JP6947409B2 - リパーゼ活性の測定方法及び測定試薬並びにリパーゼ活性測定用基質溶液 - Google Patents
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Description
また、本発明は、リパーゼ活性測定に対するアジ化物の影響を抑制できる方法に関するものである。
このリパーゼは、長鎖脂肪酸の3分子がそれぞれグリセロールにエステル結合したトリグリセライド(TG)のα位(1位、3位)のエステル結合を加水分解して、2分子の脂肪酸及び1分子のβ−モノグリセライドを生成する反応を触媒する酵素である。
この1分子のβ−モノグリセライドは、α型に異性化され、これがリパーゼの作用を受けて加水分解されてグリセロールと脂肪酸とになる。
例えば、オリーブ油のエマルジョンをリパーゼの基質として用い、このオリーブ油のエマルジョンを血清試料等と接触させ、37℃で24時間反応させた後、リパーゼによる加水分解反応により生成した脂肪酸をアルカリで滴定するCherry−Crandallの方法が知られていた。
しかし、この方法は反応時間が長く、測定しようとするリパーゼの不活性化や反応阻害が著しい方法であった。
しかし、これらの方法は、血清蛋白による阻害やリウマチ因子による凝集塊の干渉を受け、均一かつ安定なエマルジョンを作るのが難しく、再現性に乏しいという短所を有する方法であった。
しかし、この方法は、高濃度の肝エステラーゼの存在下でその干渉を受けてしまうため、他の測定項目の測定試薬から反応セル又はノズル(プローブ)を介して混入する肝エステラーゼの影響を受けて測定値に誤差が生じるという短所を有する方法であった。
しかし、この方法も、高濃度の肝エステラーゼの存在下でその干渉を受けてしまうため、他の測定項目の測定試薬から反応セル又はノズル(プローブ)を介して混入する肝エステラーゼの影響を受けて測定値に誤差が生じるという短所を有する方法であった。
この方法では、この1,2−o−ジラウリル−rac−グリセロ−3−グルタル酸−(6’−メチルレゾルフィン)−エステル[DGGMR]を血清試料等と接触させ、反応させることにより、リパーゼが触媒する加水分解反応によって、1,2−o−ジラウリル−rac−グリセロール及びグルタル酸−(6’−メチルレゾルフィン)−エステルが生成する。
このグルタル酸−(6’−メチルレゾルフィン)−エステルは不安定であって、容易に自然に加水分解されて6’−メチルレゾルフィン(λmax:580nm)を生成する。
この生成する6’−メチルレゾルフィンの増加を580nm又はその近辺の波長の吸光度を測ることによって測定し、試料中に含まれていたリパーゼの活性値を求めることができる。
このDGGMRをリパーゼの基質として用いるリパーゼ活性の測定方法は、測定が一連の反応で進むシンプルなものであり、かつ他の測定試薬から反応セル又はノズル(プローブ)を介して混入するエステラーゼの影響を受けにくいという長所を有する方法である。
このため、従来、リパーゼ活性の測定に使用するための基質溶液(リパーゼ活性測定用基質溶液)を製造するに当っては、安定で均一なミセル粒子からなるエマルジョン化(乳化)した基質溶液となるよう、種々の方法が考えられてきたが、基質を界面活性剤を含む水溶液に混合したり、基質をアルコールなどの有機溶媒を含む溶液に混合したり、基質含有液を滴々と滴下して溶液に混合したり、基質含有液を溶液に噴射注入したり、基質溶液を強力なミキサーで高速に撹拌したり、又は基質溶液に超音波を掛ける処理を行ったり等の煩雑な若しくは熟練を要する等の特別な処理が必要であったり、又は特別な装置若しくは器具などの物等が必要であった。
このため、リパーゼ活性測定用基質を含有する溶液の保存安定性の改善を目的として種々の試みが行われた。
特に、臨床検査試薬を自動分析装置で使用するといった、試薬を開封状態で使用せざるを得ない場合には、開封状態とすることにより生じる種々の要因により、試薬の劣化は著しい。
また、空気中の二酸化炭素が試薬中に溶け込むことにより、試薬のpHが低下し、本来の機能が果たせなくなってしまうことがある。
更に、試薬中に二酸化炭素が溶け込むことにより、被検物質(測定しようとする物質)が二酸化炭素により阻害を受けてしまい、正確な測定が出来なくなってしまう場合もある。
(1)1,2−o−ジラウリル−rac−グリセロ−3−グルタル酸−(6’−メチルレゾルフィン)−エステルをリパーゼ活性測定用基質として含むリパーゼ活性測定用基質溶液において、還元剤を含有することを特徴とするリパーゼ活性測定用基質溶液。
(2)前記(1)に記載のリパーゼ活性測定用基質溶液を含むことを特徴とするリパーゼ活性測定試薬。
(3)1,2−o−ジラウリル−rac−グリセロ−3−グルタル酸−(6’−メチルレゾルフィン)−エステルをリパーゼ活性測定用基質として含むリパーゼ活性測定用基質溶液を使用するリパーゼ活性測定方法において、リパーゼ活性測定用基質溶液に還元剤を含有させることを特徴とするリパーゼ活性測定方法。
(4)1,2−o−ジラウリル−rac−グリセロ−3−グルタル酸−(6’−メチルレゾルフィン)−エステルをリパーゼ活性測定用基質として含むリパーゼ活性測定用基質溶液に還元剤を含有させることを特徴とするリパーゼ活性測定に対するアジ化物の影響の抑制方法。
また、本発明のリパーゼ活性測定試薬は、混入したアジ化物によるDGGMRの劣化を防ぎ、測定により得られる吸光度値の低下を抑制することができるリパーゼ活性測定試薬である。
また、本発明のリパーゼ活性測定方法は、混入したアジ化物によるDGGMRの劣化を防ぎ、測定により得られる吸光度値の低下を抑制することができるリパーゼ活性測定方法である。
また、本発明のアジ化物の影響の抑制方法は、混入したアジ化物によるDGGMRの劣化を防ぎ、測定により得られる吸光度値の低下を抑制することができるアジ化物の影響の抑制方法である。
I.総論
1.リパーゼ活性測定用基質溶液
本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液は、1,2−o−ジラウリル−rac−グリセロ−3−グルタル酸−(6’−メチルレゾルフィン)−エステル[DGGMR]をリパーゼ活性測定用基質として含むリパーゼ活性測定用基質溶液において、還元剤を含有することを特徴とするものである。
本発明において、リパーゼは、リパーゼとしての活性、すなわちリパーゼ活性を有するものであればよく、このリパーゼ活性を有するものであれば特に限定はない。
1.総論
前記の通り、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液は、1,2−o−ジラウリル−rac−グリセロ−3−グルタル酸−(6’−メチルレゾルフィン)−エステル、及び界面活性剤よりなるミセル粒子からなるエマルジョン溶液であって、還元剤を含有するものであることが好ましい。
(1)総論
本発明において、試料中に含まれるリパーゼの活性の測定に使用するためのリパーゼの基質、すなわちリパーゼ活性測定用基質は、1,2−o−ジラウリル−rac−グリセロ−3−グルタル酸−(6’−メチルレゾルフィン)−エステル[DGGMR]である。
このグルタル酸−(6’−メチルレゾルフィン)−エステルは不安定であって、容易に自然に加水分解されて6’−メチルレゾルフィン(λmax:580nm)を生成する。
本発明においては、この生成する6’−メチルレゾルフィンの増加を580nm又はその近辺の波長の吸光度を測ることによって測定し、試料中に含まれていたリパーゼの活性値を求めることができる。
本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液におけるDGGMRの濃度であるが、この本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液におけるDGGMRの濃度が0.05mM以上であることが、安定で均一なミセル粒子からなるエマルジョン溶液とする上で好ましい。
(1)総論
本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液は、DGGMRをリパーゼ活性測定用基質として含むリパーゼ活性測定用基質溶液において、還元剤を含有することを特徴とするものである。
そして、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液は、DGGMR、及び界面活性剤よりなるミセル粒子からなるエマルジョン溶液であって、還元剤を含有するものであることが好ましい。
本発明における還元剤としては、特に限定はなく、還元能力を有するものであればよい。
本発明において、このヒドロキシルアンモニウム塩としては、例えば、塩化ヒドロキシルアンモニウム、硝酸ヒドロキシルアンモニウム、又は硫酸ヒドロキシルアンモニウム等を挙げることができる。
本発明において、このチオール化合物としては、例えば、ジチオスレイトール(DTT)、N−アセチル−L−システイン(NAC)、チオグリセロール、還元型グルタチオン、システイン、ジチオエリスリトール、臭化2−アミノエチルイソチオウロニウム、2−チオグルコース、チオグリコール酸、2−メルカプトエタノール、N−グアニル−L−システイン、メルカプト酢酸、メルカプトコハク酸、2−メルカプトエタンスルホン酸、又はシステアミン等のSH基を有する化合物を挙げることができる。
本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液における還元剤の濃度は、特に限定されないが、0.01mM以上であることが好ましい。
本発明において、還元剤は、1種類のものを使用してもよく、又は複数種類のものを使用してもよい。
(1)総論
前記の通り、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液は、DGGMR、及び界面活性剤よりなるミセル粒子からなるエマルジョン溶液であって、還元剤を含有するものであることが好ましい。
非イオン性界面活性剤としては、側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイル、又はポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレン縮合物が好ましく、側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイルが特に好ましい。
側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイル[以下、「本変性シリコーンオイル」ということがある]について、以下説明する。
そして、直鎖状のシリコーン化合物がシリコーンオイルである。
この変性シリコーンオイルとしては、ポリシロキサンの側鎖の一部、ポリシロキサンのどちらか片方の末端、ポリシロキサンの両方の末端、又はポリシロキサンの側鎖の一部と両方の末端に、各種の有機基を導入したシリコーンオイルが存在する。
ポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレン縮合物[以下、「本POE・POP縮合物」ということがある]について、以下説明する。
DGGMR、及び界面活性剤よりなるミセル粒子からなるエマルジョン溶液であって、還元剤を含有するものであるリパーゼ活性測定用基質溶液において、界面活性剤の濃度は0.01%(w/v)以上であることが、安定で均一なミセル粒子からなるエマルジョン溶液とする上で好ましい。
(1)リパーゼ賦活化剤
本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液には、リパーゼ賦活化剤を含有させてもよい。
このアルカリ金属としては、例えば、カリウム、ナトリウム又はリチウム等を挙げることができ、また、このアルカリ土類金属としては、例えば、マグネシウム又はカルシウム等を挙げることができる。
この胆汁酸としては、タウロデオキシコール酸が特に好ましい。
本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液において、リパーゼ賦活化剤は、その濃度が0.2%(w/v)以上の濃度であることが好ましい。
(1)リパーゼ活性化剤
本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液には、リパーゼ活性化剤を含有させてもよい。
(i) リパーゼの活性化能。
(ii) リパーゼの触媒作用を受けることによりリパーゼ活性測定用基質から遊離した脂肪酸は、リパーゼ活性測定用基質よりなる界面を壊すが、カルシウムイオン又はカルシウム塩はこの遊離した脂肪酸を捕捉し、当該界面が壊れるのを抑制することができる。
本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液において、リパーゼ活性化剤は、その濃度が0.1mM以上の濃度であることが好ましい。
(1)コリパーゼ
本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液には、コリパーゼを含有させてもよい。
本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液において、コリパーゼは、その活性値が15K単位/L(15K Unit/L)以上であることが好ましい。
本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液には、水を含有させてもよい。
すなわち、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液は、水溶液又は水性懸濁液であってよい。
本発明におけるリパーゼ活性測定用基質としてのDGGMRは、pH4又はその付近のpHにおいて安定である。
よって、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液において、そのpHはpH4を中心とする一定の範囲内のものであることが好ましい。
(1)緩衝剤
本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液には、緩衝剤を含有させてもよい。
本発明において、緩衝剤を本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液に含有させる場合の濃度は、特に限定はなく、設定するpHの範囲において緩衝能を発揮することができる濃度であればよい。
先に記載した通り、リパーゼは、エマルジョン化したトリグリセライド基質の水と油との界面で最も効率よく作用し、このリパーゼの反応速度は分散した基質の表面積に関係するので、このリパーゼの活性測定には安定で均一なミセル粒子からなる基質の調製が重要であるとされている(非特許文献2参照。)。
1.総論
本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液を製造する方法であるが、上記の「DGGMRをリパーゼ活性測定用基質として含むリパーゼ活性測定用基質溶液において、還元剤を含有することを特徴とするリパーゼ活性測定用基質溶液」という構成の本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液を製造することができる方法であればよく、特に限定はない。
この(a)及び(b)の工程よりなる方法は、煩雑な若しくは熟練を要する等の特別な処理、又は特別な装置若しくは器具などの物等を必要とせずに、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液を製造することができるので、好ましい。
前記1における(a)の工程、すなわち、「DGGMRと、界面活性剤を混合し混合物を調製する工程」について、以下、詳細に説明する。
前記1の(a)の工程、すなわち、「DGGMRと、界面活性剤を混合し混合物を調製する工程」においては、リパーゼ活性測定用基質であるDGGMRと界面活性剤を混合する。
すなわち、DGGMRと界面活性剤とを直接混合する。
リパーゼ活性測定用基質としてのDGGMRと、界面活性剤を混合し混合物を調製する工程において、このDGGMRを混合する量は、特に限定されない。
なお、前記1の(a)の「DGGMRと、界面活性剤を混合し混合物を調製する工程」における当該DGGMRと当該界面活性剤との混合(以下、「第1混合」ということがある)の時の当該DGGMR及び当該界面活性剤それぞれの混合量を、第2混合後にDGGMRの濃度が上記の通りになるように、考慮の上決めてもよく、このようにすることが、その製造手順の上から好ましい。
第1混合時に混合させるリパーゼ活性測定用基質の混合量をWs[単位:グラム]とし、第2混合時に水又は水溶液を混合した後の最終的な容量(メスアップ後の容量等)をVf[単位:mL]とし、そしてリパーゼ活性測定用基質の分子量をMWsとした場合、第2混合後のリパーゼ活性測定用基質の濃度Cs[単位:mM]は次の式で表すことができる。
第1混合時に混合させるリパーゼ活性測定用基質の混合量をWs[単位:グラム]とし、第2混合時に水又は水溶液を混合した後の最終的な容量(メスアップ後の容量等)をVf[単位:mL]とし、リパーゼ活性測定用基質の分子量をMWsとし、そして第1混合時の混合物のA%(重量又は容量)を第2混合時に水又は水溶液と混合した場合、第2混合後のリパーゼ活性測定用基質の濃度Cs[単位:mM]は次の式で表すことができる。
リパーゼ活性測定用基質としてのDGGMRと界面活性剤を混合し混合物を調製する工程において、この界面活性剤を混合する量は、特に限定されない。
第1混合時に混合させる界面活性剤の混合量をWp[単位:グラム]とし、第2混合時に水又は水溶液を混合した後の最終的な容量(メスアップ後の容量等)をVf[単位:mL]とした場合、第2混合後の界面活性剤の濃度Cp[単位:%(w/v)]は次の式で表すことができる。
第1混合時に混合させる界面活性剤の混合量をWp[単位:グラム]とし、第2混合時に水又は水溶液を混合した後の最終的な容量(メスアップ後の容量等)をVf[単位:mL]とし、そして第1混合時の混合物のA%(重量又は容量)を第2混合時に水又は水溶液と混合した場合、第2混合後の界面活性剤の濃度Cp[単位:%(w/v)]は次の式で表すことができる。
DGGMRと界面活性剤を混合し混合物を調製する工程において、このDGGMRと界面活性剤とを混合する方法は、このDGGMRと界面活性剤が混合するのであればいずれの方法でもよく、特に限定はない。
DGGMRと界面活性剤を混合し混合物を調製する工程において、このDGGMRと界面活性剤とを混合する時の温度は、特に限定されないが、用いる界面活性剤の曇点付近の温度又はこの曇点付近の温度以下の温度においてこの工程を行うことが、安定で均一なミセル粒子からなるエマルジョン溶液を製造する目的の上から好ましい。
この界面活性剤の曇点付近の温度としては、その界面活性剤の曇点の温度のプラスマイナス(±)15℃の範囲が好ましく、プラスマイナス(±)10℃の範囲がより好ましく、プラスマイナス(±)5℃の範囲が特に好ましい。
なお、KF−354Lは、曇点の測定に使用した恒温水槽の設定温度の上限の77℃においても曇点に至らなかったので、これの曇点は77℃超である。
DGGMRと界面活性剤を混合し混合物を調製する工程において、このDGGMRと界面活性剤とを混合する時間であるが、このDGGMRと界面活性剤とが均質に混合されればよく、特に限定されない。
通常は、安定で均一なミセル粒子からなるエマルジョン溶液を製造する目的の上から、この混合を5分間又はそれ以上行うことが好ましい。なお、一般的には、5分間で十分である。
前記1における(b)の工程、すなわち、『「DGGMRと、界面活性剤を混合し混合物を調製する工程」において調製した混合物の全部又は一部を、水又は水溶液と混合する工程』について、以下、詳細に説明する。
前記1の(b)の工程、すなわち、「前記1の(a)の工程において調製した混合物の全部又は一部を、水又は水溶液と混合する工程」において、この水又は水溶液については、特に限定はない。
本発明において、前記の水溶液に含有させることができる還元剤としては、還元能力を有するものであればよく、特に限定はないが、例えば、ヒドロキシルアンモニウム塩、チオール化合物等を挙げることができる。
第2混合後の還元剤の濃度が上記の濃度となるよう、前記の「DGGMR及び界面活性剤の混合物」と前記水溶液との混合比率等を勘案した上で、当該水溶液に還元剤を適当な濃度で含有させることが好ましい。
本発明において、前記の水溶液に含有させることができるリパーゼ賦活化剤としては、リパーゼを賦活化することができる物質であればよく、特に限定はないが、例えば、胆汁酸又はその塩等を挙げることができる。
第2混合後のリパーゼ賦活化剤の濃度が上記の濃度となるよう、前記の「DGGMR及び界面活性剤の混合物」と前記水溶液との混合比率等を勘案した上で、当該水溶液にリパーゼ賦活化剤を適当な濃度で含有させることが好ましい。
本発明において、前記の水溶液に含有させることができるリパーゼ活性化剤としては、リパーゼを活性化することができる物質であればよく、特に限定はないが、例えば、アルカリ土類金属イオン又はその塩等を挙げることができる。
第2混合後のリパーゼ活性化剤の濃度が上記の濃度となるよう、前記の「DGGMR及び界面活性剤の混合物」と前記水溶液との混合比率等を勘案した上で、当該水溶液にリパーゼ活性化剤を適当な濃度で含有させることが好ましい。
本発明において、水溶液に含有させることができるコリパーゼとしては、コリパーゼの作用、機能又は活性を有しているものであればよく、特に限定はない。
第2混合後のコリパーゼの活性値が上記の活性値となるよう、前記の「DGGMR及び界面活性剤の混合物」と前記水溶液との混合比率等を勘案した上で、当該水溶液にコリパーゼを適当な活性値で含有させることが好ましい。
本発明においてリパーゼ活性測定用基質として用いるDGGMRは、pH4又はその付近のpHにおいて安定である。
よって、第2混合後、そのpHはpH4を中心とする一定の範囲内のものであることが好ましい。
第2混合後のpHが上記のpHとなるよう、前記水溶液のpHを適当なpHにすることが好ましい。
本発明においては、第2混合後のpHを、前記(e)に記載のpH範囲に保つため、前記(e)のpH範囲に緩衝能を有する緩衝剤を前記水溶液に適宜含有させてもよい。
第2混合後の緩衝剤の濃度が上記の濃度となるよう、前記の水溶液に緩衝剤を適当な濃度で含有させることが好ましい。
前記1における(b)の工程、すなわち、『「DGGMRと、界面活性剤を混合し混合物を調製する工程」において調製した混合物の全部又は一部を、水又は水溶液と混合する工程』においては、当該「DGGMRと界面活性剤の混合物」の全部又は一部を、当該「水又は水溶液」と混合する。
前記2の「(2)DGGMRの混合量」の項に詳述した通り、第2混合後、DGGMRの好ましい濃度は、前記の目的の上から、好ましくは0.05mM以上であり、より好ましくは0.1mM以上であり、そして、特に好ましくは0.2mM以上である。
また、これも前記2の「(2)DGGMRの混合量」の項に詳述した通り、第2混合後、DGGMRの好ましい濃度は、前記の目的の上から、好ましくは2mM以下であり、より好ましくは1mM以下であり、そして、特に好ましくは0.8mM以下である。
第1混合時に混合させるリパーゼ活性測定用基質の混合量をWs[単位:グラム]とし、第2混合時に水又は水溶液を混合した後の最終的な容量(メスアップ後の容量等)をVf[単位:mL]とし、そしてリパーゼ活性測定用基質の分子量をMWsとした場合、第2混合後のリパーゼ活性測定用基質の濃度Cs[単位:mM]は次の式で表すことができる。
第1混合時に混合させるリパーゼ活性測定用基質の混合量をWs[単位:グラム]とし、第2混合時に水又は水溶液を混合した後の最終的な容量(メスアップ後の容量等)をVf[単位:mL]とし、リパーゼ活性測定用基質の分子量をMWsとし、そして第1混合時の混合物のA%(重量又は容量)を第2混合時に水又は水溶液と混合した場合、第2混合後のリパーゼ活性測定用基質の濃度Cs[単位:mM]は次の式で表すことができる。
前記2の「(3)界面活性剤の混合量」の項に詳述した通り、第2混合後、界面活性剤の好ましい濃度は、前記の目的の上から、好ましくは0.01%(w/v)以上であり、より好ましくは0.05%(w/v)以上であり、そして、特に好ましくは0.1%(w/v)以上である。
第1混合時に混合させる界面活性剤の混合量をWp[単位:グラム]とし、第2混合時に水又は水溶液を混合した後の最終的な容量(メスアップ後の容量等)をVf[単位:mL]とした場合、第2混合後の界面活性剤の濃度Cp[単位:%(w/v)]は次の式で表すことができる。
第1混合時に混合させる界面活性剤の混合量をWp[単位:グラム]とし、第2混合時に水又は水溶液を混合した後の最終的な容量(メスアップ後の容量等)をVf[単位:mL]とし、そして第1混合時の混合物のA%(重量又は容量)を第2混合時に水又は水溶液と混合した場合、第2混合後の界面活性剤の濃度Cp[単位:%(w/v)]は次の式で表すことができる。
なお、このように、この工程を複数の段階(ステップ)によって行うことが、安定で均一なミセル粒子からなるエマルジョン溶液を製造する目的の上から好ましい。
[B] 前記[A]の段階における当該混合物(DGGMRと界面活性剤との混合物)と水又は水溶液との混合後の混合液に、更に一定量の水又は水溶液を混合する段階
リパーゼ活性測定用基質としてのDGGMRと界面活性剤を混合して調製した混合物の全部又は一部を、水又は水溶液と混合する工程において、当該混合物の全部又は一部を、水又は水溶液と混合する方法は、当該混合物と、当該水又は水溶液が混合するのであればいずれの方法でもよく、特に限定はない。
リパーゼ活性測定用基質としてのDGGMRと界面活性剤を混合して調製した混合物の全部又は一部を、水又は水溶液と混合する工程において、当該混合物の全部又は一部を、水又は水溶液と混合する時の温度は、特に限定されないが、用いる界面活性剤の曇点以下の温度においてこの工程を行うことが、安定で均一なミセル粒子からなるエマルジョン溶液を製造する目的の上から好ましい。
リパーゼ活性測定用基質としてのDGGMRと界面活性剤を混合して調製した混合物の全部又は一部を、水又は水溶液と混合する工程において、当該混合物の全部又は一部を、水又は水溶液と混合する時間であるが、このDGGMRと界面活性剤の混合物と、この水又は水溶液とが、均質に混合されればよく、特に限定されない。
I.総論
本発明のリパーゼ活性測定試薬は、「1,2−o−ジラウリル−rac−グリセロ−3−グルタル酸−(6’−メチルレゾルフィン)−エステル[DGGMR]をリパーゼ活性測定用基質として含むリパーゼ活性測定用基質溶液において、還元剤を含有することを特徴とするリパーゼ活性測定用基質溶液」を含むことを特徴とするリパーゼ活性測定試薬である。(なお、リパーゼ活性測定用基質溶液の詳細については、前記の「〔1〕本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液」の項に記載した通りである。)
1.リパーゼ活性測定試薬の構成等
本発明のリパーゼ活性測定試薬は、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液のみからなるものであってもよく、又は本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液と他の構成試薬からなるもの、すなわち試薬キットであってもよい。
(a) 本発明におけるリパーゼ活性測定用基質[DGGMR]はpH4又はその付近のpHにおいて安定であるのに対して、リパーゼはpH8又はその付近のpHにおいてその活性は至適であり、それぞれ適するpH域が異なっている。
(b) 本発明におけるリパーゼ活性測定用基質[DGGMR]、コリパーゼ、及びリパーゼ賦活化剤としての胆汁酸又はその塩を、一つの試薬に共存させると、本発明におけるリパーゼ活性測定用基質[DGGMR]の安定性が良くなくなる。
前記の他の構成試薬、又はそれ以外の試薬としては、例えば、緩衝液、試料希釈液、試薬希釈液、校正(キャリブレーション)を行うための物質を含有する試薬、又は精度管理を行うための物質を含有する試薬等を挙げることができる。
本発明のリパーゼ活性測定試薬の具体例を以下挙げる。
(a)第1試薬 [下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度で含む水溶液;pH8.3(20℃)]
デオキシコール酸ナトリウム [リパーゼ賦活化剤] 2%(w/v)
塩化カルシウム [リパーゼ活性化剤] 5mM
コリパーゼ (ブタ膵臓由来;ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社[日本国]) 375K単位/L(5mg/L)
Bicine [緩衝剤] 40mM
1,2−o−ジラウリル−rac−グリセロ−3−グルタル酸−(6’−メチルレゾルフィン)−エステル 〔DGGMR〕 (ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社[日本国]) [リパーゼ活性測定用基質] 0.3mM
側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイル 0.3%(w/v)
塩化ヒドロキシルアンモニウム [還元剤] 0.5mM
L−酒石酸 [緩衝剤] 40mM
(a)第1試薬 [下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度で含む水溶液;pH8.4(20℃)]
タウロデオキシコール酸ナトリウム [リパーゼ賦活化剤] 2%(w/v)
デオキシコール酸ナトリウム [リパーゼ賦活化剤] 0.2%(w/v)
塩化カルシウム [リパーゼ活性化剤] 5mM
コリパーゼ (ブタ膵臓由来;ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社[日本国]) 150K単位/L(2mg/L)
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン 〔Tris〕 [緩衝剤] 40mM
1,2−o−ジラウリル−rac−グリセロ−3−グルタル酸−(6’−メチルレゾルフィン)−エステル 〔DGGMR〕 (ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社[日本国]) [リパーゼ活性測定用基質] 0.6mM
側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイル 0.3%(w/v)
塩化ヒドロキシルアンモニウム [還元剤] 1mM
タウロデオキシコール酸ナトリウム [リパーゼ賦活化剤] 2%(w/v)
I.総論
本発明のリパーゼ活性の測定方法は、1,2−o−ジラウリル−rac−グリセロ−3−グルタル酸−(6’−メチルレゾルフィン)−エステル[DGGMR]をリパーゼ活性測定用基質として含むリパーゼ活性測定用基質溶液を使用するリパーゼ活性測定方法において、リパーゼ活性測定用基質溶液に還元剤を含有させることを特徴とするものである。(なお、リパーゼ活性測定用基質溶液の詳細については、前記の「〔1〕本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液」の項に記載した通りである。また、リパーゼ活性測定試薬の詳細については、前記の「〔2〕本発明のリパーゼ活性測定試薬」の項に記載した通りである。)
1.リパーゼ活性測定方法
本発明において、リパーゼの活性を測定する試料は、リパーゼを含む可能性がある試料であればよく、リパーゼを含む可能性があるものであれば特に限定されない。
この試料としては、例えば、ヒト若しくは動物又は植物に由来する試料等を挙げることができる。
また、試料は、必要に応じて、希釈又は濃縮処理等を行ってもよい。
本発明のリパーゼ活性測定方法により、試料中のリパーゼ活性の測定を行う場合、その測定は終点法(エンドポイント法)により測定を行うものであってもよく、又は反応速度法(レート法)により測定を行うものであってもよく、適宜選択すればよいが、反応速度法(レート法)によるものが好ましい。
本発明のリパーゼ活性測定方法の具体例を以下挙げる。
(a)第1試薬
前記の〔2〕のIIの2の(1)の(a)の第1試薬を、この測定方法の具体例における第1試薬として用いた。
前記の〔2〕のIIの2の(1)の(b)の第2試薬を、この測定方法の具体例における第2試薬として用いた。
ヒトの血清を試料として用いた。
(a)第1段階
前記(2)の試料と前記(1)の(a)の第1試薬を混合して、混合液を調製する。
なお、一般的には、例えば、試料の量は0.5〜100μL、第1試薬の量は20〜1,000μLの範囲のもの等とすることが好ましい。
このインキュベートの時間は、特に制限はないのであるが、通常は20分以内であることが好ましく、10分以内であることがより好ましく、5分以内であることが特に好ましい。
なお、一般的に測定反応時の温度は、高い程、反応速度が高くなるので好ましい。
しかし、温度が高すぎると測定反応に係わる酵素等の成分が変性、失活してしまうので、インキュベートする際の温度は、測定反応に係わる酵素等の成分が変性、失活する温度未満の温度とする必要がある。
このインキュベートする際の温度は、通常は2〜70℃であるが、20〜37℃が好ましく、30〜37℃がより好ましい。
なお、測定反応に係わる酵素等の成分が耐熱性酵素など耐熱性の成分であれば更に高温でもよい。
前記の第1段階で調製した「試料と第1試薬の混合液」に、前記(1)の(b)の第2試薬を混合する。これを最終反応液とする。
なお、一般的には、例えば、第2試薬の量は10〜1,000μLの範囲のもの等とすることが好ましい。
このインキュベートの時間は、特に制限はないのであるが、通常は20分以内であることが好ましく、10分以内であることがより好ましく、5分以内であることが特に好ましい。
なお、一般的に測定反応時の温度は、高い程、反応速度が高くなるので好ましい。
しかし、温度が高すぎると測定反応に係わる酵素等の成分が変性、失活してしまうので、インキュベートする際の温度は、測定反応に係わる酵素等の成分が変性、失活する温度未満の温度とする必要がある。
このインキュベートする際の温度は、通常は2〜70℃であるが、20〜37℃が好ましく、30〜37℃がより好ましい。
なお、測定反応に係わる酵素等の成分が耐熱性酵素など耐熱性の成分であれば更に高温でもよい。
そして、このグルタル酸−(6’−メチルレゾルフィン)−エステルは不安定であるので、容易に自然に加水分解されて、6’−メチルレゾルフィン(λmax:580nm)を生成する。
本発明のリパーゼ活性測定に対するアジ化物の影響の抑制方法は、1,2−o−ジラウリル−rac−グリセロ−3−グルタル酸−(6’−メチルレゾルフィン)−エステル[DGGMR]をリパーゼ活性測定用基質として含むリパーゼ活性測定用基質溶液に還元剤を含有させることを特徴とするものである。(なお、リパーゼ活性測定用基質溶液の詳細については、前記の「〔1〕本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液」の項に記載した通りである。また、リパーゼ活性測定試薬の詳細については、前記の「〔2〕本発明のリパーゼ活性測定試薬」の項に記載した通りである。また、リパーゼ活性測定方法の詳細については、前記の「〔3〕本発明のリパーゼ活性測定方法」の項に記載した通りである。)
本発明におけるアジ化物の影響の抑制効果を確認した。
本発明のリパーゼ活性測定試薬の第1試薬及び第2試薬をそれぞれ調製した。
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、pHをpH8.4(20℃)に調整して、リパーゼ活性測定試薬の第1試薬を調製した。
塩化カルシウム [リパーゼ活性化剤] 20mM
コリパーゼ (ブタ膵臓由来、販売元:ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社[日本国]) 750K単位/L(10mg/L)
Bicine [緩衝剤] 80mM
[1]アジ化物添加第2試薬(本発明)
本発明のリパーゼ活性測定試薬の第2試薬(リパーゼ活性測定用基質溶液)に、アジ化物混入の影響を確かめるため、アジ化物を添加した「アジ化物添加第2試薬(本発明)」を調製した。
これを本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液である「第2試薬(本発明)」とした。
前記(6)の「第2試薬(本発明)」の10mLに0.1%(w/v)のアジ化ナトリウム水溶液の10μLを添加し、「アジ化物添加第2試薬(本発明)」とした。
また、この「アジ化物添加第2試薬(本発明)」において、濃度勾配や強い濁り等は見られず、均質に混合されていることを目視にて確認した。
従来発明のリパーゼ活性測定試薬の第2試薬(リパーゼ活性測定用基質溶液)に、アジ化物混入の影響を確かめるため、アジ化物を添加した「第2試薬(従来発明)」を調製した。
これを従来発明のリパーゼ活性測定用基質溶液である「第2試薬(従来発明)」とした。
前記(6)の「第2試薬(従来発明)」の10mLに0.1%(w/v)のアジ化ナトリウム水溶液の10μLを添加し、「アジ化物添加第2試薬(従来発明)」とした。
また、この「アジ化物添加第2試薬(従来発明)」において、濃度勾配や強い濁り等は見られず、均質に混合されていることを目視にて確認した。
対照としてのリパーゼ活性測定試薬の第2試薬(リパーゼ活性測定用基質溶液)である「対照第2試薬」を調製した。なお、この「対照第2試薬」にはアジ化物を添加していない。
これを対照としてのリパーゼ活性測定用基質溶液である「対照第2試薬」とした。
また、この「対照第2試薬」において、濃度勾配や強い濁り等は見られず、均質に混合されていることを目視にて確認した。
前記1の〔2〕の[1]において調製した「アジ化物添加第2試薬(本発明)」、及び前記1の〔2〕の[2]において調製した「アジ化物添加第2試薬(従来発明)」のそれぞれを、5℃で暗所に7日間保存した。
下の「(1)標準物質」、「(2)標準血清」、及び「(3)管理血清」をそれぞれ試料として用いた。
「常用参照標準物質:JSCC常用酵素 JCCLS CRM−001c」(販売元:特定非営利活動法人日本臨床検査標準協議会[日本国])を、「標準物質」として用いた。
市販の標準血清である「シグナスオート LIP 標準血清」[製造番号:G501](販売元:株式会社シノテスト[日本国])を、「標準血清」として用いた。
市販の精度管理用管理血清である「シグナスオート LIP コントロール」[製造番号:G501](販売元:株式会社シノテスト[日本国])を、「管理血清」として用いた。
「第1試薬」及び「対照第2試薬」、並びに前記2において5℃(暗所)にて7日間保存した「アジ化物添加第2試薬(本発明)」及び「アジ化物添加第2試薬(従来発明)を使用して、7180形汎用自動分析装置(販売元:株式会社日立ハイテクノロジーズ[日本国])により、前記3の各試料の測定を行った。
この生理食塩水を試料とすること以外は、前記(1)〜(3)の記載の通りに操作を行い、生理食塩水を測定したときの吸光度変化量を測定した。(試薬盲検の吸光度変化量の測定)
前記4において測定し、求めた前記3の各試料のリパーゼ活性値(試料の吸光度変化量差の値)を表1に示した。
(1) この表1より、第2試薬として「アジ化物添加第2試薬(従来発明)」を使用したときの測定値(リパーゼ活性値[試料の吸光度変化量差の値])は、第2試薬としてアジ化物を添加していない「対照第2試薬」を使用したときに比べ、「(1)標準物質」においては67%であり、「(2)標準血清」においては67%であり、そして、「(3)管理血清」においては70%であり、測定により得られた吸光度が大幅に低下していることが分かる。
本発明におけるアジ化物の影響の抑制効果を再度確認した。
本発明のリパーゼ活性測定試薬の第1試薬及び第2試薬をそれぞれ調製した。
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、pHをpH8.4(20℃)に調整して、リパーゼ活性測定試薬の第1試薬を調製した。
塩化カルシウム [リパーゼ活性化剤] 20mM
コリパーゼ (ブタ膵臓由来、販売元:ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社[日本国]) 750K単位/L(10mg/L)
Bicine [緩衝剤] 80mM
[1]アジ化物添加第2試薬(本発明)
本発明のリパーゼ活性測定試薬の第2試薬(リパーゼ活性測定用基質溶液)に、アジ化物混入の影響を確かめるため、アジ化物を添加した「アジ化物添加第2試薬(本発明)」を計3ロット調製した。
これを本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液である「第2試薬(本発明)」の第1ロットとした。
前記(6)の「第2試薬(本発明)」の10mLに0.1%(w/v)のアジ化ナトリウム水溶液の10μLを添加し、「アジ化物添加第2試薬(本発明)」の第1ロットとした。
これらをそれぞれ「アジ化物添加第2試薬(本発明)」の第2ロット及び第3ロットとした。
また、これらのいずれの「アジ化物添加第2試薬(本発明)」においても、濃度勾配や強い濁り等は見られず、均質に混合されていることを目視にて確認した。
従来発明のリパーゼ活性測定試薬の第2試薬(リパーゼ活性測定用基質溶液)に、アジ化物混入の影響を確かめるため、アジ化物を添加した「第2試薬(従来発明)」を計3ロット調製した。
これを従来発明のリパーゼ活性測定用基質溶液である「第2試薬(従来発明)」の第1ロットとした。
前記(6)の「第2試薬(従来発明)」の10mLに0.1%(w/v)のアジ化ナトリウム水溶液の10μLを添加し、「アジ化物添加第2試薬(従来発明)」の第1ロットとした。
これらをそれぞれ「アジ化物添加第2試薬(従来発明)」の第2ロット及び第3ロットとした。
また、これらのいずれの「アジ化物添加第2試薬(従来発明)」においても、濃度勾配や強い濁り等は見られず、均質に混合されていることを目視にて確認した。
対照としてのリパーゼ活性測定試薬の第2試薬(リパーゼ活性測定用基質溶液)である「対照第2試薬(本発明)」を計3ロット調製した。なお、この「対照第2試薬(本発明)」にはアジ化物を添加していない。
これを対照としてのリパーゼ活性測定用基質溶液である「対照第2試薬(本発明)」の第1ロットとした。
これらをそれぞれ「対照第2試薬(本発明)」の第2ロット及び第3ロットとした。
また、これらのいずれの「対照第2試薬(本発明)」においても、濃度勾配や強い濁り等は見られず、均質に混合されていることを目視にて確認した。
対照としてのリパーゼ活性測定試薬の第2試薬(リパーゼ活性測定用基質溶液)である「対照第2試薬(従来発明)」を計3ロット調製した。なお、この「対照第2試薬(従来発明)」にはアジ化物を添加していない。
これを対照としてのリパーゼ活性測定用基質溶液である「対照第2試薬(従来発明)」の第1ロットとした。
これらをそれぞれ「対照第2試薬(従来発明)」の第2ロット及び第3ロットとした。
また、これらのいずれの「対照第2試薬(従来発明)」においても、濃度勾配や強い濁り等は見られず、均質に混合されていることを目視にて確認した。
前記1の〔2〕の[1]において調製した「アジ化物添加第2試薬(本発明)」の第1ロット、第2ロット及び第3ロット、並びに前記1の〔2〕の[2]において調製した「アジ化物添加第2試薬(従来発明)」の第1ロット、第2ロット及び第3ロットのそれぞれを、5℃で暗所に7日間保存した。
下の「(1)標準物質」、「(2)管理血清−1」、「(3)管理血清−2」、「(4)管理血清−3」、「(5)管理血清−4」、「(6)標準血清」、「(7)管理血清−5」、及び「(8)プール血清」をそれぞれ試料として用いた。
「常用参照標準物質:JSCC常用酵素 JCCLS CRM−001c」(販売元:特定非営利活動法人日本臨床検査標準協議会[日本国])を、「標準物質」として用いた。
市販の精度管理用管理血清である「液状コントロール血清Iワコー C&C」[製造番号:1515I](販売元:和光純薬工業株式会社[日本国])を、「管理血清−1」として用いた。
市販の精度管理用管理血清である「液状コントロール血清IIワコー C&C」[製造番号:1515II](販売元:和光純薬工業株式会社[日本国])を、「管理血清−2」として用いた。
市販の精度管理用管理血清である「Aalto Control I R」(販売元:株式会社シノテスト[日本国])を、「管理血清−3」として用いた。
市販の精度管理用管理血清である「Aalto Control II S」(販売元:株式会社シノテスト[日本国])を、「管理血清−4」として用いた。
市販の標準血清である「シグナスオート LIP 標準血清」[製造番号:G501](販売元:株式会社シノテスト[日本国])を、「標準血清」として用いた。
市販の精度管理用管理血清である「シグナスオート LIP コントロール」[製造番号:G501](販売元:株式会社シノテスト[日本国])を、「管理血清−5」として用いた。
ヒト血清を集めたものを、「プール血清」として用いた。
「第1試薬」、「対照第2試薬(本発明)」及び「対照第2試薬(従来発明)」、並びに前記2において5℃(暗所)にて7日間保存した「アジ化物添加第2試薬(本発明)」(第1ロット〜第3ロット)及び「アジ化物添加第2試薬(従来発明)」(第1ロット〜第3ロット)を使用して、7180形汎用自動分析装置(販売元:株式会社日立ハイテクノロジーズ[日本国])により、前記3の各試料の測定を行った。
この生理食塩水を試料とすること以外は、前記(1)〜(3)の記載の通りに操作を行い、生理食塩水を測定したときの吸光度変化量を測定した。(試薬盲検の吸光度変化量の測定)
前記4において測定し、求めた前記3の各試料のリパーゼ活性値(試料の吸光度変化量差の値)を表2に示した。
(1) この表2より、第2試薬として「アジ化物添加第2試薬(従来発明)」を使用したときの測定値(リパーゼ活性値[試料の吸光度変化量差の値])は、第2試薬としてアジ化物を添加していない「対照第2試薬(従来発明)」を使用したときに比べ、第1ロットにおいては67%〜76%であり、第2ロットにおいては65%〜76%であり、そして、第3ロットにおいては65%〜79%であり、測定により得られた吸光度がいずれも大幅に低下していることが分かる。
Claims (4)
- 1,2−o−ジラウリル−rac−グリセロ−3−グルタル酸−(6’−メチルレゾルフィン)−エステルをリパーゼ活性測定用基質として含むリパーゼ活性測定用基質溶液において、還元剤を含有することを特徴とするリパーゼ活性測定用基質溶液。
- 請求項1に記載のリパーゼ活性測定用基質溶液を含むことを特徴とするリパーゼ活性測定試薬。
- 1,2−o−ジラウリル−rac−グリセロ−3−グルタル酸−(6’−メチルレゾルフィン)−エステルをリパーゼ活性測定用基質として含むリパーゼ活性測定用基質溶液を使用するリパーゼ活性測定方法において、リパーゼ活性測定用基質溶液に還元剤を含有させることを特徴とするリパーゼ活性測定方法。
- 1,2−o−ジラウリル−rac−グリセロ−3−グルタル酸−(6’−メチルレゾルフィン)−エステルをリパーゼ活性測定用基質として含むリパーゼ活性測定用基質溶液に還元剤を含有させることを特徴とするリパーゼ活性測定に対するアジ化物の影響の抑制方法。
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