの共有結合は慣例的
であシ、当分野で習熟した者によく知られている。
連断モジ為レータ−から遮断基を除去しうる酵素はどれ
も第１酵素として使用することができる。
適当な第１酵素は一般にヒドロラーゼ（加水分解薄紫）
、例えばホスファターゼ、イブチダーゼ、エステラーゼ
、〆す；シダーゼなどである。好適な第１酵素の例はト
リプシン、トロンビン、哺乳類肝臓エステラーゼ、アセ
チルコリンエステラーゼ、・β−ガラクトシダーゼまた
は最も好ましくはアルカリ性ホスファターゼであるが、
これらに限定されない。
リガンド、抗リガンドおよびトレーサーを含む液体は結
合を誘発すべく必要に応じてインキ島ベージ冒ンされる
。インキ為ベージ智ンは結合を促進するのに適した温度
で十分な時間性われ、好ましくは約２０°〜４０℃で約
工分〜４時間実施される。
結合する抗リガンド、リガンドおよびトレーサーは以後
結合分画と呼び、そして結合しない抗リガント３、リガ
ンドおよびトレーサーは以後遊離分画と呼ぶことにする
。アッセイは結合分画と遊離分画の間に平衡が確立され
るような方法で実施しうるが、必ずしも平衡である必要
はない。
結合分画はｐ過、デカンテーシ冒ン、遠心、吸引などの
慣用方法でアッセイ混合物の液相中の遊離分画から分離
される。免疫反応が担体上で行われ九ときには、通常液
相をデカンテーシ嘗ンし、担体を洗浄して遊離分画およ
びアッセイを妨害する恐れのある他の物質を除去し、そ
の抜水、食塩水または緩衝液のような適当な液体中に再
懸濁する。続いて遮断モジ−レータ−を添加し、そして
以下で述べるように遮断基の非酵素的除去を生起させな
いｐＨレベル（好ましくは６〜８）にｐＨを調節する。
遮断モジル−ターは第１酵素によって第２酵素のモジ纂
レータ−に転化されうるいかなる物質であってもよい。
好適な遮断モジ為レータ−は２つの成分、すなわちモジ
為レータ−と遮断基から成る。最適な遮断そジ島レータ
−はその遮断基が第１酵素によって除去されて阻害剤が
アッセイ媒体中に放出されるまで第２酵素に対して非反
応性の遮断阻害剤である。従って、遮断阻害剤の各成分
の選択は使用する第１および第２酵素に依存している。
遮断基は第１酵素によって実質上選択的に切断される結
合を介して阻害剤に共有結合しうるものであシ、そして
阻害剤成分は第１酵素に対して実質的に影響を及ぼさな
いが第２酵素の活性を阻害するものであるべきである。
従りて、第２酵素の性質およびその基質は遮断阻害剤お
よび成木発明アッセイにおいて、第２溝素は一般に基質
を生成物に転化するヒドロラーゼである。適当なヒドロ
ラーゼは例えばホスファターゼ；トリプシン、キモトリ
プシンおよびイブシンのようなイブチダーゼ；または好
ましくはアセチル；リンエステラーゼ（ｂＣｈＫ）およ
びブチルコリンエステラーゼのようなエステラーゼであ
る。最適な第２溝素はウサギ肝臓エステラーゼ（ＲＬＥ
）のようなカルボキシエステラーゼである。
基質は第２酵素によって切断されて色と関連した信号に
より検出可能な生成物を与える基を含むいかなる基質で
あってもよい。従って、本発明の１つの実施態様におい
て、検出される信号は色の発生または消失、もしくはあ
る色から他の色への変化である。本発明の別の実施態様
では、信号は基質が生成物に転化される速度の変化であ
シ得、例えば基質の色は特定時間の間未変化のままであ
ることが観察される。こうして、信号の測定は反応速度
論的または熱力学的条件下で行われる。反率を測定する
ものであυ、一般にアッセイ試薬類を混合した後いろい
ろな時間に一連の測定を行うことにより実施される。熱
力学的測定は基質と指示反応の生成物との間に平衡が達
成され九ときに生じた変化の厩舎を測定するものである
。測定は器械を用いて、または好ましくは肉眼で行われ
る。
基質は第２酵素によって切断されて着色生成物を与える
まで無色であるのが好ましい。適当な基質はインド９キ
シルエステルおよび好ましくはニトロフェノールのエス
テル（例えば酢酸または酪酸ｃＱｏ−およびｐ−ニトロ
フェニルエステル）である。これらの基質はカルボキシ
エステラーゼによるアセチル基ま念はブチリル基の切断
が起こってニトロフェノール着色物質を与えるまで無色
である。従って、モジ為レータ−が阻害剤であって、基
質がニトロフェノールのエステルであるＳ合、測定され
る信号は発色の抑制である。
本発明方法はまた螢光イムノアッセイにも使用しりるこ
とが明らかである。本発明のこの実施態様においては、
第２酵素が非螢光性基質を螢光生成物に転化し、その際
測定される信号は螢光の変化である。本発明のこの実施
態様の場合は、モジニレ−ターが阻害剤であ）、第２酵
素がエステラーゼであることが好ましい。
先に述べたように、トレーサーの第１酵素成分は遮断阻
害剤から遮断基を切断して第２酵素阻害剤をもたらし、
そして本発明の別の面は下記の一般式■〜■で表される
新しい種類の酵素阻害剤および遮断酵素阻害剤に関する
（以下に記載のｉＢの性質はその化合物が阻害剤である
か又は遮断阻害剤であるかによυ決定される）： ■ 式Ｉ〜■において、Ｒ１はＨ５炭素原子数１〜６であシ
；Ｒ２は炭素原子数１〜６の低級アルキパ’）　り　；
　”３　ハＨ、ニトロ、アルコキシ、ハロケンナどであ
シ；Ｒ４は炭素原子数１−１０のアルキル基、炭素原子
数２〜ｌＯのアルケニルまたはアルキニル基であシ、こ
れらの基は場合によジアリール基マタハにトロ、ヒト９
０キシ、メルカプト、アルキルオキシ、ハロアルキル、
ヒト０ロキシアルキルまたはメルカプトアルキル基で置
換された）アリール基で置換されていてもよく；Ｙおよ
びＺは独立にＨまたはＦであシ、その際ＹおよびＺの少
なくとも一方はＦであシ；Ｘは０、ｓｌたはＮＲ５（こ
こで比はＨまたはＲ２である）であシ；ｎは１〜６であ
シ：ｍは２〜６であり：ＡはＦま九はＣＦ３であシ；そ
してＢはＨ、リン酸またはその塩、グリコジル基、アミ
ノ酸残基（例えばアミノ酸のカルボキシル基を介してＸ
に共有結合されたりシンまたはアルギニン残基）、炭素
原子数２〜４のアシル基（例えばアセチルまたはブチリ
ル基）、または次式の４プチド： であシ、ここで鳥は（ＣＨ２）４ＮＨ２、（ＣＨ２）３
ＮＨ−素原子数１〜６の直鎖または分枝鎖低級アルキル
であシ、Ｒ８はＨ１炭素原子数１〜４の直＠または分枝
鎖低級アルキルまたはヒト０ロキシ低級アルキル、ＣＨ
２Ｃ０ＯＨもしくは（ＣＨ２）２ＣＯＯＨであシ、Ｒ９
は炭素原子数１〜４の直鎖または分枝鎖低級アルキルも
しくは低級アルコキシ、フェニルまたはベンジルオキシ
であ）、そしてｑは０〜１０である。
ＢがＨである場合、式■〜■は酵素阻害剤を表す。Ｂが
Ｈ以外の基である場合、式Ｉ〜■は遮断された酵素阻害
剤を表す。Ｂがリン酸またはその塩である場合、Ｂは次
式： （式中ＰはＸに結合され、ｎは上記定義通シである）で
表されるものである。
式Ｉ〜■の阻害剤および遮断阻害剤は、当分野で習熟し
九者が考えうる通常の化学反応工程により合成すること
がでなる。適当でしかも便利な合成方法は以下の実施例
において示す。有効な酵素阻害剤の下記表は例示目的で
提示される。
化合御名 ２、．１，１．１−）リフルオｃ＋−３−（３−ヒドロ
キシフェニル）−２−プロパノン ３、　　１．１．１−トリフルオロ−４−（４−ヒドロ
キシフェニル）−２−ブタノン ４、　　１，１．１−）リフルオロ−４−（３−ヒドロ
キシフェニル）−２−ブタノン ５、　　１．１．１・−トリフルオ０−５−（４−ヒト
３０キシフエニル）−２−はンタノン ６、　　１．１．１−トリフルオｏ−５−（３−ヒト”
ｏキシ７ｘ＝、ｓｒ）＋　２−４ンタノン ７、　　１，１．１−）リフルオロ−６−（４−ヒドロ
キシフェニル）−２−ヘキサノン ８、　　１−フェニル−３，３−ジフルオロ−１Ｏ−ヒ
ドロキシ−４−デカノン ９、　　１，１．１−）リフルオロ−５−ヒト９０キシ
−２−インタノンｎｍｒデータ　　　　　　　　　　　
　Ｋｔ（Ｍ）（ａｌ ６、シ （Ｑ［ ６，９ （Ｑｌ ５．７ （Ｃ［ （１゜ ７．１０（１，２Ｈ） （ＣＤ０１３　）−１−９５（ｐ−２Ｈ）　ｅ　２−７
０　（ｔ　−２Ｈ）　ｅ　　　　　　Ｌ７　Ｘ　Ｚ　Ｏ
−’ｚ、９ｓ（ｔ　、　２）１）　、　５．４０（巾広
、ＩＨ）、６．７０（ｍ、ａＨ）、　　　　ＲＩＪ７．
３０（ｍ、ＩＨ） （ＣＤＧＪ３　）−１，６３（ｍ、　４８）　、　２．
５９　（（Ｌ、　２ｆ（）　、　２．７０　　２．ＯＸ
　１０−’（ｃｔ、２Ｈ）、５．５５（巾広、ＩＨ）、
６．７７（（１，２Ｈ）、　　　　　　ＲＬＥ７．０２
（１，２Ｈ） ＣＧＤＧｊ３　）−１，３５（ｍ、　４Ｈ）　、　１．
６５　（ｍｅ　４Ｈ）、　２．２５　　　　−（ｍ、２
Ｈ）、２．７０（（Ｌ＃２Ｈ）、２．７５（ｔ、２Ｈ）
、３．１５（巾広、ＩＨ）、３．５５（ｔ、２Ｈ）、７
．２５（ｍ、５Ｈ）（ＣＤＯＡ’３）−２，１５（ｍ、
４Ｈ）、４．０３（巾広＊ＩＨ）ｓ　　　　　ａ、ｏｘ
ｔｏ−４４，２０（ｍ、　２Ｈ）　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　ＰＬＩＣ１０、　　１，１．１−）
リフルオロ−６−ヒドロキシ−２−へキサノン１１．　
　１，１．１−）リフルオロ−８−ヒドロキシ−２−オ
クタノン１２、　１−ヒドロキシ−５，５−ジフルオロ
−８，８−ジメチル−４−ノナノン １３、　　１，１，１，２．２−−！フタフルオロ−５
−（４−ヒドロキシフェニル）−３−はンタノン １４、　　１，１．１−）リフルオロ−４−（３−ヒド
ロキシド塩ニ／ｌ／）−３−トランス−ブテン−２−オ
ン １５、Ｎ、Ｎ−ジメチル−Ｎ−（２−（ヒドロキシ）エ
チル〕５、５．５−トリフルオロ−４−オキソ堅ンタン
アミニウム。
ヒト０ロキシド壇 １６、　　　Ｎ、Ｎ−シ、＋’チル−Ｎ−（”４−ヒｌ
−ロキシ）ブチル〕５．５．５−　）リフルオロ−４−
オキソペンタンアミニウム。
ヒドロキシド塩 ＰＬＥ　：ブタ肝臓エステラーゼ（Ｅ、Ｇ、３．１．１
．１）ＲＬＥ　：ウサギ肝臓エステラーゼ（Ｅ、Ｇ、３
．１．ｘ、１）ＡＣｈＥ　ニアセチルコリンエステラー
ゼ（Ｅ、０．３．１．１．７）（ＣＤ（Ｊ３）−１，８
５（ｍ、４Ｈ）、２．１０（巾広＊１Ｈ）ｐ　　　４．
０Ｘ１０−７２．３０（ｍ、　４Ｈ）　　　　　　　　
　　　　　　　　　　ＰＬＥ（ｃＩ）ｃ／５）−１，３
０〜１．８０（ｍ、５Ｈ）ｔ２．４０（巾広、　　　−
ＩＨ）、２．７５（ｔ、２Ｈ）、３．６５（ｍ、２Ｈ）
（ＣＤＣ／５）−ｏ、９ｓ（ｓ、９Ｈ）、ｘ、＋ｓ（ｔ
、２Ｈ）、　　　　１．２ＸｌＯ−’２．００（ｍ、　
５）（）　、　３．１２　（巾広＊ＩＨ）ｙ４．１５（
ｍ、２Ｈ）　　ＰＬＥ（ＣＤＣ／３　）−２，９４（ｍ
、　２Ｈ）　、　３．０４　（ｍ、　２Ｈ）　、　　　
　８．ＯＸ　１０−７４．７５　（巾広、ＩＨ）ｔ６．
９０（ｄ、２Ｈ）？７．１０（ｍ、２Ｈ）　　　ＲＬＥ
（ＣＤＣ／３）−５，９０（巾広、ＩＨ）、６．９０（
ｄ、１ｉ（）　　　　１．６Ｘ１０−７Ｊ　＝１６Ｈｚ
　ｅ　７−２５　（ｍ　＊　４　Ｈ）　−７，９５（ｄ
ｔ　ｌ　Ｈ）Ｊ　＝　１６　　ＲＬＩＥｚ （Ｄ２０）−１，９０（ｍ、４Ｈ）、３．１３（ｓ、６
ｋ（）、　　　　　５．０Ｘ１０−’３．３０（ｍ、２
Ｈ）、３．４８（ｍ、２Ｈ）、４．０１（巾広、２Ｈ）
　　ＡｃｈＥ（Ｄ２０）−１，９５（ｍｓ　４Ｈ）　＊
　２．５４　（ｍｔ　４Ｈ）　ｔ　３．１０　（ｓ　、
６．５　Ｘ　１０−８６Ｈ）ｅ３．３５（ｍ、２）（）
、３．５５（ｍ、２Ｈ）、５．２５（巾広、　　ＡＱｈ
ＥＩＨ） 本発明の最適な実施態様において、トレーサーはアルカ
リ性ホスファターゼに共有結合された第２抗リガンｒで
ある。担体の分離および洗浄、ならびに適当なアッセイ
液体中への担体の再懸濁の後に、ＲＬＥまたはＡＣｈＥ
（第２酵素）および式■の遮断阻害剤を添加する。抗原
が未知試料中に存在する場合、抗原およびトレーサーは
担体上に捕捉され、そしてアルカリ性ホスファターゼが
■のリン酸エステル結合を切断して式■の阻害剤を与え
る。アッセイは式■の酪酸０−ニトロフェニルまたは酢
酸０−ニトロフェニルの添加により完結される。
Ｈ３ ■ ■　　　　　　　　　　　　　　　　　■阻害剤■が未
知試料中の抗原の存在ゆえに形成されると、エステ２−
ゼの活性が阻害されて、無色の基質■が着色生成物■に
転化されない。未知試料中に抗原が存在しないと、アル
カリ性ホス７アターぜが担体上に捕捉されず、阻害剤■
が形成されず、それ故にエステラーゼが阻害されないの
で着色生成物■が形成される。
ｌＸｌ０　　Ｍのアルカリ性ホスファターゼおよび３Ｘ
ＩＯ−’ＭのＲＬＥをそれぞれ第１および第２醪素とし
て使用する本発明のこの最適な実施態様では、ｌＸｌ０
−１２Ｍのレイルまでの未知試料中の抗原の有無が約７
分で検出可能である。抗原が未知試料中に存在する場合
は、肉眼で検出しうる色（約ｌ　Ｘ　１５５−１ｓの生
成物■）がこの時間内に現れない。
抗原が存在しない場合には色が現れる。これとは対照的
に、第１酵素（アルカリ性ホスファターぜ）のみを使用
する通常のイムノアッセイでは、酵素が十分な量のリン
酸化ニトロフェノールを分解して検出可能な色を与える
のに約１０４分を要する。
従って、本発明は上記レベルのこれらの試薬類を使用す
る場合１ｃ１５倍の検定感度の増加を示す。
先に述べたように、本発明の別の実施態様は、第１酵素
に結合した予め定められた量のりガントから成るトレー
サーを使用する競合的イムノアッセイである。競合的イ
ムノアッセイでは、抗リガンドの使用量がアッセイ液体
中に存在するりガンｒおよびトレーサーの全部を結合す
るのに不十分であシ、それによりリガンｒとトレーサー
は限られた数の抗リガンド結合部位を競い合うことにな
る。こうして、競合的イムノアッセイでは、抗リガンド
に結合するりガンｒおよびトレーサー（結合分画）の量
がアッセイ液体中のそれらの濃度に反比例する。
更なる信号増幅が望まれる場合には、アッセイ媒体中の
複数の試薬が段階的に反応して最終的にモジ為レータ−
の遮断幕除去へ導く多段カスケード的増幅アッセイが実
施される。本発明のこの実施態様を説明する際には、ア
ッセイ媒体中の試薬を２次酵素（上記第２酵素のモジ為
し−ターノ遮断基を除去する）へ酵素的に転化する１次
酵素と。
して上記の第１酵素を考慮に入れることが有利である。
さらに、その２次酵素または後続の酵素を別の試薬と反
応させて、モジル−ターの遮断基が除去されるまでカス
ケード９的酵素反応を続行しうる追加の酵素を形成させ
ることもできる。アッセイ媒体に添加する試薬を適切に
選ぶことにより、所望の数の増幅段階を行うことが可能
である。
第１酵素または続いて形成される酵素、および第２醪素
は真の触媒として作用する（１分子の酵素が消費される
ことなく本質的に無限の遮断モジ為レータ−１たは基質
分子に対して作用する）ので、先に記載した本発明のど
の実施態様においても増幅が起こる。従って、理論的に
は、本発明を実施するのにそれぞれの酵素１分子があれ
ば足）るであろう。実際には、添加する酵素の量および
使用する増幅段階の数は希望する増幅レベルに応じて決
定され、その決定は当分野で通常の知識を有する者の理
解の範囲内である。
本発明の範囲に含まれる競合的アッセイおよびサンドイ
ッチアッセイの構成はほとんど無限に考案しうろことが
明らかである。さらに、本発明はりガントの検出または
りガント濃度の測定に適した構成のアッセイを提供する
。リガンド濃度は未知試料の信号強度を、本質的に同一
条件下で検定した既知量範囲のリガンドの信号強度と比
較することにより測定される。本発明方法がリガンド濃
度の測定のために使用される場合には、適当な器械例え
ばカリフォルニア州アービン、ベックマン・インスツル
メント社のベックマンＤＵ７スベクトロフオトメーター
のような分光光度計を用いて信号強度を読み取ることが
有利である。
本発明の別の実施態様では、第２酵素が抗すガンｒに接
近して固相に固定される。リガンドとトレーサーが担体
上に捕捉される免疫反応の後に、その担体を液相から分
離・洗浄し、そして遮断モジ為レータ−を添加する。ト
レーサーの第１酵素部分は遮断モジ為レータ−と反応し
て、担体上の第２酵素のためのそジル−ターを遊離させ
る。
その後第２酵素の基質を加えて、先に述べたようにアッ
セイを完結させることができる。
本発明の他の面は、本発明方法に従ってリガンドの検定
を行うための物質の試薬キットまたは包装品である。そ
のキットはｌａｌまたはそれ以上の抗すガンｒ、抗すガ
ンｒの１種またはりガントに結合しうる第１酵素、第２
酵素、および第２酵ｉの遮断モジ為レータ−を含み、そ
の際抗すガンｒの１種は場合により担体に結合される。
キットはまたリガンド標品、例えば１つ以上の既知濃度
のりガント試料を含むことができ、またそれはアッセイ
を行うのに有用な他の試薬、酵素基質、もしくは他の標
識または非標識特異的リガンド、抗すガンｒまたはそれ
らの複合体を含んでいてもよい。
それは食塩水や緩衝液のような溶液を含みうる。
キットの諸成分は別々の容器（例えばバイアル）Ｋ供給
されても、また２種以上の成分が１つの容器に収容され
ていてもよい。
実験 日常的分析技術−フラッシュシリカゲルクロマトグラフ
ィーは３２〜６３メツシエのＩＯＮシリカゲルを用いて
３〜７　ｐｓｉで実施した。分析用ＴＬＯはＥＭプサイ
ンティフィックからの０．２５　ｔａｘの５×２０ｃｌ
ｒＬシリカゲル−アルミニウムプレートで行った。
分離用ＴＬＣはＥＭプサインティフィックからの２．０
闘の２０Ｘ２０αシリカゲル−ガラスプレートで行った
。融点は）−Ｙス−７−バー（Ｔｈｏｍａｓ　Ｈｏｏｖ
ｅｒ）毛管融点測定装置を用いて測定し、未補正であっ
た。ＮＭＲスペクトルはＩＢＭＷＰ−２００８Ｙスはク
トロフォトメーターで記録し、化学シフトはトリメチル
シランに対するｐｐｍで表した。ＨＰＬＣはブラウンリ
ーＡＸ　−３００７Ｘ２５０圏カラムで２漂類の溶剤系
のうちの一方を用いて、ＵＶ検出を伴うウオーターズ５
１０ニポンプ装置により実施した；Ａ溶剤系は３０　ｍ
Ｍ　ＮＨ４０Ａｃ　（ｐＨ６，５）　テＣ１５分間初期
保持、続いて３０分間にわたる２．０　Ｍ　ＮＨ４０Ａ
ａへの線状勾配、その後の１．０Ｍ　ＮＨ４０ＡＣでの
５分間保持を使用しな。Ｂ溶剤系は３０　ｍＭ　ＮＨ４
０Ａｃ　（ＰＨ６，５）のインクラチック緩衝系（一定
組成の溶剤による溶出）を４０分間使用した。流速は１
．０ｄ／分でありた。ガスク四マドグラフィーは、Ｔ＆
Ｗサイエンティフィック社から購入した３０ＭＤＢ−１
メガボアカラムを使用して、ＦＩＤおよび自動インジェ
クターを備えたＨ、Ｐ、　５８４０Ａガスクロマトグラ
フで行った。凹条性は次の通シであった：すなわちｌｏ
。
℃での３分間保持、続いて２５０’Ｃへの１０’Ｃ／分
の勾配、その後２５０℃での３分間保持（ただし流速＝
１６．Ｑｄ／分）。
阻害定数は５０　ｍＭ　）リス（ＰＨ８，０）中で測定
した。酵素と阻害剤は周囲温度で２０分間インキ為は−
シ嘗ンした。その後酵素基質を加えて、加水分解速度を
分光光度計で追跡し九。ＰＩＪおよびＲＬＥのための基
質は酪酸０−ニトロフェニルであ、り、ＡＯｈＥの基質
はアセチルチオコリンおよび工Ａｔ　マフ試薬（Ｅｌｌ
ｍａｎｓ　ｒｅａｇｅｎｔ）であった。
実施例　Ｉ 還流冷却器、滴下漏斗、アルぜン流入口および電磁攪拌
機を備えたｌｌの４つ日丸底フラスコに水素化ナトリウ
ムの５０チ油分散体７．１７　、！ｉＪ　（０，１４９
Ｍ）および乾燥エチルエーテル３００１ｄを装填した。
その攪拌博液に無水エタノール９ｍｌを徐々に加えた。
水素の発生がやんだ後、４，４．４−）リフルオロメチ
ルアセト酢酸エチル２５．９（０，１３６Ｍ）と塩化４
−メトキシベンジル２１．：ｌ（０，１３６Ｍ）の混合
物を１時間にわたって添加した。その後この混合物を一
晩還流下に加熱した。次いで反応混合物を冷却し、水お
よびｘＮＨｃｌで洗浄し、無水ＭＩＳ○４で乾燥し、そ
して減圧下に溶媒を除去した。粗反応混合物３３．５．
９は６０Ｘ３００ｍシリカゲルカラムでクロマトグラフ
にかけ、酢酸エチル／ヘキサンの１：３混合溶媒で溶出
した。類似の分画を合わせて油状の目的生成物９．０．
９（２７％）を得た。ｎｍｒ（ＣＤ（Ｊｓ）−！Ｌ２．
１２（ｍ、３Ｈ）、２．６７（ｍ、２Ｈ）、３．８５（
ｍ。
３Ｈ）　ｓ　３−９０　（ｓ　、３Ｈ）　ｔ　７．２４
　（ｑ　ｔ　４Ｈ）。
還流冷却器、電磁攪拌機およびアルビン流入口を備えた
１００ｄの丸底フラスコに３−（４−メトキシフェニル
）−２−（１−オキソ−２，２，２−）リフルオはエチ
ル）フロピオン酸エチル２．０５ＩＩ（６，７ｍＭ）、
ＡｃＯＨ中の３１％ＨＢｒ　２０ｄおよび水ｉ０ｍ／を
装填した。この混合物を１２０℃で一晩加熱し、減圧下
に濃縮し、ジクロルメタンと水とに分配した。有機層を
重亜硫酸塩水溶液および飽和炭酸水素ナトリウム水溶液
で洗浄し、無水町ｓｏ、で乾燥し、そして減圧下に溶媒
を除去した。粗反応混合物は５０Ｘ３００ｍｓシリカゲ
ルカラムでクロマトグラフにかけ、酢酸エチル／ヘキサ
ンのｌ：１ｍ合溶媒で溶出した。類似の分画を合わせ、
溶媒を減圧下に除去して澄明な油として目的生成物６０
０■（４１％）を得た。ｎｍｒ　（ａｐｃｌｓ　）　−
ｆｌ　２．９５　（ｍ、　４Ｈ）　。
４．９０　（巾、広１　ｔＨ）、　６．９３　（ｄａ、
　４ｆ（）　Ｊ＝４　、６０　Ｈｚ　。
アルゴン流入口および電磁攪拌機を備えた１０１の１つ
目丸底フラスコを水浴に入れ、１．１．　ｌ　−トリフ
ルオロ−４−（４−ヒｒロキシフエニ／Ｌ／）−２−ブ
タノン４００Ｗ（１，８ｍＭ）、り１：ｒ／Ｌ／リン酸
ジエチｋ　４００１７９（２，４ｍＭ）、乾燥ピリジ７
０．１５−およびジクロルメタン５ＷＬｌを５℃で装填
した。この混合物を周囲温度で一晩攪拌し、濾過してピ
リジンＨＣｇを除き、０．２　Ｎ　ＨＣｌおよび水で洗
浄し、そして無水ＭｙＳＯ４で乾燥した。減圧下で溶媒
を除去して褐色油状の粗生成物６００〜を得た。酢酸エ
チル／へΦサンのｌ：１混合展開溶媒を使用する分離用
ＴＬＧＫより澄明外油秋物６００η（９２％）を得た。
ｎｍｒ（ＧＤＧｌｓ）−、ｃｌ、５０（ｍ、６Ｈ）、３
．０（ｍ、４）ｔ）、４．２０（ｍ、４Ｈ）、７．１５
（ｓ、４Ｈ）　。
アルゴン流入口および電磁攪拌機を備えた２５−の１つ
口丸底フラスコにジクロルメタン５．Ｑ＋ａ／、ジエチ
ル（４−（３−オキソ−４，４，４−）リフルオロブチ
ル）フェニル〕ホスフェート１４０■（０，４−）およ
びブロモトリメチルシラン２．０−を装填した。この混
合物を周囲温度で３時間攪拌した後、メタノールｌＯ−
を添加して揮発性物質を減圧下に除去した。残留物を水
に溶解し、１．０１’Ｊ　ＮａＯＨ″ｒ７ｔＨ７，３に
調整した。、その水溶液をエチルエーテルで抽出し、凍
結乾燥して白色固体１９０ηを得た。
この物質を３０　ｍＭ　ＮＨ４０Ａａ緩衝液ｌＯ−に溶
解し、Ａ溶剤系を使用するＨＰＬＣで精製した。凍結乾
燥後の生成物の収量は５（１１９（３７％）であった。
融点２３５〜２４０℃、ｎｍｒ（Ｄ２０）　−（１，９
０（ｍ、２Ｈ）。
２−５６　（ｍ＝　２Ｈ）　ｅ　４．６５　（ｅ　ｐ　
ＤＯＨ）　−６，８８（ａｄ　、４Ｈ）　Ｊ　＝６　。
Ｂ　２　Ｈｙｔ　。
４−ノナノン Ａ、ムヒえ〃２巳」上セ１か二幻詑ｌビ２滴下漏斗、ア
ルゴン流入口、水浴および電磁攪拌機を備えた１００１
１１４３つ口丸底フラスコにジクロルメタン８．０ＷＬ
ｌおよび２−オキソ−５，５−ジメチルヘキサン酸エチ
ル２．２１Ｊ’（２０ｍＭ）を装填した。この反応混合
物にジクロルメタン５ｍｌ中の三フフ化ジエチルアミノ
硫黄２．１１１１　（１３ｍＭ）を１５分間にわたりて
加え、この混合物を周囲温度で一晩攪拌した。反応混合
物は水とジクロルメタンに分配し、有機層を無水励８０
４で乾燥し、そして溶媒を減圧下に除去した。油状残留
物を８３〜８８℃、２０ｍＨ＃で蒸留して目的生成物１
、Ｏｇ（２５％）を得た。ｎｍｒ（ｃｐｃｇ３）−ｆｃ
Ｏ，９５（ｓ、　９Ｈ）、　１．４０　（ｍ、＋Ｈ）＊
　２．１０（ｍ、　２Ｈ）　、　４．３５　（ｑ　、　
２Ｈ）。
ル〕７ラン 乾燥チ島−プ、滴下漏斗、加熱マントルおよび電磁攪拌
機を備えた２５４３つ口丸底フラスコに５０％油分散体
中の水素化ナトリウム０．２４　ｇ（５，０−）を入れ
た。水素化ナトリウムを乾燥ヘキサンｒりＶｌ＾？１１
７り〒６１八　二牛ルエーテルＦｓ−ｎｍｌｆｒフラス
コに加えた。無水エタノール５滴およびエーテル５ｄの
混合物を水素化す）＋７ウム懸濁液に徐々に加え九、水
素の発生がやんだ後に、エチルエーテＪＬ！５．０−中
の２．２−ジフルオロ−５，５−ジメチルヘキサン酸エ
チル１．０１　（５，０ｍＭ）およびｒ−ブチロラクト
ン０．４３ｇ（５，０ｍＭ）の混合物を２０分間にわた
って加え九。この溶液を３時間還流し、その後周囲温度
で一晩攪拌した。反応混合物はｌＮ　ＨＧＩを用いて分
配し、有機層を水（２ｘｓｏｉ）で洗い、無水ＭＩＳＯ
，で乾燥し、そして減圧下に溶媒を除去した。油状残留
物０．８８　Ｊをヘキサン／酢酸エチル混合溶媒から結
晶化させて０．６６、Ｐ（５３９６）を得た。
ｎｍｒ（ＣＤＯ１３）　−Ｊ：　０．９５（ｓ、９１（
）、１．３５（ｍ、２Ｈ）。
２．００（ｍ、３Ｈ）、２．５０（ｍ、２Ｈ）、３．０
０（ｍ、１ｌｄ）、４．２５（ｍ。
ＩＨ）、４．５　（ｍ、　ＩＨ）。
Ｃ，ｌ　−ヒ）”　（２キシ−ｓ、ｓ　−’）７．ＩＩ
／オＭ　−８，８−’））１ｆＡｔ一番一ノナノン アルゴン流入口、電磁攪拌機および還流冷却器を備えた
１０ｍ１つ口丸底フラスコに氷酢酸ｉ、ｏｙ。
濃Ｈｏ１４滴および２．３，４．５−テトラヒト四−２
−オキソー３−（５，５−ジメチル−２，２−ジフルオ
ロ−１−オキソヘキシル）フラン２００’ｑ（０，８１
！ＩＭ）を装填した。この混合物をアルゴン雰囲気下に
１１０℃で一晩加熱した。反応混合物はエチルエーテル
で抽出し、そのエーテル層を水で洗浄し、無水Ｍ、！；
１ｓＯ４で乾燥し、そして減圧下に溶媒を除去した。残
留物を１０Ｘ６０＋ｍシリカゲルカラムでクロマドグ２
フＫかけ、ヘキサン／酢酸エチルの９：ｌ混合溶媒で溶
出して澄明な油状物を得た。
ｎｍｒ（ＣＤＣｌ２）　−４１０，９５（ｓ、９Ｈ）、
１．４５　（ｔｔ　２Ｈ）。
２．００　（ｍ、　６Ｈ）　、　３．１２　（巾広、Ｉ
Ｈ）、４．１５（ｍ、ＩＨ）。
ヒｒロキシｒ塩 ２に 還流冷却器、滴下漏斗、アルゴン流入口、電磁攪拌機お
よび加熱マントルを備えた３１３つ口丸底フラスコに水
素化ナトリウムの５０％油分散体３６ＪＦ（０，７５Ｍ
）を入れた。水素化ナトリウムを乾燥ヘキサン（２Ｘ２
００ｄ）で洗浄し、その後エチル”−一？＃８００ｍＪ
ｋよび無水エタノール２ゴ中に懸濁し九。この懸濁液に
エーテル７５０ｄ中のγ−ブチロラクトン６ｏ、ｚ、ｐ
（ｏ、７Ｍ）およびトリフルオロ酢酸エチル９９．４１
　（０，７Ｍ　）の混合物を、穏やかに還流しながら加
え九。この混合物をさらに２時間還流し、その後周囲温
度で一晩攪拌した。反応混合物を水浴で冷却して、ＩＮ
　ＨＣＩ　２５　ＱＷＬｌを加えた。
有機層を分離し、水（２Ｘ２００ｍｊ）で洗い、無水Ｍ
、Ｓｏ、で乾燥し、減圧下に溶媒を除去し念。残留物を
ヘキサン／酢酸エチルから結晶化させて目的生成物６４
．ＯＩ！（４５，４％）を得九。融点８７〜９０℃。
ｎｍｒ　（ＤＭｓＯ−（１６）　−（２−３３（ｍ　ｓ
　２Ｈ）　ｙ　３．０９　（ｔ　ｔ　Ｉ　Ｈ）Ｊ＝７　
Ｈｙｔ、　４．２０（ｍ、２Ｈ）、７．００　（ｓ、Ｉ
Ｈ）、７．５２（ｓ、ＩＨ）。
Ｂ、　　１，１．１−トリフルオロ−５−ヒドロキシ−
２−堅ンタ乙と 還流冷却器、加熱マントルおよび電磁攪拌機を備えた５
ＱＱＷＬ１３つ口丸底７ラスコに２，３，４．５−テト
ラヒドロ−２−オキソ−３−（２，２，２−）リフルオ
ロ−１，１−ジヒドロキシエチル）７ラン６１．５　ｌ
ｌ（０，３１Ｍ　）、濃ＨＣ１５，４ｍ　、水１０−お
よび酢酸８０祷を装填した。この反応混合物を１２５℃
で一晩加熱した。濃ＨＧ１３．Ｑｍｊおよび水５．０４
を追加してさらに１０時間加熱した。反応混合物は水と
エチルエーテルとに分配し、同時に水層を固体の炭酸水
素ナトリウム１００．９で中和した。エーテル溶液を水
（ｚｘｚｏｌｎｌ）？洗い、無水Ｍ、ｐｓＯ４で乾燥し
、減圧下に溶媒を除去して淡黄色油状物ｓｏ、？（４５
％）を得た。ｎｍｒ（ＣＤＧｈ）　−ｆｌ　２．１５（
ｍ、４Ｈ）＊４．０３（ｍ。
ＩＨ）　、　４．２０　（ｍ、　ＩＨ）。
Ｃ，１，１，１−トリフルオロ−５−プロモー２−−！
ンタノン滴下漏斗、電磁攪拌機、氷−塩浴、およびアル
ビン流入口を備えた５００Ｆｄ３つ口丸底フラスコに乾
燥ジメチルホルムアミド”１２５ｍ／、　　）リプチル
ホスフィン２９．９（３５，７ｍＭ）および１．１．１
−トリフルオａ−５−ヒドロキシ−２−，２ンタノン１
１．２．９（５４，９ｍＭ　）を装填した。この混合物
を一５℃に冷却し、臭素１１．５１　（７１，６ｍＭ）
を２時間にわタラて滴下した。周囲温度で一晩攪拌後、
反応混合物を２．０−Ｉの圧力で３０気ビグリユー塔（
ｖｉｇｒｅａｕＩＣｏｌｕｍｎ　）を通して蒸留した。
２つの分画：す壮ち２７〜３５℃からの第１分画および
３５〜７０℃からの第２分画を集めた。第２分画は水と
エチルエーテルとく分配し、有機層を水（３Ｘ１００に
□で洗い、無水ＭｙＳＯ４で乾燥し、そして周囲温度で
減圧下に蒸発させてジメチルホルムアミド、エーテルお
よび目的生成物の無色油状混合物３ｏ１を得、これはさ
らに精製することなく次の反応に使用した。
滴下漏斗、アルゴン流入口、電磁攪拌機および氷−塩浴
を備えた５００ｄ３つ口丸底フラスコに一８℃で無水ジ
メチルアミンｚ１．ｓ、ｐ（ｏ、４ｓＭ）を入れた。こ
の混合物に一１０℃でジメチルポルムアミｒおよびエチ
ルエーテル中の１．１．１−）リフルオロ−５−プロモ
ー２−ペンタノン１９．４１　（８８，５ｍＭ　）を滴
下した。この懸濁液を一１０℃で２，５時間攪拌した。
その後沈殿物から溶媒をデカンテーションした。この沈
殿物をエチルエーテル（３Ｘ２００１１！／）で洗い、
有機層を合わせ、水（ｚｘ３０ＷＬｌ）で洗い、無水Ｍ
ｙＳＯ４で乾燥し、減圧下に蒸発させて淡黄色油状物１
５．０ｇ（９２％）を得た。ＨＣｌ塩のｎｍｒ　（ＯＤ
Ｏ／３　）−１，８９（８１４Ｈ）、２．９０　（８＄
６Ｈ）、３．２１　（ｔ、２１（）。
２５１１１つ口丸底フラスコに２−ブロモエチルメチル
エーテル２．９５ｇ（２１，２ｍＭ）、Ｎ、Ｎ−ジメチ
ル−（５，５，５−）リフルオロ−４−オキソはフタ／
アミン）０．３３１（１，７７ｍＭ）、およびジメｆ　
Ａ／　ホＡ／　Ａ　７ミ）”２．５ｖｌ！を装填し、こ
の混合物を周囲温度で３日間攪拌した。溶媒を減圧下に
除去し１、琥珀色油状物はＯＨ形のダウエックス−１（
１５Ｘ２００１１１）カラムでクロマトグラフＫかけ、
水２００ｄで溶出した。
カラムからの溶出液を凍結乾燥して琥珀色油状のヒト９
０キシド塩としての生成物０．２８１　（６０％　）を
得九。ｎｍｒ（Ｄ２０）　−１，９４（ｍｅ　２Ｈ）　
＃　３．１３　（ｓ　＊　ｃｓＨ）　ｊ３．３９　（ｓ
、３Ｈ）、３．４１　（ｍ、２Ｈ）、’３．６０（ｍ、
２Ｈ）、３．８８（巾広、２Ｈ）。この物質はこれ以上
精製することなく次の反応に使用した。
アルノン流入口および還流冷却器を備えたｌＱ＋Ｉｌｌ
丸底７；ｙスコにＮ、Ｎ−ジメチル−Ｎ−１：２−（メ
トキシ）エチル）　−５，５，５−）リフルオロ−４−
オキソペンタンアミニウム、ヒト９０キシド塩０．２７
５ｙ（１，１ｍＭ入水４．０−および酢醗中３０チＨＢ
ｒ　Ｂ、０ＷＬｌを装填した。
この混合物を１２０℃で５時間加熱し、冷却し、そして
減圧下に溶媒を除去した。残留物は３Ｘ２０Ｗｌｌの水
と共に同時蒸留し、得られた油状物をＯＨ形のダウエッ
クス−１（１５Ｘ２００−）　カラムでクロマトグラフ
にかけた。溶出液は減圧下に蒸発させてヒｒロキシＰ塩
としての生成物０．１７＃（６３％）を得た。ｎｍｒ（
Ｄ２０）　−１，９０（ｍ、　４Ｈ）＊３．１３（ａ＊
６Ｈ）。
３．３０（ｍ、２Ｈ）、３．４８（ｍｔ２Ｈ）、４．０
１　（巾広、２Ｈ）。
実施例　■ 滴下漏斗、アルＩｙ流入口、電磁攪拌機、および氷−塩
浴を備えた１　０ｒ！Ｌｔ３つ口丸底フラスコにオキシ
塩化リン０．０９３ｍ　（１，０ｍＭ　）およびリン酸
トリメチル０．５−を装填した。この混合物に一１０℃
でＮ、Ｎ−ジメチル−Ｎ−〔２−（ヒｒロキシ）エチル
）　−５，５，５−）リフルオロ−４−オキソペンタン
アミニウム、ヒト四キシｒ塩７０．０＋ｙ（０，２−〇
を滴下した。この混合物を３０分間攪拌し、その後冷凍
庫内に一装置いた。この混合物をエチルエーテル、次に
石油エーテル（４ｘ５０ｍ）で細かくすシつぶし、樹脂
状の沈殿物を得た。との沈殿物を氷で覆い、ＩＮ　Ｎα
ＯＨでｐＨ６，０に中和し、そして減圧下に蒸発乾固さ
せた。得られ九固体１０７岬を３０　ｍｊ’Ｌ　ＮＨ４
０Ａｃ緩衝液ＣｐＨ７，０）に溶解し、Ｂ溶剤系を用い
てＨＰＬＣで精製した。１２分で溶出した生成物は緩衝
液の凍結乾燥により単離して無色の樹脂９．０１１Ｆ（
１１’ｆＡ　）を得た。ｎｍｒ　（Ｄ２０）　−、Ｃ１
，９０（ｍｔ＋Ｈ）、３．１４（ｓ、６Ｈ）ｌ　３．４
２（ｍ、２Ｈ）、　３．６０（ｍｅ２１（）　、　４．
１９　（巾広、２Ｈ）。
実施例　Ｖ アデノウィルスからのヘキソン抗原の半すンＰイツチア
ッセイ 一般方法： 精製したアデノウイルスヘキソンタンパク質の２倍連続
希釈物は、ｐＨ９，５の炭酸塩緩衝液（ｉ。
ｍＭ　）中で１−１８時間かけてポリ塩化ビニル製マイ
クロタイターウェルに被覆した。このプレートはリン酸
緩衝溶液中の０．０５　（１６ポリオキシエチレンソル
ビタン　モノツウレートから成る溶液で数回すすいだ、
免疫反応は１０ｔｓ培地（ウシ胎児血清含有）中適当な
濃度に希釈したアルカリ性ホスファターゼ結合抗体（マ
ウス抗ヘキソンＩ、ｐ（、）を用いて行った。１時間イ
ンキＳ−！−シ１ンしてすすいだ後、遮断モジ為レータ
−（１０−３〜１０−’Ｍ）およびＲＩＪ（ｌｏ””〜
１０−９Ｍ）の混合物を加え、プレートｔ−ｔｏ〜６０
分間ブレインキ為ベーシーンした。この混合物に色原体
基質（すなわちインドキシルブチレートまたハ酪酸。−
二トロフェニル）を加えた。発色は一般に１５分以内に
おこシ、過剰の遊離モジ−レータ−の添加にょシ発色は
さらに長時間安定化されるであろう。Ｌｎｇ、Ａｎｔの
ヘキンンタンノモク質を含む希釈物を被覆したウェルは
この系で陽性の応答を与えた。
ポリ塩化ビニル製マイクロタイタープレートは、１０ｍ
Ｍ炭酸塩−２０ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＫＤＴＡ
）緩衝液中の抗体＋７）４．５ｑ／Ｍ原液Ｏ１：　９０
０希釈物中で３７℃において１時間そのプレートをイン
キエベーシロンすることにょシ、抗アデノウィルス抗体
で被覆した。このプレートを１０ｍＭ）リス−１５４ｍ
Ｍ　Ｎａ１ｌ（ｐＨ７，６）中の０．５　％カゼインか
ら成る洗浄緩衝溶液で３回洗った。Ｏ，ＯＳチポリオキ
シエチレンソルビタンモノラウレート、０．１７９／ｄ
ゲンタマイシン、０．５％フェノールレット０．０．１
多ウシ血清７Ａ／プミン、１０　ｍＭ　ＥＤＴＡおよヒ
ｌｏｏｍＭエチレンビス（オキシエチレンニトリロ）四
酢酸を含有するリン酸緩衝溶液（ＰＨ７，４）巾約ｌＸ
ｌ０’プラーク形成単位（ＰＦＵ　）　／ｒ！ｔｌに希
釈したアデノウィルス感染ヒーラ細胞（ＨｅＬａ　ｃｅ
’ｌ）はプレートの一端から他端まで２倍の希釈率で連
続希釈した。プレートを上記のようにインキ為ベージ１
ンして細胞を抗体に結合させ、洗浄緩衝液で洗い、そし
て０．５％ゼラチンおよび１０％不活化ウシつ児血清を
含有する洗浄緩衝液中のアルカリ性ホスファターゼ結合
抗アデノウィルスの０．００５■／ｄトレーサー溶液と
インキ−は−シ嘗ンした。過剰のトレーサー溶液をデカ
ンテーシ冒ンし、プレートをトリス緩衝液（カゼイン不
含）で３回洗浄した。５ＱｍＭ）リス緩衝液（ＦＨ８，
５）中の実施例■からの遮断阻害剤のｌＸｌ０−４Ｍ溶
液および５Ｘ１０−’ＭＲＬＥの混合物を加え、そのプ
レートを室温で１０分間インキ為ベーシヲンした。その
後プレートの各ウェルに酪酸０−ニトロフェニル（１ｍ
Ｍ）を添加した。
抗原を含まない対照ウェルは一般に約１５分で肉眼によ
り検出可能な色を示し、そして遊離阻害剤（実施例Ｉか
らの生成物Ｂ）を対照ウェルに添加すると１５分より長
い開発色が阻害された。抗原希釈物を含む試験ウェルは
１５分以上の間然色のままであった。
図面は色原体添加の２０後にベックマンＤＵ７スベクト
ロフオトメーターで測定したときの抗原濃度に対する発
色の関係を示すものである。対照ウェル中の溶液の光学
密度（ＯＤは実質的に約０．２４で一定であるが、試験
ウェル中の溶液のＯＤは抗原濃度に反比例し、極めて低
い抗原濃度では対照値に近づくことが分かる。
要約すると、本発明は非常に低い濃度で液体試料中に存
在するりガントの検出または測定方法を提供する。リガ
ンド、抗すガンｒおよびトレーサーを結合させた後、そ
の結合相を分離して第２酵素および遮断モジュレータ−
と接触させ、それによりトレーサーの第１酵素成分で遮
断基を除去して第２酵素のモジ）レータ−を形成させる
。そのモジュレータ−は検出可能な信号へ導く第２酵素
による基質の生成物への転化反応に影響を及ぼす。
信号の検出は試料中のリガンドの有無を証明する。
信号の強度を測定することにより、リガンドの濃度を決
定し得る。モジ−レータ−および第２簿素は２つの増幅
段階を与え、それにより信号は１０６倍またはそれ以上
まで増幅され、そして肉眼による信号の検出が通常のＥ
ＸＡよ）も１００倍まで短縮された時間で可能となる。
【図面の簡単な説明】
図面は本発明の方法および物質を使用する代表的アッセ
イの結果を示す。 外４名）

Claims (44)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）（ａ）リガンドを含む疑いのある第１液体を、担
    体に固定した抗リガンドと第１酵素含有トレーサーとに
    接触させ、それにより抗リガンドをリガンドと結合させ
    且つトレーサーを抗リガンドおよびリガンドの一方と結
    合させて担体上に結合相を形成し； （ｂ）該担体を第１液体から分離し； （ｃ）該担体を、第２酵素および遮断阻害剤を含む第２
    液体と接触させ、該遮断阻害剤を前記第１酵素により阻
    害剤へ転化して第２液体中に該阻害剤を放出させ； （ｄ）該第２液体に第２酵素用の基質を加え、第２酵素
    による該基質の生成物への転化反応を前記阻害剤で阻害
    し；そして （ｅ）前記転化反応と関連した信号によりリガンドを検
    出する； ことから成る液体中のリガンドの検出方法。
  2. （２）トレーサーは前記抗リガンドと結合し、そして該
    トレーサーは第１酵素と結合した前記リガンドからなる
    、特許請求の範囲第１項記載の方法。
  3. （３）トレーサーは前記リガンドと結合し、そして該ト
    レーサーは第１酵素と結合した第２抗リガンドから成る
    、特許請求の範囲第１項記載の方法。
  4. （４）第１酵素はヒドロラーゼである、特許請求の範囲
    第１項記載の方法。
  5. （５）ヒドロラーゼはペプチダーゼ、エステラーゼ、ホ
    スファターゼおよびグリコシダーゼより成る群から選ば
    れる、特許請求の範囲第４項記載の方法。
  6. （６）ホスファターゼはアルカリ性ホスファターゼであ
    る、特許請求の範囲第５項記載の方法。
  7. （７）リガンドは抗原、抗体およびハプテンより成るリ
    ガンド群から選ばれる、特許請求の範囲第１項記載の方
    法。
  8. （８）抗リガンドは抗原、抗体および抗体複合体より成
    る抗リガンド群から選ばれる、特許請求の範囲第１項記
    載の方法。
  9. （９）第２酵素はヒドロラーゼである、特許請求の範囲
    第１項記載の方法。
  10. （１０）ヒドロラーゼはエステラーゼ、ホスファターゼ
    およびペプチダーゼより成る群から選ばれる、特許請求
    の範囲第９項記載の方法。
  11. （１１）ヒドロラーゼはアセチルコリンエステラーゼ、
    ブチルコリンエステラーゼ、カルボキシエステラーゼ、
    トリプシン、キモトリプシンおよびペプシンより成る群
    から選ばれる、特許請求の範囲第１０項記載の方法。
  12. （１２）基質はニトロフェノールのエステルおよびイン
    ドキシルのエステルより成る群から選ばれる、特許請求
    の範囲第１項記載の方法。
  13. （１３）信号による検出段階は前記基質と関連した色を
    検出することを含む、特許請求の範囲第１項記載の方法
    。
  14. （１４）信号による検出段階は前記生成物と関連した色
    を検出することを含む、特許請求の範囲第１項記載の方
    法。
  15. （１５）抗リガンドによって占有されていない前記担体
    の結合部位に不活性タンパク質を固着させることをさら
    に含む、特許請求の範囲第１項記載の方法。
  16. （１６）（ａ）リガンドを含む疑いのある第１液体を抗
    リガンドおよび第１酵素含有トレーサーと接触させ、そ
    れにより抗リガンドをリガンドと結合させ且つトレーサ
    ーをリガンドおよび抗リガンドの一方と結合させて結合
    相を形成し； （ｂ）該結合相を第１液体から分離し； （ｃ）該結合相を、第２酵素および遮断モジュレーター
    と第２液体中で接触させ、該遮断モジュレーターを前記
    第１酵素によりモジュレーターへ転化して第２液体中に
    該モジュレーターを放出させ； （ｄ）該第２液体に第２酵素用の基質を加え、第２酵素
    による該基質の生成物への転化反応を前記モジュレータ
    ーで調節し；そして （ｅ）前記生成物と関連した信号により前記リガンドを
    検出する； ことから成る液体中のリガンドの検出方法。
  17. （１７）抗リガンドを担体に固定する、特許請求の範囲
    第１６項記載の方法。
  18. （１８）第２酵素を前記担体に固定する、特許請求の範
    囲第１７項記載の方法。
  19. （１９）（ａ）抗原を含む疑いのある第１液体を、担体
    に固定した第１抗体とアルカリ性ホスファターゼに結合
    した第２抗体とに接触させ、それにより抗原を第１およ
    び第２抗体と結合させて担体上に結合相を形成し； （ｂ）該担体を第１液体から分離し； （ｃ）該担体を、エステラーゼおよび遮断阻害剤を含む
    第２液体と接触させ、該遮断阻害剤を前記アルカリ性ホ
    スファターゼによりエステラーゼ阻害剤へ転化して第２
    液体中に該阻害剤を放出させ； （ｄ）該第２液体に色原体を加え、該色原体の着色生成
    物へのエステラーゼによる転化反応を前記阻害剤で阻害
    し；そして （ｅ）該第２液体における発色の抑制を検出することに
    より前記抗原を検出する； ことから成る液体中の抗原の検出方法。
  20. （２０）エステラーゼはコリンエステラーゼおよびカル
    ボキシエステラーゼより成る群から選ばれる、特許請求
    の範囲第１９項記載の方法。
  21. （２１）色原体はニトロフェノールのエステルである、
    特許請求の範囲第１９項記載の方法。
  22. （２２）（ａ）抗原を含む疑いのある第１液体を、担体
    に固定した抗体とアルカリ性ホスファターゼに結合した
    前記抗原から成るトレーサーとに接触させ、それにより
    抗原およびトレーサーを抗体と結合させて担体上に結合
    相を形成し； （ｂ）該担体を第１液体から分離し； （ｃ）該担体を、エステラーゼおよび遮断阻害剤を含む
    第２液体と接触させ、該遮断阻害剤を前記アルカリ性ホ
    スファターゼによりエステラーゼの阻害剤へ転化して第
    ２液体中に該阻害剤を放出させ； （ｄ）該第２液体に色原体を加え、該色原体の着色生成
    物へのエステラーゼによる転化反応を前記阻害剤で阻害
    し；そして （ｅ）該第２液体における発色の抑制を検出することに
    より前記抗原を検出する； ことから成る液体中の抗原の検出方法。
  23. （２３）エステラーゼはコリンエステラーゼである、特
    許請求の範囲第２２項記載の方法。
  24. （２４）色原体はニトロフェノールのエステルである、
    特許請求の範囲第２２項記載の方法。
  25. （２５）（ａ）リガンドを含む疑いのある第１液体を、
    担体に固定した抗リガンドと第１酵素含有トレーサーと
    に接触させ、それにより抗リガンドをリガンドと結合さ
    せ且つトレーサーをリガンドおよび抗リガンドの一方と
    結合させて担体上に結合相を形成し； （ｂ）該担体を第１液体から分離し； （ｃ）該担体を、第２酵素および遮断阻害剤を含む第２
    液体と接触させ、該遮断阻害剤を前記第１酵素により阻
    害剤に転化して第２液体中に該阻害剤を放出させ； （ｄ）該第２液体に第２酵素用の基質を加え、該基質を
    検出可能な信号を発する生成物へ転化する第２酵素によ
    る転化反応を前記阻害剤で阻害し； （ｅ）前記信号の強度を測定し；そして （ｆ）前記強度を、既知量の前記リガンドを含む液体試
    料を用いて段階（ａ）〜（ｅ）を繰り返したときの生成
    物と関連した信号の強度と比較することにより、第１液
    体中の前記リガンドの濃度を決定する； ことから成る液体中のリガンド濃度の測定方法。
  26. （２６）トレーサーは前記リガンドをさらに含み、そし
    て前記抗リガンドと結合する、特許請求の範囲第２５項
    記載の方法。
  27. （２７）トレーサーは前記リガンドと結合する第２抗リ
    ガンドをさらに含む、特許請求の範囲第２５項記載の方
    法。
  28. （２８）信号は分光光度計で測定される色の変化である
    、特許請求の範囲第２５項記載の方法。
  29. （２９）一般式 I 、II、IIIおよびIV： ▲数式、化学式、表等があります▼ I ▲数式、化学式、表等があります▼II ▲数式、化学式、表等があります▼III ▲数式、化学式、表等があります▼IV 〔式中Ｒ＿１はＨ、炭素原子数１〜６の直鎖またはＲ＿
    ２は炭素原子数１〜６の低級アルキルであり；Ｒ＿３は
    Ｈ、ニトロ、アルコキシまたはハロゲンであり；Ｒ＿４
    は炭素原子数１〜１０のアルキル基、または炭素原子数
    ２〜１０のアルケニルもしくはアルキニル基であり、こ
    れらの基は場合によりアリール基または（ニトロ、ヒド
    ロキシ、メルカプト、アルキルオキシ、ハロアルキル、
    ヒドロキシアルキルまたはメルカプトアルキルで置換さ
    れた）アリール基で置換されていてもよく；ＹおよびＺ
    は独立にＨまたはＦであり、その際ＹおよびＺの少なく
    とも一方はＦであり；ＸはＯ、ＳまたはＮＲ＿５（ここ
    でＲ＿５はＨまたはＲ＿２である）であり；ｎは１〜６
    であり；ｍは２〜６であり；ＡはＦまたはＣＦ＿３であ
    り；そしてＢはリン酸またはその塩、グリコシル基、ア
    ミノ酸のカルボキシル基を介してＸに共有結合されたア
    ミノ酸残基、炭素原子数２〜４のアシル基、または次式
    のペプチド： ▲数式、化学式、表等があります▼ であり、ここでＲ＿６は（ＣＨ＿２）＿４ＮＨ＿２、（
    ＣＨ＿２）＿３−▲数式、化学式、表等があります▼ま
    たはベンジルであり：Ｒ＿７はＨ または炭素原子数１〜６の直鎖または分枝鎖低級アルキ
    ルであり：Ｒ＿８はＨ、炭素原子数１〜４の直鎖または
    分枝鎖低級アルキルまたはヒドロキシ低級アルキル、Ｃ
    Ｈ＿２ＣＯＯＨまたは（ＣＨ＿２）＿２ＣＯＯＨであり
    ：Ｒ＿９は炭素原子数１〜４の直鎖または分枝鎖低級ア
    ルキルまたは低級アルコキシ、フェニルまたはベンジル
    オキシであり；ｑは０〜１０であり：そして前記のリン
    酸またはその塩は次式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中ＰはＸに結合され、ｎは先に定義した通りである
    ）で表される〕より成る群から選ばれる、遮断された酵
    素阻害剤。
  30. （３０）一般式 I 、II、IIIおよびIV： ▲数式、化学式、表等があります▼ I ▲数式、化学式、表等があります▼II ▲数式、化学式、表等があります▼III ▲数式、化学式、表等があります▼IV 〔式中Ｒ＿１はｔ−ブチルまたは▲数式、化学式、表等
    があります▼ であり；Ｒ＿２は炭素原子数１〜６の低級アルキルであ
    り；ＹおよびＺは独立にＨまたはＦであり、その際Ｙお
    よびＺの少なくとも一方はＦであり；ｍは２〜３であり
    ；ｎは１〜３であり；そしてＢはグリコシル基または次
    式： ▲数式、化学式、表等があります▼ のリン酸またはその塩である〕より成る群から選ばれる
    、遮断された酵素阻害剤。
  31. （３１）次式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中ＹおよびＺは独立にＨまたはＦであり、その際Ｙ
    およびＺの少なくとも一方はＦであり；ＸはＯまたはＳ
    であり；そしてｎは１〜４である）で表される遮断され
    た酵素阻害剤。
  32. （３２）次式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中ｎは１〜４であり、ｍは２〜４であり、ＸはＯま
    たはＳである）で表される遮断された酵素阻害剤。
  33. （３３）一般式 I 、II、IIIおよびIV： ▲数式、化学式、表等があります▼ I ▲数式、化学式、表等があります▼II ▲数式、化学式、表等があります▼III ▲数式、化学式、表等があります▼IV 〔式中Ｒ＿１はＨ、炭素原子数１〜６の直鎖または分枝
    鎖低級アルキル、または▲数式、化学式、表等がありま
    す▼； Ｒ＿２は炭素原子数１〜６の低級アルキルであり；Ｒ＿
    ３はＨ、ニトロ、アルコキシまたはハロゲンであり；Ｒ
    ＿４は炭素原子数１〜１０のアルキル基、または炭素原
    子数２〜１０のアルケニルもしくはアルキニル基であり
    、これらの基は場合によりアリール基または（ニトロ、
    ヒドロキシ、メルカプト、アルキルオキシ、ハロアルキ
    ル、ヒドロキシアルキル、またはメルカプトアルキル基
    で置換された）アリール基で置換されていてもよく；Ｙ
    およびＺは独立にＨまたはＦであり、その際ＹおよびＺ
    の少なくとも一方はＦであり；ＸはＯ、ＳまたはＮＲ＿
    ５（ここでＲ＿５はＨまたはＲ＿２である）であり；Ａ
    はＦまたはＣＦ＿３であり；ｎは１〜６であり；そして
    ｍは２〜６である〕より成る群から選ばれる酵素阻害剤
    。
  34. （３４）一般式 I 、II、IIIおよびIV： ▲数式、化学式、表等があります▼ I ▲数式、化学式、表等があります▼II ▲数式、化学式、表等があります▼III ▲数式、化学式、表等があります▼IV （式中Ｒ＿１はｔ−ブチルまたは▲数式、化学式、表等
    があります▼であり；Ｒ＿２は炭素原子数１〜６の低級
    アルキルであり；ＹおよびＺは独立にＨまたはＦである
    が、ＹおよびＺのうち少なくとも一方はＦであり；ｎは
    １〜３であり、そしてｍは２〜３である）よりなる群か
    ら選ばれる酵素阻害剤。
  35. （３５）次式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中ＹおよびＺは独立にＨまたはＦであるが、Ｙおよ
    びＺのうち少なくとも一方はＦであり；ＸはＯまたはＳ
    であり；そしてｎは１〜４である）で表される酵素阻害
    剤。
  36. （３６）次式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中ｎは１〜４であり、ｍは２〜４であり、ＸはＯま
    たはＳである）で表される酵素阻害剤。
  37. （３７）リガンドに対する抗リガンド、第１酵素、およ
    び第２酵素の遮断モジュレーターから成るリガンド検出
    用キット。
  38. （３８）抗リガンドは担体に固定されている、特許請求
    の範囲第３７項記載のキット。
  39. （３９）第１酵素は前記リガンドおよび第２抗リガンド
    の一方に結合されている、特許請求の範囲第３７項記載
    のキット。
  40. （４０）前記第２酵素をさらに含む、特許請求の範囲第
    ３７項記載のキット。
  41. （４１）酵素基質、抗原、抗体および抗体複合体、緩衝
    液および食塩水より成る試薬群から選ばれる少なくとも
    １種の他の試薬をさらに含む、特許請求の範囲第３７項
    記載のキット。
  42. （４２）既知濃度のリガンドを含む少なくとも１つの液
    体をさらに含む、特許請求の範囲第３７項記載のキット
    。
  43. （４３）リガンドを実質的に含まない液体試料をさらに
    含む、特許請求の範囲第３７項記載のキット。
  44. （４４）１個またはそれ以上の容器をさらに含む、特許
    請求の範囲第３７項記載のキット。
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